Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ ПИКЛОРАМА (4-АМИНО-3,5,6-ТРИХЛОРПИКОЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ) В РАСТЕНИЯХ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СТЕПЕНИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЭТОМУ ГЕРБИЦИДУ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ ПИКЛОРАМА (4-АМИНО-3,5,6-ТРИХЛОРПИКОЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ) В РАСТЕНИЯХ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СТЕПЕНИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЭТОМУ ГЕРБИЦИДУ"

Л -

Министерство сельского хозяйства ссс£

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи КУДАЙКИНА Ирина Васильевна

ОСОБЕННОСТИ ПОВЕДЕНИЯ ПИКЛОРАМА (4-АМИНО-3,5,6-ТРИХЛОРПИКОЛ ИНОВОЙ КИСЛОТЫ) В РАСТЕНИЯХ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО СТЕПЕНИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ к ЭТОМУ ГЕРБИЦИДУ

(03.00.12 — физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1981

/ -С , г-, /7ь !

' 0 ' - {¿.-и/с '"-¿и, г

Работа выполнена во Всесоюзном научнб-исследователь-ском институте фитопатологии МСХ СССР.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Д. И. Чкаников.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Т. В. Лихолат, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент В. А. Зинченко.

Ведущее предприятие—Институт экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купревича АН БССР. гу

Защита состоится (ЯС^^^у/,^/. . 1981 г.

ч на заседании Специализированного совета К-120.35.06 в Московсной сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева.

127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К. А, Тимиря-

Автореферат разослан «

1981 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, Л л

качлиаят »н^..огических наук^ в* Марьенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность темы исследования. Пиклорам (4-амнно-3, 5, 6-трихлорпнколнновая кислота) обладает очень высокой токсичностью для многих травянистых и древесных растений и используется для уничтожения растительности на невозде-лываемых территориях (Bovey et al., 1968; Майер-Боде, 1972; Farnworth, Davies, 1974), для борьбы со злостными трудно-искореняемыми сорняками, такими, как горчак розовый (Березовский, Раскин, 1970; Груздев, Попов, 1971; 1974; Груздев и сотр., 1975; Мордовец, Í977). Кроме того, в дозах до 70 г/га пиклорам используется для борьбы с широколистными сорняками в посевах зерновых культур (Nolle, 1965; Воеводин, 1967; Kirkland, Keys, 1979). Постоянно возрастающее практическое значение пиклорама делает необходимым изучение особенностей его поведения в растениях.

Установлено, что пиклорам быстро проникает и передвигается по растенню (Hurtt, 1968; Baur et al., 1967; Bovey et al., 1967; Diaz-Colon et al., 1972; Hallmen, 1974), вместе с тем гербицид медленно трансформируется, причем значительная его часть остается в неизмененном виде (Meikle et al., 1966; Sharma, Vanden Born, 19736). Имеются сведения о способности растений декарбокснлировать и гидроксилировать пиклорам (Scott, Morris, 1970; Greenham, 1973). Некоторые исследователи наблюдали образование конъюгатов пиклорама с клеточными констнтуентами (Maroder, Prego, 1971; Hall-men, Eliasson, 1972; Mitchell, Stephenson, 1973).

Однако имеющиеся немногочисленные и часто противоречивые данные о поведении пиклорама в растениях не позволяют понять причины избирательности его действия, а это необходимо для успешного применения гербицида. Более точные сведения о судьбе пиклорама в растениях нужны также для разработки метода анализа его остатков в продуктах растениеводства, а также для направленного изыскания новых физиологически активных веществ. Такие данные требуются также для развития представлений о закономерностях детоксикацни эндогенных веществ в растениях.

Цель и задачи исследования. Задачи исследовании заключались и:

— определении скорости проникновения пиклорама в растения, различающиеся но степени чувствительности к гербициду;

— определении подвижности пнклорама в растениях, неодинаково реагирующих на гербицид;

— изучении особенностей метаболизма пиклорама в разных растениях.

Предполагали, что решение этих вопросов поможет выяснению факторов избирательной фитотокснчностн 4-амино-З, 5. (>-трнхлорликолпновой кислоты. Необходимо било изучить свойства метаболитов пиклорама н идентифицирован, основные продукты трансформации этого гербнцнда. Кроме того, на основе данных, полученных прн изучении метаболизма *1-амнно-3, 5, 6-трнхлорпнколнновон кислоты, нужно было подобрать адекватный метод определения остаточных количеств пиклорама в растительных тканях.

