Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ В ПЕРВИЧНОМ КАЛЛУСЕ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ В ПЕРВИЧНОМ КАЛЛУСЕ"

А-2 №3

На правах рукописи

КАРЛОВ Геннадий Ильич

I

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФИТОРЕГУЛЯТОРОВ В ПЕРВИЧНОМ КАЛЛУСЕ

Специальность 03.00.23,— биотехнология

г

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

►

МОСКВА 1997

' '.'{' /

о

/

' / /

ч <-

.сл.^

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К А Тимирязева

Научный руководитель'—доктор биологических наук, профессор Л. И. Хрусталева.

Официальные оппоненты доктор биологических наук 3. Б. Шамина; кандидат биологических наук С. В. Иванова.

Ведущее учреждение — НИН сельскохозяйственной биотехнологии

Защита состоится . * < ' / ' ^/ . . 1997 г.

'С. <~

в часов на заседании диссертационного совета

Д 120 35 07 в Московской сельскоко шиственной академии имени К А Тимирязева.

Адрес 127550, г. Москва, ул Тимирязевская, 49 Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной на-\?чной библиотеке ТСХА

Автореферат разослан ' : . '1997 г

Ученый секретарь диссертационного совета — »

кандидат наук о' ?>-'</ А. С. Лосева

( / и/, < " >

"Перестав быт спорной, мысль перестает быть интересной" У. Хэзлитт

Актуальность проблемы. Особое место среди индукторов нестабильности генома в культуре In vitro отводится фитогор-монам (D*Amato, 1985). Цитогенетическая вариабельность в культуре, а именно возникновение миксоплоидных популяций происходит из-за полисоматии исходного экепланта и нарушения механизма деления клеток (Шамина, 1988). которые в свою очередь могут регулироваться фиторегулятЪрами, Почти ничего неизвестно о цитофизиологическом и цитогенетическом действи фитогормонов в клетках экепланта в момент их дедифференци-ровки.

Способность фиторегуляторов при их экзогенном внесении в концентрациях выше физиологических вызывать структурные на-! рушения хромосом показана многими исследователями (Сварниц-кая. Гаврилова.19?6. Араратян.1981, Ервандян.1987). При изучении цитогенетических эффектов фиторегуляторов в низких физиологических концентрациях традиционным методом анафаз-но-метафазного анализа аберраций хромосом не выявлено их мутагенного действия (Араратян.1981). Однако появились отдельные сообщения о том. что компоненты питательной среды in vitro способны увеличивать частоту сестринских хроматидных обменов (СХО) (Li.Zhang,1990.PiJpacker.Ferwerda, 1994). Пока нет единого мнения о механизмах формирования СХО. Тем не менее доказано, что частота сестринских хроматидных обменов является очень чувствительным показателей для определения потенциальных повреждений ДНК, вызываемых химическими мутагенами. по сравнению с оценкой геномных и хромосомных мутаций (Tice et al..1984). Оценка цитогенетических эффектов фиторегуляторов методом СХО до настоящего времени не проводилась. •

Учитывая важную роль фиторегуляторов .. функционировании генома, можно ожидать, что даже незначительные колебания концентрации и соотношения гормонов в питательной среде могут привести к структурно-функциональным изменениям в наследственном аппарате клетки. Наличие геномных и хромосомных нарушений затрудняет использование тканей или клеточных сис-

тем для генетичеа' эй Tpa5^ej№wí®pffi^5rp7T492. McElroy. Ja-

cobsen. 1995). Иф^йАйНфШ^Ш^едгё Мвск. • академии

и*:. Л, А

Мне. Na/fc

которые обеспе-

чивагат стабильность генома составляет неогьемлимую и важную часть в клеточной и генетической инженерии растении и является залогов сохранения экспрессии в геноме реципиента встроенной ДНК.

