Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Отбор штаммов Вешенки обыкновенной по антибиотической активности и возможности ее практического использования

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Отбор штаммов Вешенки обыкновенной по антибиотической активности и возможности ее практического использования"

На правах рукописи

I и

ОД

\ 5 ДЕН

ШАПКИНА ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА

ОТБОР ШТАММОВ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ ПО АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность:

06.01.05. - Селекция и семеноводство 06.01.11. - Защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургском Государственном Аграрном университете на кафедре селекции и семеноводства в 1952 -1995 гг.

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Г.В.Бадина.

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор В.Е.Советкина ; кандидат сельскохозяйственных наук Э.В.Трускинов.

Ведущее учреждение - Биологический научно-исследовательски? институт Санкт-Петербургского Государственного университета. ,

Защита состоится " " 1996 г. в

-/¿у часов на заседании диссертационного совета К 020.18.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства имени Н.К.Вавилова по адресу: 190000, Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЗНИКР

им. Н.К.Вавилова.

Автореферат разослан " ¿М^/ИЖ- " 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор сельскохозяйственных наук [ ¿.В.Майоров.}

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема культивирования съедобных грибов неизменно привлекает внимание исследователей во многих странах мира. Ее решение связано с задачей компенсировать дефицит пищевого и кормового белка.

Искусственное культивирование грибов рода Вешенка (Pleurotus (Fr.) Quel.) осуществляется во многих странах мира, где оно признано рентабельным и экологически чистым. Плодовые тела вешенки содержат целый ряд ценнейших для человека пищевых компонентов (аминокислоты, витамины, сахара, микроэлементы), имеют приятный вкус и запах, обладают лечебными свойствами. Анализ многолетнего опыта, накопленного грибоводами многих стран мира, позволяет выделить целый ряд преимуществ выращивания вешенки в сравнении с другими грибами.

В последние годы в плодовых телах Вешенки обыкновенной обнаружены вещества, обладающие сильно выраженной биологической активностью (БАВ). Свойства этих веществ до настоящего времени остаются слабо изученными. Ранее исследования в данном направлении проводились главным образом специалистами, работающими в области медицины. Практически не рассматривались возможности использования БАВ, содержащихся в плодовых телах грибов рода Pleurotus, в фитопатологическом аспекте. Выполненные ранее работы носили чисто методический характер, а результаты не преломлялись в практическом направлении. Между тем, исследования по физиологии и биохимии вешенки свидетельствуют о высокой биологической активности гриба и перспективах использования его антимикробных свойств в фитопатологии.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения антибиотических свойств гриба P.ostreatus в отношении патогенов различной природы с целью последующего использования полученных данных на практике при разработке экологически чистых технологий защиты растений.

Цель и задачи исследований.

Цель наших исследований - изучение антибиотических свойств грибов рода Pleurotus с учетом их штаммовой специфики при воздействии на патогенов растений различной природы. Для реализации цели работы были поставлены следующие задачи:

- создать коллекцию штаммов P.ostreatus, имеющих различное географическое происхождение;

- изучить морфолого-культуральные свойства коллекционных штаммоз и дать их характеристику на естественных субстратах;

- осуществить скрининг штаммов P.ostreatus по комплексу полезных признаков;

- провести отбор штаммов Вешенки обыкновенной, обладающих наиболее выраженной антибиотической активностью;

- испытать действие экстрактов плодовых тел наиболее активных штаммов гриба на вирус табачной мозаики (ВТМ), вирус огуречной мозаики (ВОМ), новый для России вирус некротической пятнистости дыни (ВНПД);

- исследовать антибиотическую активность штаммов P.ostreatus в отношении фитопатогенных грибов и бактерий;

- определить возможности использования антибиотических свойств P.ostreatus для практических целей в защите растений.

Научная новизна. Осуществлен скрининг коллекции природных и интродуцированных штаммов P.ostreatus по их антибиотической активности и комплексу полезных признаков. Разработаны и усовершенствованы методические подходы к оценке биологической активности P.ostreatus в условиях чистой культуры и на естественных субстратах, а также к отбору штаммов по их антибиотическим свойствам в отношении фитопатогенных организмов. Установлена взаимосвязь между мсрфолого-культуральными свойствами штаммов и их активностью на естественных субстратах.

Впервые изучено влияние экстрактов плодовых тел вешенки на новый для России фитопатоген - вирус некротической пятнистости дыни (ВНПД), поражающий огурцы в условиях защищенного грунта. Показано, что замачивание семян в экстрактах плодовых тел предотвращает массовую гибель всходов огурцов после заражения ВНПД. На примере вируса табачной мозаики (ВТМ) показано, что ингибирующим эффектом обладают также экстракты мицелия вешенки и фильтрат культуральной жидкости. Впервые достигнута полная инактивация ВТМ in vitro под действием экстрактов плодовых тел P.ostreatus при использовании определенных штаммов гриба.

Получены новые данные по взаимодействию P.ostreatus с бактериями и микромицетами in vitro. Показано ингибирующее действие Вешенки обыкновенной на широкий спектр возбудителей бактериальных и грибных болезней сельскохозяйственных культур.

