Особенности молекулярной структуры некоторых последовательностей ДНК, участвующих в перестроениях генома, и проблема пространственной организации хромосом в ядрах клеток человека

Карпухин, Александр Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности молекулярной структуры некоторых последовательностей ДНК, участвующих в перестроениях генома, и проблема пространственной организации хромосом в ядрах клеток человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности молекулярной структуры некоторых последовательностей ДНК, участвующих в перестроениях генома, и проблема пространственной организации хромосом в ядрах клеток человека"

•РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На мрпппх рукописи

КАРПУХИН Александр Васильевич

особенности молекулярнои структуры некоторых последовательностей дик, участвующих в перестроениях генома, и ир01.лема пространственной ор! анн тлцип хромосом в ядрах клеток человека

А и т о р с ф е р а г диссертации на соискание ученой степени доктора

биологических наук

03.00.15 - Генетика

Москва 1996

Работа выполнена в Медико-генетическом научном центре ['АМН.

Научный к о н с у .1 ь I а н з доктор биологических наук, профессор Сшпковский Д.М.

О ф и ц и а л ь н ы е о л п о н е н ) ы:

доктор биолошческих наук, профессор Акифьек А.Г!.. доктор биолошческих наук, профессор Киселев Ф.Л.. доктор медицинских наук, профессор Кулешов Н.П.

Ведущее учреждение Институг общей генетики РАН им. Н.И.Вавилова

Защита диссертации состоится " ^ " ______ j 995 r

в /¿час.&& мин. на заседании Диссертационно!» concia (Д. 001. Ki. 01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Цешра. Автореферат разослан " " _______1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Кури, ю

окщля хлрлктнристикл рлкоты

Амуалышсть проблемы. Значительное число нарушении генома человека.

приводящих к серьешмм меликоленет нческим послелсгвиям. составляют pai.niMni.ic иересфойки хромосом (Кулешов, Лурье. 1984). Давно отмечено, чю ли перестройки не рассеяны произвольным образом по хромосомам; существует набор районов хромосом, нарушения которых происходят наиболее чаек). Такие районы » т1|1ср.н\рс ман.шакн Торячпмн" точками. Дчя выяснения особенностей ДНК, обусловливающих leiio.Mnyio нестабильность, в молекулярно-генетичееких исследованиях пч вычеляют m участком перестроения хромосом н ичучаюг cip>Ki\piivio opianii taniiio. Эш исследования дали спои плоды: накоплен значительный фактически)! материал и известны некоторые характеристики перестраивающихся фра!ментов ДНК. включ;ш роль повторяющихся элементов генома и так называемых сигналов перестроения (рекомбинаций, делений и т.д.). Однако, полученные данные ноки не дали оснований к формулированию общих еноппв нестабильных в составе хромосом фрагментов ДНК. Потому решение paccMaipnnaeMOH проблемы некоторыми исследователями связываемся с поиском наиболее общих члрамериетк несчабидыюсш. Так, Д.П. Акнфьев и соавюри па m повапнп проведенных исследований пришли к выводу о локатиашы |по крайнем мере, в основном) Пересi рттаюшихся при обменных хромосомных аберрациях ДНК н учаоках крепления последних к ядерному магриксу (Akifyev, l'»l>5). '>ш peiymiaii.i. наряду с данными друтих авторов, указывают пущ ,iaii.neinnem апалича мехашпмов нарушения хромосом и свопе I в нестабильных в геноме участков ДНК. С точки ¡рения непосредственного медико-генетического значения весьма cymeci венным moi/io бы быть выявление, помимо фм) laMt'Hia н.ных та чип. признаков структуры нестабильных учаелков ДНК. способных служить их маркерами. Только за последние три года в мире секвсиировапо около 100 миллионов пар нуклеотидов ДНК и проблема их анализа спим достаточно остро (Ubcrbacher. 1496). Выявление среди них нес Iafin |ьны.х последовак'лыюслей ДНК имело бы не только научное, но и прампческое чиаченне в качестве источника зондоп для медико-генетической диагностики. С другой стороны, обнаружение и комплексное изучение нее 1,|бн и.пых ДНК. облачающих некоторым набором общих признаков. може) бы п. применено и для .жеперпмешачьнот выделения предрасположенных к nepeeiроению фратенто» ДНК. Такие фрагменты, часто локализующиеся п некочируюших учаежах н-иома. moi^i обладать подобием (Golilbergcr et al., |ЧО(,,

Возвращаясь к механизмам межхромосомиых перестроек, еледусч отмстить, чю н.х спектр в значительном степени взаимосвязан с расположением хромосом в пшерфачноч ядре как при индукции соответствующими воздействиями, так и при

спонтанных межхромосомных обменах (Hagei et al.. 1982; Kotfurti. Chaganii. 1988). Современные данные демонстрируют взаимосвязь мпошх процессов функционирования генома с компартментачтаниен шперфазнот ядра п определенной пространственной организацией хромосом в ядре (MamieliiiK. 1<)9(): НааГ. Schmid. 1991; Crcmer et al.. 199.V. 19%; Sharp. 1994). И юм числе, межхромосомные обмены осуществляются только, как полагаю!. при наличии пространственной близости взаимодействующих последовательностей ДНК в интерфазных ядрах соматических или зародышевых клеток </\kifyc\.

Следовательно, для понимания процессов, приводящих к межхромосомным перестройкам, недостаточно знании о оруктуре потенциально нестабильных ДНК. Необходима информация о пространственной орпшизапии хромосом в нптерфазном ядре. Вместе с тем, имеющиеся п .'штс/кнуре сведения о конкронмх парамефах взаиморасположения хромосом отрывочны п неполны. Эш связано со сложностью изучения трехмерно ор1апизованнок> иитерфазною ядра, хромосомы в котором, хотя и занимают определенные компактные территории, но не поддаются непосредственной визуализации. Вследствие лот net«» (можно, например, ответить на вопрос: соответствует ли наблюдаемое |р>ипировапие хромосом по частотам взаимных обменов действительному характеру взаиморасположения хромосом в интерфазных ядрах лимфоцит» человека? Способны ли некоторые аиеуплондии. обусловливающие, и частности, повышенную частоту хромосомных перестроек, приводить к тиснению пространственной организации хромосом? Определенные свидетельства в пользу этого имеются, но полученные достаточно косвенными способами. Имеете с icm4 определение параметров взаиморасположения хромосом в нптерфазном ядре и наличия их изменении внесло бы вклад и в понимание особенностей функциональною выражения генома при ряде генетических патоломш.

Цель работы. Изучить молекулярные и пространственные чаракк-риаики организации ДНК генома человека, снятатше с хромосомными и;>р\ шениями.

1. Изучить структурную организацию выделенною участка ДИК lemma человека и признаки его потенциальной нестабильности в ichomc. Пронести сравнительный анализ выявленных признаков структурной орктпзацнп изученных фрагментов ДНК с таковыми для некоторых известных нестабильных последовательностей ДНК.

2. Предложить подходы и разработать способы изучения ipcxMcpnoii организации хромосом в интерфазном ядре. Разработать новые иффекшг.пые методы иералиоактивного мечеиия и детекпии шбридизациоппых зон шв.

3. Изучить параметры расположения прпиопромерных участков хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов человека в норме и при болезни Дауна.

Н и > ч I! а я_н од| и па,

1. При комплексном анатизе попои выделенной последовательности ДНК усI.нюнин набор признаков. связанных с нестабильностью участков ДНК в 1споме. Н част пост, ночучепы данные, свпдеючьсчвуютие о взанмоевяш опре 'именным обр;ном расположенных прямых повторов нуклеотндов со (.шик Iпамп псаабнльносш <|>ра1 мешок ДНК. На основании полученных результатов предложен механизм образования прямых поптороп и иеиабпльных »часIках ДНК.

2. Покачано, чго осиоппое число прпнентромерпмх районом хромосом п шперфашых ядрах лимфоцитов человека располагается ибдпзи ядерной мембраны, подразделяясь на несколько фупн сближенных хромосом. Данный результат может объяснить паблюдающеесд группирование хромосом по частотам взаимных обменов.

.1 Гомологичные хромосомы в интерфачных ялрах лимфоцитов человека раенолаишпея относительно друг друга различным. но не произвольным образом. Наличие упорядоченное ги указывает на неслучайный характер »¡аимолействия мши .ни ичпых хромосом п ишерфазном ядре. Лимфотны человека по танчорасноложеннт гомолотв хромосомы 1 подразделяются на несколько ! р> пп.

4. Ансунлонлия при болезни Дауна приводит к изменению некоторых парамефои взаиморасположения хромосом и интерфачных ядрах лимфоцитов, что може I бы п. существенным для понимания механизмов комплексного изменения феношпа при данной патологии, а также связанным с повышенной частотой индуцированных хромосомных аберраций.

5. Указанные выше результаты получены с использованием полого, ра'.раГнмапчон) и данной раГние. способа анализа трехмерной органшанпп ядра.

I Ьиоження, пыносимые на заицщ

1. Изученная новая последовательность ДНК имеет признаки нссмабилыюсти. выраженные п измененной структурно!! организации известных повторяющихся элементов, содержании последовательностей ' нуклеотилов, ошосяшихся к синодам перестроения. Она предстаатена в некоторых пссгабнтьныч учаечках хромосом и идентифицирована как содержащая участки крепления к Матриксу. Ра¡личные прямые повторяющиеся последовательности нуклеотдов (прямые повторы) >апнмаюг около 60% данною фрагмента ДНК н определенным образом неслучайно распределены. Сочетание некоторых ич комплекса указанных признаков обнаружено в строении проаначизированпыч и шестых нестабильных ДНК.

2. Изученная структурная оркшичапия выделенной последовательности ДНК к характер размещения прямых повторов показывают, что наиболее

вероятным механизмом их образования являются неравные рекомбинации гомологичных участков хромосом.

3. Хромосомы в интерфазных ядрах лимфоцитов человека оришизованы неслучайным образом. Прицетромерпые районы основною числа хромосом располагаются вблизи мембраны ядра, образуя несколько групп сбзнженных районов с меньшими, но сравнению с межфуниовыми, расстояниями.

4. Гомологичные хромосомы в интерфазиых ядрах лимфоитов человека разметены ошоситсльно друг друга также неслучайно, но пон>ляиин лимфоцит» неоднородна но данному параметру организации ялра. По ошосшслмюй близости ириментромерных районов юмолоюп \ромосо\1ы I лимфоцит человека подразделяются на несколько групп.

5. При болезни Дауна пространственная организация хромосом в интерфазных ядрах лимфоцитов изменена. Наиболее выраженными являются изменения расстояний между группами сближенных прииептромериыч районов хромосом.

Практическая значимость

!. В процессе выполнения иаезояшею исследования разрабоыны новые способы нерадноактивното мечения и детекции, на которые получены четыре авторских свидетельства на изобретения. Часть способов, а также paipaooiannt.ic пгбридизационпые технологии нашли применение в ряге мелипипекпх учреждений язя диагностики. По заданию ГНТП "Геном человека" создана система нерадиоактивного мечеиия и флуоресцентной детекции тбрнднзании in siiu.

2. Разработай способ исследования трехмерной организации интерфазного ялра, позволяющий определять трехмерные координаты маркированных ччасткоп хромосом по измерениям па проекции.

3. Полученная информация о структурной ориентации исаабпльных и геноме участков ДНК создаст основу для выявления попе ших сре ш (^охарактеризованных секвенироваиных ДНК. а новая пьпелоииая последовательность ДНК может быть использована .чля jKcitepituni ia.шипи выделения потенциально нестабильных фрагментов.