Научная новизна. Эксперименты, проведенные е никлора-мом, меченным по углероду карбоксильной группы, позволили установить, что во всех изученных видах растений гербицид подвергается трансформации с образованием водорастворимых продуктов метаболизма, причем в относительно устойчивых растениях образование этих метаболитов происходит наиболее интенсивно. Из относительно устойчивых растений кукурузы и очень чувствительных растений фасоли впервые был выделен, очищен и идентифицирован с помощью различных физико-химических методов водорастворимый метаболит пиклорама, который представляет собой 1-0-(4-ами-но-3, 5, 6-трихлоринколил)-0-глюконппаноз]1д,

Практическая ценность работы. На основе данных, полученных при изучении основных свойств метаболитов пиклорама в растениях, выбран наиболее целесообразный метод определения остаточных количеств гербнцнда в растительных тканях, который может использоваться для получения данных о его содержании в биосфере, необходимых в связи с исключительно высокой персистентностыо и фнтотоксичноетью этого гербнцнда.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены па III Всесоюзном совещании по анализу остатков пестицидов (Москва, 1979), на конференции молодых ученых ВНИИФ (Голицыно, Московской обл., 1980), на семинаре по применению изотопных индикаторов в сельском хозяйстве (Москва, 1981).

Публикация, По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, где рассмотрены процессы

проникновения, передвижения и метаболизма плклора.^й п* растениях; описании объектов и методов исследования, изложении полученных результатов, нх обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 58 отечественных и 1С7 работ на иностранных языках. Изложена на 129 страницах машинописного текста, включает 18 рисунков и 10 таблиц.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растения. Для изучения процессов проникновения, распределения и метаболизма ннклорама использовали растения фасоли, гороха, подсолнечника, огурца, сон, горчицы, редиса, пшеницы, кукурузы, овса, ячменя, земляники, проявляющих разную чувствительность к пнклораму. В период обработки растення пшеницы, овса, ячменя, гороха, горчицы н земляники имели трн листа, у фасолн развертывался первый тройчатый лист, у подсолнечника н редиса появилась вторая пара настоящих листьев, огурец имел два настоящих листа. Для обработки использовали раствор пнклорама в 20%-ном зта-ноле с добавлением 0,1% смачивателя Твнн 40, который наносили небольшими каплями на апикальные части листьев.

Меченый шжлорам. Меченную но углероду карбоксильной группы 4-амино-З, 5, 6-трнхлорпиколнновую кислоту (уд. ак-типн. 23 мкюрн/г) получали из пеитахлорпнридина (Ме1к1е е! а1„ 1966; Хохлов, Соколова, 1973) под руководством Г. Д. Соколовой и канд. хим. наук П, С. Хохлова, которым автор выражает глубокую благодарность.

Определение скорости проннкновения ннклорама в растения. На каждое растение наносили 1,5 или 10 мкг пнклорама в 25 мкл раствора. Через различные промежутки времени не-проннкшнй гербицид смывали с листьев 50%-пым этанолом. Измеряли радиоактивность смывов на жидкостном ецннтнл-дяцпоннОм спектрометре 5Ц--10 (Интертехник, Франция). Количество проникшего пнклорама выражали в процентах по отношению к общему количеству нанесенного па листья гербицида.

Изучение особенностей локализации пнклорама в растениях. Растения обрабатывали раствором, содержащим 1,5 или 10 мкг пиклорама-С14, Через различные промежутки времени непроникший гербицид смывали 50%-ним этанолом. Растения расчленяли на верхушку, стебель, обработанные и необработанные листья, корни. Растительный материал фиксировали 15 минут при 120°С, а затем досушивали до воздушно-сухого состояния н растирали в ступке. Содержание радиоактивного пнклорама в сухом материале определяли путем сжигания навески на установке «Трн-Карб» (модель 305, Паккард. США).

Определение скорости декарбокснлировання гшклорама в растениях. Обработанные пнкдорамом-Сн (10 мкг) растения помещали в замкнутые сосуды, через которые пропускали ток чистого воздуха со скоростью 120 мл/мни. Выделяющийся См02 на протяженна 96 часов поглотали 25%-ным раствором моноэтаполамнна в смеси метиловый спнрт-метиловый эфир этиленгликоля (1:1). Раствор поглотителя меняли каждые 4 часа. После окончания учета выделившегося СнОг, пепро-■ пккший гербицид смывали с поверхности листьев 50%-ным этанолом, проводили продолжительный кислотный гидролиз растительных тканей и последующую экстракцию днэтиловым эфиром с целью определения той доли радиоактивного углерода, которая вовлекается в нормальный обмен веществ растений.