Цеди и задачи Целями данной работы являлось установить какие изменения вызывают фиторегуляторы в кинетике клеточного цикла и структуре хромосом на ранних этапАх дедиф^ренаи-ровки клеток океяганта, а также роль фиторегуляторов в нестабильности экспрессии генов в растениях-регенерантах, полученных после культквировс .ия in vitro каллусов трансгенных растении.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Отработагь метод учета СХО и изучить цитогенетичес-кую активность фиторегуляторов в низких физиологически активных концентрациях в модельном тесте - клетки корневой меристемы лчменя.

2. Изучить влияние фиторегуляторов на частоту СХО в первичном каллусе ячменя

3. Установить влияние фиторегуляторов на продолжительность клеточного цикла и кинетику его прохождения в корневой меристеме ячменя.

4. Определить динамику полиплоидизации клеток в первичном каллусе в зависимости от плоидности, генотипа экспланта. а также концентрации и соотношения гормоной в питательной среде

5. Провести сравнительный анализ экспрессии трансгена (GUS) у растений регенерантов, полученных из каллусов трансгенного табака, культивируемых на питательной среде содержа-шей различные фиторегуляторы.

Научная новизна работы Изучена роль фиторегуляторов в в индукции нестабильности генома на ранних этапах дедиффе-ренцировки клеток в культуре In vitro.

Впервые показано, что фиторегуляторы являются индукторами сестринских хроматидных обменов в первичном каллусе и клетках корневой меристемы растений на примере ячменя.

Показана важность баланса фиторегуляторов в индукции СХО в первичном каллусе ячменя.

Установлено, что фиторегуляторы влияют на продолжительность клеточного цикла и кинетику его прохождения.

Установлена зависимость степени полиплоидизации в первичном каллусе люцерны от генотипа, уровня плоидности и по-лисоматии исходного экспланта.

Впервые проведен анализ экспрессии трансгена (GUS) у растений регенерантов. полученных из каллусов трансгенного табака, культивируемых на питательной среде содержащей различные фиторегуляторы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выполнение указанных задач позволило установить роль фиторегуля-торов в индукции нестабильности генома в культуре in vitro.

Результаты могут послужить для- оптимизации процессов трансгеноза. широко используемого в настоящее время для решения . разного рода практических и теоретических задач биотехнологии.

Метод сестринских хроматидных обменов может быть использован как чувствительный тест для оценки цитогенетичес-ких эффектов компонентов питательных сред для культуры In vitro. ,

Предлагается при выполнении трансгеноза и дальнейшем культивировании in vitro трансгенных клеток избегать исполь-вования 2,4-Д в питательных средах.

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста и содержит_ тгДдиц,

, рисунков и включает_ литературных источника.

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на пленарном заседании секции "Экспрессия генома" ежегодного ' симпозиума общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пущино.1995), в институте ботаники Венского университета (Вена. Австрия.1992), на кафедре генетики Гронингенского университета (Гронинген, Нидерланды, 1991), в институте селекции и репродукции с/х растений CPRO-DLO (Вагенинген, Нидерланды. 1996). на кафедре генетики Сельскохозяйственного университета г.Вагенингена (Нидерланды, 1997), на международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва. 1995). на международном симпозиуме "In situ conservation" (Анталкя. Турция. 1996), на еже-

годных конференциях молодых ученых ТСХА (Москва, 1994,1995), а так же на ежегодной научной конференции ТСХА (Москва, 1995)

Благодарности. Автор выражает сердечную признательность своему научному руководителю проф. Л.И.Хрусталевой за внимание и неоценимую помоиь при постановке и обсуждении экспериментов , зав кафедрой с/х биотехнологии В.С.Шевелухе, старшему научному сотруднику Г.Н. Андреевой, Г.М.Артамоновой и другим сотрудникам кафедры ja поддержку при выполнении работы. Автор благодарит Б.В. Маэина и А.А.Шаденкова за любезно предоставленный материал.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

Обоснование выбора обьекта исследований При выборе культур для экспериментов руководствовались удобством использования данной культуры для изучения тех или иных онтогенетических эффектов фиторегуляторов. Так в опытах по анализу влияния фиторегуляторов на уровень СХО целесообразно было использовать объект (культуру) с крупными хромосомами и небольшим их числом, а так же с отработанной технологией получения первичного каллуса на данном объекте. Этим требованиям более всего подходил ячмень, у которого число хромосом 2п=14 и их размер варьирует в районе 5-12 мкм. Для этого обьекта хорошо отработана технология получения первичного каллуса в присутствии различных концентрации 2 4-д, 6-БАП и сахарозы.