4. Данные об упорядоченном расположении хромосом в ншерфазноч мзре позволяют объяснить некоторые наблюдаемые характеристики межчромоеочиых обменов, а обнаруженное изменение параметров пространственной opianmamin хромосом при болезни Дауна может быть одним из механизмов, влияющих ну фенотппичеекое выражение ¡еиетических особенностей при данной илголоиш.

Апробация работы. Основные результат диесеркшиоипон р^бош были доложены на: Первом Всесоюзном сьезле медицинских к'нстнмт 11'>8Л). 1<>,я Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (1484), V Всесоюзно*] сьезле ВОГИС (19871, IX Всесоюзном симпозиуме "Структура и фчикпин

кле точною ядра" (1987). Г'" и 2"и Всесоюзных конференциях "Современные направлении со'шанпя мелицинских днамюстикумов" (1988; 1990). VI Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (1988), проблемном семинаре "Просграновсннаи организация клегочною ялра" (1989). 22nii Symp. of C>iOL4,neiie<; (Rratisla\a. 1989). 2"4 Всесоюзном совещании по использованию ДНК- и РНК-зондов (199»), 7,h Symp. "Peilialric oncology" (Weimar. 1W0). И Всесоюзном съезде мелицинских leiicniKOu (1990), конференциях "Геном человека" (1990; 1991; 1993; 1994; 1996), Первом Российском съезде мс.чинкнских (снетикоп (1494).

Структура н объем работы. Диссертация состоит из "Введения", разделов "Обзор литературы". "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "'Заключение". "Выводы" и списка цитированной литературы из 341 наименования. Работа изложена на 313 страницах, включая 72 рисунка и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В pafioie использованы молекулярно-iспстичесхие и цитогенетические юмременнме меюзы.

Для исследования клопы отбирали in Not |-связуюшей библжнеки ДНК хромосомы 3 человека (Zabarovsky el al., 1990) с использованием в качестве «шла нослеловательности ДНК. преимущественно представленном в при кюмерпмх районах хромосом. Дтя изучения клонированным фра1мснг ДНК был выбран на основании картирования при гибридизации in situ. Его секвенированне осуществлено с использованием как субклоиирояаиия. гак н меюлом получения делений с использованием автоматическою секиенатора фирмы "Фармаиня" (совместно с В.М. Захарьевым).

В работе использованы следующие ДНК-зонды. Специфичный для прицепipoMepiioio района хромосомы 1 клон pRT30l (предоставлен Н.В. Томилиным). содержащий переклонированнуто вставку специфичной для lql2 eaiejiличной ДНК (Cooke. Hindley. 1979). Специфичные для прицентромерных районов хромосом 9 и 16 клоны pHuR98 и pHuRI95 предоставлены R.K. Moyzis (Moy/is et al., 1987). Клон pHY2.1 специфичен для хромосомы Y (Bums et al., 1985; предоставлен McGee). Мечение ДНК биотипом произведено с помощью разработанною способа (Авт. свил, на изобретение N 1443404) и на основе синтезированных Н.Н. Вейко реагентов.

Лимфоциты выделяли из свсжеиолученной периферической крови человека и фиксировали холодной смесыо метанол/уксусная кислота (3:1; обч.смное соотношение) в суспензии. Препараты метафазных хромосом были приготовлены стандартным нитогенетическим методом. Лимфоциты пациентов с болезнью

Дауна были кариотипированы и наличие добавочной хромосомы 21 уиаПовлепо. В данном исследовании' все процедуры выделения и обработки клеток проведены параллельно для крови здоровых доноров и пациентов с болезныо Дауна.' Изучено 4 пары. '

Денатурацию ДНК препаратов клеток и хромосом осуществляли в растворе 70% формамида!'2*SSC ири 70°С в течение 2 мин. Гнбрилизапиопная смесь солержача 50 - 60% формамида (в зависимости от требуемой жсокоон). О..4M NaCI. 50 мМ фосфата натрия. pH 7.0. 10% декегран сульфата, олпократый раствор Денхардта бет альбумина. 100 иг/мл биотинилированного ДНК-зопда и 10 мг/мл I РНК K.coli в качестве носителя. После гибридизации препараты отмывали дважды но 20 мин. в растворе 50% формамила/2х55С ири 45°С и трижды в 2xSSC при комнатной температуре.

При гибридизации в присутствии ДНК. конкурентной для повторяющихся последовательностей, пробу,' смешанную'с Cotl ДНК, денатурировали 30 мин. при 37°С для реассоииации повторяющихся последовательностей (Косг и соавт.. 1994).

Для получения дифференциальною окрашивания метафазных хромосом использовали методики с введением в культуру лимфоцитов 5-бромлезокснуридина в концентрации 0.18 мг/мл на 16 часов (Pan ci al.. 1ЧЧ0). Препараты отмывали дистнлированной водой, окрашивали Hoechst 33258 (0.1 мкг/мл, 15 мин.) и отмывали. 'Затем облучали УФ-сsei ом <365 им) в течение 10 мин. (время подобрано экспериментально) и помешали в раствор Эрла (pll ft.5) при 87°С на 2 мин. Для получения R-окраски окрашивали политом нрони.тня (Cherifet al., 1990; Кост и соавт., 1994).

Детекцию осуществляли с использованием конышпгл ареитавитнп-шелочная фосфатаза либо авидин-FITC. Для усиления сшнала применяло биотинилнрованные антитела к авидину.

Для измерений при микроскопических исследованиях использована система анализа изображений IBAS II (Kontron. ФРГ) с микроскопом Axioplane (Opton, ФРП и видеокамерой (JSS 77СЕ). Система обеспечивает 256 градаций шкалы серого уровня и матрица изображения содержит 512x512 элементов (pixels).

Для определения взаимосвязи трехмерных параметров расположения маркированных хромосом в интерфазном ядре с измеряемыми на проекции двухмерными параметрами, была разработана и использована математическая модель. Созданный алгоритм реализован в виде программы для персонального компьютера (выполнено совместно с С.А. Карпухиным).

Программа позволяет исследователю располагать имитирующие меченные участки хромосом точки нужным образом в пределах сферы и ортoroiiaui.no проецировать их положения на плоскость. В каждом акте проецирования сфера ориентируется случайным образом.

■ На проекции определялись: расстояния каждом точки от центра проекции сферы; расстояния и утлы между точками. Подученные распределения измеренных параметров сравнивались с параметрами, заданными в пространстве сферы. Возможная вариабельность положений гибридизационных сигналов или иных меток под влиянием случайных факторов была учтена в модели введением флуктуации точки относительно среднего положения. Отклонения точки задавали в соответствии с нормальным распределением при выбранных значениях дисперсии. Теоретические распределения получали при 100 000 - 500 000 проецирований. Эти распределения являются практически "идеальными", что подтверждает сравнение результатов с аналитическими функннями.

Чтобы отразить вариации распределений, получаемых в эксперименте вследствие ограниченного объема выборки, определены границы, в которых могут находиться распределения из-за указанных вариаций.. Критерии границ аначогичны описанным ранее (Emmerich et al.. 1989).

Статистическую обработку ретудьгатои вели стандартными методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

( )ощан ^характеристику__выждеинуй___л едови «у j ыг о<л _Л11К.,

Изученный в работе клон NLI247, выделенный из клонотеки хромосомы 3 человека, при нералиоактивнон гибридизации in situ в присутствии избытка конкурентной ял я повторяющихся последовательностей ДНК (Cot 1 ДНК) имел ряд участков тибридизации.

На хромосоме 3 наибольшую интенсивность гибридизации наблюдали в районах Зр21, Зр25-26. а также в районах 3q25 и 3ql3 (приведены н порядке уменьшения ннгенспвност и мечення; выполнено совместно с Л.И. Федоровой, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта). Все указанные участки гибридизации, кроме 3ql3, относятся к наиболее часто перестраивающимся (нестабильным) районам хромосомы 3 (Mitelman et al., 1991). Присутствие последовательности NLI247 в нестабильных районах хромосомы 3 свидетельствует о ее возможном участии в процессах перестроения. На хромосоме 1 человека при гибридизации с NLI247 также выявлены гпбрилизанпоннме сигналы, локализованные в нестабильных участках 1р31-32 и lc\31 (Milclman et al., 1991). То есть, пять участков гибридизации совпадают с районами наиболее частых перестроек хромосом 1 и 3; только один их гибридизушшихся, причем с наименьшей интенсивностью, участков указанных хромосом не относится к таким районам. ДНК фрагмента NL1247, возможно, расположена в Зр21, поскольку указанный фрагмент образует коптит' с участком ДНК. картированным в Зр21 (EMBL/GenBank. Z22347, HS ARG). Данный район .хромосомы 3 подвергается транелоканиям. делениям. Эти перестройки

ассоциированы с раком легких; предполагается наличие в укачанном районе icna-супрессора этого заболевания. Возможна взаимосвязь перестроек и noiepn гетерозиготности в Зр21 и с другими типами патологий.

Выделенный фрагмент был секвснпрован (EMBL/GenBank: .485232 и Х85231) и изучена его структурная организация. По построению клонов (Zabarovsky el а!.. 1990) и в силу наличия в выделенной последовательности места рестрикции Sal I. она была частично делегирована и мы имели два реально разнесенных в геноме фрагмента с размерами 2868 п.н. (NLI247S) и 630 п.н. (NL1247N). Расстояние между ними может быть оценено исходя in размеров клонированных фрагментов в пределах 4 - 8 т.н.п. Первоначально был рассмотрен более длинный фрагмент (Х85232), обозначенный как NLI247S.

Анализируемая ; последовательность ДНК размером 2868 н.п. (пар нуклеотндов) относится к АТ-богатым (fA+T]/[G+C]=1.48). не имеет протяженной открытой рамки считывания и содержит известные повторяющиеся элементы -два А/и, MIR, MIR2 и MER42. Элементы Л/и составляют приблпзтельно УУг некодирующих последовательностей со средним расстоянием 4 т.п.н. (Moyzis et а!., 1989). В исследуемом фрагменте ДНК (меньшего размера) находятся два элемента Л/и и еще три известных повторяющихся элемента, представленность каждого из которых в геноме как минимум на порядок ниже. Это укапывает на обогащсмность данного фрагмента повторяющимися последовательностями ДНК. Ни один из перечисленных повторяющихся элементов не относится к полноразмерным: четыре из них делетнрованы с одного или с обоих концов. МНК42, входящий в семейство LI, перестроен более сложным образом. Велел за начальными 90 п.н. находится протяженная деления, а близкий к друюму концу фрагмент размером 21 п.н. инвертирован.

представления о процессах, проходивших в данном фрагменте ДНК, проведен анализ прямых повторов. Рассматривали блоки, содержащие восемь и более нуклеотндов, повторенные без замен (совершенные прямые повторы). Обнаружено 108 пар повторенных последовательностей размером от 8 до 24 п.н. Принимая во внимание размер фрагмента (2868 п.н.). получаем, что каждые 100 и.и. в среднем содержат около 8 повторенных нуклеопшных последовательностей или. иными словами, прямые повторы занимают более 60% данною фрагмента ДНК. Насыщенность разнообразными прямыми повторами укагывает на интенсивность перестроек (Kotchanov, 1994). Для изучения механизма перестроек анализировали расположение повторов. Распределение частот их встречаемости не обнаруживает статистически значимого отличия от равномерною распределения. В то же время, гистограмма расстояний между одинаковыми последовательностями (пары прямых повторов) статистически значимо отличается

И]!,il ill 11,1,ПН,I

— — — — C* Oí Ci W

Расстояние (п.н.)