Изучение особенностей метаболизма пнклорама в растениях

а. Выделение пнклорама и его метаболитов 80%-ным ацетоном из фиксированных в жидком азоте растительных тканей. Растения, обработанные пиклорамом-С'4, помещали в жидкий азот, измельчали, экстрагировали 80%-ным ацетоном, гомогенат фильтровали, ацетоновый экстракт концентрировали. оставшуюся водную фазу подкисляли до рН 2 и экстрагировали днэтиловым эфиром". Измеряли радиоактивность веществ, находящихся в эфирной и водной фракциях. Эфирные фракции хроматографнровали в разных системах растворителей.

б. Выделение пнклорама н его метаболитов кипящей водой. Обработанные ппклорамом-С14 растения трижды экстрагировали кипящей водой, экстракты объединяли, охлаждали, осаждали белки равным объемом ацетона, осадок отфильтровывал и, фильтрат подкисляли до рН 2 и экстрагировали днэтиловым эфиром. Определяли радиоактивность веществ, находящихся в эфирной и водной фракциях. Эфирные фракции хроматографнровали в разных системах растворителей.

в. Определение содержания радиоактивных веществ, не экстрагируемых из растительных тканей кипящей водой или 80%-ным ацетоном. Твердые остатки после экстракции кипящей водой или 80%-ным ацетоном гидролнзовалн в бн соляной кислоте в течение одного часа на кипящей водяной бане, фильтровали через стеклянный фильтр ОРД\ После охлаждения проводили трехкратную экстрактно диэтиловым эфиром. Определяли радиоактивность водной н эфирной фракции на жидкостном сцинтилляционном спектрометре ЗЫО. В некоторых случаях твердые остатки сжигали на

установке «Три-Карб» и определяли уровень активности выделившегося СиОг-

г. Щелочной и кислотный гидролиз выделенных из растений водорастворимых метаболитов циклорама. К йодной фракции, оставшейся после экстракции днэтпловым эфиром, прибавляли 2 н раствор ^ОН или концентрированную соляную кислоту так, чтобы концентрация водного раствора соответствовала 0,1 н раствору МаОН или 1 н раствору соляной кислоты. Щелочной раствор подкислял» 2 н раствором соляной кислоты до рН 2 и проводили трехкратную экстракцию щелочного и кислотного гидролизатов днэтпловым эфиром. Измеряли радиоактивность эфирной и водной фракции на жидкостном сцинтнллнцнонном спектрометре ЭЬ-'Ю.

д. Идентификация водорастворимого метаболита пиклорама. Обработанные пиклорамом-Си растения кукурузы и фасоли гомогенизировали в жидком азоте н экстрагировали гербицид и его метаболиты 80%-иым ацетоном. Экстракт очищали от примесей гексаном и затем на колонке с амберли-том ХЛД-2. Для уменьшения степени лабильности водорастворимого продукта проводили его апеллирование смесью уксусного ангидрида и безводного пиридина, после чего аце-тнлированннй продукт очищали с помощью колоночной, тонкослойной и бумажной хроматографии. Выделенный метаболит пиклорама идентифицировали по поведению при хрома-тографиронанин на бумаге Ватман I в 16 системах растворителей в сравнении с синтетическим 1-0-(4-амино-3, 5, 6-трихлор-ииколнл) -О-глгокопир а ноз л лтотра ацетатом и по характеру масс-спектра. .Масс-снектры метаболита и метчика были получены на приборе ЛКБ-9000 (Швеция) при энергии ионизирующих электронов 70 э. в., при температуре образца и ионного источника 120° и 230а соответственно.

Подбор способа экстракции пиклорама и его метаболитов из растительных тканей для определения остаточных количеств гербицида. Надземные органы 15—20-днепиых растений кукурузы, обработанных пнклорамом, фиксировали 30 мин при 120°, затем сушили при 60е до воздушно-сухого состояния. Навески измельченного материала экстрагировали пятикратными объемами 0,05 и МаОН, 50.%-ного и 80%-иого ацетона, 50%-ного ацетонитрила и подкисленного диэтнлового эфира в течение 30 мни при встряхивании. Фильтровали через бумажный фильтр, а остаток промывали двумя порциями растворителя. Экстракты объединяли, раствор подкисляли 2 и соляной кислотой до рН 2 и экстрагировали трижды равным объемом диэтнлового эфира, О полноте экстракции пиклорама и возможных потерях гербицида судили по радиоактивности, определявшейся на жидкостном сиинтилляционном спектрометре 5Ц-40.

о

Определение остаточных количеств пнклорама в растительном материале. Сухой измельчении» растительный материал экстрагировали 15 минут 0,05 н МаОН при комнатной температуре. Все последующие этапы очистки экстракта воспроизводились без существенных модификаций по методу Бьерка (В^егке е* а1., 1967), Схема анализа представлена па рис. 3.

