Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОГО ТРОСТНИКА

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОГО ТРОСТНИКА"

д за т

На правах рукописи

Анандрам СИР ИРАМ

ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗВИРУСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА САХАРНОГО ТРОСТНИКА

Специальность: 06.01.11 — защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

л-г&т

і

■ ЦЕНТРАЛЬНАЯ ■ НАУЧ. Г,Я БИВ А' ¡ОТЕКА Мо;к. ссллкохоз. академии . н,и К. А, Тимирязева

и.ш ______________

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Российском универсктете дружбы ¡народов.

Научные руководители: доктор с.-х. наук, профессор Помазков Ю. И., кандидат биологических наук Келдыш М. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л\азин В. В., кандидат биологических наук, доцент Белошапкина О. О.

Ведущая организация — Биологический факультет Московского государственного университета и.м. М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится

1999 г. в » час. на заседании диссертационного совета Д 120.35.09 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 49. Ученый совет МСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.

Автореферат разослан

«II..» 9МЬО£>Э* . . . 199^ г.

Ученый секретарь диссертационного совета —

Шкаликов В. А.

І

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Странам Южной Америки и Азии в настоящее время принадлежит более 70% всего мирового производства сахара (РАО, 1997), поэтому их экономика зависит от выращивания сахарного тростника. Главный путь увеличения сахарного тростника - повышение его урожайности. Однако серьезным препятствием на этом пути является высокая поражаемость растений сахарного тростника самыми разнообразными болезнями, среди которых одно из ведущих мест занимают вирусные заболевания, отличающиеся широким распространением и большой вредоносностью.

Особенностями вирусных болезней растений, определяющими сложность борьбы с ними, является гетерогенность вирусных популяций, представленных различными вирусами и их штаммами с разнообразными биологическими свойствами, а также формирование новых патологических связей в условиях интенсификации производства. Для Гайаны эта культура является основной, однако вместе с тем биологические возможности повышения и урожайности далеко не исчерпаны. Многие вопросы, связанные с видовым составом вирусов, способами их распространения, выявлением доноров устойчивости N к основным векторам требует дополнительных исследований.

Важная роль принадлежит разработке эффективных и рентабельных методов получения свободного от вирусов посадочного материала.

Цель и задачи исследований. Целью являлась разработка оптимальной методики оздоровления сахарного тростника от комплекса вирусов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: .

- определить видовой состав мозаичных вирусов, поражающих сахарный тростник;

• - изучить особенности векторной передачи вируса мозаики сахарного тростника; •

- провести оценку устойчивости образцов сахарного тростника к основным тлям-векторам;. •

- разработать оптимальные условия индукции адвентивного побегообразования из почек сахарного тростника;

. - изучить сортовую реакцию на оздоровление методом культуры верхушечных меристем;

- определить размеры эксплантов, обеспечивающих освобождение растений от комплекса вирусов. ■

Научная повита результатов исследований. На сахарном тростнике диагностированы несвойственные этой культуре вирусы желтой карликовости ячменя - Barley yellow dwarf viras (BYDV), желтой мозаики фасоли -Bean yellow mosaic virus (BYMV), мозаики люцерны - Alfalfa mosaic

'rrY\J.!>'ЛЯ

нлУ'-і. і. л l: оь:,отека

і. і.

■ 'ЛЯ

.'Ja-.-j. 5.кадэмии

«

virus (AI MV) мозаики pcivxn - Arabis mosaic virus (AMV) и S картофеля -I'otdio virus (PVS)

Покачано что доминирующим компонентом комплексной инфекции в обра шах сахарною тростника является вир)с мозаики сахарною трочника (SCMV)

В резузыате проведенных исс ¡едопании показана возможность ин-финиронлния SCMV посредством видов иекторов, для которых сахарный тростник не является основным кормовым растением Впервые показана вошожноегь передачи SCMV новыми видами тлей Hyalopterus pruni (icotl и Aphis labae Scop Выявлена восприимчивость представителен р Гмпсит к SCMV Определены оптимальные составы питательных сред для получения адвентивных побегов, а также условия регенерации растении из меристем для грех сортов сахарного тростника

Выявлены оптимальные размеры жеплангов, обеспечивающие эффективность оздоровления от комплекса вирусов при максимальном выходе растсиии