Практическая значимость. Создана коллекция штаммов Вешенки обыкновенной, представляющая собой ценный материал для селекционной работы. Выявлены 8 наиболее перспективных из них в отношении промышленного культивирования, утилизации отходов сельскохозяйственного производства, использования антибиотических свойств в практике защиты растений. Показана необходимость проведения первичного . скрининга природных штаммов P.ostreatus по морфолого-культуральным признакам и антибиотической активности в совместной культуре с фитопатогенными микромицетами.

Разработаны методы практического использования экстрактов плодовых тел вешенки в борьбе с возбудителями заболеваний растений различной

природы. Впервые показано снижение зараженности растений вирусной инфекцией в результате замачивания семян томатов и огурцов в экстрактах плодовых тел.

Результаты работы в целом дополняют и расширяют традиционную схему практического использования Вешенки обыкновенной за счет выявленной способности инактивировать фитопатогенные вирусы, бактерии и микромицеты, оздоравливать семена, стимулировать рост и развитие растений, повышать их индуцированную устойчивость.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции профессорско-преподавательского состава Санкт-Петербургского Государственного Аграрного Университета (1993 г.), на Всероссийском съезде по защите растений ( С.-Петербург, 1995 г.). Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедре ботаники Санкт-Петербургского Государственного университета при чтении курсов "Основы грибоводства" и "Общая фитопатология".

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы.

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных болезней Всероссийского НИИ защиты растений и кафедры фитопатологии Санкт-Петербургского Государственного Аграрного Университета за предоставленный инфекционный материал, микологам кафедры ботаники Санкт-Петербургского Государственного Университета за полезные консультации методического характера, специалистам отдела споровых растений Ботанического института РАН за ценные советы по идентификации видов РкигоШэ, а также сотрудникам Никитского Ботанического Сада (Крым) за содействие в проведении экспедиционной работы.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6-ти глав, выводов, практических и методических рекомендаций. Работа проиллюстрирована 26 таблицами, 22 рисунками. Список литературы содержит 199 наименований.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цель и задачи исследования, показана новизна и практическая значимость достигнутых результатов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены основные тенденции в современных исследованиях антибиотических свойств грибов рода РкигоШБ. Анализ литературных

источников позволил нам обобщить данные о возможностях практического использования вешенки и представить их в виде оригинальной схемы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для отбора наиболее перспективных в хозяйственном отношении штаммов вешенки послужила коллекция, созданная нами в период с 1992 по 1995 годы. В нее вошли 30 штаммов Р.озйеаШз, полученные из различных эколого-географических зон России и Украины. Чистые культуры грибов сохранялись нами на двух питательных средах: сусло-агаре и агаризованном пшеничном отваре. Пересев культур осуществляется каждые три месяца.

Большинство штаммов Р.озигеайш, вошедших в коллекцию, получены путем прямого посева на питательную среду участков плодовых тел, найденных нами в природе, и последующих пересевов чистых культур грибов.

Исходный инфекционный материал представлен в исследованиях патогенными штаммами грибов, бактерий и вирусов, которые идентифицировали и поддерживали на кафедре фитопатологии • СПбГАУ и в лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных заболеваний ВИЗР. Штаммы фитопатогенных бактерий получены нами от бактериолога ВИЗР, кандидата биологических наук А.М.Лазарева.

При работе со штаммами вешенки мы руководствовались методическими рекомендациями, данными в работах Дудки и др. (1978), Билай (1982), Бисько и др. (1987), Бухало (1988), Дворниной (1990).

Для изучения биологической активности различных штаммов вешенки необходимо было получать плодовые тела, а, следовательно, иметь посевной материал (мицелий). В качестве последнего использовался зерновой мицелий вешенки, полученный нами по технологии, используемой в совхозе "Заречье".

В качестве питательного субстрата для роста и плодонощения вешенки использовалась ячменная солома или лузга семян подсолнечника. В экспериментах по оценке активности штаммов Р.оэйеайк на естественных субстратах нами также использовались опилки лиственных пород и льняная костра. Приготовление субстрата, инокуляция мицелием вешенки, поддержание условий и сроков инкубирования, стимуляция плодоношения осуществлялись в соответствии с интенсивной технологией выращивания вешенки, описанной рядом авторов (Бисько, Дудка, 1987; Дворника, 1990; ННЬег, 1982, и другие).

Для получения водных экстрактов вешенки, с целью изучения их антибиотической активности использовали плодовые тела, диаметр шляпки которых составлял 5-7 см. Плодовые тела измельчали и затем растирали их в керамической ступке; гомогенат отжимали через капроновую ткань. К полученному экстракту добавляли дистилированной воды в определенных

соотношениях, после чего фильтровали экстракт через несколько слоев стерильной марли.

Хранение материала осуществляли в холодильнике при температуре +2° С. В отдельных опытах использовались также экстракты мицелия вешенки и фильтраты культуральной жидкости.

Антивирусную активность экстрактов P.ostreatus определяли по динамике развития симптомов заболеваний в опыте и контроле, а также, в опытах с ВТМ, по сопоставлению титра вируса.

При изучении действия экстрактов вешенки на ВТМ in vitro инфекционный материал, содержащий ВТМ, смешивали с экстрактами из плодовых тел вешенки в определенных пропорциях. Время экспозиции составляло 2 часа (Бистрикайге, 1992). Контролем служил инфекционный материал, содержащий ВТМ, смешанный в определенных пропорциях с дистиллированной водой. Титр вируса в опыте и контроле определяли общепринятым "методом половинок" на растениях-индикаторах. В опытах с замачиванием семян томатов и огурцов в экстрактах вешенки проводилось заражение всходов томатов ВТМ, а всходов огурцов - ВОМ и ВНПД. Контроль: замачивание семян в воде с последующим заражением всходов указанными вирусами.