Рис. I. Гистограмма расстояний между прямыми повторами

oí равномерною распре teлспия (Р < 0.001: опенка по и имеет несколько пиков (рис. I).

Из noeiроенной диафаммы расстояний между повторами в соответствии с их положением, а также других видов обработки данных следовало предварительное заключение о наличии определенных закономерностей расположения. Исходя из эюго был проведен аназиз распределения прямых понюров но (идельным участкам фрагмента ДНК с использованием следующего приема. Начиная с первых нуклеотидов последовательности ДНК, на основании предварительного аначиза выделяли участки, находили в них прямые повторы, имеющие пару за пределами участка, и анализировали распределение вторых членов пары по остзьной длине фрагмента ДНК. Преимущественную локализацию вторых членов пары статистически оценивали по x2"KP,nePliw-Найдены ipil нары участков, обогащенных определенными группами повторов в соотвегствин с указанным критерием и одна пара с уровнем значимости несколько ниже принятой i рамииы в 5% (табл. 1).

Расстояния между парами участков, оцененные по положению их середины, составляют 400, 1000. 1350 и 2100 п.н. При сравнении указанных величии с инками шетограммы па рис. 1 видно их совпадение (в районе 400 п.н. наблюдается плечо).

ТиО.тца /

Расположение прямых повторов в анализируемом фратенте ДНК

Расположение первого набора повторов

436 - 602 1203 - 1407 6 - 372 562 - 788

Расположение второго набора повторов

717 - 1124 2586 - 2721 1993 - 2565 1445 - 1906

Доля второю набора повторов, попадающая в указанную область)

наиденная во

фратенте

83.3 70,0 56.6 66.6

рассчитанная для

равномерною распределения 18,0

9.3 23.0 22,2

Лосшпер

HOC1 ь

отличия по кршерпю /

I' < 0.05 /' < 0.001 Г < 0.01 Г < 0. !

Примечание. Первые, по порядку встречаемости от начала фрашеша ДНК. и повторенные далее пуклеотидные последовак'льиосп! огнпн;|чсны как мерным м шорой наборы повторов соответственно.

Кыло проведено также определение локальных мест скопления повторов. Обнаружено три достоверно выделяющихся участка. При средней плотности повторов, равной 8 на 100, нуклеотидов в интервале 968 - 991 и.и. плошость составила 30/100нуклеотидов (Р < 0.001), в интервале 1893 - 1947 п.и. - 14.8 (Р < 0.05) и в интервале 2261 - 2396 п.н. - 12.6 на 100 нуклеотидов (Р < 0.05).

Полагают, что АТ-богатые фрагменты ДНК размером в сотни п.н н с содержанием AT более 65% в основном принадлежат к участкам прикрепления к ядерному матриксу (Saitoh, Laemmli, 1994). Такие участки именуют SAR (scaffold associated region) или MAR (matrix attached region). К наиболее характерным и общим признакам SAR/MAR относят присутствие участков связывания топоизомеразы II (топо II), мотивов ATTA, АТГ'ГА и так называемых А и Т боксов (Gasser, Laemmli, 1987; Boulikas, 1992). Известны несколько консенсусов последовательностей связывания топо II. В анализированном фрагменте найдены последовательности, соответствующие всем трем тинам консенсусов. Но.тее подробно проанализированы топо II d (консенсус GTN|T/A|A|C7T|ATT'N.ATNN> и топо II V ( |A/G|N[T/C]NNCNNG[T/C]NGlGn |TN[T/C]N[T/Cl), поскольку данные консенсусы выяачены в перестраивающихся участках ДНК. Кроме тою. .тля

L_____I____

l>.2

\ \ \ Hill

I I

_J____L.

f t

♦ • « , »

II II II II

»» *• •

T fTI » « •« « ♦

III) I I IUI II IUI I J-1-1-1_1_I_t I '

M ».(• 0,я 1.0 1.2 1,4 1.6 I.» г,9 ?,J 2,4 2.6 i,8 I.1UL

111111 I I 1 t

А ЛЛЛЛ AAA A

TIT TT T T T TT T

t tt

Рис. 2. Представленность и расположение элементов, присущих участкам взаимодействия ДНК с матриксом (SAR/MAR)

^ - гопоичомерача II v:

♦ - гопоичомерача II d:

| - ЛТТЛ. ЛТГТА мошны:

Л. I А- и 'Г-боксы:

Т - ARS - пометы:

• - участки, у ¡капаемые а-иротеином; I.2.3 - учаоки крепления.

mimll V BoiMOAiia опенка последовательности е ючки зрения слеиени се способности к связыванию и расщеплению ДНК. Соответствующие расчеты были проведены с помощью специально созданной компьютерной профаммы, позиотяюшей проводить процедуру расчетов по всей последовательности ДНК с пин ом в I пуклеотид. Определяемая величина matrix mean характеризует способность к связыванию и растеплению ДНК топоизомеразой II с пороговым значением 0.315 (Spit/пет el al.. 1990). На рис. 2 нанесено местоположение последоваи'лыюсгей. удовлетворяющих критерию "сильных" мест связывания топо II и растепления данной последовательности (matrix mean > 0.36). Там же показано положение последовательностей нуклеотидов, соответствующих А (АЛТЛАА|Т/С)ААА) п Т ( ТТ[ Л ЛГ |Т | Т/А ] TT ( Т/А ] ТТ) боксам при юмодогии более 80%. Покашиы также места нахождения мотивов ATTA и АТТТА. Из рис. 2 видно, что в трех участках сочетаются все признаки SAR/MAR; содержание AT в них превышает 65%.

Ныло изучено присутствие в изучаемой ДНК некоторых других последовательностей, которые, по данным литературы, также могут часто воречаться в областях взаимодействия ДНК с матриксом. В частности; в ассоциации с ядерным матриксом находятся участки инициации репликации. В

качестве одной из последовательностей такого рола нами был пчят консенсус автономно реплицирующейся последовательности - ARS-злемента (A/T)TTTA(C/T)(A/G)TTT(A/T) (Murakami et al.. 1945). Эгог эземсит. как известно, обнаруживается в SAR/MAR ДНК человека (Глазков, 1995). Найденные в NL1247S последовательности, содержащие не более двух замен нуклеотпдов по отношению к консенсусу, расположены в районах, охарактеризованных выше как участки взаимодействия ДНК с матриксом (рис. 2).

Чтобы оценить возможное рсгуляторнос значение данною фрагмента ДНК определяли наличие в нем последовательностей связывания транскрипционных факторов. Д>1Я этого провели поиск с использованием программы Signal Scan (Prestridge, 199J), включающей постоянно обновляемые базы данных. С использованием базы данных IMD (Information Matrix Database) было найдено 297 мест связывания транскрипционных факторов.

Некоторые SAR/MAR имеют высоко упорядоченную организацию нуклеосом (фазированные нуклеосомы), характерную для негранскрибнруемых областей хроматина, находящихся на границе с активно транскрибируемыми областями. Фазирование нуклеосом может осуществляться посредством связывания негистонового ДНК-связываюшего белка - а-ирогеина, который взаимодействует с ДНК по последовательностям АААТАТС и ТТААТТС (Strauss. Varshavsky. 1984). В изучаемой последовательное i m ДНК обнаружено 2S мест связывания «-протеина, отличающихся от указанных выше последовагельностен не более чем на I нуклеотид. 24 из них локализованы и участках, охарактеризованных как области взаимодействия ДНК с мафиксом.

Итак, выявленная и рассмотренная совокупность признаков определяет клонированный нами фрагмент ДНК как относящийся к эдеме»гам SAR/MAR генома. Некоторые признаки, например, наличие значительного числа мест связывания транскрипционных факторов, указывают на возможную реиляторпую роль данной последовательности. В пользу этого говорит и обнаружение последовательностей, узнаваемых «-протеином, которое, как уже отечалось выше, может указывать на нахождение данной пегранскрнбируемой последовательности вблизи транскригшионно активной области ДНК.

SAR/MAR рассматриваются рядом исследователей в качееше участков генома, по которым осуществляются перестройки хромосом (Sperry el al., 1989; Akifyev, 1995). Структура и организация повторяющихся элементов п изучаемой последовательности ДНК также свидетельствуют об ее участии в процессах перестроения ДНК. В связи с этим имеет значение выявление факторов, способствующих таким процессам.

перестроения ДНК« Изучаемая последовательность была проанализирована на наличие таких значимых для перестроения хромосомной ДНК элементов.

" <х а -Л------1---1_1_I 1 1

»» I « 12 14 I 6 1.1

-1-1 и О и ■!

/ / /

Рис. V Представленность п расположение элементов. известных и качестве сишачов пересгроепия ДНК. ^ гонои зомераза II:

^ последовательности мнннсагсллити:

ц. мое чедовагсльноепт консенсуса гентамер-шшомера:

" ~ участки ттакгчпеппя последопатезыюстен. ушиваемых юноизомеразой I; • утасткн. \ '.макаемые («-протеином:

л теи тамер-но юбные ностедоиа1етыюс1 и:

С'1н-ио,юбные лемеши: и ткнештна тт.ные месит чадержмт молимеразы а.

2.«

Полеченные рс п.Iагы покачаны на рис. 3. На схеме нанесены положения совпадающих или наиболее юмолошчных из найденных последовательностей нуклеочндов.

Пзанмосвять рассмотренных нуклсотилных последовательностей с перестройками хромосом обоснована п ряд с работ. Следовательно, пч присутствие в N1.1247$ указывает па возможность перестроек данного фрагмента ДНК с участием обнаруженных элементов. Однако, поскольку нельзя исключить нашчне последовательностей, соответствующих сигналам перестроения, и в иронию ».ном фрашеше ДНК, была определена вероятность сочетания некоторых рскомбнпаппонных признаков (тшличие и число синтачов перестроек) в случайных фрагментах ДНК.

С лой нелыо с помощью компьютерной протраммы образовывай! слутаппые нуклеошлные последовательности равною N1^12478 размера и определяли в них представленность СЫ-подобного элемента, последовательностей минисагелдита и узнаваемых «-протеином. Определяли вероятность появления каждою пришака в случайно!! последовательности. Вероятность сочетания признаков определяли как произведение вероятностей, найденных для каждого прншакд. Получено, что указанная вероятность не превышает 2 ■ 10'7. Учет

большего числа признаков будет приводить к дополнительному уменьшению вероятности их случайного сочетания.

Полученные результаты показывают, что насыщенность сигналами перестроек характеризует определенные последовательности ДНК (всрояшоеть сочетания таких признаков в случайной последовательности весьма мата), которые, учитывая суть анализируемых признаков, яшшются потенциально рекомбиногенными. Для реализации же перестроек хромосом необходимы и другие условия, в частности, близость рекомбиногенных участков ДНК в интерфазпом ядре, данные о параметрах организации которою будут рассмотрены далее.

Приведенные данные позволяют предположить, что прямые повторы мот возникать в результате взаимодействия двух гомологичных фрагментом ДНК. При дискретных сдвигах, соответствующих расстояниям между учаакачи ДНК (табл. 1) и пиками гистограммы (рис. 1), будет наблюдаться совмещение основного числа повторов (рнс. 4). Кроме участков скопления одинаковых наборов повторов отмечены положения и других повторенных последовательностей ДНК, указанные преимущественно в местах их повышенною содержания. Отмеченные на схемах повторы охватывают около .VI от н\ общею числа.