Иракпшческан ценность работы На основе экспериментальных 11ННЫХ с учетом имеющихся сведении разработана методика оздоровления р 1с1снии сахарного тростника от i омплекса вирусов

Ратработана технология получения о торопленных растений сахарного тростник I из апикальных меристем с учетом оптимального сочетания in it рсд1кнгов пигагетьных сред и условий культивирования, позво-зяющаи сократить сроки полу чения растений регенератов

{пробация работы Материалы доложены на 4-и международной конференции «Регузяторы роста и развитие растении» (Москва, МСХА, 24-2Ь июня \

О пьем и стр\кт\ра работы Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста состоит из введения, 4-х глав и выводов, со-iep-кит 13 цифровых табчиц Список использованной литературы включает 209 источников, в том чисте 116 на иностранных языках

СОДЕРЖАНИИ РАБОТЫ

I. Обюр штературы по теме

В обзоре зитературы приведены важнейшие публикации за поспел-пне юаы даюшие характеристику основным цирусным заболеваниям сахарного тростника особенностям их распространения и вредоносности Позробно рассмотрены и обойдены основные сведения о мето-лх оморов тения растении от вирусных болезней дан анатиз особенностям оо обо/кдения paciemiil от вир\сов Проанатизированы механизмы рашроегр 1НСНИЯ BHpvcou в растениях проведено сравнение эффективное in р и шчных методов оз юровчения Обс\ждаются наименее изучен-

ные и спорные вопросы оздоровления и защиты сахарного тростника от вирусных болезней.

2. Материал, методика и условия проведения опытов

Работа проводилась в отделе защиты растений Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина и на кафедре защиты растений РУДН. Работы по культуре тканей выполнены в лаборатории биотехнологии кафедры ботаники и физиологии растений РУДН. Объектами исследований служили растения трех.^ммерческих сортов сахарного тростника: POJ 2878, PR 980, СО 421 4ASaccWuni giganteum. Выбранные сорта отличаются как по морфологии, так и по физиологическим особенностям.

В диагностике и идентификации вирусов, поражающих сахарный •тростник, использовались следующие методы: визуальный, индикаторный, серологические тесты, двойная иммуннодиффузия в агаровом геле, иммунноферментный анализ по (Ouchterlony, 1968). ELISA (Clark, Adams, 1977),. >•-." Морфологическое строение вирио-

нов контролировали под электронным микроскопом (Филлипс ЕМ-301) в очищенных препаратах и прямым методом.

• Оценка устойчивости форм, сортов и видов к возбудителям. переносчикам и векторный перенос проводили по известной схеме (Помазков, Келдыш, 1979). Тестирование растений на наличие вирусной инфекции проводили согласно типовым методикам диагностики вирусных болезней (Власов, Ларина, 1982: Келдыш, Помазков, 1980).'

Оздоровление от вирусных болезней проводили методом культуры верхушечных меристем. Техника приготовления питательных сред, стерилизация бокса, инструментов, лабораторной сосуды, растительного материала, методика вычленения и посадки апексов, а также выращивание растений-регенерантов общепринятые.

• . Поверхностную стерилизацию исходного растительного материала проводили 0,1% раствором .сулемы при экспозиции - 4 мин. Апексы выделяли из покоящихся почек при помощи препаровальной иглы и малого глазного скальпеля, - ' :

Основная питательная среда содержала макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу (Murasige, Skoog, 1962); тиамин - 1 мг/л, пиридоксин -' 1 мг/л, никотиновую кислоту - 5 мг/л, глицин - 2 Мг/л, фолиевую кислоту - 0,5 мг/л, биотин - 0,05 мг/л, агар - 7 г/л, pH - 5,6-5.8. Кроме основного состава в питательную среду добавляли регуляторы роста, осмотики и сахарозу. Состав основных вариантов питательных сред приведен в табл. 1. • '". ;' л. ■' " V ' / .