Статистическая обработка данных. Опыты проводились в трех—пятикратной повториостн. Математическая обработка полученных данных проводилась на ЭВМ «Наирн-2» методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

I. Проникновение и локализация пнклорама в растениях, различающихся по степени чувствительности к этому гербициду

Растения, которые использовали для изучения особенностей поведения пнклорама, проявляют неодинаковую чувствительность к гербициду. К группе очень чувствительных растений относятся фасоль, горох, подсолнечник, огурец. Несколько слабее реагируют на гербицид горчица и редис. Относи-

Таблица 1

Динамика проникновения пнклорама-С1* а листьо растены4

Растения Проникло гербицида (% от сонного количества) после боткн, через нане-обра-

б ч 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч

л к а § у 3 О ? 3 Фасоль Гороп Подсолнечник Огурец 38,0 19,0 13.3 87,0 77,2 57,5 66,4 89,0 86,3 92,0 86,6 94,0 95.5 93,5 97,8 98,0 97,5 95,0 98.2 98,0

I О К ч Й Е Д ^ Горчица 82,0 91,0 93,0 94,0 97,0

£ 5 а 5 О ^ Редис 43.0 87,3 89,5 90,0 90,0

Я о • ы V Я 'В 2 ^ г; _ ^ а о^ Пшеннпа Кукуруза Овсс Ячмень -10.1 5?,2 21,8 37,8 71.7 95,5 35.8 70,0 87,0 96.7 08,3 04.2 93.3 98,0 87,0 94,3 94,4 98.0 90,0 95,0

НСРм-8% Точность опыта "3%

тельную устойчивость к пиклораму проявляют злаковые растения — пшеница, кукуруза, овес, ячмень (Нашакег о1., 1963; Щеглов и сотр., 1967),

В результате изучения динамики проникновения пиклора-ма в листья растений выяснено, что в первые б часов после обработки наблюдаются значительные различия в количестве проникшего гербниида (табл. 1), которые почти полностью нивелировались уже черезАв часов, так что на поверхности листьев как чувствительных, так и относительно устойчивых растений оставалась незначительная часть использованного для обработки пнклорама. Следует отметить, что процесс проникновения гербицида наиболее интенсивно протекает в первые 24 часа, однако в отдельных случаях для его завершения требуется несколько большее время. Важное значение имеет тот факт, что по способности поглощать нанесенный на листья гербицид устойчивые растения практически не отличаются от крайне чувствительных. Это позволяет полагать, что скорость проникновения никлорама не играет существенной роли в реализации избирательности гербицидного действия.

Результаты определения содержания пиклорама-С14 в различных органах растений показали, что характер локализации гербицида неодинаков в растениях, различающихся по степени чувствительности к этому гербициду (табл. 2). Чув-

Таблица 2

Динамика оттока пнклорама-С1' мз обработанных легьеа растений

Растения Обнаружено за пределами обработанного листа (% от общего количества проникшего гербицида) через

6 ч 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч

айЗ <Ш О хи =г ь Фасоль Горох Подсолнечник Огурец 51.8 44,7 38,2 42.9 77,1 57,6 72.0 83,0 84,3 74,0 84,С 80,2 87,6 71,9 89,6 86,3 89,3 72,5 85.7 75.8

■ 1-, н ° - О И м Й = а с ойГ. 3 Горчица 15.9 25,7 23,4 28,8 47,1

^ ** ^ а О г >- Редис 10,0 10,7 25,5 38,7 46,8

~ О = £ Ч И" и о ** £ Пшеница Кукуруза Овес Ячмень 5.3 1,8 1.7 13,5 9,9 1,7 2,9 21,6 13,6 3,7 8,6 26,3 21,0 2,7 4,6 30.3 25,7 2.1 7,3

Точность опита — 5%

ствптельные растения отличаются довольно высокой скоростью оттока гербицида в другие органы. Уже через 24 часа после обработки 58—83% гербицида передвигалось за пределы обработанного листа, причем транспорт его в осевые органы продолжался и в дальнейшем, так что через 96 часов в обработанных листьях оставалось только 10—25% гербицида.

В противоположность '->тому у относительно устойчивых злаковых растений интенсивность передвижения ииклорама из обработанных листьев в другие органы была низкой. Даже через 96 часов после обработки основное количество гербицида (70—98%) находилось в обработанных листьях. Растения, занимающие промежуточное положение по степени чувствительности к пиклораму, осуществляли иммобилизацию гербицида тканями листьев более энергично, чем чувствительные растения, и менее интенсивно но сравнению с листьями злаков.