В качестве возможных механизмов, обусловливающих образование прямых повторов, следует назвать рскомбипанпп и ошибки репликации. После лине чаше всего приводят к делениям, но при определенных условиях способны вызывать и дупликации вследствие эффекта "скольжения" (slipped mispairing), обозначаемого также как переключение матрицы (template switching). Однако взаиморасположение прямых повторов свидетельствует против определяющею влияния ошибок репликации на их образование. Смешения синтезируемой и матричной цепей ДНК, способные привести к подобному размещению прямых повторов (рис. 4), трудно представить. В то же время, совмещение прямых повторов при выявленных сдвигах двух гомологичных фрагментов ДНК. указывает . на неравные рекомбинации как на основной механизм образования повторенных последовательностей в изучаемом фрагменте ДНК.

Были проанализированы структурные особенности, способные обусловить выявленные совмещения гомологичных участков ДНК при неравных рекомбинациях. Известны примеры сдвига гомологичных участков при неравных рекомбинациях вследствие взаимодействия повторенных нчктеотндных последовательностей.Такими повторенными последовательностями moist быть, например. Alu-элементы. В проанализированном фрагменте ДНК расстояние между двумя Alu составляет 950 п.н., что соответствует одному из взаиморасположений рскомбиннруюших ДНК (tío п.2 схемы на рис. 4).

1 'мЖй&.р " Т

; I .. I \ I_ШШ I_| h

' .' ' ' ' .

i ■

TPzavtaad-1->-

' ' 1 1

I.Vi'.V.'.'.V w

.....-.iT-

/ t

' '_I_I_I_I , ■ Ji

i-Ar-1-i-t-rX.

| i t | ) ; | t | '

' ' . \_!_1_l.

и PB M If

Рис. 4 ■ '

Схема ступенчатых совмещений последовательности ДНК в соответствии с размещением прямых повторов

-Совмещение положений участков, обогащенных набором одинаковы* пояторов, -совмещение участков повышенного накопления прямых повторов; -совмещение положения некоторых других прямы* повторов, -положение идентифицированных SAR/MAR -совмещение отдельных прямых повторов.

Остальные из известных повторяющихся элементов представлены в данном фрагменте по одной копии, и протяженных повторенных внуфи фра! мен та участков высокой гомологии выявлено не было. Возможно, таковые нам>.зи1ся пне клонированной ДНК п обусловливают наблюдаемые сочетания рекомбнннруюшнх молекул.

Выявленные совмещения могут быть связаны и с друз ими особенностями строения ДНК. Например, не исключено влияние нериозпчпою изменения AT/GC-состава.

Интересным представляется и взаиморасположение повторяющихся элементов, наблюдаемое при размещениях ДНК в соответствии с расположением обменивающихся между собой участков (рис. 4). Расстояние между MER42 и Alu составляет 422 п.н., между Alu и MIR2 - 984 п.н. и между MF.R42 и M1R2 - 1406 п.н. К этим элементам примыкают и участки повышенной концентрации прямых повторов. Другими словами, повышенная частота образования прямых повторов (отражающая частоту рекомбинаций) наблюдается на "стыках" указанных повторяющихся элементов при выявленном совмещении двух молекул ДНК.

Следует обратить внимание на характер взаиморасположения потенциальных SAR/MAR при выявленных рекомбинацио нно активных совмещениях двух тмолотчных ДНК (рис. 4). Взаимодействие этих участков, выстраивающихся в пеночку или накладывающихся друг на друга, возможно, является одним из факторов, приводящих к рассмотренным неравным рекомбннанпям.

Кроме повторяющихся элементов «енома значимыми для "неправильного" втапмотснсвия ДНК Moiyr быть и иные последовательности, например, короткие блоки гомолошчных нуклеотидов (Biiclarf et al., 1995 ). Как показывает анализ, в пашем случае при совмещениях, обеспечивающих обмены ДНК в соответствии с наблюдаемым размещением прямых повторов, обнаруживается набор относительно коротких участков с несовершенной гомологией. Приведем их характеристики для совмещения под номером 3 на рис. 4. При таком взаиморасположении лвух фрагментов ДНК они содержат 21 участок гомологии со средним размером 14 п.н. Суммарная их протяженность составляет 285 п.и. с усредненной гомологией 73%. Подобными параметрами могут обладать, например, два А /«-элемента.

Рассматривая возможные механизмы рекомбинаций, приводящие к образованию прямых повторов, следует отмстить (кроме уже указанных рекомбпнационных епшатов) наличие в анализируемом фрагменте ДНК иуклеотндных последовательностей, способных при определенных условиях вызывать изменения конформацни. К ним относятся найденные последовательности тина АТ„А. переходящие в однонитсвое состояние р супсрспирализованпом виде (Bode et al., 1992); мотивы CT и TG/CA, которые Moiyr образовывать H- и /.-формы ДНК. Эти данные соответствуют результатам анализа некоюрых ранее известных SAR/MAR (Botilikas, 1993) и их повышенной чувствительности к нуклеазам, включая специфические для одноцепочечных ДНК (Razin et al.. 1996).

Таким образом, имеется набор факторов, способных обусловить обнаруженный ряд дискретных взаиморасположений и взаимодействий гомологичных ДНК, приводящих к образованию прямых повторов.

размером 630 п.н.. отстоящая, как уже отмечалось, от проанализированного фрагмента на расстоянии, по-видимому, в несколько т.п.н., имеет более высокое содержание GC-нуклеотидов - 63.5%. Из других сочетаний нуклеотидов повышено содержание Т и G. в сумме составляющих 54%. Фрагмент содержит caiii юно 11 и районе 480-ого пуклеотида (анализ последовательности проводили как описано нами рапсе) и два участка, включающих AIT А и АТТТА. Найдено чначикмыюе число мест святывапия транскрипционных факторов; при поиске по 6aic данных IMI) выявлено 33 последовательности нуклеотидов, со 100%

гомологией соответствующие последовательностям, свжмпаюшпм пзвссшыс транскрипционные факторы. Их распределение достоверно оыпчастся от равномерного (Р < 0.05) и имеет выраженный пик плотности » интервале 300 -350 п.и. В этом районе весьма веройiно кластерное накопление блока транскрипционных факторов, что hmcci особое шачеппе ятя роулипнн транскрипции (Kontlrakhin el al., IW5).

Данный фрагмент ДНК хотя и содержи! учасюк muo И и ЛПЛ. АН ГА мотивы, но ие является АТ-ботатым (напомним, что таковыми яачяюкя основное число SAR/MAR). Однако, существуют и друше типы SAR/MAU. Недавно обнаружен обогащенный TG SAR/MAR » геноме человека, который содержал только один участок ATTA (Boulikas, Kong, PW3). Определенное сходство с последовательностью, описанной в укатанной работе, и наличие caiiia топо H позволяет предположить, что изучаемый фрагмент также содержит потенциальный SAR/MAR мало исследованного типа. В частности, выделенная нами последовательность, как и описанная Нудикасом и Кошом. обобщена палиндромами.

Весьма интересным представляется наличие значитетыюю числа новюров между фра!ментами ДНК NLI247N и NL1247S. В двух указанных фраиклпах повторены 17 последовательностей нукдеотидов размером от 8 ,ю 14 и.п. Последовательности, повторенные в обоих фрагметпах. не рассеяны проп¡вольно. Во фрагменте NLI247S статистически достоверно выделяются две облает преимущественного накопления повторов: в интерватах (54 - 274) п.н. (Р < 0.025) и (571 - 735) п.и. (Р < 0.001). Причем во фрагменте NL1217N ли пои юры 1икже имеют преимущественную локализацию. Представленные в первом из указанных выше интервалов все они имеют свою пару » участке 355 - 544 п.н. фра/мета NLI247N; все, кроме одного, представленные по втором - в учаакс (20 • 248) п.н. Следовательно, наблюдается определенная упорядоченность ра)мсшения повторов в двух рассматриваемых фрагментах ДНК. Это позволяет полакнь. что их происхождение обуслоалено механизмом, подробно рассмотренным выше па примере одною фра1 мента ДНК, т.е. неравными рекомбинациями.

Последовательности ДНК, которые мы изучили, не имеют цршижеппои открытой рамки считывания, т.е. являются псколпруюшими. Они находятся по краям пока неизвестного нам фратменга ДНК. Однако, данные, порченные при изучении выделенных ДНК, указывают на свойства и неизвестною фрагмента. Изучаемая ДНК содержит последовательность GCGGCCGC, расщепляемую рестриктазой Not I. Места Not I маркируют CpG-островки, которые были успешно использованы для идентификации кодирующих последовательностей в геноме. Ряд фактов указывает в пользу присутствия транскрибируемой последовательности в делегированном участке ДНК. Оба фланкирующих ею фрагмента содержат значительное число мест связывания транскрипционных

факюров. чю является характерным для фланкирующих экепресснруемые последовательности ДНК. Фрагмент. NLI247S надежно и NLI247N предположительно относятся с SAR/MAR. которые, как правило, фланкируют ■ сим.

l'ucnpocrpniwinic неравных рекомбинашш на протяженную область ДНК, охватывающую и обсуждаемый участок, может привести к нарушению экепреесирующихся последовательностей. С другой стороны, изменения в ре1\дя|орных участках способны вызвать модификацию функционального выражения полирующих белок ДНК. выражающуюся либо в уровне экспрессии, либо в степени согласованности транскрипции различных генов.

Гомологии выделенной последовательности ДНК с участками церес,тр!>4НН-Я- Наличие в выделенном фрагменте ДНК значительного числа сигналов рекомбинаций указывает на возможность вовлечения данной ДНК в перестройки и с лрушми хромосомами. Чтобы протестировать представленность последовательностей изучаемой ДНК в других перестраивающихся ДНК, были проанализированы гомологии NLI247S с выборкой фрагментов ДНК. клонированных из перестроенных районов хромосом (банк данных F.MBL). Протяженных последовательностей с высокой гомологией выявлено не было. Наиболее высокие гомологии наблюдаются на коротких участках (20 - 80 н.п.). Представляло интерес определить их локализацию в изучаемой последовательности ДНК, для чего была построена соответствующая гистограмма частоты встречаемости гомологичных последовательностей (проанализировано 108 фрагментов ДНК из банка EMBL). При определении гомологичных участков учшывллись как пропенг совпадающих нуклеотидов, так и степень их сбточснностп.

Полученная гистограмма статистически достоверно отличается от равномерного распределения (Р < 0.001. оценка по '/.2). То есть, последовательности нуклеотидов разных участков анализируемой ДНК с различной частотой встречаются в ДНК. подверженных перестроению. Наибольшее число найденных гомологии приходится на элемент А/и и прилетающие к нему участки. Отметим, что явные А/и-элементы, т.е. имеющие значительную область перекрывания. позволяющую идентифицировать последовательность в качестве Л/м-иовтора. в расчет не принимали. Из данного регхлыага следует существование в ДНК из районов перестроек значительною числа ■"осколков" Л/н-элементов. образовавшихся, по-видимому, в результате частых рекомбинаций таких районов с участием Д/к-повторов.

Интересным фактом представляется наибольшая насыщенность выборки нестабильных фрагментов ДНК последовательностями из интервала (2 - 2.2) т.п.п. NL1247S.. Гели повторы Л/и известны как участвующие в .перестройках ДНК и составляют около 3 - 6'i генома, то последовательность в указанном участке ДНК

l'irn mua ?

Сопоставление локализации районов шПрнли »пин субклонон N1.12-17''' и районов частых перестроек хромосом

Гибрилитукишюся ршипш XjHiMi^iiM ||.м tp?l ■14 -4"! ■Ч-" -N !l- 4 Ip4 1ч--» 4'- I,.

