Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности загрязнения молока ассоциацией аэробных микроорганизмов и их выявление в Саратовской области

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности загрязнения молока ассоциацией аэробных микроорганизмов и их выявление в Саратовской области"

РГ6 Ой 14 тол 1яя?

На правах рукописи УДК:619:576.8:637.1

Попова Ольга Михайловна

ОСОБЕННОСТИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОЛОКА

АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ В САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

а

т

Саратов, 1997 г.

о

На правах рукописи УДК:619:576.8:637.1

Попова Ольга Михайловна

ОСОБЕННОСТИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОЛОКА

АССОЦИАЦИЕЙ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ В САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ

03.00.07 • микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1997 г.

Работа выполнена в Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии.

Научный руководители: академик МАНЭБ, доктор биологических

наук,профессор П.А. Чиров

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Л.Ф. Зыкин

кандидат биологических наук,

ст.научный сотрудник Е.И.Тихомирова

Ведущая организация: Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится 1997 года в часов на засе-

дании диссертационного совета К-120.97.01 при Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии.

Адрес: 410005, г. Саратов, ул. Б.Садавая,220. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СГАВМиБ.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

ЮМ. Давыдов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Поскольку молоко является идеальной питательной средой для микроорганизмов (Джавец и др., 1982) избежать угрозы ее бактериальной обсемененности от экзо- и эндогенных источников контаминации задача очень сложная и трудноосуществимая. Тем не менее при надлежащей санитарной культуре на ферме, соблюдении требований по технологии хранения молока и эффективной обработке оборудования моюще-дезинфицирующи-ми средствами можно достичь высокого санитарного качества продукта (Леонтьев, 1965; Глухих, Золотницкая, 1991; Прудов, Романова, 1994 и др.). Однако, в последние годы показатели качества молока в России заметно ухудшились (Прудов, Романова, 1994). Наряду с общим экономическим обвалом в сельском хозяйстве существенно увеличился дефицит холодильных установок, пастеризаторов, моюще-дезинфекционных средств и пр. В результате снижения общей культуры получения молока на фермах многих хозяйств начала падать его сортность, в том числе по причине бактериальной загрязненности как условно-патогенной, так и патогенной микрофлорой.

Огромной экономической проблемой в России является бруцеллез (Авилов, Седов, 1994; Желудков, Маликов, Таран,1997). Только в Саратовской области ежегодно обследуется до 1,5 млн. животных и выявляется 0,3-0,4% положительно реагирующих в РСК. Проводимые меры по оздоровлению неблагополучных пунктов не уменьшает их число, а количество больных животных нарастает (Попова, Чиров, 1995).

Сложившаяся к настоящему времени санитарно-гигиеническая ситуация в животноводстве и отсутствие сведений о видовом составе и количественных показателях микроорганизмов, содержащихся в важнейшем продукте питания людей, послужило основанием для проведения настоящего исследования.

Цель работы. Изучение бактериальной загрязненности молока коров в некоторых хозяйствах Саратовской области и выяснение экологических особенностей размножения микроорганизмов и их чувствительности к антибактериальным веществам.

Основные задачи исследования. 1. Выявить ассоциацию аэробных микроорганизмов в молоке коров в различных хозяйствах Саратовской области.

2. Определить показатели численности отдельных видов и всей ассоциации микроорганизмов на единицу объема молока.

3. В эксперименте изучить особенности экологии некоторых видов бактерий.

4. Испытать антибактериальное действие соли аммония (ATM) на доминирующие виды грамотрицательной и грамположительной микрофлоры.

5. С помощью серологических (КР, РСК) и новых иммунологических (ТИФА, ПЦР) методов оценить возможность выявления бруцеллезного антигена в молоке и сыворотке крови коров.

Научная новизна. Изучен уровень обсемененности условно-патогенной микрофлорой молока, получаемого при разных условиях доения коров. Выявлен видовой состав аэробных микроорганизмов, определены структура и показатели численности всех представителей ассоциации микробов. Показаны особенности экологии доминантных видов бактерий, обладающих способностью интенсивно размножаться в молоке при температуре +4°С. Получены материалы по выявлению бруцеллезного антигена в молоке и сыворотке крови коров. Дана оценка эффективности ТИФА и ПЦР для лабораторной диагностики бруцеллеза. Испытана чувствительность бактерий к тетрациклину и соли аммония.