В случае сравнительного изучения 2,4-Д и ИУК на процессы, происходящие в первичном каллусе, а так же их влияния на инактивацию трансгена в растениях регенерантах целесообразно было использовать табак, для которого хорошо отработана система регенерации растений после длительного культивирования In vitro, а так же имеется целый ряд трансгенных растений.

Для экспериментов по выявлению факторов влияющих на степень полисоматии исходного экспланта нами была использована люцерна, для которой получены ряд линий с различным генотипом и уровнем плоидности.

В работе использовали следующие фиторегуляторы; 2.4-Д

(Serva, D 8407), ИУК (Serva. 1 2886), кинетин (К 0753). зеа-ТИН (Z 0876) и 6-ЕАП (В 9395).

Дифференциальное окрашивание сестринских хроматид проводили после инкубации материала в растворе BrdC (10 мг/л) по методу флюоресценция плюс Гимза (Perry,1973). с некоторыми модификациями.

Культуру первичного каллуса люцерны получали на среде Гамборга В5 с добавлением 250 мг/л NH4NO3. 8 мг/л 2,4-Д, 8 мг/л кинетина, 1 мг/л НУК -

Первичный каллус ячменя индуцировали иа незрелых зародышей на среде Гамборга В5 с добавлением следующих вариантов фиторегуляторов и сахарозы: 1.30 г/л сахароза, 2. 45 г/л сахароза, 3. 1мг/л 2.4-Д+Э0 г/л сахароза," 4. 2мг/л 2,4-Д +30 г/л сахароза, 5. 2мг/л 2,4-Д + 45 г/л сахароза, 6. 2мг/л 2,4-Д +0,5 мг/л 6-БАП + 45 г/л сахароза

Измерение продолжительности клеточного цикла проводили кофеиновым методом (Gimenez-Martin et al.. 1965).

Денситометрию проводили на постоянных давленных препаратах, окрашенных по Фельгену (холодный гидролиз) на микроскопе Ахlophot под маслинной иммерсией при увеличении 100x2.0. при' длине волны 520 км, с использованием системы анализа изображений ИБАС-2000, по специально написанной программе. О количестве ДНК в ядре судили по оптической плотности, выраженной в условных единицах 1.0.D. В зависимости от эксперимента в каждом варианте измеряли I.O.D. 200-500 ядер не менее чем от трех образцов.

Митотический индекс считали на давленных препаратах. Для каждого срока фиксации подсчитывали 1500-3000 клеток.

Культуру каллусов табака получали на среде Мураси-ге-Скуга в присутствии 30 г/л сахарозы и фиторегуляторов в двух сочетаниях: 1.2мг/л ИУК+0,2 мг/л кинетин; 2. 2мг/л 2,4-Д+0,2 мг/л кинетин. После четырех субкультивирований каллус переносился на среду для регенерации побегов.

Наличие или отсутствие экспрессии тс. лсгена (GUS) в растениях регенерантах определяли модифицированным нами методом по Jefferson (1987).

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами, а также с использованием программ математического обеспечения ИБАС-2000 - Class! и Class 2

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Влияние фиторегуляторов на частоту сестринских хро-матидных обменов (СХО) в корневой меристеме ячменя.

Метод выявления сестринских хроматид основан на инкорпорации Вгс!С в молекулу ДНК в течение двух циклов репликации. Необходимым условием проведения эксперимента является подбор оптимальной концентрации ВпЗС и времени прохождения двух циклов репликации.

Опыты были проведены на двухдневных проростках семян ярового ячменя Зазерскии 85. Наиболее подходящим временем инкубации оказалось 24 часа. Как видно из табл.1 наиболее оптимальной концентрацией оказалось 15 мг/д. В дальнейшем эта концентрация испольвовалась во всех вариантах экспериментов для подсчета СХО.

После двух циклов репликации в присутствии ВгсЗС и фито-регуляторов, было получено четкое дифференциальное окрашивание по методу ПЗР (Флюоресценция плюс Гимза). Подсчет частоты СХО был проведен в расчете на хромосому.

Таблица 1

Степень выявления сестринских хроматид в корневой меристеме ячменя в зависимости от концентрации ВпЗС в инкубационном растворе

Концентрация Вг<1С (кг/л) / Степень выявления сестринских хроматид

2.5 Не выявляются

5.0 Не выявляются

10 Слабо

15 Четкое

20 • Четкое

. - ■ ■ . •

В контроле ( при инкубации проростков в присутствии только ВгсЮ) частота сестринских хроматидных обменов колебалась в пределе 0.37 на хромосому и практически не зависела от времени постановки эксперимента (Рис. 1,2). Максимальное количество СХО не превышало 3.обменов на хромосому.

Луксини. В присутствии ауксинов (ИУК и 2,4-Д) при увеличении концентрации с 0.5 мг/л до 5 мг/л частота СХО значительно увеличивалась (Рис. 1). Так если при наименьшей концентрации ауксинов эта цифра незначительно превышаяа контрольную, то при наивысшей эти значения более чем в два-три раза превышали контроль. Наибольший эффект увеличения частоты СХО обнаружен для 2,4-Д. Интересно отметить, что для выявления сестринских хроматид в присутствии ауксинов при концентрации более чем 2мг/л, время инкубации приходилось увеличивать с 24 часов до 30, что свидетельствовало о задержке клеточного цикла ауксинами.

Цитокинины. Из изученных цитокининов наибольшее влияние на частоту СХО оказывали зеатин и кинетин (Рис. 2). Значительное повышение СХО отмечается, начиная с концентрации 1 мг/л. При этом наблюдается четкий доза-зависимый эффект. Для выявления сестринских хроматид в присутствии зеатина и кине-тина в концентрации 5 мг/л, так же как и в случае с ауксинами, время инкубации проростков приходилось увеличивать. Для 6-БАП картина изменения частоты СХО с увеличением концентрации была иной. Не наблюдалось доза-зависимого эффекта. Так максимальный уровень СХО отмечен при концентрации 1 мг/л. Дальнейшее повышение концентрации 6-БАП до 5 мг/л приводило к снижению уровня СХО до значения близкого к контрольному.

Итак, проведенные нами исследования в модельной тест-системе показали, что фиторегуляторы значительно повышают частоту сестринских, хроматидных обменов в корневой меристеме ячменя. При этом наиболее сильным индуктором СХО является 2,4-Д, который в концентрации 5 мг/л, более чем в три раза увеличчвает частоту СХО по сравнению с контролем.

' 2. Влияние компонентов,питательной среди на частоту СХО в первичном каллусе ячменя.

В экспериментах на корневой меристеме ячменя тест на индукцию СХО фиторегуляторами дал -положительный результат.

Рис.1 Влияние ауксинов на частоту СХО I корневой меристеме ячменя сорта Зазерскии ВЬ

С X О

н а

12

оэ

ое

х Р о м с о

м 04

02

К-

/ 11 1 11| 11111) 11)11( 1IIIII111II 111111111111+и+и

Концентрация, мг/л

— Контроль -+- 2,4-Д -*- ИУК

Рис.2 Влияние цигокининов на частоту СХО в корневой меристеме ячменя сорта Зазерский 85

Концентрация., иг/л -*- Контроль -4- Кинетин -*■ Зеатин -в- 6-БАП

поэтому мы ис полью вали его для оценки роли компонентов питательной среды в повышении нестабильности генома In vitro. При культивировании 15 дневных зародышей на питательной среде без фиторегуляторов частота СХО была невысокой 0.30-0,33 в расчете на хромосому (Табл. 2). Эта цифра была несколько меньше, чем в случае с корневой меристемой. При повышении количества сахарозы в питательной среде с 30 г/л до 45 г/л уровень СХО практически не изменялся. Введение в среду синтетического аналога ауксина - 2,4-Д, значительно повышало частоту СХО. При этом повышение концентрации 2,4-Д с 1 мг/л до 2 мг/л приводило к увеличению частоты СХО с 0,51 до 0,67 в расчете на хромосому. Увеличение концентрации сахарозы при неизменном уровне 2,4-Д ье меняло уровень сестринских хроматидных обменов. Однако, добавление в питательную среду б-БАЛ приводило к значительному снижению количества СХО до уровня 0,47 в расчете на хромосому. Эти данные могут свидетельствовать в пользу предположения о важности баланса фиторегуляторов в стабильности генома.

Таблица 2

Влияние компонентов питательной среды Гамборга Bs на частоту СХО в культуре первичного каллуса ячменя сорта Зазерский РЧ

Компоненты питательной среды Частота СХО td

30 г/л сахароза 0,30 í 0,03 —

45 г"/л сахароза 0,33 ± 0,03 0,71

1 мг/л 2,4-Д + 30 г/л сахароза 0,51 ±. 0,04 4.20*

2 мг/л 2,4-Д + 30 г/л сахароза 0,67 ± 0,05 5.31*

2 мг/л 2,4-Д + 45 г/л сахароза 0,64 ± 0,05 4.63*

2 мг/л 2,4-Д +■ 0.5 мг/л б-БАП + 0.47 ± 0.04 3,40"

45 г/л сахароза

* - статистически достоверная разница (td > 1,96)

, Рис.3 Влияние 2,4-Д (2 «г/л) на распределение клеток по фааам клеточного цикла в корневой меристеме ячменя сорта Заэерский 85

Контроль 2.4-Д

Таблица 3

Влияние фитогормонов и их синтетических аналогов (2мг/л) на продолжительность клеточного цикла в корневой меристеме ячменя сорта Зазерский 35

Вариант' Средняя продолжительность клеточного цикла

Контроль (НгО) 12.0

2.4-Д 14.5

ИУК 14.0

Кинетин 13.0

Зеатин 14,0

6-БАЛ 10,5

Таким образом, из протест, рсвлньых компонентов питательной среды наиболее Еыра^еньым чффрктом оохагчпа ?, Л - Д, однако при добавлении в питательную ср r.v с/нт-'т," емкого аьаяога ш-токинина - 6-БАП частота СлО снизсу »сь

3. Фиторегудяторы и клеточный цикл.

3.1. Продолжительность и кинетика клеточного цикла. Механизм образован/? 0X0 связан с Еозникновен/ам одюаепечечных разрывов ДНК, которые могут приводить к задержке клеток в

5-фаое и &г-фа^е, что в конечном итоге колет уведшей*® клеточного цикла Б данной серии ^ксгериментов мы установил.: влияние экзогенных Флторегуляторов на гродслллтелььость клетсчьо-го цикла и динамику его грохеждения Чс.ми бьли испытаны 2,4-Д, ИУК, зеатин, кинетин и б-БЛП в копдеьт^чции 2 мг/д. Бее Фиторегудяторы вызывал/ изменение продолжительности клетсчього цикла ( Табл 3) Наиболее силъньи эффект оказывал 2,4-Д. Этот синтетический аналог ауксина увеличивал продолжительность клеточного цикла на 2,5 часа по сравнении с контролем. ИУК '< зеатин увеличивали продолжительность на С часа, а юшетин всего на 1 час. Интересно отметить, что ла,!меньший индуктор СХО,

6-БАП, ускорял прохождение клеток по клеточному циклу.