PjMMIH.r ЧЛСПЛ

lICpCCipoCK хромосом'"' - + + + - + + + + + ' h + + +

II) - вшчены так же результаты гибрида шцт» ч прт \>т киши (\ч1 .'¡ПК.

отражчкпцпе .tokilth нщин> тпкотштчрянпцчи я tun нчЬтатс ¡ынн шей: (2) - но данным работы Maelman el til.. ¡49!

не относится к какому-либо из известных семейав пошорок. Хшя секвенированныс ДНК составляют1 к настоящему времени не очень ш.ччшельпмо час п. г енома, обнаружение послслонаясльносги с более высокой, чем ,\!и-повторы. представленностью маловероятно. Высказанные соображения и полученный результат позволяют заключить, что дальнейшее' исследование свойств выявленного участка ДНК, последовательное!!! которого высоко представлены в ДНК из перестроенных районов хромосом, может быть перспективным для понимания особенностей нестабильных в lenouc ДНК.

На наличие гомологии с субфрагменгами выделенной ДНК были проанализированы также участки некоторых хромосом. При нералноакншнон гибридизации in situ двух субклонов данного фра(мсша ДНК. вк почаюншх некоторые повторяющиеся элементы, наблюдази распределение метки по многим хромосомам. Анализ расположения гнбрндизуюшихся районов был нровстсн но хромосомам I и 3. Сравнение районов накопления сшпатов, совпадающих для обоих субклонов, с известными из литературы участками перестройки хромосом I и 3 выявило совпадение основного числа участков гибридизации и районов перестроек. В таблице 2 приведено сопоставление учаелков тбри икании с районами частых перестроек хромосом (Milelman el al.. 1941). Предоанлены результаты по локализации субклонов и полученные при гибридизации N1.1247 в присутствии Cot I ДНК. Статистический анализ, проведенный с учетм общего

числа выяизяемых полос при стандартной дифференциальной окраске, общею числа районов частых перестроек для хромосом 1 н 3 (М1'(е1шап е( а1., 1991) и рез\дыапч» в !аблпие 2, показал достоверное (Р<0.01) превышение частот шбридщанпн укатанных выше фрашентов ДНК с нестабильными районами хромосом по отношению к иным (критерий х2 -чля четырехклеточной таблицы). Апа'юшчнын апатит только язя хромосомы 3 лат тог же результат (Р = 0.017; ючпып кртерий Фишера).

Гледова1ел1»но. последовательноеги. содержащиеся в данном фрагменте ДНК. преимущественно накапливаются в перестраивающихся участках хромосом.

Проведенный памп аначпз известных участков перестроек ДНК. а также данные лшсратуры указывают на нередкое присутствие в них ряда повюряюшихся элементов. Например, в подверженных перестройкам участках юна и-тттамшчы А нами обнаружен близкий N1.12473 набор известных повюряюшихся элементов с наличием юмологий с N1^1247$ и вне последних. По-видимому, определенная комбинация повторяющихся элементов присуща ряду нестабильных районов хромосом.

Таким образом, выделенная н изученная последовательность ДНК по данным (ибрпдизацни ш преимущественно представлена в подвергающихся частым персе 1 ройкам районах хромосом. Она имеет набор признаков, встречающихся в нестабильных участках генома: присутствие набора последовательностей иуклеотидов, способных служить рскомбинаиионными сшналами. и насыщенность повторяющимися элементами; принадлежность к .ЧАН/МАК и значительное количество прямых повторов; наипчис гомологии с извесшымп перестраивающимися ДНК. Перестроенные известные повторяющиеся элсметы и выявленный механизм образования прямых повторов указывают на частое воатечепие в события, приводящие к изменению ее структуры. Указанные признаки определяют данную последовательность ДНК как рекомбпнациопно активную. И соответствии с полученными данными вероятно, что выделенные фра!менты ДНК фланкируют кодирующие последовательности (ген). Следует огмешгь перспективность выделения фланкируемого участка геномной ДНК. а также ДНК ближайшего окружения для выяснения молекулярных механизмов паго.зошн при перестройках района хромосомы 3, в котором находится описанный фра!менг ДНК.

Анализ известных нестабильных последовательностей ДНК. Изучение выделенной нами последовательности ДНК, а также некоторых ранее известных нестабильных фрагментов ДНК указывает на ряд особенностей персе фапваюшихся в составе хромосом участков ДНК. Следует отметить обнаруженную принадлежность выделенного фра!мента ДНК к потенциальным ЯАК/МАК. что может являться, как следует из аназиза литературы, характерным пн перестраивающихся ДНК. Выявленные размещения ЯЛК/МАИ при

вовлечении в неравные рекомбинации, по-пилимому, связаны с особенностями строения содержащих их участков ДНК.

Это свойство, если бы оно оказалось присуще и другим нестабильным ДНК, мо1ло бы бьпь испольшвано п дальнейшем зля их ндешпфик.тннн. Существенен также и фундаментальный acncKi вопроса.

В этой связи было изучено наличие и распределение прямых новюров. а ыкже пекоюрых друтх характеристик в mncciiu.ix нестабильных ДНК. Озннм m примеров закон ДНК является находящаяся в участке 22qll. Рекомбинация этою участка с 9q34 приводит к гранслокапии 1(9; 22)U|34; (|11) с образованием филадельфийской хромосомы. Для анализа нами был выбран фратмеш рашером 5 т.п.и., относящийся к главному кластеру разрывов (М her) (Sowerby el al.. 1993). В качестве еше одного примера участвующих в межхромосомных обменах ДНК был рассмотрен фрагмент, клонированный из места перестройки хромосомы X при транслокации t (X; 21)(р21; р 12). связанной с мышечной дистрофией (Boilrug el а!.. 1987). Анализ прямых повторов показал те же параметры их расположения, что и для выделенною нами фра1меша: нео тнородное распределение расстояний между одинаковыми повюрами с назичнем нескольких пиков и отсутствие значимых отличий от равномерною распределения часниы встречаемости повторов по /шине фра) мент а ДНК. Эю укатывает па нотможноси. образования прямых повторов в анали тируемом фр.нмеше ДНК но рассмотренному выше механизму неравных рекомбинаций.

При проведенной идентификации участков прикрепления к матриксу AI-бокпые SAR/MAR обнаружены во фратменте ДНК хромосомы X. Выявлено, чю разрыв хромосомы X, деления и транслокаиня произошли rio местам, узнаваемым топоизомера¡ой II. В участке ДНК нт 22i] i 1 протяженных АГ-бшатых участков не найдено. Однако, обнаруженное наличие Mecí связывания топо II и "iipoiciiiia может свидетельствовать в пользу и его принадлежности к SAR/MAR иного, по сравнению с АТ-богатыми, типа (Boulikas, Kong, 1993; Boulikas. 1993t.

Обнаруженные свойства могут быть использованы к дальнейшем для определения нестабильных ДНК но характеристикам первичной орхыхры. Рассмотренные примеры мотут свидетельствовать и об общности пекоюрых процессов, связанных с нестабильностью изученных фрагментов ДНК. Хктивиое участие в неравных рекомбнпапиоппых событиях может 6i.ni, приемке определенным участкам ДНК районов хромосом, часто перестраивающихся с патологическими последствиями.

Существенно, что межхромосомиые обмены реализуются только при определенных обстоятельствах (Koduru. Chaganli. 1988). В лом плане недостаточным условием является даже произвольное внесение дну тяжевых разрывов ДНК (Akifvev, 1995). Экспериментальные данные и проведенные на их основе расчеты привели ряд авторов к заключению о необходимости

спинифнчсскпч межхромосомпых взаимодействий, нарушение которых приводит к '-хромосомным' - аберрациям и- ; об 1 обусловленности межхромосомпых взаимодействий пространственной цфцшизацией хромосом в йнтерфазном ядре (Сонфср. Акнфьев. 1976). , i

Таким образом. дтя понимания • процессов -межхромосомпых взаимодействий, приводящих к аберрациям, недостаточно знаний о структуре нестабильных районов хромосом. Необходима информация о пространственной opianmaiuiH хромосом в интерфазном ядре. Например, в связи с выявленными нами процессами взаимодейепшя юмологичпых хромосом, приводящими к перестроению ДНК. встает вопрос о расположении гомологов в интерфазных ядрах клеток человека. Соответствует ли группирование хромосом по частотам взаимных обменов (Hager et al.,: 1982) действительному характеру взаиморасположения хромосом в пнтерфазных ядрах лимфоцитов человека? Эти и лруше вопросы. функционирования 1енома в норме н при генетических нарушениях требуют изучения оршннзацин хромосом в интерфазном ядре.

Вместе с тем. имеющиеся сведения недостаточны дчя решения встающих вопросов. Отчасш ло положение связано со сложностью изучения трехмерно opiaiiHiiHiannoio шперфазпого ядра, что требует развития эффективных способов сю изучения.

Важным инструментом изучения структурно-функциональной организации генетическою материала и диашостики различных патологий является i нбрилн'тапия нуклеиновых кислот.

Нами разработан ряд способов нерадиоактнвного мечения и детекции. Отметим, что разрабатываемые подходы были ориентированы на создание досгаючпо npocibix и педорошх. по эффективных в использовании способов.

Дмя введения биотипа пли других соединений в ДНК предчожен способ введения метки на основе фотоактивирусмой реакции. Снижение возможности песнсцпфической сорбции за счет устранения положительного заряда и высокая чувствительность позволили применять данный способ мечения при тбрндизацни на фильтре и in situ (Авт. свид. на изобретение N 1443404).

Дня дальнейшего упрощения процедур нерадиоактнвного мечения и детекпии предложена возможность устранения молекул-посредников (биотин-анинин. an in ген-антитело; авг. свид. на изобретение N 1538126). Разработан метод усиления сигназа при детекции гибридизации (Авт. свид. на изобретение N 1279368).

Дзя количественною определения ДНК. иммобилизованной на фильтре, предназначен способ, позволяющий ле цитировать результат гибридизации по флуоресценции субстратов некоторых ферментов п растворе (Авт. свид. на шобрегеппе N 1613493).

Полученные результаты позволили расширить поставленную ¡а шч\ и в рамках задания ГНТГ1 "Геном человека" разработаны система и набор pcaietnoft для флуоресцентно!! детскнии гибридизации ш situ, предназначенные тля широкого использования. Система включает реагенты ятя бжнпни лиромаппя ДИК и детекции с. усилением сигнала. Созданная снаема применена ятя флуоресцентной детекции хромосомо-спенифнчных зоилов.

Результат!.! проведенных ра1рабоюк и указанные рсагсшы исполыоваиы в настоящей работе, а также нашли ряд практических применении для диагностики.

Современные исследования организации иитерфазнот . ядра связаны со стремлением к реконструкции em трехмерною изображения. Однако, метод реконструкции на основе оптических срезов трудоемок, что, как правило, заметно ограничивает обьемы выборок исследуемых клеток. Кроме тою. существующая аппаратура обеспечивает прост рапсшеппое разрешение в вершкальпом направлении в несколько раз ниже по сравнению с юризопцыьным. Количественные способы анализа расположения набора сш палов при реконструкции оптических срезов не разработаны.

Способы реконструкции трехмерною расположения хромосом по измерениям на проекции нитерфазною ядра устраняют укашнные недостатки. В то же время, имеющиеся в настоящее время способы такою аналша позволяют лишь сделать заключение о случайности пли наличии упоряточснносш в расположении анализируемых меток, по не векрынакн параметры расположения.