Практическая ценность. При выполнении данной работы получены результаты, имеющие определенную практическую значимость:

1. Показана целесообразность и представлены предложения (Ин-форм. листок № 15-16, 1996 г.) по применению ATM как моюще-дезинфицирующего средства.

2. Оказана практическая помощь подсобному хозяйству "Динамо" Новобурасского района по использованию ATM для дезинфекции молочной посуды и оборудования.

3. Для проведения оздоровительных мероприятий по бруцеллезу рекомендуется исследование молока в твердофазном иммунофер-ментном анализе и полимеразно-цепной реакции для выявления бруцеллезных антигенов.

4. Материалы диссертации используются при чтении лекций по микробиологии на биологическом факультете Саратовского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Видовой состав ассоциации выделенных микроорганизмов из мо-

лока.

2. Особенности экологии доминантных видов бактерий и их чувствительность к препаратам.

3. Эффективность применения ТИФА и ПЦР для выявления бруцеллезного антигена у животных.

Апробация работы и публикации. Изложенные в работе данные доложены и нашли отражение на тринадцатой региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Резервы увеличения производства и повышения качества сельскохозяйственной продукции" (Оренбург, 1994); на научно-производственной конференции профессорско-преподавательского состава, аспирантов, стажеров и студентов Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии (Саратов, 1995); на Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1995); на Международной конференции "Го-меостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996).

По теме диссертации опубликовано 5 работ и одна статья сдана в печать,

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Объем диссертации составляет 83 страницымашинописного текста. Диссертация содержит 7 таблиц, 10 рисунков. Список литературы включает 140 наименований, из них 98 отечественных и 42 иностранных.

1. Обзор литературы

В обзоре литературы представлены сведения об источниках микробного обсеменения молока и дана характеристика механизмов проникновения наиболее часто встречающихся условно-патогенных (стафилококки, эшерихии) и патогенных (бруцеллы, листерии) микроорганизмов. Обсуждаются вопросы передачи бактерий человеку и животным с молоком, а также методы выявления их в нем.

2. Материалы и методы исследования

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и эпизоотологии Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии в течение 1993-1995 гг. На бактериальную загряз-

ненность свежевыдоенного молока коров исследовалось 70 проб, полученных из трех хозяйств. Посевы осуществляли на пластинчатый МПА после проведения серии последовательных разведений 0,1 мл молока в стерильном физиологическом растворе. Определение содержания микроорганизмов проводили путем подсчета роста колоний из трех последних разведений, которые суммировали и выводили среднее количество микробных клеток (м.к.) в 1 мл молока.

Серологическими методами выявляли наличие бруцеллезных антигенов и антител в молоке и сыворотке крови коров. Для этого использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА), кольцевую реакцию (КР), реакцию связывания комплемента (РСК) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Для выявления антигена и антител методом ТИФА использовали коммерческую диагностическую тест-систему, выпускаемую ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН России. Этим методом было исследовано 330 проб молока и 208 сывороток крови коров. Действующими компонентами системы для определения антигена служили бруцеллезные иммуноглобулины, адсорбированные на планшете. В качестве положительного контроля использовали бруцеллезный сухой монопо-лисахаридный антиген, полученный из вакцинного штамма Brucella abortus 19 ВА. Конъюгатом для выявления образовавшегося комплекса "антиген-антитело" служил ковалентно связанный с перок-сидазой хрена бруцеллезный иммуноглобулин, полученный из телячьей сыворотки крови. Подробно техника выявления антигена и антител с помощью этой реакции приведена в диссертации. Данная работа проводилась совместно с к.б.н. Т.А. Полуниной« лаборатории РосНИПЧИ "Микроб".

В полимеразно-цепной реакции исследовали 50 проб молока. Реакцию проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл) на программируемых термоциклерах "Techne" (Англия) или Биокомсервис (Россия). Техника постановки реакции подробно описана в диссертации. Эти исследования проведены в РосНИПЧИ "Микроб" совместно с Т.А. Гараниной.

Кольцевой реакцией исследовано 330 проб молока. Данная работа проведена нами в областной ветеринарной лаборатории (г.Саратов) под контролем к.в.н. И.Д. Кононенко.

Реакция связывания комплемента использовалась для выявления бруцеллезного антигена в двух хозяйствах. Всего исследовано 538 сывороток крови. Постановка реакции осуществлялась в вете-

ринарной лаборатории г. Энгельса. Содействие в выполнении данных исследований оказывал Главный ветеринарный врач Энгельсско-го района В.Н. Бодров.

Эксперименты по определению чувствительности бактерий к тетрациклину и соли аммония (ATM) проводили путем высева в пробирки со стерильным молоком по 100 м.к. бактерий. Первая пробирка служила для наблюдения за накоплением бактерий, во вторую дополнительно вносили 0,1 мл тетрациклина, в третью- ATM. Все культуры содержали в холодильнике при температуре +4°С. Через различные интервалы времени (0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 ч ) из каждой пробирки высевали по 0,1 мл жидкости на МПА. Подсчет выросших колоний на пластинчатом агаре служил показателем размножения бактерий. Количество бактерий вычисляли путем выведения средней из подсчета роста колоний в трех последних разведениях (1:10000, 1:100000, 1:1000000).

Кроме того , чувствительность бактерий Escherichia coli, Listeria monocytogenes и Staphylococcus epidermidis к указанным препаратам изучали методом диффузии в агаре. Для этого на поверхность пластинчатого МПА и засеянной культуры бактерий наносили пропитанные тетрациклином и ATM бумажные диски. Чашки содержали в термостате при температуре +37°С в течение 24 часов. Оценку чувствительности фиксировали по диаметру литической зоны вокруг дисков.

3. Результаты исследований

3.1. Бактериальная загрязненность молока в хозяйствах Саратовской области

Проведенные нами исследования в трех хозяйствах Саратовской области показали, что из 70 обследованных проб молока бактериальная обсемененность выявлена в 100% случаев. Наибольшее количество видов микроорганизмов обнаружено в пробах молока совхоза "Энгельсский" Энгельсского района. Молоко в этом хозяйстве получают с помощью доильной установки ДСК-200. Несмотря на замкнутость системы, которая казалось бы, должна ограничивать доступ микрофлоры в молоко из воздушной сферы, тем не менее количество видов и численность бактерий в среднем составила 8,6' 106 м. к./мл, а максимальное число выделенных микроорганизмов достигало 25 млн. м. к. По-видимому, интенсивное обсеменение молока микроорганизмами происходило в результате недостаточно

промытого и продезинфицированного оборудования, контактируя с которым свежевыдоенное молоко существенно обсеменялось смывами осадков в доильных машинах, трубопроводах и резервуарах.

В совхозе "Новый" Энгельсского района, где доение проводилось с помощью доильных аппаратов и молоко сливалось в бидоны, на бактериальную обсемененность было обследовано 28 проб и во всех содержалось от 104 до 20-Ю6 м. к. в 1 мл.

В пробах молока, взятых вначале (7.12.95 г) стойлового периода содержания животных, выявлено от двух до семи видов бактерий, концентрация которых колебалась от 10® до 14-Ю6 м. к. В январе и марте видовой состав микроорганизмов увеличился до 11-ти, а максимальная концентрация бактерий достигла 20-10® м. к.. Увеличение видов, как правило, происходило за счет молочно-кислых, психрот-рофных, гнилостных и других микроорганизмов. Источником обогащения молока различными видами бактерий, по-видимому служили корма, состав которых хотя и не отличался разнообразием, но обилие силоса и сена различного качества, естественно, способствовали загрязнению продукта. Высокая концентрация аммиака в воздухе свидетельствовала также об активных процессах по разложению микроорганизмами органических веществ, скапливающихся в различных нишах коммуникационных систем. Поэтому возможность контаминации молока микроорганизмами различного происхождения присутствовала постоянно.

В индивидуальном (фермерском) хозяйстве, в котором содержалось восемь дойных коров и две нетели, пробы молока также брались в стойловой период. В ноябре из молока выделялись четыре вида бактерий, но некоторые пробы содержали лишь два вида стафилококков (St. aureus, St. epidermidis), причем концентрация их в пробе порой не превышала 5-104 м. к. в 1 мл. Пробы молока, взятые от других особей коров,-оказались более насыщены видами бактерий и их количеством, достигающим 9-106 м. к./мл.

В более поздние сроки (январь) и особенно в феврале разнообразие видов микроорганизмов в молоке существенно увеличилось. К трем основным видам (St. aureus, St. epidermidis, E. coli) добавились Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Aspergillus sp. и др. Всего же из 70 проб молока, взятых в трех хозяйствах Саратовской области выделено 267 культур микроорганизмов, относящихся к семи родам бактерий, одному роду грибов и двум родам дрожжей (табл.1).

Таблица 1

Структура аэробных видов микроорганизмов, выделенных из молока коров

№ Виды Получено культур

п.п.

абс. %

1 Escherichia coli 72 26,9

2 Staphylococcus epidermidis 65 24,3

3 St. aureus 41 15,3

4 Micrococcus Iuteus 30 12,2

5 M. roseus • 24 9,0

6 Pseudomonas fluorescens 6 2,2

7 Bacillus cereus 6 2,2

8 Вас. subtilis 5 1,8

9 Proteus vulgaris 4 1,5

10 Aspergillus sp. 4 ' 1,5

11 Saccharomyces sp. 3 1,1

12 Ktuyveromyces sp. 2 0,7

13 Lactobacillus bulgaricus 2 0,7

14 L. acidophilus 2 0,7

15 L. brevis 1 0,4

Итого: 267 100

Как видно из табл. 1, по частоте выделения доминировали Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, St. aureus и Micrococcus iuteus, которые представлены в 10% и более от всех полученных культур микроорганизмов. К субдоминантным (2-10%) видам отнесены; Micrococcusroseus, Pseudomonas fluorescens и Bacillus cereus. Остальные виды в структуре выявленной ассоциации микроорганизмов занимают подчиненное положение и выделялись редко.

Особенностью исследованной нами выборки проб молока в трех хозяйствах Саратовской области является отсутствие бактерий рода Streptococcus. Причины не выявленного роста этих бактерий на МПА намине выяснены. Однако установлена закономерность, свидетельствующая о том, что чем разнообразнее видовой состав, тем выше концентрация микроорганизмов на единицу объема молока. Вместе с тем определяющее значение по частоте встречаемости и интенсивности обсеменения молока имеют два вида бактерий: Escheric-

э

hia coli и Staphylococcus epidermidis.

Приведенные данные показывают, что оба эти вида не только являются фоновыми, но и составляют основу количественных показателей выявленных популяций бактерий. Это дает нам основание полагать, что Е. coli и кокковым формам бактерий принадлежит основная роль в снижении качества молока, получаемого в хозяйствах Саратовской области. Если учесть, что стафилококки обладают способностью вырабатывать энтеротоксины, гемотоксины, лейкоциди-ны, а также устойчивы к физическим и химическим факторам воздействия, то их опасность для здоровья человека становится значительной.

3.2. Серологическое исследование коров на бруцеллез

В 1993 г. было проведено исследование сывороток крови, взятых от 70 телят (возраст 6-12 месяцев) и 138 дойных коров, в благополучном по бруцеллезу учебном хозяйстве "Степное" Эн-гельсского района. Исследование проведено методом твердофазного иммуноферментного анализа. Реакция ставилась на выявление бруцеллезного антигена и наличие антител, поскольку молодняк был привит за 5 месяцев до исследования, а дойные коровы ревак-цинированы за 2 месяца до взятия крови.

Исследования показали, что бруцеллезный антиген выявлен в 9 (4,3%), а антитела в 100% случаев, причем титр антител колебался в пределах 1:100 до 1:1600. Наличие антител в указанных титрах свидетельствуют о выраженном иммунологическом ответе животных на вакцинацию, сохраняющим напряженность и присутствие иммуноглобулинов в значительно отдаленные сроки по сравнению с указанными сроками автором вакцины (Салмаков, 1966,1972). Вместе с тем, выявление девяти (4,3%) антигенов позволяет полагать о проникновении клеток бруцелл вакцинного штамма из мест аппликации в кровь животных. Нельзя, по-видимому, исключать и возможность инфицирования телят до первой их прививки, которая проводится (согласно инструкции) в 4-х месячном возрасте. Особенно настораживает выявленный достаточно высокий (1:100) титр антигена у дойных коров, способных выделять его с молоком. Поэтому, видимо, в настоящее время ведутся изыскания безвредных (убитых) вакцин для защиты животных от бруцеллеза (Лутфуллина, 1994).

Для уточнения способности коров выделять возбудителя бруцеллеза с молоком нами проведены исследования проб молока и сыворотки крови в неблагополучном по бруцеллезу совхозе "Новый"

Энгельсского района, где проводились все необходимые оздоровительные мероприятия.

Исследования проводились комплексно с использованием традиционных (КР, РСК) и новых (ТИФА, ПЦР) иммунологических методов. Результаты показали (табл. 2), что методом твердофазного им-муноферментного анализа выявлено 1,5% положительно реагирующих животных, в то время как в кольцевой реакции оказалось лишь три сомнительных результата, а при исследовании крови в реакции связывания комплемента антиген в сыворотке обнаружен у четырех животных. Использование полимеразно-цепной реакции для выявления бруцеллезного антигена в молоке коров подтвердили данные •ТИФА, что свидетельствует о высокой чувствительности этих методов для выявления указанного инфекционного агента в молоке.

Таблица 2

Результаты исследования коров в совхозе "Новый" Энгельсского района

Тесты Исследовано

сывороток крови проб молока

всего положительных всего положительных

КР - - 330 ±3

РСК 330 4 - -

ТИФА - - 330 5

ПЦР - - 50 5

3.3. Некоторые вопросы количественного определения размножения бактерий в молоке и их чувствительность к ATM Особенности экологии отдельных видов микроорганизмов, в частности,. такие его важнейшие показатели как рост, размножение и накопление популяций в закрытых системах механизированных доильных установок и в открытых емкостях при ручном доении заслуживают самого тщательного изучения. Но прежде чем перейти к таким исследованиям необходимо было изучить способность наиболее часто встречающихся в молоке аэробных видов бактерий в условиях, близких к'стандартному (+4°С) хранению молока.

Для этого были использованы выделенные нами культуры Stap-

hylococcus epidermidis и Escherichia coli, а также культура Listeria monocytogenes, полученная из мозга погибшего ягненка.

Исследования показали, что при засеве в стерильное молоко 100 м.к. бактерий динамика их размножения не имела существенных различий (рис.1). Однако виды, часто обнаруживаемые в молоке (St. epidermidis и Е. coli), сразу после внесения их в среду не испытывали влияния каких-либо сдерживающих факторов и в течение 3 ч. размножения численность St. epidirmidisдостигла 5-10е, а Е. coli - 8-Ю5 м.к. в 1 мл. Дальнейшие наблюдения через различные интервалы времени (6, 12, 24, 48 ч.) выявили нарастание микробных субпопуляций до 108 м.к. St. epidermidis и 4-Ю6 м.к. Е. coli (рис. 1, кривая 1,2). Естественно, что накопление такого количества бактерий сопровождалось интенсивным выделением продуктов их метаболизма, что приводило к быстрому сбраживанию молока. Молоко, в котором культивировалась монокультура St. epidermidis свернулось в течение 36 ч., а в опыте с монокультурой Е. coli оно свернулось на третьи сутки содержания в холодильнике, когда численность бактерий увеличилась в 100 тыс. раз и более.

Особый интерес представляют листерии. Экология этой бактерии достаточно хорошо изучена, поскольку она является опасным возбудителем зооантропонозного заболевания (Поманская, 1961; Ба-кулов, 1967; Бакулов и др., 1990; Гребенюк и др., 1972; Гершун, 1981; Васильев, Микишина, 1991). Характерной особенностью листерии является высокая приспосабливаемость к весьма разнообразным условиям обитания. В одних условиях они ведут себя как сапрофи-ты, в других - как явные паразиты (Чиров, 1984). О сапрофитном существовании листерии свидетельствуют данные выделения их из воды, почвы, силоса и других объектов, где они могут длительно сохраняться и даже размножаться, используя для своего питания имеющиеся в субстрате органические соединения (Поманская, 1962; Гершун, 1981). Паразитические черты микроба проявляются при обитании в организме человека и животных.

Важной особенностью листерии служит вертикальный механизм передачи возбудителя у позвоночных и беспозвоночных животных (Чиров, Озерова, 1996). Выяснилось, что агрессивное проявление болезни нередко провоцируется эндогенными факторами, в частности, беременностью, сопровождаясь абортами, гибелью, например, ягнят в первые дни жизни. По-видимому, в период ягнения в энзоотических очагах листериоза наблюдается интенсивное выделение

листерий с молоком больных овец, В связи с этим нами проведен опыт по длительности сохранения и размножения Listeria monocytogenes в молоке. Установлено, что при внесении 500 м.к. через 3 часа количество их сократилось до 10 м.к., а затем стало резко увеличиваться и в течение 5-ти суток достигло 6-106 м.к. в 1 мл (рис.1, кривая 3). Причем молоко при этом не сбраживалось, а подсыхало, что затрудняло дальнейший высев.

Из этих данных можно заключить, что молоко является прекрасной средой для культивирования всех трех испытанных видов бактерий и попадание их в молоко по причине эндогенных или экзогенных источников распространения, накопление популяций может приводить к негативным последствиям. В связи с этим нами проведены опыты по изучению антибактериального действия 100 мкл/мл ATM (соли аммония), на бактерий непосредственно в молоке (in vitro). Для сравнения эффективности действия использовали тетрациклин (ТЦ).

Опыты с листериями показали, что соли аммония в препарате ATM обладают высоким бактерицидным действием на L. monocytogenes, которые после совместного культивирования с ATM уже через 3 часа из молока не высевались (рис. 2, кривая 3). В пробирке же, где листерии культивировались совместно с тетрациклином такой активности препарата не наблюдалось. В первые 3 часа культивирования их количество снизилось до 10 м.к., а затем численность резко стала нарастать и через сутки достигла показателя 5-105 м.к. в 1 мл, но на вторые сутки высевалось не больше десятка микробных листерий (рис. 2, кривая 2).

В контроле (рис 2, кривая 1) накопление субпопуляций микроба происходило в течение всего срока наблюдений (5 суток). Это свидетельствует о том, что патогенный штамм листерий оказался очень чувствительным к ATM и менее чувствительным к тетрациклину. Бак-териостатическое действие тетрациклина на листерий в молоке проявлялось лишь на вторые сутки совместного культивирования. Очевидно, что даже при концентрации 100 мкг/мл тетрациклина, требуется время для подавления синтеза белка на уровне рибосом микробной клетки.

При изучении антибактериального действия указанных препаратов на Е. coli установлено, что при внесении в молоко 100 мкг/мл тетрациклина и 100-300 м.к. бактерий, первые 3 часа наблюдалось интенсивное размножение микробов, количество которых увеличи-

ir

3

Э1' 5 С о ъс

а 1

7 б • 5 • 4 3

2 -I

12 24 4S

Время.час

72

120

Рис. 1. Размножение монокультур бактерий в молоке

1 - Staphylococcus epidermidis; 2 - Escherichia coli; 3 - Listeria monocytogenes

6 12 24

Время.час

72 120

Рис. 2. Бактериостатическое действие препаратов на

листерии в молоке: 1 - L. monocytogenes (контроль); 2 - L. monocytogenes + ТЦ; 3 - L. monocytogenes + ATM

6 12 24 46 Бремя.час

Рис. 3. Бактериостатическое действие препаратов на Е. coli в молоке: 1 - Е. coli (контроль); 2 - Е. coli + ТЦ; 3 - Е. coli + ATM

Б 24

Время, час

Рис. 4. Антибактериальное влияние ATM

1 - Escherichia coli; 2 - Staphylococcus epidermidis; 3 - Listeria monocytogenes

лось в 5 тыс.раз. Но в последующие периоды исследования (6, 12, 24, 48ч) размножения Е. coli не наблюдалось и даже отмечался спад численности бактерий (рис. 3, кривая 2). Однако показатели численности субпопуляций этого вида бактерий оставались высокими в течение всего срока наблюдений. По-видимому, доза 100 мкг/ мл тетрациклина оказалась недостаточной, поскольку минимальной подавляющей концентрацией для Е. coli является доза в 200- 300 мкг/мл (Ласкин, 1969).

Антибактериальное действие ATM на Е. coli оказалось более эффективным. Внесение в молоко 100 мкл/мл препарата и 100 м.к. бактерий так же как и в опыте с тетрациклином не сдерживало размножения бактерий в первые шесть часов инкубирования при температуре +4°С, но через 12 ч отмечалось интенсивное бактерицидное действие ATM на Е. coli (рис.3, кривая 3), Посевы молока через 24 и 48 ч не выявили роста бактерий на питательных средах (МПА), что свидетельствует о гибели всей субпопуляции микроорганизмов. Механизм действия ATM на бактерии еще не изучен, но одним из вероятных свойств препарата служит поверхностное обволакивание клеток с образованием пленки, препятствующей обменным процессам (Попова и др., 1966).

В аналогичном опыте с культурой Staphylococcus epidermidis тетрациклин и ATM антибактериального действия на микробов практически не оказывали. Динамика размножения бактерий, культивируемых с препаратами, почти соответствовали с таковой в контроле. Если сравнивать действие ATM на листерий, эшерихии и белый стафилококк, то последний оказался наиболее устойчивым к препарату (рис.4, кривая 2). Объяснить это можно характерным свойством склеивания стафилококка в субкультурах. Возможно, что данная биологическая особенность и служит меньшей уязвимости стафилококков к воздействию не только ATM, но и тетрациклина.

Таким образом, изучение особенностей размножения Е. coli, L. monocytogenes и St. epidermidis в стерильном коровьем молоке показало совершенно определенную динамику увеличения численности субпопуляций бактерий в течение всего срока наблюдений. Причем, отдельно засеянные в молоко виды микроорганизмов интенсивно размножались и сохраняли высокую (5-Ю6 - 108 м.к.) численность до сбраживания и полного истощения молока как источника их питания.

Исследование действия ATM на эти виды бактерий показало, что

препарат обладает избирательным действием. Более эффективное влияние он оказывал на палочковидные формы бактерий, не обладающих характерным свойством склеивания клеток (листерии, эшерихии). Стафилококки, обладающие этой биологической особенностью, как оказалось, менее поддаются воздействию ATM. Учитывая данную морфобиологическую особенность бактерий, использование ATM как моюще-дезинфицирующего средства должно проводиться направленно, с учетом выявленных ассоциаций микробов. 3.4. Изучение качественного определения чувствительности бактерий к ATM

Активность ATM определяли методом диффузии в агаре. Его чувствительность сравнивали с подавляющим действием тетрациклина (ТЦ). Установлено, что разведение солей аммония 1:10 оказывало выраженное литическое воздействие на листерий, при этом диаметр зоны подавления роста бактерий составил более 25 мм, а тетрациклина - лишь 12 мм.

Достаточно чувствительной к ATM оказалась Е. coli, зона подавления роста которой была около 25 мм, причем заметное угнетение роста препарат вызывал и при малых концентрациях.

В аналогичном опыте со St. epidermidis подавляющего воздействия ATM на бактерий не выявлено как при малых (разведение 1:1000), так и при больших (1:10) концентрациях препарата. Зона светлой задержки роста на «газоне» исследуемой бактериальной культуры составляла не более 5 и 10 мм, тогда как воздействие тетрациклина оказалось более эффективным (12-15 мм).

Проведенные исследования по определению спектра действия ATM на грамположительные (листерии, стафилококки) и грамотри-цательные (кишечная палочка) виды бактерий в условиях диффузионной активности препаратов на агаре, как оказалось, не противоречат данным, полученным нами в опытах количественного определения бактерий в молоке. Вместе с тем определение антибактериальной активности ATM методом диффузии в агаре на чашках Петри свидетельствуют о том, что препарат обладает не только обволакивающим, но и положительным химиотаксисом, способным диффундировать в агаровом геле. Поэтому он обладает бактерицидным действием и может быть использован как химическое моюще-де-зинфицирующее вещество поверхностно-активного действия.