Для определения антигрибной активности P.ostreatus оценивалось взаимодействие грибов in vitro с применением методики смешанных культур. Кроме того, проводились опыты с добавлением в питательную среду экстрактов из плодовых тел вешенки.

Антибактериальную активность различных штаммов вешенки исследовали методами агаровых блоков, штрихов, лунок, колодцев, изложенных в "Руководстве для изучения бактериальных болезней растений" (1968) и книге "Методы экспериментальной микологии" (1982). Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами (Смирнов, Дунин-Барковский, 1959; Рокитский, 1967; Доспехов, 1985; Пересыпкин и др., 1989).

ГЛАВА 3. СКРИНИНГ КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ P.OSTREATUS ПО КОМПЛЕКСУ ПРИЗНАКОВ

Основу коллекции штаммов P.ostreatus, создаваемой нами на протяжении 3-х лет (с 1992 по 1995 годы) составили штаммы из Ленинградской и Новгородской области (всего 16). Они были получены из плодовых тел P.ostreatus, обнаруженных нами на осине, березе, ольхе, дубе, липе и яблоне. Вторую по численности группу (всего 9) составляют штаммы, полученные из плодовых тел вешенки, собранных в Крыму в период экспедиции 1993 года (на буке, пальме юкка и березе). Чистые культуры P.ostreatus с Дальнего Востока

были любезно предоставлены для исследований нашими коллегами из Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского университета. Один из наиболее популярных в России культивируемый штамм 2ошшег был получен нами в порядке обмена из совхоза "Заречье" (Московская область), являющегося основным производителем посевного мицелия съедобных базидиальных грибов в России. В процессе работы с данным штаммом был получен его интродукционный вариант, который также был включен в коллекцию. Номера штаммам вешенки давали по мере их поступления в коллекцию (от Р1 1 до Р130).

Рис. 1 • Основные этапы отбора штаммов Р!еигоШз озйеаШБ, перспективных для промышленного культивирования.

Таблица 1.

Краткая характеристика наиболее активных штаммов Р.оз(геа1щ по комплексу признаков.

С Л ГА У, Н 932-1935 гг.

№ штамма в коллекции Происхождение Природный субстрат или форма интродукции Год интродукции в коллекцию Плодовые тела Ростовой коэффициент in vitro Обилие примордиев in vitro

PI 1 Ленинградская обл., Ломоносовский р-н Осина 1992 Сростки 3-8 ПТ 62,0 +++

Р12 Московская обл., с-з "Заречье" Чистая культура 1992 Сростки до 30 ПТ 94,3 ++++

Р13 Московская обл., с-з "Заречье" Чистая культура 1992 Сростки до 25 ПТ 86,0 +-Н-

PI5 Ленинградская обл., Тосненский р-н Береза 1992 Крупные ПТ, единичные и сростки 42,5 +++

PI9 Новгородская обл., дер. Морозовичи Яблоня 1992 Бугристые ПТ 90,4 +

Р1 14 Крым, Никитский бот. сад Бук 1993 Сростки до 10 ПТ 41,0 +

Р1 17 Крым, буковый лес Бук 1993 Сростки до 10 ПТ 61,0 ++

Р128 Дальний Восток СПбГУ (обмен) Чистая культура 1994 Крупные ПТ, единичные и сростки 41,4 +-

Примечание: (-) - примордии отсутствуют, (+) - примордин единичные (преимущественно по краю колонии), (++) - примордии формируются на нескольких участках колонии, (+++) - примордии обильные, расположены по всей поверхности колонии.

Примордии фиксировали на 20 сутки культивирования.

-W

Характеристику плодовых тел P.ostreatus, собранных в природе, давали непосредственно на естественном субстрате. При этом отмечали цвет и обилие плодовых тел (ПТ), характер края и цвет гименофора, измеряли длину ножки и т.д.

Полученные данные показали высокую вариабельность (полиморфность) штаммов Вешенки обыкновенной, интродуцированных в коллекцию. В связи с этим, возникает вопрос о принципах отбора перспективных для селекции штаммов гриба, включая отбор на биологическую (в т.ч. на антибиотическую) активность.

Биологические особенности P.ostreatus, а также широкие перспективы использования штаммов вешенки в нескольких направлениях предполагают определенную последовательность в изучении основных свойств гриба. Эта последовательность схематично отражена на рис.1. Она предложена нами на основании накопленного опыта в области культивирования вешенки.

В результате проведенного первичного скрининга коллекционных штаммов Вешенки обыкновенной нами отобрано 8 наиболее перспективных из них по комплексу показателей (табл. 1). Учитывались ростовой коэффициент, обилие плодовых тел в естественных условиях, обилие примордиев в культуре и другие особенности. Следует отметить, что именно среди высокопродуктивных форм вешенки целесообразно проводить поиск штаммов, обладающих высокой антибиотической активностью. В этом случае не будет больших проблем с получением необходимых количеств биомассы гриба для ее переработки и практического использования в целях защиты растений от патогенов.