В настоящей работе разработан подход, позволяющий определяв трехмерные параметры расположения хромосом по измерениям в плоскости препарата. Кто предпосылками послужили следующие представления (опишем их применительно к изучаемым в данной работе интерфазпым ядрам лимфоцитов человека). Когда лимфоциты помешают на предметное стекло m суспензии, они приобретают случайную ориентацию. Нс.чи при -злом меаа в ;ире имеет определенное положение, то ее положение в нлоскосш iipcnapaia 6yiei ишпесп, от ориентации ядра. Распределение положений метки должно подчиняться определенным закономерностям. Их выяснение было проведено с помощью компьютерной модели (см. Материалы и методы).

На рисунке 5 представлены экспериментально и теоретически полученные распределения для нрнцентромерных участков хромосомы I. выявленных гибридизацией меченного биотипом специфичного ДНК-зонда, и итерфпшых ядрах лимфоцитов человека.

Как видно, экспериментальное распределение cooibctcibsct теоретическому, построенному для случая фиксированною положения сигнала гибридизации в случайно ориентированных относительно плоскости препарата

?ьо

Расстояние

Рис. 5. Определение расстояний районов \ц12 ог центров ядер лимфоцитов человека. Гистограмма - распределение частот измеренных на плоскости расстоянии. Сплошная кривая - частотное распределение расстояний, полученное с помощью компьютерного моделирования. При моделировании расстояния определены в 500 ООО имитируемых ядрах и полученная кривая приведена к числу расстоянии (1000) в ядрах, измеренных в эксперименте.

ядрах лимфоцитов и находится в пределах обозначенных границ частот. Лта.ншшт пика распределения показывает, что участки 1(]12 располагаются около мембраны в ннтерфазиых ядрах нестимулированных лимфоцитов человека. Подученные результаты также показали адекватность модели экспериментально исследуемой системе.

С использованием хромосомо-спенифичных нерадиоактивных ДНК-зондов и описанною выше подхода была изучена также локализация в интерфазных ядрах лимфоцитов хромосом Р. 16 и У. Показано расположение сигналов гибридизации вблизи мембраны ядра.

Итак, представленные в настоящем разделе данные свидетельствуют о нримембранном расположении прицентромерных районов по крайней мере ряда хромосом в ядрах нестимулированных лимфоцитов.

нз;шм"[)аСГ10Д(ШСННС__гом()ЛОГИЧНЬ|х__хромосом в ядрах лимфоцитов

человеку. Путем моделирования было показано, что значение угла или расстояния между двумя фиксированными точками на сфере соответствует положению максимума распределения углов или расстоянии, измеренных на плоскости.

Угол, градусы

Рис. 6. Итаиморасположенис районов lq?2 и интерфалшх ядрах зимфошпов человека. Гисгофамма представляет распределение частот веi речаемос i и \гтоп. образованных опюсителыю шлира ядра между участками It|l2 iomoioiob хромосомы i при измерении в плоскости nperiapaia. Сплошная кривая - описание экспериментальной гистограммы посредством компьютерно!о моделирования. При моделировании оГфаботано 500 ООО имтируемых ядер и полченнаи кривая приведена к числу ядер в эксперименте, равном 500. Пунктирные линии покашганл иптерват егандаргиых отклонении для частот, получаемых при моделировании 400 ядер.

В соответствии с этим, для анализа взаиморасположения нрнцеитромерных районов гомологов хромосомы I измеряли углы межл> двумя cm пазами гибридизации хромосомо-спснпфнчною ДНК-зопда. Рсчузматы были суммированы в вгше распределения накопленных частот и сравнены с теоретическим распределением для двух точек, случайно расположенных на поверхности сферы. Также определены границы вариации случайного распределения при данном объеме выборки (500 измеренных ядер лпмфоцшов). Экспериментальная кривая отличается от случайною распределения и существенно выходит за пределы границ случайною распределения. Эю ошачасг, что даже в соответствии с жестким кршерием (Emmerich el al., 1989) различия должны быть рассмотрены как статистически значимые. Следовательно, взаиморасположение прицеп громерных районов гомологов хромосомы I неслучайно.

Для определения параметров неслучайною расположения юмолотв анализировали распределение частот углов.

Па рис. 6 изображено полученное распределение измеренных угловых расстояний между меченными участками Iql2. Viды образованы л\чамм oi пешра

ABC i-! '

■г i

v/ ПKM

Piic. 7,- Гибридизация* специфичного для хромосомы I ДНК-тоила с ' ннтерфазнымн ядрами лимфоцитов человека. Покачаны характерные

размещения гибридизанионных сигналов. .

ядра к центрам меченных участков. Как видно, гистограмма не является одновершинной, а имеет три основных пика. Ее вид не соответствует случайному распределению, что покачали приведенные выше результаты. Для проверки существования нескольких групп частот был использован итерационный критерий СЗаке, 1'>76). позволяющий проверить напичне кластеризации в противовес регулярному изменению. Ныла покачана кластеризация частот (Р < 0.01).

Таким - обратом. распределение углов между гомологичными прпиентромерными участками неслучайно и существует несколько групп частот. Можно выделить три. основных пика, локализованных в интервалах 10° - 20°, 40° - 50" п 70" - 80". Три типа расположения опиатов пгбридизаннн с 1(|12 в ннтерфашмх ядрах лимфоцитов показаны на рис. 7. Получение теоретическое описание экспериментальной гистограммы, исходящее из наличия трех групп лимфопиюв с разной степенью сближенности гомологов хромосомы 1 (рис.6).

Икгк. полученные данные показывают неслучайное расположение припенгромерных участков гомологов хромосомы 1. Однако лимфоциты человека неоднородны по изученному параметру организации интерфазного ядра. Они могут быть подразделены на три группы. В этнх группах районы lq 12 гомологичных хромосом, расположенные около мембраны ядра, имеют различную сближенность, характерную для каждой группы.

В предшествовавших работах в основном наблюдали гетерогенность взаиморасположения гомологичных хромосом, хотя часть результатов и интерпретаций были конфликтными. Количественный анализ взаиморасположения гомологов в ядрах клеток человека в основном сводился к сравнению результатов измерений со случайным распределением.

Ряд данных свидетельствовал о неслучайности гетерогенного взаиморасположения гомологов. При наличии ассоциаций с ядерными структурами клетки могли быть подразделены на несколько групп в соответствии

2Ь-------

с расположением гомологов. В отсутствие укачанных признаков парамефы взаиморасположения гомологов не были ранее определены, если даже была обнаружена неслучайная, вариация относительною положения.

Полученные результаты создают основу для понимания некоторых процессов в ядрах клеток. Так, в лимфоцитах человека при вотлейстнии 5-а ¡дппшдина наблюдается повышенная частота рекомбинации в нринентромерпом гетерохроматинс между юмологами хромосомы I (Кока1|-Уокае с» а!.. 1'>'>3). Можно полають. что декомпенсация тетерохроматина. вызываемая укатанным агентом, приводит к взаимодействию данных участков в полтине лимфоцитов с близко расположенными прниентромериыми участками хромосомы I. Причем доля ассоциаций гомологов хромосомы. I (приблизительно \Т7г, Кока^-Уокас е! а)., 1993) коррелирует с относительным количеством лимфоцитов со сближенными \ц\2 ( - 20%).

Известно, что при синдроме Блюма значительное число хромосомных аберрации связано с обменами между гомолот ичнымн хромосомами, включая хромосому I. Такие процессы мотут происходить в фуппе лимфопшов со сближенными гомологами вследствие дисфункции механизмов, шшержпваюшпх стабильность генома: либо, альтернативно, щменепие взапморасно южеппя юмолоюв (их сближение) при данной патологии в друзпх подтипах тнмфоитпп может провоцировать втаимодейетвия и обмены межд\ юмо ни ичнымн хромосомами.

Оро^низаиця^прлиентром^риы^ пз'оррхроматнноиых участков хромосом в итасрфязиыхядрах ^11шфои!тгоач&човск;1,

Изученные выше: структурные свойства рекомбииаиионно активных участков ДНК могут приводить к хромосомным перестройкам различных видов. Одним из факторов, определяющих спектр межхромосомных обменов, является, как полагают, пространственная организация хромосом в иптерфазпом ядре. Для изучения ее параметров уже описанный подход был развит далее и обоснованы новые возможности изучения взаиморасположения множественною числа меченных участков хромосом в иптерфазпом ядре. Эксперименты с использованием модели, имитирующей ряд возможных вариантов расположения прицентромерных участков набора хромосом в ядрах лимфопшов. показали возможность определения параметров их взаиморасположения в трехмерном пространстве ядра при измерении ею двумерного изображения на плоскости.

Как показано выше, прицентромерные участки хромосом 1.9 ц 1о в ядрах лимфоцитов человека расположены на периферии ядра вблизи мембраны. С тем. чтобы проанализировать расположение припентромерпых участков п других хромосом, аналогичные измерения были проведены при маркировании чанных участков с помощью С-окраски (исходя из показанною комныотериым моделированием, и в случае нахождения на сфере нескольких точек

распределение расстоянии от центра их проекций пи плоскость имеет вил, аналогичный уже описанному нами лая I или 2 точек). Результаты измерении и харамер построенного распределения показали, что нринентромерные участки, выявляемые С-окраской.находятся также вблизи мембраны.

Для сравнения проанализировано распределение расстояний от центра ядра учаохом, 1пбрнлиз)!ошпхся с Д/н послеловак'льностыо. В связи с диспертрованпсм Л/и-элементов по хромосомам с одновременной кластеризацией в К-полоеах, анализ нх распределения в ннтерфазном ядре был использован для выяснения степени однородности заполнения плечами хромосом объема ядра. Показано, что по крайней мерс фубые отклонения в заполнении плечами хромосом обьема ядра в зависимости ог расстояния от центра, отсутствуют'. Это коррелирует с наблюдениями, показывающими, что одно из плеч может расиолашться на периферии ядра, а другое во внутренней его части (Окитига с( а!.. 19%).

Распределение расстояний между прицептромерными участками харлк|еризуегся наличием нескольких максимумов. Вид экспериментального распределения, как следует из результатов моделирования, свидетельствует о неслучайном и неоднородном расположении прицентромерных участков хромосом но отношению друг к друту. Имеется упорядоченность, определяемая несколькими фиксированными расстояниями между изучаемыми участками в ядрах лимфоцитов человека. В работе (Кигек, Ма(хито№, 1995) при изучении расположения сателлит-содержащих районов хромосом положения меток проецировали на фиксированную сетку и полученное распределение сравнивали со случайным распределением. При таком подходе авторы также смогли сделать вывод о неслучайности расположения указанных районов.

Следующий вопрос состоит в том. как изучаемые участки распределены по ядру, ю есть какую конфигурацию они образуют.

Ятя выяснения этот вопроса был использован кластерный анализ, проведенный но алгоритму ^осЫа. описанному в работе (Айвазян и соавт., 1989). Оптимальность разбиения на кластеры определяли с помощью нахождения экстремума функционала качества разбиения при неизвестном числе классов (Айвазян и соавг., 1989). В результате было выявлено, что изучаемые участки в зависимости ог расстояния между ними подразделяются в ядре на три или четыре I руины. Доли клеток с объединением прицентромерных участков хромосом в три или четыре группы соотносятся как 1,7 : 1. соответственно.

На рис. 8 приведены полученные тстограммы частот встречаемости величин внутри- и межкластерных углов. Ввиду близости параметров распределении для клеток с 3 и 4 кластерами дана суммарная гистограмма.

