Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала

ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала"

Всесоюзная ордена Ланина и ордена Трудового Красного Зламэви академия сольскохозяйствешппс - « п^ул имени Б.И.Лонипа Отделэнив по Нечерноземной зоне РСФСР ‘

НАУЧНМЇССВДОВШЛЬСКЙІ ЗОШЪШЙ ИЖТГОТ САДОВОДСШ ШКРН032ШЙ ПОЛОСЫ

На правах рукописи

КОРНАДИЙ ■

Сергеи Аркадьевич

ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗЮОЖЕЯШ сливы в СИСТЕМЕ ПРОИЗВОДСТВА ОЗДОРОВЛЕННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТ2РИШ .

Специальность - 06.01.07 - плодоводство .

Автореферат • диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва - 1991

Работа выпошэиа в Научно-исследовательском зональном институте садоводства Нечерноземной полосы в 1987 - 1990 гг,

Научный руководитель: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор, член-корреспондент ВАСЕШ В.Г.Трушечкин

Официальные оппонента: доктор сельскохозяйственных наук

• ' Е.В.Колесников

. кандидат сельскохозяйственных наук

Н.Т.Ревякша

Водущее учреждение: Украинский научно-исследовательский •

институт садоводства .

Защита состоится * № " 1991 г. в 13 часов на

заседании Специализированного совета К 020.20.01 в Научно-исслеяс ватвльском зональной институте садоводства Нечерноземной полосы I адресу: 115598, Москва, М-598, Загорье, НЛЬИСНП, Ученый совет.

С диссертацией «окно ознакомиться в библиотеке НИЗИСНП.

Автореферат разослан и1± ' 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, С.ВЛванов

кандидат с.-х. наук

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш. Плодоводство - неогьемлшая часть сельско- • )ЭяЙствекного производства, а эго продукция пользуется большим )требит9льским спросом, который в последнее время все.чаща окази-штся неудовлетворенным по ряду организационно-технических прит-ш и в том числа из-за снижения урожайности плодовых и ягодных . юаздений, ухудшения их породно-сортового состава.

1^гльтура слива в Нечерноземье, как и в целом в СССР, не состав-ют исключения и требует серьезного внимания ввиду резкого сокра-2НИЯ плодоносящих площадей после подмерзания деревьев в суровые от, распространения ряда опасных грибных и 'вирусных болезней/ .М.Махеев, Н.Г.Рввякияа, 1985/. Закладка новых насаждений сливы хэрхивается отсутствием в достаточном количества оздоровленного эсадочного материала перспективных сортов, а также подвойных форм.

Решение этих задач органически связано о совершенствованием аботы питомников, так как интенсификация плодоводства в значите ль-: эй степени определяется качеством посадочного материала, выпуск эторого в требуемых объемах возможен лишь в условиях дальнейшей 1ециализации выращивания плодовых саженцев на основе рационально-э применения современных технологий. •

В этом аспекте, перспективным методом, привлекающим присталь-ое внимание питомниховодов, является клональное микроразмнохенив • использованием техники культивирования изолированных тканей и рганов растений на искусственных питательных средах. По оути, ме-од культуры тканей представляет собой микромасштабный и усовер-енствованный вариант традиидонного черенкования с постоянно во-обновляющимся маточником побегов. Ряд неоспоримых преимуществ пе-ед традиционными методами, а особенно огромный потенциальный ко-Зфнциент размножения и возможность перехода к безвирусному штом-

ниководству, явилась мощными стимулами привлечения техники для решения практических задач. ■

Возможность применения метода j.n vitro для размножения сливы находится в состоянии изучения в ряде научно-исследовательских учреждений СССР, которые относятся к разным зонам возделывания это нудьтуры. Очевидно, что сортовые особенности и связанный с ними ря вопросов, таких как повышение коэффициентов размножения, укоре аяе-ыости побегов и, в наибольшей мере, эффективности перевода микро-растениЁ в нестерильные условия, требуют детального выяснения.

Таким образов, в сложившихся условиях, когда традиционные при от вырацивания посадочного материала не обеспечивает воспроизводс ва плодовых насаждений, разработка технологии получения саженцев сливы с использованием метода 1в vitro имеет важное практическое значение. В системе производства Сезвирусных растений эта технология приобретает еще большую актуальность, .поскольку ценность оздоровленного посадочного материала несоизмеримо выла, чей рядовых саженцев.

Цель и задачи исследований. Цельа настоящих исследований явдя лось изучение особенностей клонального ыикроразмножения районированных и перспективных сортов сливы и разработка на этой основе технологического процесса для использования в системе производства оздоровленного посадочного материала.

В этой связи решались следутадие задачи: отработка приемов, по вышающих эффективность введения в культуру, собственно макроразшо жашш, укоренения побегов и перевода микрорастений в нестерильные условия, а также определение экономической эффективности произволе ва стандартного посадочного материала сливы с однолетним циклом вы ращивания, ,

Научная новизна результатов исследований. Установлено наличие

связи между сроком изолирования экспланта, длительностью периода от стерилизации, до внсадки на питательную среду и его жизнеспособ-. ностью в стерильных условиях. Изучена возможность применения пода в качестве стерилизатора для начальных эксплантов, Определена целесообразность использования на этапе введения в культуру эксплантов сливн гидролизата казеина в качестве добавки к составу питательной среды .для провоцирования развития латентной бахтерзальной инфекции.

Выявлена зависимость медцу долей побегов с длиной более 1,5 см в коэффициентах размножения за пассаж, концентрацией 6-ЕАЛ и числом проведенных пассагей.