Для того чтобы выяснить на какой именно фазе фиторегуля-торы вызывают задержку клеточного цикла нами была проведена денситометрия ядерной ДНК через 12 и 24 часа при совмесг -ои инкубаш-л проростков с фиторегуляторами в концентрации 2 мг/л. 2,4-Д, »1УК, зеатин и кинетин вызывали увеличение продолжительности 5-Фазы и задержку клеток на рубеже G2/M. При этом наиболее выраженным эффектом обладал 2.4-Д (Рис. 3). 6-БАП практически не менял динамику прохождения клеточного цикла по сравнению с контролем.

Эти данные по замедления клеточного цикла хорошо укладываются в гредлагаемую на сегодня модель образования СХО, которая построена на основе функционально,! организации единицы репликации ДНК (Schubert, 1S30}.

3.2. Полисоматия в первичном каллусе. Наиболее распространенным типом геномных нарушении в культуре первичного каллуса является полиплоидия, которая чаще всрго возникает в результате эндоредупликации, связанной с нарушением клеточного цикла. Установленная способность Фиторегудяторов влиять на

Рис.4 Ми готический индекс (М.И.) в первичном каллусе табака при культивировании яа 2,4-Д и ХУК содержащей средах

Дни культивирован«я

—в— ИУК -О— 2,4-Д

Таблица 4

Числа хромосом в делящихся клетках первичного каллуса тасака на 5-й день от начала индукции.

Вариант опыта.- Просмотрено метафаз Число хромосом на клетку Количество метафаз, X

24 48 96 >96 .

ИУК+кин. 48 10.5 . 83,3 6,3 -

2.4-0+кин. 38 5,3 86,8 5,3 2,6

Таблица 5

Процент полиплоидных клеток при культивировании незрелых зародышей ячменя сорта Зазерский 85

Компоненты питательной среды Процент полиплоидных клеток

0 день 3 день 13 день

2 мг/л 2,4-Д 2,6 7,8 12.2

2 мг/л 2.4-Д+ 0,5 мг/л 6-БАП 2.6 4.6 6.9

Б-Фазу и выход клеток в митоз, послужило основанием для проведения серии экспериментов, где мы попытались установить зависит ли степень полиплоидизации клеток от используемого Фиторе-гулятора и как влияет на этот показатель происхождение исходного экспланта, плоидность , генотип и вид вводимой ку-гьтуры. Были использованы представители двудольных и однодольных: лч-мень, табак и люцерна. Среди изученных видов наиболее высокий уровень полисоматии в исходных эксплантах был у лгчерны, количество полиплоидных клеток превышало (>0~ (Табл 6). Тканевое происхождение экспланта практически не влияло на процент полиплоидных клеток. Экспланты из листовых пластин и междоузлий по числу полиплоидных клеток практлч^.си не отличалось внутри каждой Формы. Резко отличалась от остальных Форм сравнительно низким уровнем полиплоидных клеток в исходьом экспланте диплоидная Форма Д-16. Это дает основание предположить. что- степень полиплоидии исходного экспланта контролируется генотипом.

Небольшое количество полиплоидных клеток было выявлено в незрелом зародыше ячменя - > 32 (Табл.5). В листовых пластинках табака полиплоидных клеток не обнаружено.

Для сравнительного изучения действия ИУК и 2,4-Д на процессы. происходящие в первичном каллусе, мы использовали пробирочную культуру растений табака. Более сильным инду тором пролиферации по сравнению с ИУК, оказалась 2,4-Д (рис.4). Эти данные хорошо коррелировали с результатами денсптометрии ядерной ДНК. Уже на третии день бользая часть клеток экспланта находилась в Б-Фазе. В процессе культивирования возникали лол.ш-лоидные клетки, что подтверждено денситометриеи ядерной ДНК и подсчетом чисел хромосом на 5-й день культивирования (Табл.4). В конце пассажа (31 день) уровень полисоматии был примерно одинаков для 2.4-Д и ИУК содержащей среды.

При культивировании незрелых зародышей ячменя на питательной среде с 2,4-Д (2 мг/л) количество полиплоидных Iклеток увеличивалось (табл.5 ). Ухе на третии день их количество повышалось до 8Х. При добавлении в питательную среду 6-БАП (0,5 мг/л).тенденция увеличения количества полиплоидных клеток была менее выраженной, по с равнению с первичным каллусом культивируемом только на 2,4-Д содержащей среде.