Данные о передвижении пиклорама в различные органы (рис. 1) свидетельствуют о том, что в чувствительных растениях огурца основное количество гербицида (более 50%) через 96 часов после обработки концентрировалось в молодых листьях л верхушке растений н лишь небольшая его доля находилась в старых листьях, корнях и стебле растений. В относительно устойчивых злаковых растениях, как уже отмечалось, транспорт пиклорама за пределы обработанного листа очень затруднен. Так, в молодых листьях ячменя через 96 часов после обработки было обнаружено лишь 4,6% общего количества проникшего в ткани пиклорама. Растения редиса, занимающие промежуточное положение по степени чувствительности к пиклораму, имели много общего с очень чувствительными растениями, так как в их молодых листьях аккумулировалось 35% гербицида.

Таким образом, представляется очевидным, что высокая чувствительность растении к пиклораму ассоциируется с быстрым передвижением его в осевые органы, преимущественно в верхушки и молодые листья. В то же время иммобилизация пиклорама тканями обработанных листьев является, по-видимому, одним из способов снижения концентрации гербицида в интенсивно растущих органах, а, следовательно, важным фактором устойчивости растений. Можно было предположить, что иммобилизация пиклорама тканями листьев обусловлена главным образом образованием малоподвижных метаболитов гербицида.

2. Метаболизм пиклорама в растениях

Но данным большинства исследователей пиклораму свойственна весьма высокая персистентность в растительных тканях, за счет чего отчасти и относят его исключительную физи-8

ОЇЇРВЕЬ ; , : очень ^вотвятоде»

1511

ил

rt V.

яшь-

ЩИС-

относительно чувствятеле«

35,0

- сеиядольныелистья; ~ друлю яиотъя;

РиооІ. Оодерзвашю ішорв^^О^ в органах кийр равлтающихся ш> оїєшш ^зотвитешоохг s атоцу гербициду (% о® рбщэ^о кодичвргаа ідоникімго

s рйОїЬНИД гербицида),1

■ K-sr-y.

■ , „V ■

lOQEf

. » » Я

200

300

400

500

600

т.

Ш:

\ 1

¿ ,, J

•î • . ■ *

,j• J. . -:

пиклораш/выделенного кз ЯУзн.

«логическую активность (Scott, Morris, 1970; Reber et al„ 1971; Roiston, Robertson, 1975). Между тем имеются сведения, что гербицид в растениях претерпевает определенные превращения, хотя их характер и скорость осуществления все еще и достаточной мере не изучены {Maroder, Ргедо, 1971; Mailmen, Eliasson, 1972; Sharma, Vanden Born, 1973). Тот факт, что в устойчивых растениях наблюдается иммобилизация пиклора-ма тканями листьев, дал основание для предположения о связи этого явления с образованием тех или иных метаболитов пнклорама.

Определение скорости декарбоксилирования пнклорама в растениях. При определении интенсивности декарбоксилирования пнклорама использовали относительно устойчивые к этому гербициду растения пшеницы, кукурузы, земляники, относительно устойчивый редис и очень чувствительную сою. Как следует из данных таблицы 3, все изученные растения характеризовались низкой скоростью декарбоксилирования (табл. 3). Во всех случаях этот процесс протекал медленно, так что доля радиоактивного углерода, выделившегося за сутки в виде углекислого газа, не превышала 2% того количества гербицида, которое проникло в растение.

Т а б л и н а 3

Интенсивность декарбоксилирования пнклорама-С14 в растениях

Растения Выделение радиоактивного углерода в виде С "О?, % от общего количества радиоактивных веществ в растениях

0—24 ч 24—18 ч ■18—72 ч 72—96 ч всего за 96 ч

Пшеница...... 0,4 0,4 0,3 0,2 U

Кукуруза...... 1,7 1,5 1.3 M 5,6

0,4 0,5 0.4 0,4 1,7

Редис ....... 1,7 1.4 0,9 0,6 4,6

Соя........ 0,1 0,5 0,6 0,2 M

Точность опыта .... 2,4%

За 96 часов после обработки растений доля подвергшейся декарбоксилированию 4-амино-З, 5, 6-трнхлорпнколнновой кислоты составляла всего 2—6% от количества проникшего в растения гербицида. Таким образом, устойчивость растений к пиклораму не связана, по-видимому, с их способностью осуществлять декарбоксилированне гербицида.

Образование конъюгатов пнклорама в растениях. Сравнение двух способов извлечения пнклорама и его метаболитов из растительных тканей показало, что экстракция 80%-ным ацетоном обеспечивает практически полное выделение всех

радиоактивных веществ с сохранением нативности большей части водорастворимых продуктов. При изучении динамики образования метаболитов пиклорама в различных растениях было установлено, что в относительно устойчивых к гербициду злаковых растениях трансформация пиклорама происходит наиболее интенсивно (табл. 4). Через 72 часа после обработ-

Т а б л к ц а 4

Содержание пиклорама н его метаболитов в растениях, различающихся по степени чувствительности к гербнаиду, через 72 часа

после обработки . ,

Растения ' ! 1 Радиоактивность, % от общего количества проникшего в ткани меченого гербицида

водорастворимая фракция эфирораствори-мая фракция неэкстра-гнруемые вещества

пикло-рэм метаболит

Очень чувствительные Фасоль Город ' Подсолнечник Огурец | 21,6 18,6 75,7 12,7 76,4 79,4 20,8 85,2 0 0 2,0 0 2,0 2,0 1,5 2.1

Относительно чувствительные Горчица | Редяс 82,5 . 42,2 - 15,9 30,4 0 25,7 1,6 1.7

Относительно устойчивые Пшеница Кукуруза ; Овес Ячмень : 59,9 65,0 68,3 50,8 35.4 32.5 28.5 46,0 1.7 0 0 0 3.0 2,5 3,2 3,2

Точность опыта »5%

ки в этих растениях основная часть пиклорама (50—70%) находилась в составе водорастворимых метаболитов. В относительно чувствительных растениях метаболизм также протекал с довольно высокой скоростью. В растениях горчицы 82% пиклорама превращалось в водорастворимые продукты. В растениях-редиса водорастворимых метаболитов образовывалось меньше, чем в растениях горчицы, однако заметные количества гербицида в-нем превращались в эфирорастворн-мые метаболиты. Скорость трансформации гербицида в очень чувствительных растениях фасоли, огурца и гороха была низкой— в составе водорастворимых метаболитов через 72 часа после обработки находилось «тишь около 20% гербицида. Ис-ю

ключение составлял очень чувствительный подсолнечггик, в котором образование водорастворимых продуктов метаболизма пнклорама происходило столь же интенсивно, как и в относительно устойчивых видах.

Проведенные эксперименты дали возможность полагать, что иммобилизация пнклорама в листьях злаковых растений может обусловливаться быстрым образованием водорастворимых метаболитов.

Изучение свойств водорастворимых метаболитов пнклорама позволило установить, что образующиеся продукты во всех видах, кроме подсолнечника, лабильны в щелочной среде (практически полностью гидролнзуются в 0,1 и ЫаОН), но довольно устойчивы в 1 и ИСК В то же время метаболит, выделенный из подсолнечника, был устойчивым в щелочной среде, но быстро гидролнзовался в 1 и НО при 20°С. В процессе гидролиза водорастворимых метаболитов высвобождался неизмененный пиклорам, который не отличался от аутентичного образца по поведению при хроматографированнн на бумаге и в тонком слое силнкагеля, а также по времени удерживании при анализе на газожидкостном хроматографе и по характеристикам масс-спектра. Это дало основание считать, что водорастворимые продукты метаболизма пнклорама представляют собой конъюгаты 4-амино-З, 5, 6-трихлорл и кол иловой кислоты с эндогенными веществами растения.

Идентификация водорастворимого метаболита пнклорама, накапливающегося в растениях кукурузы и фасоли

Относительно устойчивые растения кукурузы и очень чувствительные растения фасоли обрабатывал» меченным по углероду карбоксильной группы ппклорамом, убирали, выделяли гербшшд и его водорастворимый метаболит из замороженных жидким азотом листьев 80%-ным ацетоном. Экстракт очищали от примесей по методике, описанной выше. Для выделения конъюгата использовали в общей сложности 2 кг растений кукурузы и 5 кг растений фасоли.

Достаточно высокая степень чистоты выделенного соединения дала возможность провести его идентификацию. По поведению при хроматографированнн на бумаге в 16 системах растворителей ацетилнроваиный метаболит пнклорама существенно отличался от пнклорама и был сходен с синтетическим Ь0-(4-амино-3, 5, 6-трнхлоршшолил)-0-глюкопираио-зилтетрааиетатом. Масс-спектр метаболита полностью совпадал с масс-спектром синтетического 1-0-(4-амнпо-3, 5, 6-три-хлориикоднл)-0-глюкопиранознлтетрааиетата (рис. 2).

После щелочного гидролиза выделенного из растений кукурузы к фасоли метаболита в гндролизате был» об) ¡ару же-

иы пнклорам и глюкоза, которые не отличались от аутентичных образцов по поведению при газо-жндкостной и бумажной хроматографии. Полученные данные дали нам основание считать, что образующийся в обработанных ппилорамом растениях кукурузы и фасоли водорастворимый конъюгат представляет собой 1-0-(4-амнно-3, 5, 6-трихлорпиколнл)-0-глюкони-ранознд. Это вещество оказалось основным продуктом метаболизма пиклорама во всех изученных нами растеинях.