Рекомендован эффектавннй способ укоренения побегов с использованием ауксинсодержащих Тальковых пудр. '

Предложен способ подготовки микрорастений к пересадке в нестерильные условия, позволяющий проводить адаптацию надземной часта растений к пониженной влажности воздуха без извлечения их из культивационных сосудов /А.с.№1493187/. При статистической оценке установлено отсутствие существенных различий в развитии корневой системы у растений после пересадки их для адаптации в стерильный субстрат по следующим изученным вариантам: удаление корней in vitro ., укорачивание корней in vitro , сохранение корней щ vitro •, Разработан комбинированный способ укоренения и адаптации микрорастений непосредственно в изолированном обгеме стерильного субстрата, позволяющий исключить пересадку растений для адаптации, рационально использовать растительный материал и за счет этого повысить выход адаптированных растений.

Впервые в Нечерноземной зоне проведено широкое изучение районированного сортимента слива для определения возможности применения микроразмножения и дана экономическая оценка эффективности метода. Практическая ценность работы. Полученные результаты дают воз-

ыожносгь оптимизировать процесс клонального шкрораэлшодания слз на основе рационального подбора аффективных концентраций 6-ЕАД в зависимости от.сорта и числа пассажей размножения. В работе пока на нецелесообразность использования для укоренения побегов длино менее 1,5 си. Установлено, что приживаемость микрорастений ва ст рильноы субстрате в процессе адаптации при влажности воздуха, бл кой к 100$, не зависит от наличия корней, числа корней и их длин Разработанный способ укоренения побегов и адаптация микрора тений непосредственно в изолированном объеме стерильного субстра послужил основой для разработки технологии получения стандартные саженцев славы с использованием метода in vitro при оддолетнеи цавдэ выращивания и может быть использован в размножении других древесных и кустарниковых культур.

Внедрение в практику. Растения сливы, полученные в процессе изучения на протяжении 1987-1990 гг., после тестирования на нале чие вирусной инфекции группой вирусологии, были использованы длг закладки маточно-черенковых насаждений отдела размножения НИЗШ На основании результатов исследований оказана методическая и прг тичэская помощь в налаживании выпуска оздоровленного посадочноп материала косточковых культур с использованием метода «и iy ,'7 гс на Донецкой опытной станцип садоводства, передан посадочный мак риал для закладки маточных насавдений.

Апробация работы. Основные положения диссертация доложены i (&ядународной конференции “Биология культивируемых клеток и био технология"/г.Новосибирск, 1988/, на Республиканской научво-пра тической конференции "Проблемы современного садоводства"/г.Киев 1989/, на 4-й областной конференции молодых ученых "Проблемы ин . танси{.икании современного садоводства"/г.Мичуринск, 1990/, .на з седанин секции плодовых культур Ученого совета НИЗИСНП/1990/. Работа отмечена серебрянной медалью ЩЩХ СССР/1990/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена га 431 странице машинописного текста и состоит из введения, четы- . рех глав, выводов, предложений производству, приложений и списка іспользованной литературы. Работа содержит 28 таблиц и 20 рисун-«та.Список использованной литературы включает 180 источников, в гом числе 138 наименований на иностранных языках. '

Автор выражает глубокую признательность кандидату биологичес-шх наук В.А.Высоцкому за консультационную помощь в ходе выполнения забот по теме диссертации.- ' _

Объекты, методика и условия проведения исследований. В качест-39 объектов исследований были выбраны районированные и перспективне для Нечерноземной зоны РСФСР сорта сливы: Память Тимирязева, Скороспелка красная, Венгерка московская, Красная десертная. Волжская іфасавица, Евразия 21, Смолияка. Заготовку растительного материала для культивирования проводили в фазу активного роста побегов з период с апреля по июль месяц ежегодно. Использовали растения как ірошедше термотерапию, так и заведомо здоровые, растущие в открытом грунте. Экспланты стерилизовали 0,1^-ным раствором сулемы в те- t іение 10 мин. или 0,01/&-ннм раствором иода в течение 15 мин. о по- ' следующей 3-х кратной промывкой стерильной водой. .

После стерилизации из апикальных и латеральных почек изолиро-зали экс планты размером 0,1-0,3 сы и культивировали их на модифици-хзванной питательной среде Мурасиге-Скуга о концентрацией 6-<5ензил-їминопурина/&~БАЦ/ - 0,2 мг/л. Минеральная основа среды была допол-ієна сахарозой в концентрации 3, С%, агаром - 0,7%, тиамином, пири-іоксином и никотиновой кислотой - по 0,5 мг/л, аскорбиновой кисло-гой - 1,0 мг/л, глицином - 2,0 от/л и мезоияозитом - 100,0 мг/л. pH питательной среды в процессе приготовления устанавливали в пределах 5,6-5,8 с помощью децинормалышх растворов NaOH или НС1.

В процессе исследований изучали действие 6-ЕАП в концентрациях от 0,25 до 2,0 мг/д иа пролиферацию почек и побегов в течение 7 оассахеА. При укоренении побегов испытывали ауксины: ^-ицдолшшас-дявую кислозу/ИМК/, ^-индолилуксуснух кислоту/ИГЦ/, л-нафгидук-оусную кислоту/НУК/ в концентрациях от 0,3 до 6,0 мг/л, а также тальковые пудри о концентрациями ауксинов 0,125, 0,25, 0,5$. Опыты по укоренению побегов проводили посла 4-го, 5-го, 6-го и 7-го пассажей. При подготовке растений к пересадке в нестерильные условия адаптацию надземной части проводили без извлечения их из культивационных сосудов/ А.с. 1493187А, 1989/. Укоренение ш-фо черенков не посредственно в субстрате осуществляли посла стерилизации контейн& ров с субстратом в автоклаве при давлении 1 аш в течение 15 шш.

Элементами учета были выбраны следующие показатели: процент инфицированных, погибших и развивающихся эксплантов; число вновь образованных почек и побегов в каждом пассаяе; выход побегов длина свыше 1,5 си; процент укоренения побегов; число корней и их длина; длина надземной части ьикрорастений.; выход пробирочных растений, после адаптации; процент растений, прижившихся в нестерильных уело ях; диаметр штамба растений; число боковых разветвлений; выход ста дартных однолеток.

Дня обработка результатов исследований использовала методы да персионного анализа/ Н.А..Елохииский, 1970; Б.А.Доспехов, 1985/.

Все опиты выполнены на базе лабораторного блока, участков закрытого и открытого грунта отдала размножения ШШСНП.

Культивирование начальных эксплантов, субкультивирование почек и побегов, укоренение ыикрочеренков и подготовку микрорастений к пересадке в нестерильные условия проводили в светокоынате при 16-ти час фотопериоде, освещенности 3,5 тыс. лк, температуре.воздуха 26 ± 2°С, влажности-воздуха 50-6СЙ. Для доращивания саженцев

использовали зимнюю теплицу в период с марта по сентябрь месяц.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. '

Введение в культуру. Изучение на этапе введения в культуру , различных сортов сливы выявило различия по способности.к изолированное развитию у эксплантов из апикальных и латеральных почек.

По пригодности для дальнейшего культивирования апикальные почки обладали значительным преимуществом перед латеральными, которое выразилось в более стабильных результатах по выходу жизнеспособных эксплантов, в среднем на 30-60£, а наличие у таких эксплантов сапрофитной контаминации наблвдали лишь в единичных случаях. Статистическая обработка результатов исследований подтвердила существенность влияния типа экспланта на этапе введения в культуру, а также года исследований. По-видиыому, некоторые различия по годам была обус- ■ ловлены особенностями раз ей гея растений на момент изолирования эксплантов. Это прежде всего касалось эксплантов из латеральных почек, у которых такие колебания били довольно значительными. '

Крома того, в процессе работы часто отмечали побурениа верхних покровов эксплантов после стерилизации. Очевидно, что стерилизатор проникал и в-более глубокие части экспланта, что выражалось в потемнении тканей, особенно со стороны среза. Это явление классифицировалось нами кал остаточное действие стерилизатора, который оставаясь в проводящей системе экспланта контактировал с ним более продолжительное время, имея при этом значительно меньпую концентрацию. Таким образом, было установлено, что существует связь между моментом заготовки начальных эксплантов в течение фазы активного роста и их жизнеспособностью посла введения в культуру. На жизнеспособность материала после стерилизации также влияет длительность интервала между стерилизацией и высадкой экспланта на питательную среду, что имеет аналогичное объяснение, а также в некоторой степени обус-

ловлену окислительными процессами на месте среза. Б этом отношении была отмечена непригодность для использования эксплантов из латеральных почек, заготовленных в конце фазы активного роста побегов. Значительная их часть погибала в течение месяца после высадки, причем, на месте контакта среза экспланта с питательной средой отмечали .характерное для окислительных процессов коричневое окрашивание. Использование поливишшшрршшдова с молекулярной шссой 25000 -30000 у.ед. в качестве антиоксиданта не дало положительного эффект!

Сравнительное изучение в качестве стерилизаторов сулемы к иода показало, что выход эксплантов, пригодных'для .дальнейшего культивирования, после стерилизации иодом был на 10-15$ нихе, чем после сулемы, однако, число инфицированных культур было равным, особенно в отношении апикальных почек. Инфекцая, наблюдаемая во всех случаях на этане введения в культуру, преимущественно имела грибную природ Визуально чистые от сапрофитной микрофлоры апикальные акспланты со] тов Память Тимирязева, Скороспелка красная, Красная десертная к кої цу нулевого пассажа/введение в культуру/ формировали хорошие конгломераты из 3-5 почек и побегов. Из латеральных почек за этот період развивались одиночные побеги длиной 3-8 ма. ■

Как оказалось в дальнейшей, преодоление начального этапа не всегда гарантировало получение достаточного количества культур, сш собных в последуодеиу развитию. Увеличение концентрации 6-БАП с 0,1 иг/л в 0-м оассахз до 1,0 мг/л в 1-м пассаке вызвало у сорта Евразия 21 гибель апикальных эксплантов на 83,3?, что снизило общув эффективность введения в культуру с 60 до 10?.

В последующих пассатах основным источником потерь жизнеспособных культур было развитие латентной бактериальной инфекции. Ущерб от нее был весьма ощутим, а в отдельных случаях достигал 100^. Подобное явление наблюдалось рядом авторов/с.согпи ,и.У.иісЬаі,198?;

‘.Horlno»*.Loretl» 1987/ и наши исследования подтвердили вывод о . гасостоятельности визуального отбора эксплантов сливы, пригодных 1ля дальнейшего культивирования. Использование на этапе введения в ультуру гидролизата казенна в концентрации 0,5 г/л и состава пита-:ельноЙ среды способствовало ранней отбраковке инфицированных.экс-шантов и позволило проследить тенденцию х проявлению бактериальной ифекции у контрольной группы эксплантов в последующих пассажах.

Стбкгльтивирование побегов. После периода, когда произошел ос-говной отпад, инфицированных и нежизнеспособных эксплантов, не было 1ыявлено существенных различий в развитии обоих типов эксплантов.

>ыло установлено, что у большинства сортов после 1-го пассажа раз-нчия не только между типами эксплантов, но и между сортами находи-шсь в пределах ошибки опыта. По плотности конгломератов почех и гобегов экспланты из апикальных и латеральных почек также были сходы. Самые объемные конгломераты формировали сорта Скороспелка крас-шя. Память Тимирязева, Красная десертная. Сорт Венгерка московская [мел плотные малообъемныа конгломераты, а сорт Волжская красавица ->ыхлые объемные. Исключение составили сорта Евразия 21 и Смолянка, г которых формирования конгломератов не отмечали в первых 2-х - 3-х ( taccaxax.

Дальнейшее субкультивирование показало, что для размножения . :ливы ю vitro на этом этапе пригодны общепринятые подходы. Над-. 1олее эффективной в фазе пролиферации почек и побегов была опреде-юна концентрация 6-ЕАЛ в питательной среде - 1,0 иг/л. Болышнст-ю изучаемых сортов имело коэффициенты размножения в пассажах в [ределах 2,5-3,5, что позволило получить довольно высокие суммар- . гые коэффициенты размножения за 7 мес. культивирования/таблица 1/.

В процессе изучения сортов, задействованных в исследованиях, . »ыделилрс>; 3 группа, -^«ри$ицировали по способности к раз-

- ю - . •

множвшао как легко размножаемые - Скороспелка краевая, Память Тин рязева, Красная десертная; сорта со средней способностью к размно хеш» - Венгерка московская, Евразия 21; трудно размножаемые сорт

- Волжская красавица, Смолинка.

Таблица 1,

Коэффициента размножения эксплантов различных сортов сливы аа питательной среде с 6-бвнашшшнопуринок в концентрации 1,0 ыг/л.

I ІСуша

Сорт Коэффициенты размножения в пассажах 1 Ї I ный к

1-а і 2-а і 3-й ! 4-й ! 5-й 1 &-а і ! 7-а ! Ізффзц Іент р

і і 1 1 ! ! 1 Імнохе

Скороспелка ! ! і і ! 1 1 I ! ! I 1 ! 1 ! Іза се Іоасса 1

красная Память 1,9 2,4 3,4 3,9 4.8 3,7 3,8 ! 1 3,4 1 4200 !

Тимирязева Красная 2,9 3,0 3,6 4.1 3,2 3,3 3,0 I 1 3,3 1 4068 !

десертная Венгерка 2,3 3,7 3,4 3,3 3,1 3,5 3,2 ! 1 3,2 ! 3315 1

московская 2,0 2,7 3,5 2.7 3,8 3,0 3,4 ! I 4,0 I 1 3,0 1 1978 ! 1 1554 І

Евразия 21 Волжская 1,2 2,4 2,3 2.3 5,0 5,1 3,2

красавица 1.4 3,4 3,6 2,8 2,6 2,3 2,1 ! І 2,1 ! 2,6 ! 603 І 1 83

Смолинка 1,0 1,8 1.9 1.6 3,0 2.4 2,0

X 1,8 2,7 3,1 2,9 3,6 3,3 3,0 I 1 1

Среди особенностей развития эксплантов при данной концентрап $-ЫЛ било отмечено, в среднем, 2~х кратное увеличение коэффациен та размножения у сорта Евразия 21 после 5-ти - 6-ти пассажей и у

юрта Смолянка после 8-ми - Э—(га пас сажай. .

Однако, более важным показателей, чем коэффициент размножения, 1еы выход побегов длиной свыше 1,5 см от общего числа вновь образо-шшых почек и побегов. Побеги такого размера использовали в даль-юйшем для укоренения. . ".

Таблица 2.

влияние концентрации 6-БАЛ на выход побегов, пригодных для укоре нагая/ > 1,5 см /, при очередной пересадке эксплантов сорта Скороспел-са красная, взятых после культивирования на среде с б-БАЛ/1,0 мг/л/.

концентрация 6-БАЛ в! Выход побегов длиной более 1,5 см от I _

сассаже предаеству- I коэффициентов размножения в пассажах, % ! I

идем укоренению по- ! ! ! ! ! I !

1егов, мг/л ! 1-й ! 2-й ! 3-й ! 4-й I 5-Й ! 6-Й ! 7-й !

- _

1,0 . ! 3,2 6,2 7,6 9,7 10,2 11,0 12,11 9,5

! . . • !

0,25 ! - 26,2 28,2 28,1 30,0 29,3 29,6! 28,6

______________________I____________________________________________1--

X ! - 16,2 17,2 18,9 20,1 20,2 20,9!

!ущественность различий: концентрации уф > рдд 5 ’

гассажа НСРд5 = 2,9 ; взаимодействия НСРдд = 4,0

Изучение проводили на фоне различных концентраций 6-ЕАП. В 3-х гачальних пассажах отмечали единичные случаи формирования побегов ушной более 1,5 см. С 4-го по 7-й пассаж шло увеличение доли побе-'ов, пригодных для укоренения, в общем объеме развившихся почек и гобегов. Сходные наблюдения были сделаны ранее в отношении других древесных плодовых культур. Г.Хасси/ 1987/ считает, что данный эффект связан с частичной реювенилизацией растительного материала.

[роме того, увеличение концентрации в-БАЛ в питательной среде от 3,25 до 2,0 мг/л вызывало снижение числа побегов длиной более 1,5

- 12 -

см в отношении к коэффициенту размножения в пассажах.

На основании этих наблюдений было признано необходимый пров< дать пассах, предшествующий укоренению побегов, на питательную с] ду с содерханием 6-БАП - 0,2-0,25 мг/л. Данный прием вызывал снш пае коэффициентов размножения в очередных пассахах по сравнению < контролем, в среднем, в 1,5 раза. В то хе время, в процентном вы] женшг доля побегов длиной свыше 1,5 см в изучаемом варианте у со] та Скороспелка красная имела существенное превышение перед контрольным вариантом во всех изученных пассахах. Это позволило получать от каждого начального экспланта в пассахах в 1,2-1,4 раза больше кондиционных побегов, чем в контроле/таблица 2/.

Укоренение микрочетенков. При изучении укореняемости побего; различных сортов, взятых после нескольких пассажей было отмечено что процесс укоренения зависит от сортовых особенностей, числа щ веденных пассажей, концентрации я типа ауксина, способа его прдо нения. Установлено, что оптимум концентраций ИМК в составе питательной среды находится в пределах 0,5-1,0 мг/л, что согласуется результатами отечественных и зарубежных ученых/В.И.Деменко, В.Г.1 щечкин, 1983;С.Ва1ег1о1а-Шсаа ,ы.а.11и111па , 1984/. Включение И в питательную среду позволило получить максимум укоренения побеп у сорта Память Тимирязева - 72,5% и у сорта Венгерка московская ■

80,02. В более поздних пассахах эффективным было снижение концен' рации ИМК с 1,0 до 0,5 мг/л. Побеги сорта Скороспелка красная у» ронялись на 100, после всех изученных пассахей на среде с ИМК : концентрации 0,5 мг/л. . .

Сравнительное изучение индукторов укоренения/ИМК, ИУК, НУК/ выявило высовуо эффективность ИУК в концентрации 6,0 мг/л. НУК в изучаемом интервале концентраций оказалась непригодной для укорв' нения побегов. Увеличение концентрации ИМК более 1,0 мг/л вызыва до интенсивное каллусообразование в зоне ризогенеза, а также поя.

ление гипертрофированных корней, что было помехой при пересадке микрорастений в субстрат.

В целом, результаты по укоренении побегов при данной способе аппликации ауксинов были признаны неудовлетворительными, так как укореняеыость части сортов была низкой. Еа укоренившихся побегах развивалось по 1-2 корня длиной 3-5 см, а сам процесс затягивался на 4-5 нед. Исключение составил сорт Скороспелка красная, у которого корнеобразование начиналось массово и уже через 3 нед. достигало максимального значения. Кроме того, в ряде случаев результаты по укоренению были не всегда воспроизводимы в параллельных опытах.

Таблица 3.

Укореняемость побегов сливы в зависимости от их начальной длины при концентрации ИМК в составе питательной среды 0,5 мг/л

Сорт !Начальная дли- Укоренение, ! Число кор- IДлина кор-

!на побегов, см % !ней,'шт !ней, см

I 0,5 - 1,5 75,0 1,5 1,6

Скороспелка ! 1,6 -3,0 100,0 2,4 6,3

красная Г > 3,0 100,0 3,0 13,3

! 0,5 - 1,5 50,0 1,5 1,9

Венгерка ! 1,6-3,0 80,0 2,5 9,5

московская ' ! > 3,0 100,'0 3,4 15,7

НСР05/взаимодвйствие/ 2,9

В связи с этим изучали укореняемое» микрочеренков в зависимости от их размера/таблица 3/. У хорошо укореняющихся при включении ИЫК в состав среды сортов сливы Скороспелка красная и Венгерка

московская было отмечено 100^-ное укоренение, когда использовали микрочарешеи длиной более 3,0 см. Были зарегистрированы существенные различия в длине корней в сравнении с друпши группами. Побеги группы длин 1,5-3,0 см по этому показателю также существенно

Таблица 4.

Укоренение побегов различных сортов сливы в зависимости от содержания ИМК в тальковой

пудре/ 5-й пассаж /.

!

Сорт

Укоренение, % I Число корней, ПТ

--------------------[- - т-------------------т - “ ■

концентратия, % ! I !концентрация, % I X

--------т----------, : ,--------------т-----------,

! Длина корней, см

I------------------г-;

{концентрация, % I X Г-------Т----------!

0,125 0,25 ! ! 0,125 ! 0,25 ! ! 0,125 I 0,25 I

Евразия 21 70,0 85,0 77,5 2,9 4,7 3,8 6,5 7,6 7,1

Красная десертная 40,0 4о,о 50,0 1.9 1,9 1,9 5,8 6,0 5,9

Венгерка московская 95,0 60,0 77,5 2,7 3,3 3,0 2,2 2,2 2,2

Скороспелка красная 40,0 25,0 32,5 2,4 2,0 2,2 3,1 3,9 3,5

Память Тимирязева . 80,0 90,0 85,0 3,4 2,1 2,8 8,5 13,8 11,2

X 65,0 64,0 ! ! 2,7 2,8 ! ! 5,2 6,7 !

Существенность различий: концентрации у*'>г05 сорта НСРо5" 1,7

взаимодействия НСРд5*2,4

сличались от побегов длиной 0,5 - 1,5 см.

Изучение возможности использования тальковых ауксинсодержащих іудр в качестве альтернативного способа индукцга ризогенез'а показа-[О высокую эффективность данного приема. Начиная о 4-го пассажа от~ іечали высокий процент укоренения побегов у большинства изучаемых ортов. Начало укоренения регистрировали на 7-8 день после высадки икрочеренков. Корнеобразование было дружным, на побеге формирова-ось 3-5 корней, которые нормально развивались, быстро росли, дос-игая длины 10-12 см и более;

Использование тальковой пудры ИМК с разными концентрациям уксина выявило сортовую специфику при укоренении микрочеренков, собенно.выделялся сорт Скороспелка іфасная, укореняемость побегов оторого не превысила 40,СЙ. Среди изученных концентраций ИМК раз-нчия по длине корней били не существенными у сортов Красная десерт-ая и Скороспелка красяая/таблица 4/. Из других ауксинов, применимых в виде тальковых пудр, высокоэффективной была ИУК в концентра-ии 0,5!?. Побеги сорта Красная десертная после 6-го пассажа укоре-ялись на 93,3?. Применение пудр с НУК на протяжении всего периода сследований не дало удовлетворительных результатов.