Таблица С

Степень полипловдизации (%) при культивировании in vitro листовых пластинок и междоузлий у различных генотипов люцерны.

Полиплоидные интерфазные ядра (X)

Гено- Уровень

тип плоид-

ности

Д-16 2х

Г-13 2х

Г-12 2х

Д-32 4х

Д-16 2х

Г-13 2х

Г-12 2Х

Д-32 4Х

Дни

культивирования 10

15

Листовая пластинка

23*3,7 64*4, ,3 65*4,3 64*4,3

56Ы.4 59±4, ,4 6U4.4 65±.4,4

58±4,4 59*4, ,4 ' 58*4,4 58±4,4

62±4,3 61*4, ,4 55±4,4 37±4,4

Междоузлие

29*4,0 57*4, ,4 64*4,3 72±4,0

44±4,8 57i4, ,4 62*4,3 72*4,0

65t4,3 69±4, ,1 64*4,3 62±4,3

55±4,4 5614, ,4 5Ш,5 44±4,8

Темпы полиплоидизации в первичном каллусе люцерны зависели от уровня полиплоидных клеток в исходном экспланте. Самый низкий процент полиплоидии в 0 день был у Д-16. Однако в период с О по 3-й день наблюдается резкое увеличение процента полиплоидных клеток.

Исходя из результатов наших исследований можно заключить, что уровень полисоматии первичного каллуса зависит от вида вводимой культуры и соотношения фиторегуляторов в питательной среде. При снятии тканевого контроля в популяции клеток каллуса устанавливается оптимальный уровень плоидности. Для люцерны, вероятно, этим оптимальным уровнем является тет-раплоидный.

4. Влияние условий культивирования каишусов транстенного табака на потери экспрессии в растениях регенерантах.

• В данной работе мы использовали клон трансгенного табака у которого трансген (GUS) находился в гетерозиготном состоянии. Для этой цели были получены несколько линий трансгенного табака. В качестве вектора для трансформации использовали плазмиду рВ1 121, несущую репортерный ген GUS под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Из семенного потомства этих линий было отобрано и клонировано растение у которого трансген находился в гетерозиготном состоянии. При самоопылении у этого клона наблюдалось расщепление 3:1. От этого клона были получены каллусы на 2,4-Д и ИУК содержащих питательных средах. После 4 субкультивирований от

-IS-

Таблица 7

Влияние культивирования каллусов трансгенных растений на ИУК или 2,4-Д содержащей среде на эамолкание GuS-гена у регенерантов

Вариант Проанализировано растеч/1 регенерантов Из чих готерялл эксгр« село

CIT.

2,4-Д 4 л О»* 8 со

ИУК 144 « о 8.3

этих каллусов на среде д."я регенерации Сыто голучено более 200 растении регенерантов, которое анализировались на наличие экспрессии трансгена GUS Как видно из таблицы у части растении-регенерантов экспрессия трансгена отсутствс чла. Наиболее сильныи эффект на потерю экспрессии трансгена сказывало культивирование на ?,4-Д содержащей среде. У 28,8Z растений регенерантов GUS активность отсутствовала. Культивирование на ИУК содержащей среде приводило к потере экспрессии гена GUS лишь у 8.3Z рчстенин регенерантов.

Эти результаты хорошо коррелируют с данными получишь._и при оценке цитогеьетических эффектов 2,4-Д и ИУК, где было показано, что 2,4-Д являете? гораздо более сильным индуктором СХО по сравнению с ИУК.

ВЫВОДЫ

1. Разработан моделький тест на основе корневой меристемы я'¡меня для оценки онтогенетической активности флторегу-лятороь в физиологически активных концентрациях, используемых в культуре тканей In vitro.

2.Фиторегуляторы значительно повышают частоту сестринских хроматидных обменов (СХО) в корневой меристеуе ячменя. Сильным индуктором СХО является 2,4-Д, средними- ИУК. зеатин и кинетин, слабым- б-БАП. Частота СХО возрастает с увеличением концентрации фиторегулятора.

3. Экзогенные фиторегуляторы в концентрации 2 мг/л влияют на кинетику клеточного цикла в корневой меристеме ячменя. 2,4-Д, ИУК. кинетин и зеатин увеличивают продолжительность клеточного цикла за счет удличения 3-фазы и галер^ки клеток на рубеже G-^/M. 6-БАП сокращает кг°тсчнь.и ш*кл. Уст^-

-Обновлена корреляция между продолжительностью клеточного цикла и индукцией СХО. Увеличение продолжительности клеточного цикла под действием экзогенных фиторегуляторов приводит к повышению частоты СХО.

4. Изучено влияние состава питательной среды на частоту СХО в первичном каллусе ячменя.;. Установлено, что с увеличением, концентрации.2,4-Д возрастает уровень частоты СХО, а при введении в среду б-БАП этот показатель снижается. Изменение концентрации сахарозы в питательной среде не оказывает какого-либо влияния на уровень частоты СХО.

■ 5. Уровень полисомзтии в исходных эксплантах зависит от от вида. У табака полиплоидных клеток не обнаружено. Небольшое количество полиплоидных клеток выявлено в незрелом зародыше ячменя - Высокий уровень полксоматии был ха-

рактерен для листовых пластинок и междоузлий люцерны, что вероятно обусловлено типом дифференцировки. связанной с эн-доредупликацией. Одной из причин полиплоидии в культуре первичного каллуса люцерны является наличие полиплоидных клеток в исходном экспланте. Показано, что степень полиплоидизации в первичном каллусе люцерны зависит от уровня плоидности. В течение каллусогенеза устанавливается преимущественно тет-' раплоидный уровень плоидности у всех исследованных форм люцерны.

6. 2,4-Д является наиболее сильным индуктором пролифе-ративной активности в культуре первичного каллуса табака по сравнению с ИУК. Однако действие Е.4-Д сопровождается отрицательными цитогенетическими эффектами: потеря пролифератив-ной активности клеточной популяцией уже на 18 день культивирования. массовой гибелью клеток в этот период.

7. Культивирование трансгенного табака на .неселективной среде в присутствии 2,4-Д или ИУК в течение шести месяцев приводит к потере экспрессии трансгена (GUS) у части растений регенерантов 28.82 и 3.3Z соответственно.

8. Наиболее выраженными цитогенетическими эффектами (повышение частоты СХО.задержка клеточного цикла и влияние на потерю экспрессии трансгена) среди изученных фиторегуляторов обладает 2,4-Д. При выполнении трансгеноза и дальнейшем культивировании in vitro трансгенных клеток необходимо избегать использования 2,4-Д в культуральных средах.

Список литературы, опубликованной по теме диссертации:

1 Хр\сталева Л И , Карлов Г И Кинетика полиплоиди-¡ашш клеток в первичном каллусе у различных генотипов люцерны//Цитология и генетика 1990, т 29, № 2, с. 31—ЗЬ

2 Карлов Г И, Хрусталева Л И Влияние фитогормо-нов на частоту сестринских хроматидных обменов в мери-стематических клетках Hordeum vulgaris// Тез III Межд\на-роднои конференции «Регуляторы роста и развития растений» Москва, 1995, с 213

3 Karlov G I , Khrustaleva L I The geneti mechanibm of bomaclonal variation in plant tissue culture in vitro//Abst. of Int symposium on in situ conservation of plant genetic resources Turkey, 1996, p 37

4 Карлов Г И , Андреева Г Н , Xpv ста лева Л И Влияние 2,4-Д и ИУК на калл\согенез в листовых ¡»ксплантах Nicotiana tabacurn//Тез IV Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений». Москва, 1997 (В печати)

Объем 1 п л

Закат 368

шпография Издатечьства МСХА 1.27551) V\oi_KBa Тнмирялса^кая ул , 44

Тираж 1Ü0