В качестве одного из примеров, характеризующих свойства отобранных 8 штаммов, приведем данные об их отношении к различным субстратам (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют о способности всех изученных штаммов активно развиваться на четырех субстратах, представляющих собой отходы производства. Наиболее благоприятными для них оказались ячменная солома и опилки лиственных пород. При этом первые три штамма имели активный или очень активный рост на всех четырех субстратах. Среди указанной группы штаммов, характеризующихся наибольшей активностью при развитии на различных естественных субстратах (а также перспективных и по другим признакам) отбирались штаммы для изучения их антибиотических свойств. В подобных случаях первоначально необходимо применение экспресс-методов, позволяющих предварительно оценить антибиотическую активность штаммов гриба. В наших опытах, мы избрали в качестве экспресс-метода оценку взаимодействия вешенки с агрессивными микромицетами (биодеструкторами), обладающими высокой антагонистической активностью. Своеобразными тестерами для таких испытаний считаются виды Pénicillium, Aspergillus, Tri choderma (Горл енко, Соловей, 1973;Бисько, Дудка, 1977).

Таблица 2.

Отношение перспективных штаммов вешенки к различным субстратам.

№ штамма в коллекции Опилки Ячменная солома Льняная костра Лузга семян подсолнечника

PI 1 FF F F F

Р12 FF FF F FF

Р13 FF FF F FF

Р15 FF F M F

Р19 M F F F

Р114 M F M F

Р117 M F M F

Р1 28 F F M F

Примечание:

(F) - активное оплетение субстрата мицелием Вешенки, (FF) - очень активное оплетение субстрата мицелием Вешенки, (М) - умеренная активность гриба при оплетении субстрата.

В наших опытах были взяты по одному еиду из каждого рода (с учетом их встречаемости на естественных субстратах), а также Botrytis cinerea, повсеместно распространенный на растительных остатках и обладающий высокой конкурентоспособностью в отношении других грибов. Оценку результатов взаимодействия этих тест-объектоз с 8 штаммами P.ostreatus проводили по специально предложенной нами для этой цели упрощенной шкале, позволяющей отмечать главные тенденции взаимовлияния изучаемых видов. В итоге выявилась наибольшая антагонистическая активность у штамма Р1 2 (Zommer) я его интродукционного варианта Р1 3. Они практически полностью подавляли развитие Botrytis cinerea и Aspergillus oryzae. Наиболее агрессивным в отношении штаммов P.ostreatus оказалась T.viride.

Дополнительным подтверждением антибиотических свойств штаммов Вешенки обыкновенной стали результаты наших наблюдений за состоянием плодовых тел при их хранении в течение 30 дней при температуре + 2°С в полиэтиленовых пакетах (не стерильно). Из 8 изученных штаммов лишь Р12 и Р1 3 практически не теряли своих свойств (внешний вид и консистенция ПТ) в течение месяца. ПТ остальных 6 штаммов сохраняли свои свойства в течение 1520 дней, после чего на их поверхности формировалось спороношение плесневых грибов нз рода Pénicillium.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ НА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ТОМАТОВ И ОГУРЦОВ.

Нами была проведена серия опытов по влиянию экстрактов Вешенки обыкновенной на ВТМ in vitro и in vivo. Необходимо отметить, что ВТМ и его штаммы продолжают наносить заметный ущерб культуре томата в России и странах СНГ. Устойчивые к ВТМ гибриды томатов культивируются преимущественно в крупных тепличных комбинатах. Вместе с тем во многих тепличных хозяйствах и в открытом грунте ВТМ все еще имеет широкое распространение. Так, в работе Аль-Каддах Вадид (1993), выполненной на Украине, показано, что в условиях обследованных теплиц ВТМ поражал от 15,3 до 45,3% растений томатов, снижая в среднем урожай на 6,2 иг/и2 . В числе мероприятий, направленных на снижение вредоносности ВТМ, немаловажная роль принадлежит использованию биологически активных веществ (БАВ). Что же касается влияния на вирус экстрактов высших базидиальных грибов, то как было показано в литературном обзоре, эти работы носят в основном методический характер. Нами, наряду с методическими исследованиями , проведена серия опытов, результаты которых могут иметь непосредственное практическое значение.

При изучении действия ЭПТВ на ВТМ in vitro нами была установлена существенная роль штамма гриба, использованного в опытах (в исследованиях других авторов характеристика штаммов вешенки обычно отсутствует). В первоначальных экспериментах, проведенных со штаммом Р1 5, не было установлено его ингибирующее действие на ВТМ in vitro. В дальнейшем мы работали преимущественно со штаммами PI 1, Р1 2, Р1 14, показавшими высокую антивирусную активность. Основные из полученных результатов приводятся ниже. Методика опытов изложена в главе 2, опыты проводились при разных соотношениях ЭПТВ и сока из листьев мозаичных томатов, содержащих ВТМ. Инфекционный материал обычно использовался в разведениях 1:10 и 1:50, а также концентрированным. Поскольку полученные результаты с различными разведениями принципиально не различались, мы их представляем в автореферате в обобщенном виде, тогда как в диссертации приведены детали и особенности каждого опыта (табл. 3). Далее нами изучено действие экстрактов мицелия вешенки (ЭМВ) и фильтрата культуральной жидкости (КЖ) на ВТМ in vitro. Опыты проводились со штаммом Р1 2 по той же схеме, что и опыты с ЭПТВ. Результаты проведенных экспериментов, подробно изложенные в диссертации показали, что наиболее эффективное подавление ВТМ наблюдается под воздействием экстрактов плодовых тел вешенки (штамм Р1 2). Близкое по эффективности воздействие на ВТМ оказывают и экстракты мицелия гриба. Несколько меньший (хотя и достаточно выраженный эффект) зафиксирован при воздействии на ВТМ фильтратом культуральной жидкости P.ostreatus.

Таким образом, экспериментально установлен эффект снижения титра вируса в результате ингибирования его биологически активными веществами определенных штаммов вешенки.

Таблица 3.

Влияние ЭПТВ P.ostreatus на ВТМ in vitro.

СПГАУ > 6ИЗР> -f993--i995rp

№ опыта Штамм P.ostreatus Среднее число некрозов на 1/2 листа растения-индикатора на ВТМ

1 PI 2 0,12/17,1

2 PI 2 0/10,4

3 PI 2 0,5/23,2

4 PI 2 0/26,4

5 PI 1 0/18,3

Примечание:

1) В числителе - число некрозов в опытном варианте (воздействие ЭПТВ на ВТМ), в знаменателе - число некрозов в контроле (вода + ВТМ в тех же соотношениях).

2) Подавление ВТМ in vitro зафиксировано на статистически высоко значимом уровне (Р < 0,05 или Р < 0,01) в соответствии с критерием знаков Уилкоксона -Манка-Уитни.

Далее, нами были поставлены опыты по замочке семян томатов сорта Волгоградский 5/95 в концентрированных экстрактах плодовых тел вешенки с последующим заражением сеянцев вирусом табачной мозаики.

Цель данных экспериментов - проверить, не индуцирует ли предпосевное замачивание семян томатов в экстрактах вешенки повышение устойчивости растений к ВТМ. Кроме того, предполагалось дать оценку состояния всходов томатов после воздействия на них ЭПТВ. Подобные опыты по повышению индуцированной устойчивости ранее проводились с некоторыми биологически активными веществами, в частности, со стероидными гликозидами, по применению которых были достигнуты некоторые положительные результаты (Балашова и др., 1985).

Методика опыта предусматривала использование двух штаммов P.ostreatus (PI 2 и PI 14). Семена замачивали в экстрактах вешенки в двух вариантах: в концентрированном ЭПТВ и в разведенном водой в соотношении 1: 2. Экспозиция замачивания 1 час. После этого семена помещали на смоченную водой фильтровальную бумагу, проращивали на светоустановке и пересаживали в стерильную почву. Контролем служили семена, замоченные в воде. Титр ВТМ в молодых листьях томатов определяли через 15 и 30 дней после их

и

искусственного заражения вирусом. В таблице 4 представлены результаты опыта со штаммом Р1 14. Полученные данные свидетельствуют о том, что в опытных вариантах оказалось значительно меньше выпадов всходов, чем в контроле. Кроме того, снижение титра вируса в вариантах с ЭПТВ было очевидным. Аналогичные результаты были получены нами и со штаммом Р1 2. И в этом случае полностью отсутствовали выпады всходов. Полученные данные свидетельствуют не только о подавлении ВТМ под действием ЭПТВ, но и положительном влиянии экстрактов гриба на рост и развитие растеши.

В опытах, проведенных с культурой огурцов, было использовано 2 патогена - вирус огуречной мозаики (ВОМ) и вирус некротической пятнистости дыни (ВНПД). Этот патоген, ранее неизвестный в России, впервые идентифицирован в лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных болезней ВИЗР, а нами проведены исследования в направлении повышения устойчивости растений к болезни. Симптомы заболевания огурцов ВНПД проявляются в некротической пятнистости листьев (ожог). В своей биологии

Таблица 4.

Влияние ЭПТВ (штамм PI 14) на развитие всходов томатов и размножение ВТМ в проростках. СЯГАЙ, -/993--fS9i>>r

№ п/п Варианты замачивания семян Выпады среди всходов Титр ВТМ (число некрозов на 1/2 листа индикатора)

15 дней 30 дней

1 ЭПТВ + вода (1:2) 10 не определяли не определяли

2 ЭПТВ конц. 0 3,4 5,3

3 Контроль (вода) 35,3 15.0 28.1

Примечание:

Различия между опытом и контролем по титру вируса достоверны согласно критерию знаков на уровне р « 0,05.

вирус тесно связан с почвой и переносится грибами рода 01р1с1шт (Воб е! а!., 1984). Поскольку в условиях России меры борьбы с этим вредоносным заболеванием не разрабатывались, мы проверили влияние ЭПТВ на повышение устойчивости растений к ВНПД, а также к вирусу огуречной мозаики. Семена огурцов гибридов Либелла и НИИОХ 412 замачивали в ЭПТВ. В разных вариантах использовались штаммы Р.озКеаШБ Р1 1, Р12, Р1 14. заражение огурцов вирусами проводили в фазу появления первого настоящего листа методом инокуляции инфекционным соком.

Результаты опыта показывают, что замачивание семян в ЭПТВ в целом оказывает благоприятное влияние на всходы. При этом наилучшие результаты были получены в вариантах с разведениел! ЭПТВ водой в соотношении 1 : 2. Необходимо отметить, что все изученные штаммы дали сходные результаты по воздействию на растения. Оба изученных сорта огурцов оказались чувствительны к воздействию ЭПТВ примерно в равной степени, причем высота растений к моменту измерений в опытных вариантах была в среднем на 2 см выше чем в контроле.

Было проанализировано развитие симптомов на растениях огурцов, обработанных ЭПТВ, и инокулированных ВОМ. Прежде всего, необходимо отметить заметную разницу в поражении ВОМ генотипов НИИОХ - 412 и Либелла. Наиболее благоприятные результаты были получены в опытах с гибридом огурцов Либелла. Учеты проводились на сравнительно низком инфекционном фоне, поскольку ВОМ, распространяясь в природе главным образом посредством тлей, с трудом передается методом инокуляции соком, который обычно применяется в экспериментах. Однако и на таком инфекционном фоне были зафиксированы достаточно четкие различия. Если в контроле число мозаичных растений составляло 22,2% , то в вариантах со штаммом Р12 больные растения сорта Либелла вообще отсутствовали.

В других вариантах число больных растений в опыте существенно не отличалось от контроля и колебалось на уровне 14 - 25%. Следует отметить, что ВОМ относится к числу патогенов, чрезвычайно агрессивных для культуры огурцов, поэтому нахождение даже отдельных вариантов с положительным результатом ингибирования ВОМ представляет интерес и перспективу для дальнейших исследований. Заслуживает внимания факт высокой антивирусной активности ЭПТВ именно штамма Р1 2, что проявилось ранее на культуре томатов. Положительным фактом для всех испытанных штаммов явилось стимулирование (хотя и в разной степени) роста и развития всходов огурцов.

Переходим далее к анализу результатов опытов с почвенным вирусом -некротической пятнистости дыни (ВНПД). Один из наиболее важных результатов этого опыта заключается в том, что выявлены существенные различия между вариантами с ЭПТВ и контролем. Так, в контроле (замачивание семян в воде) после заражения ВНПД наблюдалось массовое поражение растений и выпады всходов. Через 10 дней после заражения ВНПД количество выпадов в контроле уже составляло от 67 до 100% растений, тогда как в опытных вариантах (с замачиванием семян в ЭПТВ) были выявлены лишь единичные случаи поражения растений ВНПД. Положительный эффект- получен в вариантах со всеми испытанными штаммами P.ostreatus (PI 1, PI 2, PI 14). В качестве примера ниже приведены результаты опыта с ЭПТВ штамма Р114 (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние замачивания семян в ЭПТВ (штамм Р1 14) на развитие симптомов поражения всходов огурцов НИИОХ - 412 почвенным вирусом - ВНПД.

СГГГАУ, 1т-1995гг

№ п/п Вариант опыта Средняя высота растений (см) Характер поражения растения-хозяина через 10 дней после инокуляции ВНПД

1 ЭПТВ (конц.) 7,0 ±0,2 Выпадов нет, слабая пятнистость семядолей - единично

2 ЭПТВ (разв. 1 :2) 6,0 + 0,3 Выпадов нет, полегание растений -единично, мозаика - единично

3 Контроль: замачивив. семян в воде 4,1 ±0,5 Гибель 85% растений, системные некрозы, усыхание.

Необходимо отметить, что период наблюдений в данном эксперименте был ограничен, ввиду наступившей массовой гибели растений в контроле, что привело бы впоследствии практически к отсутствию контрольного варианта. Полученные данные одновременно указывают на существенные различия в высоте растений, при явном угнетении их в контрольном варианте, по сравнению с опытом.

Таким образом, можно констатировать исключительно сильное положительное воздействие экстрактов вешенки на снижение вредоносности ВНПД на ранних фазах развития огурцов.

В диссертации проведено обсуждение полученных результатов. Отмечено, что нами впервые найдены варианты полного подавления ВТМ in vitro. Выделены штаммы P.ostreatus, приводящие к такому результату. Значительный интерес представляет анализ воздействия экстрактов вешенки на ВТМ в опытах in УГУо(замачивание семян.в ЭПТВ). Снижение титра вируса в инокулированных ВТМ проростках томатов после такого замачивания свидетельствует, что при этом происходит изменение метаболизма растений в направлении, повышающем сопротивляемость вирусной инфекции. Аналогичный эффект зафиксирован при обработке семян томатов некоторыми биологически активными препаратами, например, стероидными гликозидами (Балашова и др., 1985; Лахматова и др., 1989). Учитывая, что ЭПТВ непосредственно влияет и на подавление ВТМ in vitro, замачивание семян томатов в ЭПТВ может иметь двоякий смысл: 1) непосредственное воздействие БАВ вешенки на ВТМ на поверхности семян и его инактивация; 2) повышение устойчивости вег&тирующих растений к ВТМ.

При замачивании семян огурцов в ЭПТВ особо следует отметить стимуляцию роста и развития растений на ранних фазах онтогенеза, а также, в некоторых вариантах, и антивирусное действие ЭПТВ.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ ПЛОДОВЫХ ТЕЛ ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ НАФИТОПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ

Испытание действия экстрактов плодовых тел вешенки (ЭПТВ) на фитопатогенные бактерии проводили в 1991-1994 гг. В исследование были включены экономически важные виды бактерий, вызывающие вредоносные заболевания томата, огурца, картофеля и других культур. Среди мероприятий, ограничивающих вредоносность бактериозов, например бактериального рака томатов, значительное внимание уделяется поиску, изучению, испытанию биологически активных веществ тииа фитобактериомишша, фитолавина и других (Матвеева, Фокина, 1994; Пехтерева, 1994), аренарина, симбионта 2 и др. (Быкова, 1992). При исследовании действия ЭПТВ на фитопатогенные бактерии использовали для сравнения растворы эталонных антибиотиков, обладающих ингибирующим эффектом против бактерий.