В ходе исследований было установлено, что на процесс укоренв-ия значительное влияние оказывает минеральный состав питательной реды и качество используемого агара. 2-х и 4-х кратное разбавление инералыюй основа среды Мурасиге-Скута на способствовало существен-ому увеличению процента ризогенеза у хорошо укореняющегося при ' ключешш ауксина в состав среды сорта Скороспелка красная, однако азлйчия с контролем в показателях развития корней во всех случаях ыли существенны. Из изученных типов агаров лучшим был определен гар фирмы "ВасСо *. При его использовании отмечали наибольшие про-энты укоренения, а также лучшее развитие корневой системы.

-16 -

Перевод микро-растений в нестерильные УСЛОВИЯ. ’ Необходимость поиска новых подходов к решению вопроса перевода микрорастений в нестерильные условия была продиктована значительными потерями пробирочных растений после пересадки в субстрат. Наиболее заметным признаком гибели растений в этот период являлось увядание и усыхание листьев после пересадки, которая связана с резкам изменением влажности воздуха со 100 до 50-6056. Использование для адаптации индивидуальных полиэтиленовых пакетов, заполненных на 1/3 субстратом, не давало надежных результатов, так как значительная часть растений погибала ухе после окончательного раскрытия пакетов.

Попытка проводить подготовку растений к пересадке в нестерильные условия путем адаптации надземной части имела положительный эффект. 100? растений с 5-ю и более корнями с общей длиной свыше 4,5 см удавалось адаптировать непосредственно в пробирках и через 2 нел их можно было высаживать в нестерильные условия. Ори температуре воздуха 25°С приживаемость таких растений была близкой к 100?. Более высокие температуры отрицательно сказывались на приживаемости растений. Причиной гибели в этот период было отмирание у них корне! чему способствовало развитие микрофлоры в субстрате.

Дм уточнения причин гибели растений на субстрате.и выяснения роли корней, сформировавшихся in vitro , растения разделили на 3 группы. Первую из них использовали для высадки в первоначальном виде, у второй корни укоротили вдвое, у третьей удалили ПОЛН0СТЫ). Растения высадили в стерилизованную смесь торфа, песка и перлита в соотношении 1:1:1 и накрыли прозрачными стеклянными сосудами джя предотвращения гибели растений от потерь влаги/таблица 5/.

В результате проведенных исследований не было выявлено сущест венных различий в развитии корней у изученных групп микрорастений. При осмотре подземной части наличие корней было отмечено во всех

- 17 - '

случаях. У первой группы растений сформировались новые адвентивные корни, у второй произошло образование боковых корнай, у третьей группы развились корни продолжения.

• . Таблица 5.'

Развитие растений сорта Скороспелка красная в процессе адаптации.

Вариант

Перед высадкой I Через 2 недели после высадки

т-------( т-------,-----X-------,--------,-----

число ідлина !длияа !число !дтгаа !длина (прирост!прирост: корней!корней!стебля!корнай !корней!стебля!корней,!стебля,

шт ! см ! см ! шт ! см ! см ! см ! см

Удаление ! корней ! 1,9 3,9 4,8 4,4 10,7 6,8 10,7 2,2

Укорачива-! ние корней! 2,9 3,4 5,1 4,0 11,3 6,9 9,6 1,8

Сохранение! корней ! 3,0 •5,2 7,0 3,9 15,3 10,1 10,1 3,2

X ! 2,5 ! 4,2 I 5,6' ! 4,1 ! 12,4 ! 7,9 ! 10,1 1 2,4

НСР,

05

*ф<?05

1,0

" В случае использования нестерилизованяого субстрата приживаемость растений была не болэе 12-15&. во всех вариантах. Основной * причиной гибели растений являлось развитие грибной микрофлоры на корнях и освовании стебля.

На основании сделанных наблюдений был разработан способ, позволяющий совместить укоренение и адаптацию в одном процессе за счет высадки шкрочеренка непосредственно в изолированный объем' стерильного субстрата и создания мнкрсусловяй. о высокой влажность в для каждого отдельного растения. Это позволило избежать дополнительной пересадки микрорастений для адаптации, исключить непроизводительные потери микрочеренков при укоренении и гибель растений после пересадки в нестерильные условия. При высадке побегов по разра-

ботаняому способу удалось добиться укораняемости микрочеренков у сорта Скороспелка красная на 87,5$, у сорта Венгерка московская -100,0# и у сорта Память Тимирязева - 75,0$. Выход адаптированных растений во всех случаях составил 100,С(3! от числа укорененных поб гов, а сам процесс никаких сложностей не представлял.

Рост и развитие растений в нестерильных условиях. Сравнителъ ное изучение разработанного способа с общепринятым при микроразмн ж&нии, т.е. укоренением побегов в агаризованной питательной среде адаптацией микрорастений в субстрате, показало, что растения, укс ненные непосредственно в субстрате, существенно отличались по для надземной части от контроля после адаптации их к пониженной влааа ти воздуха. Забег в развитии сохранялся и после высадки в теплищ Превышение в длине надземной части в сравнении с контрольными рас ниями было существенным на протяжении 2-х мес наблюдения/таблица

Таблица 6.

Развитие растений сливы в зависимости от способа укоренения микр< черенков и адаптации к нестерильным условиям.

Способ Длина надземной части/м Придали

укоренения после после при выращи- емость

Сорт и адаптации 1 мес 1 мес вании в теп растет

укоре адап- лице в теч. в тешп

— К0НИЯ тации 1 мес [2 мес це, %

!укоренение в агаре и 1 3 7 Скороспелка!адаптация в субстрате! 5,1 7.6 18,1 ! 75,1 1

красная !укоранениа в субстра-! _ те с адаптацией тамке! 6,9 16,0 25,2 ■ 90,

Венгерка .'укоренение в агаре и ! 3 4 !адаптация в субстрате! 5,0 7.5 10,0 50,

московская (укоренение в субстрате с адаптацией тамиа ! і 7,2 14,6 25,4 83,

НСРо5 /взаимодействие/ 1.7 3,0 5,3

Кроме того, приживаемость растений, полученных при укоренении икрочеренков непосредственно в субстрате, после пересадки в несте-илыше условия была на 25,0? выше у сорта Скороспелка красная, а у орта Венгерка московская - на 33,3£ по сравнению о контролем.

Изучение возможности получения стандартного посадочного мате-яала за один вегетационный период с использованием теплицы позво-шю установить, что его длительность должна быть не менее 6-ти :ес /табшща 7/.

Таблица 7,

днашка роста надземной части растений сливы сорта Скороспелка грае мал в зависимости от срока высадки в нестерильные условия, см.

Срок высадки ■ ! ! июнь Срок учета | август 1 —\ 1 І 1 ! сентябрь | X

март ! 96,9 128,6 154,7 ! 126,7

эл роль ! 47,1 112,1 127,2 ! 95,4

-X . ! 72,0 ! 120,3 ! 140,9 !

НСРод= 15,3/ взаимодействие/

Растения сорта Скороспелка красная, полученные из укоранайнше

* субстрате- микрочеренков и высаженные в марта 1990 г. к сентябрю ■ого же года на 85,7? отвечали 2-му сорту стандарта для однолетних :ажвнцев, причем по длине надземной части 71,4$ из них соотватство-шло 1-му сорту стандарта. Растения того же сорта, высаженные на . мес. позже, к сентября были нестандартны по диамэтру штамба, хотя, на 55,СЙ соответствовали 2-му сорту по длине надземной части. У контрольной группы растений, высаженных в марте, только 33,3^5 растений отвечали 2-му сорту по диаметру штамба и 16,7% - 1-му сорту ю длине надземной части. Особенностью развития растений, палучан-шх с использованием метода 1а т!Ьго # било формирование боковых

- 20 -

разветвлений. У 71,055 растений, высаженных в марте, развилось, в среднем на растение, по 1,7 боковых побегов. Из растений, которые высадили в апреле, 77,0% имели, в среднем, по 2,6 разветвлений. К концу вегетационного периода растения первых двух сроков высадки закончили развитие и имели вызревшие побеги.

Экономические вопросы -размножения сливы <» . Оптимизал

процесса микроразмножэния и разработка комбинированного способа у ренения побегов и адаптации мтфорастений позволили осуществлять выращивание стандартных однолетних саженцев сливы за 1 вегетациов ный период. Общая потребность в микрочеренках для укоренения в 3, раза ниже, чем в общепринятой технологии.

Двухмесячный забег в развитии растений, полученных при непосредственном укоренении микрочеренков в субстрате, позволяет в ГС высадки в теплицу получать в 2,6 раза больше стандартных саженце! чем в контрола. Преимущества разработанной технологии перед общепринятой позволили в 3,1 раза со!фатигь затраты на выращивание а женцев, которые были по сорту Скороспелка 1фасная - 660 руб/тыд.и ■ вывода.

. 1, Жизнеспособность инициальных эксплантов сливы в стерильга условиях зависит от календарного срока получения исходного матер!

иЛи м Д*П»?СЛ1тОСТЗ иирмСДа ОТ СТормЛпЗаДии дО Ла ВаъаЯпл аа илю*

тельную среду. Игнорирование этой связи приводит к непроизводите. ным потерям эксплантов, которые обусловлены физиологическим сост янием растений на момент изолирования. Увеличение интервала врем! ни между стерилизацией и высадкой эксплантов на питательную сред более 2-х часов может вызывать полную гибель последних.

2. Эффективность введения в культуру эксплантов сливы из ап кальных почек на 30-БСЙ выше, чем из латеральных почек. При пове ностиой стерилизации эксплантов целесообразно использовать иод в концентрации 0,0155, который, являясь экологически более безопасн

препаратом, обеспечивает качество стерилизации на уровне сулемы. Использование в составе питательной среды гвдролизата казеина в ■ концентрации 0,5-1,0. г/л повышает надежность отбора стерильных зкс-плантов на этапе введения в культуру на 10-30$.

3. Для стимуляции.бокового ветвления у эксплантов сливы наибо-

лее эффективно применение 6-БАП в составе питательной среды в концентрации 0,5-1,0 мг/л. Среди.сортов сливы, изученных на протяжении 7 пассажей, по способности к размножению выделились следующие группы: легко размножаемые - Скороспелка красная, Память Тимирязева, Красная десертная; со средней способностью к размножению - Венгерка московская, Евразия 21; трудно размножаемые - Волжская красавица, Смолинка. Культивирование конгломератов почек и побегов в пассате, предшествующем укоренению побегов, на питательной среде с концентрацией 6-ЕАЛ 0,2-0,25 иг/л повышает выход побегов длиной более 1,5 см в 1,2-1,4 раза. .

4. Нецелесообразно использовать для укоренения побеги после

первых трех пассажей и побеги длиной менее 1,5 см ввиду их низкой ухореняемости. Процент побегов длиной более 1,5 см возрастает во 2-м - 7-м пассажах и зависит -от сортовых особенностей и концентрации 6-ЕАП. ■ •

5. Укореняемость побегов сливы зависит от числа пассажей размножения, предшествующих укоренению. Для изученных сортов сливы четырех пассажей размножения достаточно для получения у большинства из них укореняемоети свыше 60?. Наиболее эффективным способом укоренения побегов сливы на агаризованной питательной среде является использование тальковых пудр ИМК с концентрацией 0,125?, 0,25?

и ИУК с концентрацией 0,25?, 0,5?. 2-х - 4-х кратное разбавление основы питательной среды Мурасиге-Скута в процессе укоренения микрочеренков благоприятно сказывается на развитии корней. •

- 22 -

6. При подготовка микрорастений к пересадке в .нестерильные условия путем адаптации надземной части к влажности воздуха 50 -60? их жизнеспособность зависит от степени развития корневой системы, после пересадки в нестерилизованный субстрат - от темпарату-. рн окружающей среды. Повышение температуры воздуха в культивационном помещении в интервале от 25° до 35°С приводит к резкому уменьшению числа прижившихся растений.

. 7. При пересадке неадаптированных пробирочных растений в сте-

рилизованный субстрат в условия влажности воздуха, близкой к 100?, приживаемость растений сливы не зависит от наличия корней, их числа и диш, Соблюдение указанных требований позволяет исключить потери выращенных растений.

8. Совмещение укоренения побегов и адаптации микрорастений к

условиям окружающей среды в одной операции позволяет добиться укора няемости в пределах 75,0-100,0? в зависимости от сорта сливы, снизить потребность в микрочеренках в 3,2 раза, исключить дополнительную пересадку и тем самым повысить до 100,0? выход адаптированных растений после культивирования в стерильных условиях, обеспечить 2-х месячный забег в развитии растений в сравнении с контролем. .

9, Разработанная в процессе исследований технология выращивания растений сливы с использованием метода in vitro может быть применена в системе производства оздоровленного посадочного материала. При изучении способов получения растений легко размножаемых сортов было установлено, что в сравнении с общепринятой технологией материальные и трудовые затраты снижались в 3,1 раза и составили 660 руб. за 1000 шт.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.

При использовании для размножения сливы техники клонального

микроразмножешш, в качестве начальных эксплантов желательно брать апикальные почки в период начала активного роста побегов в весенние месяцы. В качестве стерилизатора кроме сулемы можно использовать иод в концентрации 0,01#. Для повышения эффективности отбора зтерилышх эксплантов на этапе введения в культуру необходимо добавлять к составу питательной среда гидролизат казеина в концентрации 0,5-1,0 г/л.

Субкультивирование эксплантов сливы следует проводить не ме-юе 4-х пассазшй на модифицированной питательной среде Мурасиге-Зкуга, содержащей 6-ЕАП в концентрации 0,5-1,0 иг/л, с учетом осо-5енностей сорта. Для повышения выхода побегов, пригодных дал укоренения, пассая, предшествующий укоренению, необходимо осуществ-шть на питательной среде с 6-БАП в концентрации 0,2-0,25 мг/л с :спользованием больших культивационных сосудов.

В качества индукторов ризогенеза следует применять тальковые 1удры И?Ж с концентрацией 0,125$, 0,25/? и ИУК с концентрацией 0,25$, ),5%. Для снижения затрат на выращивание растений укоренение мшсро-гаренков нелательно проводить в индивидуальных культивационных со-;удах, заполненных стерильным субстратом, без специальной пересад-я на адаптацию.

Культивирование пролиферирующих культур, а также укоренение гобегов и адаптации микрорастекий необходимо проводить в культива-сяонном помещении при длительности светового периода 16 час, освэ-'энности 3,5 тыс. лк, температуре 24-26°С, влажности воздуха 50-60$.

При высадке иикрорастений в нестерильные условия следует ис-:ользовать субстрат, состоящий из торфа и песка в соотношении 2:1,

I юткрорастения пересаливать с частью субстрата, в котором прово-нлось укоренение микрочеренков. •

Разработанная на основе исследований технология получения

. - 24 -

стандартных саженцев сливы с однолетним циклом выращивания рекомендуется для использования в системе производства оздоровленного посадочного материала.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ. '

1. Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А., Корнацкий С.А. Клональное микро-

размножение косточковых культур в система производства оздоровленного посадочного материала // Тезисы докладов Международной конференции " Биология культивируемых клеток и биотехнология Новосибирск,- 1988,- Т.2.- С.319. .

2. А.с, 1493187 А СССР. Способ пересадки растений, выращенных 1в *о . на питательной среде в культивационных сосудах с покрытием, в нестерильные условия / С.А.Корнацкий, В.А.Высоцкий, В.Г.Трушечкин/ СССР/.- Опубл. 15.07.89.- Бюл. Л26.

3. Корнацкий С.А. Особенности ризогенеза у микропобегов сливы 1й У1 *о // Тезисы докладов Республиканской научно-производственной конференции " Проблемы современного садоводства ".- Киев.- 1989.-

Ч.1.- с.зз. . .

4. Корнацкий С.А. К вопросу адаптации растений в нестерильных усло-

виях // Тезисы докладов Республиканской научно-производственной конференции " Проблемы современного садоводства ".- Киев,- 1989.-

4,2,- С,25. -____

5. Корнацкий С.А. Способ адаптации растений к нестерильным условша информ. листок №89-155/.- МОТЦНТИ И П. -1989,- С.1-3.

6. Корнацкий С.А. Шкроразмножеяие сортов сливы // Тезисы докладов 4-ой областной научной конференции молодых ученых " Проблемы интенсификации современного садоводства Мичуринск,- 1990,- С.164.