выводы

1. В 1993 - 1995 гг. прослежено ухудшение санитарного качества молока коров в некоторых хозяйствах Саратовской области. Выявлена высокая его загрязненность различными аэробными микроорганизмами.

2. Впервые для Саратовской области в свежевыдоенном молоке установлена ассоциация аэробных микроорганизмов, состоящая из 16 видов, относящихся к семи родам бактерий, одному роду грибов и двум родам дрожжей.

3. Установлено, что по частоте выделения доминировали Escherichia coli (26,9%), Staphylococcus epidermidis (24,3%), St. aureus (15,3%), Micrococcus luteus (11,2%). К субдоминантным (2-10%) отнесены три вида . Остальные виды в структуре выявленной ассоциации микроорганизмов занимали подчиненное положение и выделялись редко (0,4-1,9%),

4. На фоне высокого размаха количественных (10® - 25- 10s м.к.) показателей микроорганизмов на единицу объема (1,0 мл) молока выявлена закономерность, свидетельствующая о корреляции увеличения разнообразия видового состава с повышением концентрации микробов.

5. Комплексное использование традиционных (КР, РСК) и новых иммунологических (ТИФА, ПЦР) методов позволило выявить бруцеллезный антиген в молоке коров после проведения всех оздоровительных мер в хозяйстве. Установлена высокая чувствительность ТИФА и ПЦР по сравнению с КР и РСК.

6. В эксперименте изучены особенности экологии St. epidermidis, Е. coli и L. monocytogenes, в частности, рост, размножение и накопление их численности в молоке. Установлены показатели динамики размножения этих видов бактерий в условиях, близких к стандартному (+4°С) хранению продукта. Показано, что молоко является прекрасной средой для культивирования всех трех испытанных видов бактерий, попадание которых из эндо- и экзогенных источников распространения приводит к негативным последствиям.

7. Испытано антибиотическое действие тетрациклина (ТЦ) и соли аммония (ATM) на St. epidermidis, Е. coli, L. monocytogenes в молоке (in vitro). Выявлено бактерицидное действие ATM на L. monocytogenes, и Е. coli, в то время как ТЦ оказывал лишь некоторое бактериостатическое влияние. На St. epidermidis оба препарата антибактериального действия не оказывали.

8. Предполагается, что вероятным механизмом действия ATM на бактерий служит поверхностное обволакивание клеток с образованием пленки, препятствующей обменным процессам. Вместе с тем, определение активности ATM методом диффузии в агаре, доказано, что препарат обладает положительным химиотаксисом, способным диффундировать в агаровом геле и оказывать лити-ческое действие на бактерий.

9. Разработаны и внедрены предложения (инфор. листок N 15- 96) по применению препарата ATM как моюще-дезинфицирующего средства.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Выявление бруцеллезных антител и антигена с помощью иммуно-ферментного анализа// Резервы увеличения производства и повышения качества сельскохозяйственной продукции: Тез. докл. XIII регион, научн.-практ. конференции. - Оренбург, 1994. - С. 352353 (Соавт.: Т.А. Полунина)

2. К вопросу о диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота // Материалы научно-производственной конференции профессорско-преподавательского состава, аспирантов, стажеров и студентов Саратовской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии, - Саратов, 1995. - С. 63 (Соавт.: П.А. Чиров)

3. Экологические предпосылки накопления бактерий в молоке // Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Мат. междунар. науч.-производ. кон-фер. - М., 1995. - С. 27 (Соавт.: П.А. Чиров)

4. Выявление возбудителя бруцеллеза в молоке // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тез. докладов международ, конф.- Саратов, 1996. - С. 294 (Соавт.: П.А. Чиров)

5. Применение препарата ATM как моюще-дезинфицирующего средства: Информ. листок № 15-96. - Саратов, 1996. - 3 с. (Соавт..: С.П. Убираев, П.А. Чиров)

6. Обсемененность молока ассоциацией аэробных микроорганизмов в хозяйствах Саратовской области //Сб.: Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных. - Воронеж, 1997. - (Сдана в печать).