В итоге наших исследований установлено, что ЭПТВ (PI 2) эффективно подавляет in vitro развитие возбудителя бактериального рака томатов на уровне антибиотика кефазола. В других вариантах (с использованием штамма PI 1 и фильтрата культуральной жидкости) отмечено умеренное подавление роста бактерий.

В отношении возбудителя черной бактериальной пятнистости томатов (Xanthomonas campestris pv.visicatoria) показано, что этот патоген менее чувствителен in vitro к действию ЭПТВ и фильтрату культуральной жидкости по сравнению с возбудителем бактериального рака.

В опытах с другими объектами (бактерии родов Pseudomonas и Erwinia) не найдено вариантов, в которых ЭПТВ достигали бы эффективности сильнодействующих антибиотиков.

6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ P.OSTREATUS И ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ

IN VITRO

В главе 3 был рассмотрен экспресс-метод оценки антагонистической активности 1рибов при совместном культивировании, который можно использовать при отборе штаммов вешенки по признаку биологической активности. В данной главе вопрос взаимодействия P.ostreatus и фитопатогенных грибов проанализирован более широко. Следует отметить, что в литературе сведения о влиянии видов Pleurotus на фитопатогенные грибы крайне малочисленны.

В качестве главных объектов нами были выбраны Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum f.lycopersici (3 штамма), Botrytis cinerea, имеющиеся в

Таблица 6.

Влияние ЭПТВ на рост F.oxysporum f.lycopersici in vitro.

СПГАУ,<9д5Н93£Ггг

N Варианты сред Показате- Штаммы F.oxysporum f.lycopersici

п/п ли роста

R- 25 255 605

I II I II I II

1 СА (контроль) d 4,8 10,0 4,5 10,0 4,0 10,0

h 0,4 0,9 0,4 0,9 0,4 0,9

2 СА + ЭПТВ (авт) d 3,5 10,0 1,5 3,5 2,0 5,6

h 0,2* 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

3 СА + ЭПТВ (свеж) d 0 0 0 0 0 0

h 0 0 0 0 0 0

Таблица 7.

Влияние ЭПТВ на рост Phytophthora infestans и Botrytis cinerea in vitro.

criray, 4993-"i9SÄYr

N Варианты сред Показате- Phytophthora Botrytis cinerea

n/n ли роста infestans

I II I II

1 2 3 4 5 6 7

1 СА (контроль) d 3,2 8,0 4,5 10,0

Ь 0,3 0,5 0,4 0,9

2 СА + ЭПТВ d 1,0 4,0 2,8 6,8

(авт)

Ъ 0,2* 0,2 0,3 0,3

3 СА + ЭПТВ d 0 0 0 0

(свеж)

11 0 0 0 0

Примечание:

с! - диаметр колонии, Ь - высота колонии

I - первый срок учета (7 дней),

II - второй срок учета (14 дней),

* - очень тонкий, стелющийся мицелий.

1б

коллекции чистых культур кафедры фитопатологии С.-Петербургского аграрного университета. Изучалось действие экстрактов из плодовых тел вешенки на развитие микромицетов в культуре. Экстракт добавляли в сред}' в 2-х вариантах: среду автоклавировали после добавления в нее ЭПТВ; экстракты добавляли в среду непосредственно перед разливом ее в чашки Петри. После 1-2-х недельной инкубации инокулированных чашек в термостате при t = + 24° С измеряли высоту и диаметр колоний. Контролем служили культуры грибов на сусло-агаре (CA) без добавления ЭПТВ, выращенные в тех же условиях. Полученные результаты представлены в таблицах 6 и 7. Результаты, представленные в таблице 6, свидетельствуют о том, что добавление экстракта из плодовых тел Pleurotus ostreatus (шт.Р1 2) в питательную среду оказывает существенное влияние на рост всех испытанных штаммов F.oxysporum f.lycopersici in vitro. Полное подавление роста наблюдалось в варианте с добавлением ЭПТВ непосредственно перед разливом среды в чашки Петри. При автоклавировании CA, содержащей ЭПТВ, эффект подавления заметно снижается, хотя скорость роста и характер мицелия заметно изменяются. Так, на 14 сутки роста диаметр колоний у штамма - 255 был на этой среде в 2,8 раза меньше, чем в контроле, а у штамма - 605 в 1,8 раза. При этом мицелий был тонким, паутинистым, стелющимся и практически не поднимающимся над средой. Результаты опыта свидетельствуют о том, что в процессе автоклавирования, вероятно, происходит частичное разрушение БАВ, находящихся в ЭПТВ.

Что касается влияния ЭПТВ на рост Ph.infestans и В.cinerea in vitro, то, как и в случае с F.oxysporum, наблюдалось полное подавление микромицетов в 3-м варианте.