Состав основных вариантов питательных сред

H.ipil.lMT сре 11.1 Содержание основных компонешов Источник

MCR 1 Основная среда + тюти г ІООмг/ч, гидропнзат казеина 1 ООО мг/i, кинсгин 2 мг/л, НУ К 10 мг/л, сахароза 2" о Nancy Santana, 1983

MCR2 Основная среда + инозит 100 мг/ і ИУКО.І мі/л, Б All 2 0 мг/л сахароза 2% Оригинал

MCR 3 Основная среда + инозит 100 мг/л БАП 5 мі/л, сахароза 3%, манитоз 1% Оригинал

MCR Л Основная среда + инозит 100 мг/л, гидролизат казеина 1000 мг/1, кинетин 2 мг/л, НУК 5 мг/л, сахароза 2% Irvine, Benda, 1985

MCRS 1 Основная среда + инозит 100 мг/л, гидролизат казеина 1000 мг/l, БАП 0 6 мг/л, ИУК0 1 мг/л, сахароза 2"« Оригинал

Размер вычленяемого варианта экслланта контролировали с помощью окуляр микрометра Пробирки с растениями культивировали на световом стеллаже, где освещенность составляла 5000 люкс Выращивание растений проводит! при 16-часовом фотопериоде и температуре 23 25°С

Методика проведения отдетьных экспериментов описана в соответствующих разделах экспериментальной части Результаты всех опытов обрабатывали статистическими методами (Ларин, 1980)

Л Диагностика и идентификация вирусных заболеваний сахарного тростника

1

Симптомы и степень проявления вирусных заболеваний на сахарном гростнике весьма разнообразны и во многом зависят от смешанной инфекиии и различной реакции сортов, от условий выращивания и других факторов *

ГТо визуальным признакам на образцах сахарного тростника зарегистрированы разнообразные симптомы вирусного поражения Каблю-•ылись штрихи, лотосы и пятна, изменяющиеся по размеру и цвету в динамике

Такое разнообразие патологических признаков, по-видимому, связано с присутствием комплекса вирусов или штаммов в образцах каждого сорта.

В результате вирусологического анализа (ИФА) на растениях сахарного тростника выявлены следующие вирусы: Sugar cane mosaic virus (SCMV), Barley yellow dwarf virus (BYDV), Alfalfa mosaic virus (ALMV), Tobacco mosaic virus (TobMV), Bean yellow mosaic virus (BYMV), Arabis mosaic virus (AMV) (табл. 2). На образцах Saccharum giganteum, CO 421, PR 980 no методу ДДА выявлены соответственно вирусы Arabis mosaic virus (AMV), Cucumber mosaic virus (CMV), Potato virus S (PVS) (табл. 3).

В результате тестирования методом механической инокуляции соком зараженных растений сахарного тростника тест-растении кукурузы , показано, что опытный изолят SCMV по характеру проявления можно отнести к группе штаммов, вызывающих тяжелую мозаику. Точка тер. мической инактивации составила 50...52°С, а инкубационный период 2123 дня (табл. 4).

Таблица 2

Выявление вирусов на образцах сахарного тростника (ИФА)

Обнаруженные вирусы Co рт сахарного тростника

Pr 980 СО 421 POJ 2878 Sacharum їдцашеит

Sugar cane mosaic virus Вирус мозаики сахарного тростника + + + +

Barley yellow dwarf virus (BYDV) Вирус мозаики карликовости ячменя + + + +

Bean yellow mosaic virus (BYMV) Вирус желтой мозаики фасоли + + + +

Arabis mosaic virus (AMV) Вирус мозаики резухи. . + + + +

Tobacco mosaic virus (TobMV) Вирус мозаики табака +

Alfalfa mosaic virus (ALMV) Вирус мозаики люцерны + + +

Выявление вирусов на образцах сахарного тростника по методу ДДА

Обнаруженные вирусы С о р1 сзхарного тростника

РИ 480 СО-121 РСХ1 2878 ЬасЬагиш ип'аШсит

Ропю У|гич Ь (РУЧ) •1-

/\rahis пючаи, уния (ЛМУ) Вир\с чоз шки резухи

СисшнЬсг шочаи. унич (СМ\0 Вирус мозаики огурца +

Таблица 4

Выявление вирусов на образцах сахарного тростника (ИФА)

1 и ю пшк 1 1 1см1ии • 1сст 1 1сгсние Характер симпго мов Чисто инфекпин/ число заражении Инкчоа-нионныи период (дни) ГТИ Контро зьное тестирование

ЧасИагит ¡.^атсит /ез тауя СР СМ. Ш. /КМ 24/17 21 52 +

РК 980 /са 1 СР СМ тауч 1 15/11 23 50

С Р системн 1Я реакция, С Ч средняя мозаика ЗМ зеленая мозаика.

ЖМ желтая чоынка

4. ¡¡лучение векторной передачи вируса мошики сахарного тростника

Известно, чго подавпяюшее большинство фитопатогенных вирусов р.1(.пр0(.граняет1.я в природе посредством векторов (насекомых, клешей, грибов немагот) В результате чего возникает необходимость их выяв-.сния дока ыгезьства способности к передаче инфекции, организации > ишпиич мероприятии ит1 Исслепования векторной передачи остаются V» ними 111 имп\ акг\а ibhl.iv поскотьку они в значительной степени чир ч хю1 ii травт 1.11111. 1 иантных мероприятии и весьма ценны как ди-

ь

агностический прием: вид переносчика и способы передачи, как правило, специфичны для конкретного вируса. Состав векторов, передающих основные вирусы, поражающие сахарный тростник, довольно разнообразен. Так, вирус полосатости переносят цикадки (Cicadulina mbila Naude, C.loreyi Dup., C.latens, C.parazea, C.bipunctella zeae), хлоротическую поло-сатость сахарного тростника - Sugarcane chlorotic streak virus (SCCSV) переносят в основном цикадки Draeculacephala portola, а также слюнявицы Aenomalia liturata. Переносчиками заболевания Фиджи (Fiji disease) являются цикадки: Perkinsiella saccharicida Kirkady, P.vitiensis, P.vastatrix, P.lalokensis.

Основную роль в передаче вируса мозаики сахарного тростника играют тли (Aphis maidis Scop., Toxoptera graminum Rond, Oro!¡na cyperi V.D.G., Rhopalosiphum maidis Fitch, Aphis gossypii Glov., Myzus persicae Sulz., Aphis craccivora Koch, Rhopalosiphum padi W.). Тли являются наиболее распространенными переносчиками вирусов растений. Онн служат важным звеном, определяющим в значительной степени закономерности развития передаваемых ими заболеваний, и звеном, на котором основывают защитные мероприятия.

В эпифитологии афидофильных вирусов значительную роль играют число и активность тлей, степень вирофорности популяции, фенология культуры по отношению к фенологии переносчика, поведенческие особенности тлей, принуждающие их искать и заселять культурую Именно биология и поведенческие особенности тлей заставляют рассматривать их как наиболее активных и .значимых переносчиков вирусных инфекций.

Для изучения роли тлей в передаче SCMV нами испытаны 11 видов тлей, которые зарегистрированы в посевах зерновых культур. Кроме видов тлей давно известных как переносчиков вируса мозаики сахарного тростника, таких как Aphis maidis, Rhopalosiphum maidis, Aphis gossypii, Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, показана возможность распространения изолята вируса двумя видами тлей, ранее не известных в качестве векторов SCMV (Hyalopterus pruni Geoff, и Aphis fabae Scop.) (табл. 5).

При этом при передаче Aphis fabae отмечен наиболее короткий инкубационный период (12 дней) в сравнении даже с видами, приуроченными к злаковым культурам.

, В наших экспериментах не наблюдалось значительной разницы в передаче вируса бескрылыми и крылатыми стадиями тлей, а минимальный период для получения вирофорности составил. у видов Shisaphis gramiaum и Aphis fabae 30 сек. '

Вместе с тем при увеличении срока подкормки на источнике инфекции наблюдалось повышение эффективности передачи и сокращение инкубационного периода в опытных растениях.

F.iKHM обрлом, в резупьгате проведенных исследовании показана втмомюсгь инфицирования SCMV посредством видов векторов, для Kouipi ix сахарный rpocimiK не является основным кормовым растением В насюящсе время получено много фактов, свидетельствующих об эффективности передачи вирусов неспеиифическими видами тлей Последние играют бо 1ьшую роль в их распространении Так, различные штаммы вируса карликовой мозаики кукурузы - Maize dwarf mosaic virus (V1DMV) - передаются 22 видами тзеи, из которых только 7 используют в качестве кормового растения кукурузы

Таблица 5

Изучение роли тлен в передаче нзолята вируса мозаики сахарного тростника

Число тест Инкубаци Контрольное тестирование

Hin переносчика* р 1стении/ опиыи механиче ре 1КЦИЯ со

чисчо зара- перпод екпя ино- специфиче

женных (тнеи) ку тяцня скои сыво-

р icieiimi роткой

Rh< р iluMphuin и aidis 10/3 15 + +

1 .ich **

4hiNapbis gr iminum

Rund im •• 10/4 14 + +

Aphis *ossvpn Cilov ** S/l 15 + +

Kt opalosiphum padi W ** 12Í2 16 - +

Rh inserium Walk *•* 6>0 - -

Site bien aicnae h •** 10/1 22 +

M iui ivipb(4i dirtiodiun 1 *** 6 0 -

1 \l\/*is p^rsicac Vil/ ** 10'2 18 - +

1 МссГам! • 10 0 -

1 Aphis i ihae Scop • 10» 12 ч-

1 H\akpi-ru.4pruni(jeoir •• 12» 16 + +

Puiciiuc акцептор сеянии к>куруц|

* ко ш iccibo i си, по каживаечых н i I растение 10-15 особей, ** и 1всс11п 1 в Качестве Перенос ihkj *** cpouti ценны паковым культурам

«ui laß 1нааю1ся а ч |Шки Мсрике в биоценозе Пакового потя, •• um рнрчюг на tax ipm 1и ipocIHMK .

5 Оценка ) апоичивости силирного тростника к пыим векторам

При шкнкс а i ивнос про! позе фитосанитарнон обстановки осо-UWO ак|\аТЫЮСГЬ lipnoöpv г nur сведения об устойчивости генофонда не

Ч

тотько к вредоносным в настоящее время, но и потенциально опасным объектам При разработке н внедрении системы защиты рзстенни важное место отводится использованию их видов и сортов обладающих устойчивостью к патогенам вирсной этиологии и их переносчикам

Таблииа 6

Оценка устойчивости образцов сахарного гростника к различным векторам

Вид вектора Число ттеи сохранившихся через V24 ч іс і

S officinarum S eigantcum j PR-980 C.O-421 . POJ-2878

Aphis fabae 4/3 1/1 j V2 4/2 V2

Aphis gossvpu 5/4 5/2 1 4/3 і 4/4 VI

Hvatopterus pruni 6/4 7/3 1 4/4 4/3 3/2

Mvzus persicae 4/2 V3 ! VI 1 V2 2/1

Rhupalosiphum maidis 10/7 10/10 1>/S s/s 7,6

Rhopalosiphum padi is/6 9/9 10/7 9,7 9/9

Shisaphis graminum 10/9 I 10/10 10/X v/7 9/9

Sitobion avenae 10/(2 8/S 10/9 9 8 10/S

На каждое растение подсажено по 10 осооси

Устойчивость является важнейшим фактором повышения урожайности и утучшения качества сахарного тростника Особую ценность представляют сорта, обладающие комплексной групповой устойчивостью к нескольким возбудителям Немалую ценность представляют также формы, обладающие относительной устойчивостью к афидофичьиым возбудителям

Наблюдения, проведенные на различных кучьт\рах показывают, что относительная устойчивость к ттям предохраняет от развития эпи-фитотий ряда вирусов

Известно, что интенсивность распространения афидофичьных возбудителен в значительной степени зависит ог факторов, опреде 1яющих численность вирофорных особей персносчика (осооенно ею мигрир\ю-щих стадии) и характера использования поп> зяниеи для питания сортов и гибридов поражаемой кутьтуры Поэтому выявчение растении даже не обладающих иммунитетом к век гору но ограничивающих его ра« множение. имеет практическое значение

В этой свят нами бьпа провезена перекрестная оценка образцов сахарного тростника на устойчивость к пям различного \ ровня спсци-

фмчности для злакового поля и представителей злаков - к SCMV (табл. 6).

Результаты проведенных исследований показали, что тли питаются на сахарном тростнике в течение времени, достаточного для передачи изучаемого вируса и могут служить его переносчиками. Устойчивых образцов не выявлено. Вместе с тем показана восприимчивость ряда озимых пшениц к SCMV.

*

6. Методы освобождения растений сахарного тростника от вирусов и пути повышения их эффективности

Высокая восприимчивость большинства сортов сахарного тростника к вирусной и другим инфекциям, вегетативный способ его размноже- • ния способствуют накоплению инфекции в потомстве и приводят к массовому поражению растений болезнями, особенно вирусными. Быстрое распространение вирусной инфекции привело к полному заражению вирусами большинства районированных сортов сахарного тростника, значительно снизило их урожайность.

Различные агроприемы, включающие борьбу с переносчиками и ре-зерваторами инфекции, могут лишь ограничить скорость распространения вирусов, поэтому лишь использование здорового посадочного материала позволяет значительно повысить продуктивность.

Наиболее перспективным методом получения посадочного. материала, свободного от большинства вирусов, в настоящее время считается сочетание методов термо- или химиотерапии с методом культуры апикальных меристем in vitro. Этот метод нашел применение для получения свободных от вирусов растений самых разнообразных вегетативно размножаемых растений, имеющих важное сельскохозяйственное значение, таких как плодовые и ягодные культуры, картофель, ряд цветочных культур. Применение этого метода требует разработки достаточно эффективных методов регенерации растений из апикальных меристем.

6.1. Индукция адвентивного побегообразования нэ почек сахарного тростника

При разработке эффективной технологии оздоровления растений с использованием культуры меристем в первую очередь возникает проблема получения достаточного количества активно растущих меристем. Для ряда культур, таких как картофель или земляника, эта проблема решается относительно просто, в то же время для сахарного тростника, учитывая его биологические особенности, получить достаточное количество меристем нужного размера трудно.. , '

На первом этапе работы нами была предпринята попытка разработать методы получения достаточного количества адвентивных побегов

сахарного тростника в культуре in vitro для дЛлысеише! о их использования в качестве исходного материала при вычленении меристем

С этой целью использовали пазушные почки тепличных растении После поверхностной стерилизации верхние покровы почек удаляли и подготовленные таким образом »кспланты размером 10 1,5 мм помеша-1и на питательные среды

Приживаемость почек большинства образцов была достаточно высокой (18,5-22,6%) Только почки клона S giganteum приживались значи-течьно хуже (13,3°о) Самую высокую приживаемость v всех сортообраз-цов имели почки нижнего яруса В то время как у верхних эксплантов приживаемость была самой низкой Кроме того, определенную роль играет удаленность почек нижнего яруса or апекса побега

Количество побегов от одного экспланта также было выше у нижних почек, хотя зависимость этого показатепя от происхождения экс-пинта была меньше, чем приживаемость (рис 1)

|*ис I Н 1ИМНИС 414-1UHO Н1лс<!1ни iuСИ |лн I а и i ф* р ч ировинне Я |веН!ИН|Н.Ц 1Н»СС1'1И

6.2. Сортовая реакция на оздоровление методом культуры верхушечных меристем

Как известно, для целей освобождения от вирусов, как правило, используют апикальные меристемы, оптимальный размер которых зависит от особенностей той или иной культуры, набора используемых сортов, степени зараженности вирусными заболеваниями, регенерационных способностей выделяемых меристем, используемых питательных сред и других факторов. •• .

При оздоровлении для регенерации растений в культуре in vitro обычно изолируют конус нарастания с 1-2 листовыми примордиями (зачатками) субапикальной меристемы. Размер выделенного экспланта обычно колеблется от 250 до 500 мкм. Увеличение размера выделенного экспланта приводит к увеличению количества полученных растений, но уменьшает возможность иметь растения, освобожденные от вирусной инфекции.

Размер эксплантов определяет их приживаемость и дальнейший органогенез. В то же время, чем меньше размер меристем, тем больше гарантия, что в клетках меристем нет вирусных частиц, но тем труднее получить из такой меристемы целое растение.

Исследования регенерационной способности эксплантов в зависимости от сортовых особенностей у образцов сахарного тростника проводили с верхушечными апексами размером 0,2-0,7 мм, выделенными из' адвентивных побегов, в каждом варианте высаживали по 20-30 апексов. Результаты этих исследований по сортам приведены в табл. 7.

Таблица 7

Регенерационная способность меристем сахарного тростникаразличных сортов '

Погибло апексов, % Характер роста, % Получено

Сорт от инфекции в процессе культивирования ■ стебель, лист каллус растений, %

СО-421 7,6 47,8 39,0 5,6 29,1 „.

PR-980 4,3 48,8 . 40,9 6,0 34,2 '

POJ-2878 4,1 60,2 32,7 3,0 27,3 ;

S.giganten . 4,9 92,2 2,9 0,0. 2,0

Достоверность различий Рф< Fos Рф> Fos Иф> Fos ■- .F4,<Fo5 F»> Fos

Наиболее высокий процент регенерации (34,2%) имели апексы сорта PR-980. Наименьшей регенерацией in vitro обладали апексы клона S.giganteum. Сорта СО-421, POJ-2878 имели среднюю регенерационную

способность Различия в регенерационной способности меж чу сортами статистически значимы (Р<-0,05)

Следует отметить, что у всех сортов, кроме клона S giganteum, было отмечено образование апексами каллуса И хотя апексы, формировавшие каллус, довольно часто давали и «обеги, а процент каллусообра-зования по сортам не превышал 6° о, зто явление следует считать нежелательным, поскольку формирование каллуса существенно затягивает период регенерации растений Кроме того, растения-регенеранты, полученные от каллуса, могут нести генетические изменения и очень часто отличаются от исходных растений по биохимическим, морфологическим и другим признакам

6 3 Опреде tenue pat мера jkcnaauma, обеспечивающего освобождение растении от вирусов

Оздоровление - процесс длитечьныи и трудоемкий, поэтому стедует критически оценивать имеющиеся данные о его эффективности Одним из самых важных моментов при оздоровлении растении от вирусов является определение оптимального размера вычленяемых меристем, обеспечивающих, с одной стороны, высокую приживаемость и достаточный выход растений, а с другой - эффективное освобождение от вирусов

В тгон связи в своей работе мы изучали влияние размера вычленяемого экспланта на приживаемость вирусов Для этих целей использовали экспланты размером от 0,1 до 0,7 мм Для культивирования использовали среду MCR 5 (табл 8)

Очень мелкие экспланты размером 0,1-0,15 мм практически полностью погибали на ранних этапах культивирования, вероятно, вследствие высокой травмируемости при вычленении и поэтому данные об этих эксплантак не рассматриваются

Наблюдения за ростом и развитием меристем показало, что увеличение размера экспланта приводит к существенному увеличению приживаемости меристем и, соответственно, к более высокому выходу растений

Наиболее ярко это проявилось у S giganteum Меристемы этого клона приживались чрезвычайно плохо и даже при размере 0,5-0,7 мм из них были получены лишь единичные растения, которые не укоренились и в дальнейшем погибли При использовании более мелких эксплантов не было получено ни одного растения

Анализ полученных растений на присутствие вирусов с помощью метода иммуноферментного анализа показал, что все растения, полученные из эксплантов размером более 0,3 мм, содержали вирусы Были обнаружены вирусы SCMV, BYDV, BYMV, AMV, ALMV

Среди растений, полученных из эксплантов рашером 0.2 0,3 мм выход свободных от вирусов составлял у сорта POJ-2878 - 42,9" а у сорта

СО-421 - 75,0%. У сорта РК-980 даже использование эксплантов такого размера не позволило получить свободные от вирусов растения. В растениях этого сорта, полученных из эксплантов размером 0,2-0,3 мм, было ' обнаружено присутствие вирусных частиц 5СМУ и ВУОУ.

Таблица 8

Регенерационная способность и выход здоровых растений у сахарного тростника в зависимости от размера и экспланта

Размер Погибло апексов, о/ -1» Характер роста, % Получе-

Сорт эксплан- от в про- стебель, каллус но

тов, мм инфек- цессе лист растсни

ции культи- й

вирова-

ния

СО-421 0,5-0,7 11.1 22,2 "* 55,6 11,1 46,3

0,3-0,5 8,3 36,7 54,2 0,0 43,8

0,2-0,3 3,7 70,4 22.2 3,7 13,0

1>1*-980 0,5-0,7 7,1 17,9 71,4 3,6 55,4

0,3-0.5 4,2 37,4 54.2 4Д 47,9

0,2-0,3 0,0 67,9 32,1 0,0 26,8

РСи-2878 0,5-0,7 П.1 37,1 48,1 3.7 42,6

0,3-0,5 3,1 53,2 40,6 3,1 35,0

0,2-0,3 5,9 61,7 32,4 0,0 27,1

S.giganleum 0,5-0,7 6.5 90,3 зд 0,0 2,3

0,3-0,5 5,7 91,4 2,9 0,0 2,0 '