Поскольку имеется определенная связь между интенсивностью метаболизма н степенью подвижности гербицида в растениях {табл. 5), можно полагать, что образование 1-0-(4-амнно-З. 5, 6-трихлорпиколнл)-0-глюкопнранозида является важным фактором иммобилизации пиклорама.

Таблица 5

Транспорт пиклорама н образование его глюкоз ног о эфира в относительно устойчивых н чувствительных к гербициду растениях через. 120 часов после обработки

Растения Количество пиклорама, переместившегося за пределы обработанного листа (% от общего содержания в растениял) Содержание пиклорама в составе 1—0—(4-ами-но-3, 5, 6-трнхлоршжо-лнл)-Ь-глюкопн рано-зидэ (% от общего содержания в растениях)

Кукуруза 5,0 71,0

Фасоль 88,7 14,2

Точность опыта=5 %

Однако трансформация пиклорама, видимо, не всегда лишает гербицид подвижности. Например, в растениях подсолнечника энергично образуется водорастворимый метаболит пиклорама, что не препятствует транспорту вещества за пределы обработанного листа и реализации его физиологической активности. Правда,.образующийся в подсолнечнике водорастворимый продукт по своим свойствам отличается от 1-0-(4-амино-З, 5, 6-трихлорпнколнл)-0-глюкопиранозида — основного метаболита пиклорама во всех других изученных растениях.

Обоснование рационального метода анализа остатков пиклорама в растениях. Основным продуктом метаболизма пиклорама в большинстве растений, в том числе во всех злаковых растениях, является: быстро разрушающийся в щелочных растворах 1-0(4-амнно-3, 5, 6-трнхлорпиколнл)-0-глюкопн-ранозид, поэтому можно было полагать, что наиболее эффективным способом извлеченияевободного и связанного пиклорама окажется обработка растительной ткани именно раствором щелочи. Нужно сказать, что 0,1 н КОН о качестве экстра-гента пиклорама был. предложен еще Бьерком (В^егке с1 а!,, 12

Высушенный її измельченный растительный материал

Щелочной экстракт

Эфирный экстракт

Соловы» элюат

Эфирный экстракт

Экстракция 0,05 н ЫаОН .... (98—100) Фильтрование через фильтриел , (93—95)

Подкислснпе 85%-ной Н3РО+ н экстракция диэтиловым эфиром (87—90)

Очистка на ЛІгОз, элюцня 0,23 % -ним ЫаНСО}.......(85—87)

Окисление КМпО,......(84—86)

Экстракция диэтиловым эфиром (82—84)

Высушивание, метилирование диа-зометаном........(75—82)

Этап 1 Этап 2

Этап 3

Этап 4

Этап 5 Этап 6

Этап 7

Метиловый эфир циклорама

Очищенным метиловый эфир пшело-рама

Г а зо-жидкостная хроматография

Очистка на Л1гО}, элюцкя диэтиловым эфиром.......

Хроматограф Цвет-105 с ДПР, колонка (200 x 0,25 см), заполненная хроматоном \V-AW-ДМСБ с 5% силикона ЭЕ-ЗО, Т ,-.„. =215°, Ткол. = 200°,Т „„«.= —220°, время удерживания метилового эфира пиклирама— б мин 30 сек.......

(74—80) Этап 8

Этап 9

Рис. 3. Схема анализа остаточных количеств пнклорама (в скобках указано количество радиоактивного пнклорама, обнаруженного после проведения соответствующей процедуры, % ог исходного содержания).

1967), и этот вариант экстракции был принят нами как эта'-лонный. Кроме того, исследовалась эффективность извлечении пиклорама и его метаболитов с помощью ряда органических растворителей и растворов щелочи меньшей концентрации.

Проведенный эксперимент показал, что обработка сухого растительного материала 0,05 н раствором NaOH в течение 15 мин при комнатной температуре позволяет добиться такой-;ке степени извлечения радиоактивных веществ, что и при использовании в качестве экстрагента рекомендованного Бьер-ком 0,1 и раствора КОН,

Некоторые органические растворители (50%-ний и 80%-иый ацетон, 50%-ный' ацетонитрнл)- обеспечивали не менее полное извлечение радиоактивных соединений, однако эти экстракты содержали большое количество пигментов и других мешающих анализу веществ, и, кроме того, для полного высвобождения пиклорама они должны были обязательно подвергаться гидролизу-либо в 0,05 н NaOH, либо в 1 и НС1 при ÍOU'C. Одно уже это обстоятельство делало экстракцию органическими растворителями нецелесообразной. Таким образом, обработка сухого измельченного растительного материала в течение 15 мин 0,05 н раствором NaOH при комнатной температуре была признана наилучшим способом извлечения пнклорама, находящегося как в свободном, так и в связанном состоянии. Все последующие этапы очистки экстракта, описанные Бьерком, воспроизводились без каких-либо существенных модификаций (рис. 3). Регистрация уровня радиоактивности образца после каждой операции позволила выяснить размеры потерь вещества на соответствующем этапе анализа (см, рис. 3).