В целом полученные данные свидетельствуют о перспектитвности поиска практических путей применения ЭПТВ в борьбе с грибными болезнями овощных культур.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция штаммов Вешенки обыкновенной, имеющих различное географическое происхождение. Проведен скрининг 30 штаммов Р.ostreatus по комплексу полезных признаков и выявлены 8 наиболее перспективных из них в отношении промышленного культивирования, утилизации отходов сельскохозяйственного производства, и использования антибиотических свойств в практике защиты растений.

2. Разработаны и усовершенствованы методические подходы к оценке биологической активности P.ostreatus в условиях чистой культуры и на естественных субстратах, а также к отбору штаммов по их антибиотическим свойствам в отношении фитопатогенных организмов.

3. Показана тесная взаимосвязь активности штаммов P.ostreatus в условиях чистой культуры и на естественных субстратах.

4. Установлено ингибирующее действие экстрактов плодовых тел вешенки (ЭПТВ), экстрактов мицелия и фильтрата культуральной жидкости на вирус табачной мозаики (ВТМ) in vitro. Впервые исследования проведены на уровне штаммов P.ostreatus, охарактеризованных по комплексу признаков, причем со штаммами PI 1 и Р12 достигалась полная инактивация ВТМ in vitro. В результате замачивания семян томатов в ЭПТВ (штаммы PI 2 и PI 14) установлено снижение титра ВТМ в искусственно зараженных растениях томатов.

5. Отмечено стимулирующее влияние замачивания семян огурцов в ЭПТВ на рост и развитие всходов, повышение устойчивости растений к вирусу огуречной мозаики (гибрид Либелла) и новому вирусу некротической пятнистости дыни.

6. Экспериментально изучено ингибирующее действие ЭПТВ на пять видов бактерий, вызывающих опасные заболевания сельскохозяйственных культур. В итоге установлено, что ЭПТВ (PI 2) эффективно подавляет in vitro развитие возбудителя бактериального рака томатов на уровне антибиотика кефазола. В опытах с другими объектами отмечено умеренное либо слабое подавление роста бактерий.

7. В условиях совместного культивирования вешенки с фитоиатогенными и сапрофитными видами грибов выявлены различные типы взаимодействия P.ostreatus с микромицетами из нескольких таксономических и экологических групп. Преобладающими оказались реакции взаимного подавления организмов, а также доминирование вешенки с последующим обрастанием соседней колонии. Наиболее сильным антагонистом для P.ostreatus оказался гриб Trichoderma viride.

8. Выявлено ингибирующее действие ЭПТВ на фитопатогенные грибы из различных таксономических групп. Под воздействием ЭПТВ (штамм PI 2) отмечено полное подавление in vitro Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum f.lycopersici и Botrytis cinerea.

9. Определены возможности практического использования антибиотических свойств P.ostreatus в практике защиты растений против патогенов различной природы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При отборе штаммов Вешенки обыкновенной по комплексу полезных признаков рекомендуется проводить первичный скрининг по морфолого-культуральным свойствам, а также оценку антибиотической активности P.ostreatus в совместной культуре с фитопатогенными микромицетами.

2. При оценке штаммов Вешенки обыкновенной на антивирусную активность целесообразно использовать доступный метод биологического титрования на растениях-индикаторах. При этом пробы для определения титра вируса табачной мозаики в вегетирующих растениях следует брать через 2-4 недели после заражения, когда обычно происходит активизация защитных реакций растений.

3. В целях инактивации поверхностной семенной инфекции целесообразно проводить замачивание семян томатов в экстрактах плодовых тел вешенки (ЭПТВ), имея в виду как непосредственное обеззараживание семян, так и повышение устойчивости растений к болезням. Семена следует замачивать в ЭПТВ, разведенных водой (в соотношении 1:2), в течение 1-го часа. Данный метод особенно доступен при подготовке семян к посеву на приусадебных участках.

4. Для повышения устойчивости растений огурца к заболеваниям и предотвращения массовых выпадов всходов рекомендуется замачивание семян огурцов перед посевом в ЭПТВ (разведенных водой в соотношении 1:2).

5. Рекомендуем для дальнейшего изучения антибиотических свойств Вешенки обыкновенной в отношении фитопатогенных организмов использовать новые объекты из различных таксономических групп. Целесообразно включить в испытания вирусы, близкие по таксономическому положению к уже испытанным с положительным результатом (например, почвенные вирусы некроза табака и некроза огурца, относящиеся, так же как и испытанный нами вирус некротической пятнистости дыни, к группе фуровирусов).

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

Шапкина Ю.Ю. Отбор штаммов вешенки по признаку биологической активности. И Сб. научн. трудов С.-ПГАУ: Морфо-генетические показатели продуктивности растений и использование их в селекционно-семеноводческой работе. - СПб., 1993. - С. 64-68.

Шапкина Ю.Ю. Антибиотическая активность грибов рода вешенка. // Сб. научн. трудов С.-ПГАУ: Оптимизация защиты сельскохозяйственных культур от вредителей и болезней. - СПб., 1993. - С. 84-87.

Шапкина Ю.Ю., Власов Ю.И. Об антивирусной активности гриба вешенки Р1еигоШз оэ^еаШв (Бг.) Кишт. // Вирусные эпифитотии и пути их предупреждения С.-П., ВИЗР., 1993. - С. 79-81.

Шапкина Ю.Ю. О действии экстрактов гриба вешенки на вирус табачной мозаики. // Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: Экономика, эффективность, экологичность. Всероссийский съезд по

защите растений. С.-П., -1995. - С. 574.