0,2-0,3 2,6 94,8 2,6 0,0 1,8

Достоверность Рф< Рол Рф<Ро? Р*> Р05 Р»> Ро5

различий

Таким образом, проведенные исследования показали, что приживаемость эксплантов разного размера и выход растений регенерантов при культуре меристем, а также количество свободных от вирусов расте- • ний в значительной степени зависит от сортовых особенностей. При использовании меристем размером 0,2-0,3 мм у отдельных сортов удается^ получить безвирусные растения. Однако значительно увеличить выход и надежность получения таких растений можно, по-видимому, путем соче- . тания метода культуры меристем с термо- и химиотерапией. \

Отмеченные сортовые различия в результативности оздоровления ;. связаны с физиологическими особенностями сортов, которые определяют разное содержание фитогормонов в тканях растений; например, аук-

сипов, способствующих более интенсивному росту и делению меристем, количество митозов в единицу времени и другие показатези Апатомо-морфологические особенности, например глубина проникновения в апекс элементов флоэмы и ксилемы, проникаемость апоплаеза также могут иметь энд 1ение Сама устойчивость copra, несомненно оказывают влияние на резузьтативность оздоровления сахарного тростника от вирусов

Таким образом, в резутьтате проведенных исследовании покаина возможность инфицирования bCMV посредством видов векторов, для которых сахарный тростник не является основным кормовым растением В настоящее время получено много фактов, свидетельствующих об эффективности передачи вирусов »«специфическими видами вируса карликовой мозаики кукурузы - Maize dwart mosaic virus (MDMV) - передаются 22 видами тлей, из которых только 7 использчют в качестве кормового растения кукурузу

ВЫВОДЫ

1 По данным вирусологических анализов на образцах сахарного тростника выявлены следующие вирусы Sugar cane mosaic virus Barley yellow dwart virus. Alfalfa mosaic virus. Tobacco mosaikv. virus. Bean yellow mosaic virus

Показано, что доминирующим компонентом комп ккснои инфекции является Sugarcane mosaic virus Вирус идентифицирован биологическим методом, посредством переносчиков, методами иммунноферменг-ного анализа, иммуноблоттинга, полимерашои цепной реакции и лек-тронной микроскопией

2 Опытный изолят вируса мозаики сахарного тростника отнесен к группе штаммов, вызывающих тяжелую мозаику (размер частиц 15x620 нм) Точка термической инактивации составляет SO S2°C, инкубационный период 21-23 дня при передаче векторами от 12 до 22 дней

3 Доказана возможность передачи вируса мозаики сахарного тростника двумя новыми видами пей Aphis fabae и Hyalopterus. pruni

4 Способностью к передаче обладают крылатые и бескрытые стадии тпей Минимальный период для потучения вирофорности составляет 30 сек При увеличении срока подкормки на допорном растении эффективность передачи повышается

5 Выявлена восприимчивость пречетавите теп р Тгтсеп к вирусу мозаики сахарного тростника, иммунных образцов к ттям векторам не выявлено

6 На основе изучения особенностей регенерации растении сахарною гроезника из апексов разработана техтпотия по пчения бсзнир^иьи растении с учетом оптимального сочетания иш радием юв пи ra re п.ных сред и четовий культивирования для осуществлении ТВУХфаШОЮ меюда

регенерации растений, позволяющего сократить сроки получения растений-регенератов. •

7. Показана возможность использования адвентативных побегов in боковых пазушных нижних почек растений сахарного тростника для получения достаточного количества меристем необходимого размера.

8. Определены оптимальные условия регенерации растений из меристем для трех сортов сахарного тростника. Размеры эксплантов, обеспечивающие максимальный выход растений, освобожденных от вирусов, составляет 0,2-0,3 мм, при этом достигается достаточно высокая приживаемость апексов. ■ ■ ,

Опубликованная работа по теме диссертации:

Калинин A.B., Сирнрам А., Помазков Ю.И. Роль фитогормонов в регуляции процессов морфогенеза у сахарного тростника // 4-я Международная конференция «Регуляторы роста и развития растений». Тез. Докл. - М.: МСХА, 1997. - С.294.

Объем 1 п л

Заказ 694

Тираж 100

127530 Москва Тимиря^ж-яии V.! 44 Типография И^»тельч.тва .ЧОСА