Сравнение распределений показывает четкое огличие величии углов для прииепфомерпых участков, объединенных и кластер, ог углов, образованных

Jljjj

IlllJ

24 44 64 84

Угол, градусы

Рис. 8. Распределение частот встречаемости углов, обраюнапных прнцентромернымн гетерохроматиновыми участками хромосом относительно центра ядра: Л-внугри кластеров, В-между кластерами.

участками, находящимися на tранние между кластерами. i. с. определяющих межкластерные расстояния (Р<0.0()1, опенка по кршерию Колмогорова-Смирнова). На это же укатывают положения максимумов рассматриваемых распределении (15°-20° и 50° - 60°), а также величины средних углов (25° ± 0.9" и 51.8° ± 1.8°). Следова гелию, полученные результшы покалываю] наличке объединения прицеп i ромерных участков хромосом в ipymiu и корректность выделения групп с помощью использованной процедуры кластерного анализа.

Пространственно сближенные хромосомы, входящие в выявленные труппы, Moiyr с повышенной вероятностью Bciynaui в хромосомные обмены между собой. По данным работы (Hager et al., 1482). выделяется такое же число ipynn хромосом, среди которых наиболее часты взаимные обмены.

Следовательно, полученные результаты спидетельпвукп в пользу взаимосвязи реализующихся межхромосомных обменов с пространственной организацией хромосом в интерфазном ядре.

Наличие указанной корреляции дает основание предполагать и обратную связь нарушение расположения хромосом может приводить к изменению спектра

межхромосомных обменов н к увеличению частоты хромосомных аберраций вследствие возможною искажения регуляции внутриядерных процессов.

Имеющиеся в литературе данные о взаимосвязи организации интерфазного ядра с функциональными особенностями клеток и изменении расположения хромосом в ядре при некоторых плтолотях указывают на такую возможность.

1'асшнренне исследовании и лом направлении позволит лучше понять особенности функционального выражения генома при ряде генетических нарушений. Н настоящей рабою изучена организация хромосом в интерфазном ядре при трнсомии 21 - патолопш. сопровождающейся искажением широкого набора фспотнннческих признаков, предрасположенностью к лейкемии и повышенной частотой перестроек хромосом.

Анализ проводили аналогично описанному в предыдущем разделе. Были исследованы препараты от 4 здоровых доноров н 4 пациентов с болезнью Дауна.

Изучение распределения расстояний прицентромерных районов от центра ядра в лимфоцитах при болезни Дауна выявило зависимость, аналогичную наблюдающейся в норме и свидетельствующую об их примембранном расположении. Используя процедуру кластерного анализа, проведено сравнение (рунпированпя прицентромерных районов в лимфоцитах здоровых доноров и при болезни Дауна. В основной доле клеток в норме и при патологии принентромерпые районы объединены в три иди четыре кластера. В то же время, доля лимфоцитов с подразделением в два кластера при болезни Дауна повышена. Это отличие статистически значимо (Р < 0.001). ,

Сравнение распределений внутри- и межкластерных углов между прнцентромернымп районами для ядер лимфоцитов с тремя и четырьмя кластерами в норме и при патологии показало, что расстояния между участками итерочромапша внуфп кластеров существенно не изменены (статистически достоверные отличия соответствующих распределений отсутствуют). В то же время, распределения углов между кластерами отличаются достоверно (Р < 0.01).

Следует отметить, что при данном способе маркирования (без пдеитнфикапип каждой хромосомы) мы получаем информацию о расстояниях между соседствующими гетерохроматиновыми участками и не можем судить о, например, возможном переходе какой-либо хромосомы в иную область ядра при сохранении общею порядка организации. Полученный результат создает основу для последующего более детального исследования изменения пространственной организации с помошью хромосомо-специфнчных ДНК-зондов. Такое изучение позволит ответить на вопрос, какие именно хромосомы в наибольшей степени меняю! взаиморасположение. Известен пример, когда при патологическом состоянии клетки из исследованных четырех хромосом наибольшее смешение обнаружено для одной хромосомы (Borden. Manuelidis, 1988). Данные же работы

(Hager et а!.. 1982) лают' основание полагать более комплексный характер реорганизации расположения хромосом при снилроме Клюма.

Показанное изменение некоторых параметров взаиморасположения хромосом может быть олним из механизмов комплексною нарушения фенотипа при ланпой патолоши. а также бьнь связанным с повышенной частотой индуцированных хромосомных перестроек.

Использование некоторых результатов._ раГмпы __ в целях .дндпнхтнкн, Разработанные в процессе выполнения настоящей работы способы п гибридизапнонные технологии создавали условия для изучения возможностей применения нерадиоактивных ДНК-зондов в целях диагностики. В частности, в совместной работе с Н.И.Гриневой (Институт гематологии РАМН) и К.Юнкер (Институт антропологии и медицинской генетики. Иена) была продемонстрирована возможность определения ABL-BCR трапелокаппп с использованием разработанных нерадиоактивных способов и технологии блот-гибридизапин.

ДНК-зонды важны также для определения возбу.ипезеи инфекций. Исследования были проведены в сотрудничестве с рядом заишсрссовапных научных учреждений (общее число - II. приведены в диссертации), в pciviuare которых разработаны методики и показана эффекншносп- применения 14 различных нерадиоактивных ДНК-чонлов. На их основе в некоюрых научных и клинических центрах (например, Центр акушерства, гинекологии и перннтоломш. МОНИАГ. Детская консультативно-диагностическая поликлиника) проведены обширные клинико-диагностические исследования, подтвердившие достоинства используемых подходов и способов.

Кроме тою, как уже отмечалось, была разработана, апробирована и получила одобрение система перадпоактпвной дси'кпнп тбрп.ниацип in situ. применимая для диагностики хромосомных нарушений.

ЗАКЛЮЧЕНИИ

По имеющимся в литературе данным перестройки хромосом наиболее часто осуществляются по определенным (нестабильным) районам, что связываю! с особенностями структуры ДНК этих районов. Мсжхромосомпме обмет,! .происходят, как полагают, в случае близости таких участков хромосом в интерфазпом ядре. Следовательно, для понимания механизмов перестроек необходима информация о структуре участков ДНК нестабильных районов н пространственной организации хромосом в ядре. В настоящей работе изучены ли аспекты структурной организации генома человека, связанные с хромосомными нарушениями.

В выделенном и выбранном для изучения на основании преимущественной представленности в часто перестраивающихся (нестабильных) районах некоторых хромосом новом фра!мепте ДНК хромосомы 3 человека выявлен набор признаков, присущих рекомбинационпо активным участкам ДНК. Изучение особенностей молекулярной организации выделенного фрагмента позволило пленшфиппровап. ею как содержащий участки прикрепления к магриксу (SAR/MAR) п выявить параметры организации, свидетельствующие о его вовлечении в неравные рекомбинации, а также связывающие последние с определенными особенностями структуры фрагмента. На основании анализа известных перестраивающихся ДНК в сопоставлении с обнаруженными особенностями организации выделенного фрагмента выдвинуто предположение о существовании ряда признаков, свойственных определенной категории нестабильных участков ДНК. К их числу относится, по-видимому, принадлежность к -SAR/MAR и тестируемое по расположению прямых повторов вовлечение в неравные рекомбинапионные события гомологичных участков хромосом.

Подученные при изучении пространственной организации интерфазного ядра результаты указывают на неслучайный характер расположения и, следовательно, взаимодействия хромосом в ядре, В частности, существует группа лимфоцитов со сближенными гомологами, что создает возможность обменов между ними. Соответствие выявленных параметров организации хромосом в интерфазном ядре некоторым характеристкам частот межхромосомных обменов свидетельствует в пользу взаимосвязи межхромосомных перестроек с взаиморасположением хромосом в ядре. Дисфункция внутриядерных процессов или внешнее воздействие Moiyr приводить к перестройкам хромосом по рекомбинационпо активным участкам ДНК в соответствии с взаиморасположением хромосом.

ВЫВОДЫ

1. Выделена и изучена новая последовательность ДНК, в которой выявлен набор признаков, свойственных рскомбинашюпно активным участкам ДНК. Показао, чго данная последовательность имеет представленность по результатам гибридизации in situ в некоторых нестабильных участках хромосом, гомологии с рядом известных предрасположенных к перестроению фрагментов ДНК и идентифицирована как содержащая участки крепления к матриксу (SAR/MAR).

2. Выявлено, что около 60% выделенной последовательности ДНК составлено ш прямых повторов нуклеотидов размером от 8 до 24 п.н., которые размешены не случайно. Показано, что положения основного числа одинаковых повторов практически совпадают при совмещениях с несколькими дискретными

сдвигамн изученной последовательности ДНК. Анализ структурной организации последовательности выявил признаки, способные определять обнаруженные совмещения гомологичных участков ДНК.

3. С учетом выявленных особенностей структурной организации проведен анализ некоторых ранее известных нестабильных фра!ментов ДНК. участующих в межхромосомных обменах. Показано, что указанные фрагменты содержат ряд общих признаков с выделенной н изученной нами последовательное и>ю ДНК и имеют подобные характеристики расположения прямых повгоров.

Проведенный анализ взаиморасположения прямых повторов и особенностей структурной организации выделенного участка ДНК, связанных с рекомбнногенными свойствами, позволил предложить в качестве механизма образования указанных повторов неравные рекомбинации гомологичных районов хромосом.

4. Гомологичные хромосомы в интерфазных ядрах лимфоциюв человека размещены относительно друг друга также неслучайно, что показано на примере взаиморасположения гомологичных прицентромерпых районов хромосомы I. По относительной близости указанных участков лимфоциты человека полрапелямпся на несколько групп.

5. Показано, что пространственная организация хромосом в ншерфазпых ядрах лимфоцитов человека, способная являться одним из факгоров, определяющих спектр межхромосомных обменов, неслучайна. Припентромерные участки основного числа хромосом располагаются вблизи мембраны ядра, обрапя несколько групп сближенных участков с меньшими, по сравнению с межгрупповыми, расстояниями.

6. Трисомия по хромосоме 21 сопровождается изменением пространственной организации хромосом. При сохранении свойственных норме общих параметров организации, наиболее выраженными являются изменения расстояний между указанными выше группами хромосом.

7. Для проведения исследование! разработан ряд новых способов нерадиоактивного мечення и детекции шбрнлизапнонных ДНК-юнлоч. а мк способ анализа трехмерной организации хромосом в интерфазном язре

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ по ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карпухин A.B.. Афанасьев Б.Н. (1983) Взаиморасположение: генов в : мнтерфазных ядрах клеток -. г' новый подход к; анализу генетического

полиморфизма. Тезисы докладов Первою Всес. съезда медицинских (снетков. Москва, с. 137-138.

2. Karpukhin A.V... Al'aiiasjev B.N., Spilkovsky D.M.. (1984) The avidin-biotin complex: a new approach lo-thc studies of molecular pathology. Abstr. J; Meeting of the federation of European biochemical societies. 111-021.

3. Карпухин A.B.. Афанасьев H.H.. Спитковский Д.М. (1986) Способ индикации биологических макромолекул. Авторское свидетельство па изобретение N 127,9368. ... i

4. Карпухин. A.B.. Жукоцкнй A.B. (1987) Анализ расположения и зсптпфипированных участков хромосом в интерфазном ядре в норме и при п>менснном кариотипе. Тезисы докладов V Всес. съезда ВОЕИС, Москва, с. 47. .,

5. Вейко H.H., Салимов А.Г.. Немцова М.В., Спитковский Д.М., Карпухин A.B. (.1487) Биотииирование ДНК и, изучение локализации нуклеиновых посдедона1слыюстсй в ядрах клеток. Тезисы докладов IX Всес. сими. "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка, с. 104.