Описанным методом можно обнаружить ппклорам в концентрации 0,01 мг/кг сухого растительного материала с относительно высокой точностью (±10%).

Выводы

Изучение особенностей поведения 4-амино-З, 5, 6-трихлор-пиколнновой кислоты в растениях, различающихся по степени чувствительности к этому гербициду, позволило сделать следующие выводы:

1." Ппклорам проникает в ткани: листьев растений с довольно высокой скоростью: уже через 48 часов на поверхности листьев оставалось не более 20% использованного для обработки гербицида,-При этом отсутствует какая-либо связь между степенью чувствительности к гербициду и интенсивностью его поглощения листьями.

2. Передвижение пиклорама из обработанных листьев в осевые органы чувствительных растений происходило с гораз-

до (юлее высокой скоростью, чем у относительно устойчивых растений. Проявление устойчивости к пнклораму ассоциировалось со способностью растений подвергать значительную часть гербицида иммобилизации в тканях листа.

3. Иммобилизации пиклорама в листьях, как правило, связана с образованием щелочелабнльного водорастворимого метаболита гербицида, который был выделен из обработанных растений кукурузы н фасоли и впервые идентифицирован различными физнко-хнмичсскнмн методами с 1-0-(4-амино-

у, ()-трихлор11нколил)-0-глюкош1р;пюзндом. В устойчивых растениях кукурузы это соединение образовывалось гораздо более интенсивно, чем в чувствительной фасоли.

4. Декарбокснлнрование пиклорама во всех изученных растениях вне зависимости от степени их чувствительности к гербициду протекало с довольно низкой скоростью (от 0,1% до 1,7% за сутки). Это позволило полагать, что указанный процесс не играет существенной роли в деградации пиклорама и не может расненнваться как фактор устойчивости растений к этому гербициду,

5. В растениях подсолнечника отмечено присутствие больших количеств водорастворимого метаболита пиклорама, отличающегося по своим свойствам от 1-0-(4-амино-3, 5, 6-три-хлорпнколил) -О-глюкоипранознда.

6. Наряду с водорастворимыми метаболитами пиклорама в растениях могут образовываться и некоторые другие продукты трансформации гербицида.

7. Полученные данные позволяют считать, что, вопреки сложившемуся мнению, пиклорам в растительных тканях подвергается разнообразным превращениям, причем в относительно устойчивых растениях эти процессы протекают более интенсивно, что, как правило, приводит к иммобилизации гербицида.

8. Показано, что наилучшим способом извлечения «свободного» и «связанного» пиклорама из растительного материала является обработка последнего 0,05 н раствором МаОН в течение 15 мин при комнатной температуре. Очистка экстракта путем перевода пиклорама в днэтиловый эфир, последующего хроматографнровання на колонке с окисью алюминия и дополнительной очистки окислением КМл04 позволяет проводить количественный анализ при помощи газо-жидкост-ной хроматографии с высокой степенью чувствительности — до 0,01 мг/кг. Процедура обеспечивает выявление 74—80% общего количества пиклорама в растении.

Публикации по теме диссертации:

1. Кудайкина И. В., Мпкитюк О. Д„ Макеев Л. М„ Чка-ннков Д. И. Метод определения пиклорама в растительных

тканях. Тезисы докладов III Всесоюзного совещания ло анализу остатков пестицидов, ВДНХ СССР, Москва, 1979, 99.

2. Кудайкина И. В., Дубовой В. П., Микитюк О, Д., Арте-менко Е. Н., Макеев А. М„ Чкаников Д. И. Об избирательности гербицндного действия пнклорама. Физиол. и биохимия культ, растений, 1981, 13, № 2, 206—209.

3. Кудайкина И. В., Макеев А. М., Чканнков Д. И. Метаболизм пнклорама в некоторых растениях. Физиол. и биохимия культ, растений, 1981, 13, № 3,'306—309.

4. Кудайкина И. В., Макеев А. М., Чкаников Д. И. 1-0-(4-амино-3, 5, 6-трнхлорпнколнл)-0-глкжопиранознд — продукт метаболизма пнклорама в растениях. Физиол, растений, 1981, 28, № 2, 435—439.

Л 78883 5/УИ1—81 г. Объем I п. л. Заказ 1733.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. Л, Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44