6. Карпухин A.B.. Вейко H.H.. Салимов А.Г., Немцова М.В., Спитковский Д.М. (1987) Новый фотоактивирусмый реагент для биотинирования нуклеиновых кислот и его применение в биотехнологии. Материалы 5 Всес. конф. "Методы получения и анализа биохимических реактивов", Юрмала, с. 237.

7. Карпухин A.B.. Жукоцкий A.B., Спитковский Д.М. (1988) Изменение расположения прицентромерных участков хромосом в интерфазном ядре при трисомии-21. Материалы 1 съезда медицинских генетиков УССР, Львов, с. 141-142.

8. Карпухин A.B.. Вейко H.H., Салимов А.Г., Немцова М.В., Богуш ■ А.И., Спшковекий Д.М. (1988) Нерадиоактивное мечение и определение ДНК-гибриднзационных зондов для медицинской диагностики. Тезисы докладов Весе. конф. "Современные направления , создания медицинских дна! посткумов". Москва, с. 112.

9. Карпухин А.В, Салимов А.Г., Спитковский Д.М., Вейко H.H. (1988) Способ биотинирования нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство на H!o6peiCHHcN 1443404.

10. Вейко H.H., Карпухин A.B., Сазн.мов А.Г.. Немцова М.В.. Спитковский Д.М. (1989) Бнотинпрование ДНК с использованием фотоактивируемого реагента М-(4-азидо-2-нпгробензод)-1,7-диамнногептана. Биотехнология т. 5, с. 414418.

11. Вейко H.H.. Карпухин A.B.Y CajWiMOiTÄllV'Спитковский Д.Л!:' (1989) Модификация ДНК фотоактивпруемымн аридазидами. Химия ириротммх соединений т. 2, с. 259-263. .......

12. Карпухин A.B., Салимов А.Г.. Вейко H.H.. Немцова М.В.. boiyiir А.П.. Спитковский Д.М. (1989) Определение расположения клоппрованпмх последовательностей ДНК в интерфазных ядрах клегок с использованием мерадиоакпшной метки. Тезисы докладов Всес.- конф. по к-петпкс сомашчееких клегок в культуре, Москва, с. 97-98.

13. Карпухин A.B., Вейко H.H.. Спитковский Д.М. (1989) Способ кчекпии нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство N 1538126.

14. Карпухин A.B., Салимов A.C., Вейко H.H., 'Зайцев A.B.; Boiyiii А.И., Немцова М.В.. Спитковский Д.М. (1990) Изучение организации хромосом в интерфазном ядре. Тезисы докладов II Всес. е-ьсзла медицинских тенегиков, Москва, с. 182. ,

15. Карпухин A.B.. Вейко H.H.. Немцова М.В.. Когуш А.И.. Салпмов А.Г., Спитковский Д.М. (1990) Разработка системы перадноактивпою чеченки ДНК-зоилов и использование локусспенифичных зондов д 1Я и ¡учения фотографии генома в интерфазном ядре. Материалы Всес. конф. "1'еном человека", Москва, с. 214-215.

16. Вейко H.H., Немцова М.В.. Салимов А.Г.. hoiym А.П.. Спшковский Л.М.. Карпухин A.B. (1990) Нерадиоактивное определение ДНК-зондов лля молекулярно-генетических исследований и медицинской лиашосшки. Тешсы докладов II Всес. съезда медицинских генетиков, Москва, с. 71.

17. Karpukhin А.V., Junker К., Veiko N.N., Nemtsova M.V.. Bogush A.I. (199(1) Development of nonradioactive hybridization nucleic acids for testing ABL-BCR ranslocation in chronic myelogenous leukemia. 7 Symp. "Pediatric onkoloey", Weimar, Germany, p. 13.

18. Урываев Jl.В., Русавская Е.А., Сиганатуллина Н.М., Файзуллнп Л.'З.. Вепгеров Ю.Ю., Парасюк H.A., Ионова К.С.. Вейко H.H., Спитковский Д.М., Карпухин

A.B. (1990) Выявление РНК вируса гриппа А методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием бнотпнплпрованпых зондов. Вопросы вирусологии N 6. с. 464-466.

19. Вудяк И.В.. Сафроиов И.В., Батурина И.И., Сшапатул.липа U.M.. Наумов

B.А., Хомяков А.Г., Шишкин Г.В., Карпухин A.B., Файзуллнп Л. $.. Мертвецов Н.П. (1990) Использование иерадиоактивных ДНК зондов для детекции вируса гепатита А в клинических образцах. Материалы 2-ой конф. "Современные направления создания медицинских днашоегикумов". Москва, с. 62.

20. Карпухин A.B., Салимов А.Г., Вейко H.H., Немцова М.В., Boiym А.И.. Спитковский Д.М. (1991) Нерадиоактивная детекция ДНК-зондов при

гибридизации in situ с помощью нового фотоактивируемого реагента для биотинировання нуклеиновых кислот. Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. N II. е. 13-14.

21. Файзуллип Л.З., Сигаиатудлина Н.М., Вейко H.H., Немцова М.В., Богуш

A.И., Карпухин A.B. 0991) Создание и применение нерадиоактивных ДНК-I ибридизанионных тест-систем для диагностики. Материалы 2 Всес. снмп. '"Теоретические н прикладные аспекты молекулярной биоложи", Москва, с. 198.

22. Каратаев Г.Н.. Шакирова Р.Г., Карпухин A.B. (1991) Высокочувствительный видоспецнфичный ДНК-зонд для идентификации возбудителя коклюша. Материалы 2 Всес. сими. "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Москва, с. 84.

23. Погапов В.К., Вейко H.H.. Карпухин A.B.. Сиитковскнй Д.М. (1991) Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот. Авторское свидетельство на изобретение N 1613493.

24. Карпухин A.B., Богуш А.И., Немцова М.В., Вейко H.H., Сапимов А.Г., Cum конский Д.М. (1991) Клонирование и анализ умеренно повторяющихся ДНК- 1енома человека, содержащих последовательности, представленные в прнтеломерных участказ хромосом. Материалы 2 Всес. конф. "Геном человека-') 1". Москва, с. 38.

25. Карпухин A.B.. Салимов А.Г., Вейко H.H.. Зайцев A.B., Богуш А.И., Немцова М.В., Спнгковскнп Д.М. (1992) Определение положения хромосомы Y в шперфазных ядрах человека. Доклады АН т. 327. с. 156-159.

26. Будяк Н.В.. Сафронов И.В., Батурина И.И., Синагатуллнна Н.М., Наумов

B.А.. Хомяков А.Г., Шишкин Г.В., Орешкова С.Ф., Вейко H.H.. Карпухин A.B. (1992) Использование нерадиоактивных биотин-меченных зондов для детекции вируса гепатита А. Мол.генетика, микробиолог., вирусол. N 9-10, с. 5-8.

27. Карпухин A.B., Boiytn А.И., Вейко H.H., Захарьев В.М., Салимов А.Г., Банников В.М.. Забаровский K.P., Киселев Л.Л. (1993) Изучение структурной организации последовательностей ДНК прнтеломерных районов хромосомы 3 человека. Материапы 3-ей конф. "Геном человека", с. 161.

28. Вейко H.H.. Салимов А.Г.. Конорова А.Л., Богуш А.И., Карпухин A.B. (1993) Разработка системы для нерадиоактивной гибридизации in situ с флуоресцентной детекцией. Материалы 3-ей конф. "Геном человека", с. 148.

29. Карпухин A.B., Вейко H.H., Boiyiu А.И.. Салимов А.Г.. Спитковскни Д.М. (1993) Анаши организации прнтеломерных участков хромосом человека. Материалы 3-сй конф. "Геном человека", с. 25.

30. Карпухин A.B., Богуш А.И., Салимов А.Г.. Вейко H.H., Немцова М.В., Захарьев В.М., Залетаев Д.В.. Спитковскни Д.М. (1993) Повторяющаяся

?fi

последовательность ДНК, представленная в притслочерпых участках хромосом человека. Доклалы АН т. 329. с. 365-368.

31. Борисова В.Н,. Карнаухова ИЛ!.. Красильников И В. Карпухин А Н . Всико Н.Н.. Синагатуллина Н.М., Блоха В.В.. Бекегова 'Г.В.. Фапчул.чнн Л.Ч (1493) Апатит содержания примесной ДНК в препарате рскомбипашнои ipoaacdoh ваккипы гепатита В. Бнотехно.тотия N I. с. 27 30.

32. Budjak E.V.. Karpukhin A.V.. Shishkin G.V.. Oreshkova S.F.. Merivcisov N.P. (1993) Detection of hepaiiiius A \iiu.\ by molecular hybridization uiili hiotiny laud probes. Abst.: Int Meet. on Biology, lmmunopalhology and Clinic of Hepatitis viruses. Parma, p. 99.

33. Карпухин А.В.. Салнмов А.Г.. BeiiKO H.H.. Карпухин С.А., Ботп А.И. (1944) Анализ взаиморасположения гомологичных хромосом в тнперфазны.х ядрах лимфоцитов человека. Генетика т. 30. с. 66.

34. Будяк Н.В., Синагатуллина Н.М., Карпухин А.В.. Наумов В.А.. Мамаева Н.В.. Чижиков В.К., Золотова В.А.. Мертвецов Н.П. (1994) Использование биотиннровапного зонда для детекппп геномной РНК вируса lenanna .Л в клинических образцах. Вопр. вирусодотии N4. с. 17-2!.

35. Карпухин A.M., Готмар Я.. Карпухин С.А.. Салимов А.Г.. Всико II.П.. Ьотуит А.И.. Спитковскпй Д.М. (1994) Расположенпе приисптрохк'рных гетерохроматиновых участков хромосом в интерфазпых ч.чрах шчфопшоп человека. Доклалы акатемии наук т. 336, с. 414-417.

36. Карпухин А.В.. Салнмов А.Г., Карпухин С.А.. Вейко Н.Н.. Боти А.П.. Спнгковскнй Д.М. (1995) Взаиморасположение гомологов хромосомы I в интерфазных ядрах лимфоцитов человека. Доклады акачемпи паук '. 341. с. 553-557.

"'7. Карпухин A.Is.., Ьогуит А.И., Захарьев В.М.. Сатимов А Г.. Пеню II II.. Банников В.М.. Домнинскии Д.М.. Забаровскпй Г".Р.. Киселев Л .Л I 1°%) Организация новой потенцначьно рекомбннантной последовательности ДНК генома человека. Материалы 5 конф. "Геном че ¡овека-96". Москва, с. IX-19.

38. Карпухин А.В.. Ьогуш А.И.. Захарьев В.М.. Сачпчов А.Г.. Вейко II.II.. Спшковский Д.М.. Федорова Л.II.. Зелепнн А.В.. Банников В.М . Ломиннскшг Д.М , Чабаровскнй Г..Р., Кг.-седев Л.Л. (1996) Пучп и чет нфмкапии •-.'.•комби11а1!нонно-а-;гим|ыч участков ДНК в |еиоме человека, Молекулярная •' :a.,oii!s, т. 6,

Информация о работе

Карпухин, Александр Васильевич
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.15

Автореферат

Особенности молекулярной структуры некоторых последовательностей ДНК, участвующих в перестроениях генома, и проблема пространственной организации хромосом в ядрах клеток человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы