Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности кариотипа соматических клеток в раннем онтогенезе и при беременности у человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Особенности кариотипа соматических клеток в раннем онтогенезе и при беременности у человека"

КИЇВСЬКИЙ ІНСТИТУТ УДОСКОНАЛЕННЯ ЛІКАРІВ МОЗ УКРАЇНИ

• На правах рукопису

ЛОЗИНСЬКА МАРІЯ РОСТИСЛАВІВНА

ОСОБЛИВОСТІ КАРІОТИПУ СОМАТИЧНИХ КЛІТИН У РАННЬОМУ , ОНТОГЕНЕЗІ І ПРИ ВАГІТНОСТІ У ЛЮДИШ

03.СЮ. 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1992

Робота виконана у Львівському науково-дослідному інституті педіатри, акушерства та спадкової патології

Науковий керівник - кандидат медичних наук.

старший науковий співробітник , 1СОЗАНСЬКИЯ 0.0.'

Офіційні опоненти - доктор медичних наук,

БАРИЛЯК І.Р.

. - кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник ■ . ‘ ШЕМЕТУН А.М.

Провідна установа - Харківський державний університет

Захист відбуваться юо/р о год.

на засіданні Спеціалізованої вченої ради •

у Київському інституті удосконалення лікарів,

252112,КиІв-112, вул.Дорогожицька 9.

■ 3 дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського Інституту удосконалення лікарів • ■

Автореферат розісланий "Л£" шИ р •

Вчений секретар '

Спеціалізованої вченої ради, • .

кандидат медичних наук, доцент . . Горовенко Н.Г.

российсзл» rOCyflAPC''.',;'.J,-s-44 бйг>;і*':0’.

Актуальність теми. Сьогодні у цитогенетиці людини велику увагу приділяють не тільки наявності постійних хромосомних аномалія (делецій, транслокацій тощо), але Я можливому впливу на формування патологічного фенотипу 1 репродуктивну функцію таких хромосомних аномалій, які трапляються лише у частині ме-тафазних хромосом. . ■

З цієї точки зору важливим у клінічній і експериментальній цитогенетиці є дослідження хромосомних аберацій, яьищз передчасного розходження центромер (хроматид) - ПРЦ (ПРХ), ідо е патогномонічним для деяких вроджених і спадкових захворювань (Tomkins D. ,1989;Scapaticci S., 1988); поліплоїдії та с-., ^редуплікації, які можуть свідчити про процеси диференціації тканин 1 характеризувати певні онкологічні гахворпЕзния, бути причиною елімінації ембріонів 1 плодів на різних етапах онтогенезу (Mulleris М., 1987; Zelante L., 1988).

Деякі особливості каріотипу соматичних клітин е також Інформативний для оцінки наслідків мутагенного та тератогенного впливу шкідливих факторів зовнішнього середовища у популяції людини. Розробка нових підходів у цьому напрямку набуває особливої актуальності у зв'язку Із Чорнобильською аварією 1 хімічним забрудненням навколишнього середовища.

Оскільки організм вагітної жінки 1 плода є особливо чутливим до мутагенного впливу шкідливих факторів навколишнього середовища, то .визначення наслідків такого впливу за допомогою ци-тогенетичного аналізу І зіставлення комплексу показників, що характеризують стан клітинної популяції, а саме: частоти хромосомних аберацій, поліплоїдії, ендоредуплікації, П?Х дає змогу розширити можливості клШко-експериментальної цитогенетики. Однак праці по зіставленню перелічених показників відсутні. Не проводилось також порівняльного дослідження особливостей каріотипу 'В різних тканинах ембріонів людини в умовах in vivo та in vitro. Більшість робіт по вивченню хромосомних аберацій, поліплоідій, ендоредуплікацій та ПРЦ (ПРХ) виконувалась на культивованих in vitro клітинах індивідів постнаталь-кого періоду розвитку ( Cha."Rla G., 1988; Бочков Н.П., 1S39;

Gandy S., 1989). Особливості каріотипу у соматичних клітинах

! і

: * " г‘! - З -

■ - 4 -

Оріоні в досліджувалися лише у декількох роботах, зокрема .встановлено частоту шшюїдій та структурних хромосомних аберацій у трофобластах медичних 1 спонтанних абортусів 8-13 тижнів розвитку (Lukas U. аі. 1989). У цьому відношенні вивчення раннього періоду онтогенезу становить інтерес, так як чутливість соматичних клітин ембріонів 1 плодів до мутагенного впливу може відрізнятися від такої у дорослих (Bourgeoi С.А. et аі., 1981 ;АлександроВ С.Е., 1982).

Метою даної роботи було вивчити особливості каріотипу соматичних клітин різних тканин ембріонів людини 6-12 тижнів розвитку in vivo, in vitro та у вагітних жінок. Для досягнення поставленої мети послідовно розв'язували наступні задачі:

1. Вивчити частоту 1 спектр хромосомних аберацій, поліплоідій, ендоредуплікацій у "лІмфоцитах"печ1нки 1 фібробластах шкірно-м’язової тканини ембріонів людини.

2. Вивчи'і.і особливості метафазних хромосом у різних тканинах ембріонів людини in vivo, in vitro та у вагітних жінок.

3. Провести порівняльне дослідження явища передчасного розходження хроматид у соматичних клітинах ембріонів людини та у вагітних жінок.

Наукова новизна дослідження. Вперше вдійснено порівняльне вивчення особливостей каріотипу (хромосомних аберацій,поліплоїдії, ендоредуплікації, передчасного розходження хроматид) клітин різних тканин ембріонів людини та вагітних жінок.Достовірно доведено наявність більш високого рівня хромосомних аберацій як у "л1мфоцитах"(ми вживаємо термін у лапка* тому, що лімфоцити ембріонів функціонально дещо відрізняються від лімфоцитів дорослих індивідів), так 1 в фібробластах ембріонів людини порівняно з лімфоцитами вагітних жінок.

При зіставленні спонтанного рівня поліплоїдії та ендоредуплікації у клітинах різних тканин у ранньому онтогенезі та у вагітних жінок вперше встановлено, що досліджувані явища більш характерні для культивованих in- vitro фібробластів ембріонів людини, а ендоредуплікації практично повністю відсутні в лімфоцитах вагітних жінок.

Уперше вивчена частота ПРХ у різних тканинах ембріонів людини в 'умовах in vivo 1 при культивуванні in vitro; досто-

вірно показано збільшення частоти ПРХ у "лімфоцитах" порівняно з фібробластами ембріонів людини.

Порівняльне вивчення феномена передчасного розходження хроматид у клітинах ембріонів людини та у вагітних жінок показало, що явище ПРХ, по-перше, характерне для стану in vivo, по-друге, залежить від статі ембріона. '

Уперше досліджено особливості каріотипу ембріонів -близнят 1 вагітних жінок, від яких вони отримані. Показано відсутність різниці по частоті хромосомних аберацій, поліплоідій та ендоредуплікацій у ембріонів у межах однієї пари 1 наявність значної різниці по частоті ПРХ у ембріонів різної статі в межах пари. Цитогенетичне вивчення ембріонів-близнят може служити зручною моделлю для розуміння феномена ПРХ.

Практична цінність роботи. Результати порівняльного дослідження частоти 1 спектра хромосомних аберацій у ембріонів людини та’вагітних жінок дають змогу оцінити сумарний вплив мутагенних факторів на ембріон при дії на організм матері. Відсутність достовірної різниці по частоті 1 спектру хромосомних аберацій між "лімфоцитами” печінки 1 культивованими in vitro фібробластами шкіри дозволяє рівноцінно використовувати цитогенетичне дослідження двох тканин для генетичного моніторингу.

У результаті проведеної роботи складені методичні рекомендації "Хромосомний аналіз абортного матеріалу для оцінки можливої мутагенної дії факторів навколишнього середовища” та "Генетичний моніторинг населення у зв’язку із забрудненням навколишнього середовища". Упровадження цих рекомендацій дає змогу швидко 1 чітко провести -вивчення частоти і спектра хромосомних аберацій у "лімфоцитах” ембріонів 1 плодів, отриманих при артифіціальних абортах від жінок- працівниць деяких промислових підприємств 1 з несприятливих у екологічному відношенні регіонів. Це дозволяє оцінити частоту мутаційних подій при впливі потенційних пошкоджуючих факторів 1, отже, адекватно проводити профілактичні заходи.

На основі результатів дослідження явища передчасного розходження хроматид зроблено припущення, що висока частота ПРХ у соматичних клітинах ембріонів 6-12 тижнів розвитку, що знаходяться у стані in vivo, не зв’язана з будь-якою патологією і

'• нормою функціонування геному людини. Отримані нами дані можуть бути використані у пренатальній діагностиці.

Впроваджень., результатів дослідження практику. Результати дослідження були впроваджені у Тернопільській обласній дитячій клінічній лі.лрні, Чернівецькому міському пологовому будинку N1 1N 2 та Львському НДІ педіатрії, акушерства та спадкової патології, що сприяло підвищенню точності оцінки можливого мутагенного впливу факторів навколишнього середовища.

Основні положення. що виносяться на захист.

1. У "лімфоцитах" ембріонів людини частота хромосомних аберацій, поліплогч1в, клітин з передчасним розходженням хро-матид вища порівняно з лімфоцитами крові вагітних жінок.

У культивованих in vitro фібробластах ембріонів людини частота хромосомних аберацій, поліплоідів 1 ендоредуплікацій вища, ніж у лімфоцитах вагітних жінок.

2. Частот' хромосомних аберацій у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів 6-12 тижнів розвитку достовірно не відрізняється. Поліплоїдія 1 ендоредуплікацій частіше трапляються у фібробластах порівняно з "лімфоцитам" ембріонів людини. При культивуванні in vitro частота поліплоідів та ендоредуплікантів збільшується з наростанням номеру пасажа. .

3.Існують міжтканинні та міжстатеві відмінності по частоті клітин з передчасним.розходженням хроматид у ранньому онтогенезі людини.Спостерігається більш висока частота ПРХ,по-перше, у "лімфоцитах" ембріонів порівняно з фібробластами ембріонів людини, по-друге, у "лімфоцитах" ембріонів жіночої C" ті порівняно з чоловічою. Феномен ПРХ ке зв’язаний з будь-якою патологією у ранньому онтогенезі людини 1 є нормою функціонування геному б умовах in vivo. При культивуванні in vitro кількість метафаз з ПРХ поступово зменшується.

Апробація роботи. Ьіатеріали дисертації доповідались 1 обговорювались на 22-му міжнародному симпозіумі по цитогенетиці (Братіслава, 1989), на V Пленумі правління НТАГ УРСР (Тернопіль, 1989), на Другому Всесоюзному з’їзді медичних генетиків ( Алма-Ата, 1990), на Європейській асоціації акушерів 1 гінекологів (Москва,1991), на засіданні Вченої Ради НДІ педіатрії, акушерства та спадкової патології (Львів, 1992).

Публікації По темі дисертації е 8 друкованих праць.

Об'єм дисертації. Дисертація містить наступні розділи: вступ, огляд літератури, матеріали та методи, результати власних досліджень, обговорення, заключения, висновки, список літератури. Робота викладена на 138 стор. машинописного тексту 1 містить 17 таблиць 1 10 рисунків. Список літератури складається з 170 назв. •

ЗМІСТ РОБОТИ

1 .Матеріали J_ методи дослідження. З метою оцінки особли-' востей каріотипу соматичних клітин в ембріональний період онтогенезу людини досліджено’40 ембріонів 6-12 тижнів внутпішььо-утробного розвитку, отриманих в результаті артифіціальних абортів.

Проведено обстеження 23 вагітних жінок, які проживають на території м.Львова чи ЛьвІвськоГ області, з нормальним акушерсько-гінекологічним анамнезом віком від 20 до 35 років. У всіх випадках у жінок не було спроб ' переривання вагітності внаслідок приймання медикаментозних препаратів.

Матеріалом для дослідження служили лімфоцити периферичної крові вагітних жінок, "лімфоцити" з тканини печінки, а також фібробласти зі шкірно-м’язової тканини ембріонів людини.На кожного Індивіда аналізували 100-150 метафазних пластинок. Усього у процесі виконання роботи досліджено близько 8000 соматичних клітин.

Препарати метафазних хромосом з лімфоцитів крові вагітних жінок отримували за загальноприйнятою методикою (Eloorhead P.S., I960). Кров культивували in vitro у поживному середсЕкідІ Ігла з додаванням глютаміну, сироватки крові великої рогатої худоби. Як стимулятор проліферації використовували ФГА "Difco" у стандартному розведенні. Фіксацію клітин проводили на 48-й годині від початку культивування.

Препарати метафазних хромосом з "лімфоцитІв”печінки ембріонів людини без їх культивування in vitro отримували за методом, розробленим у Львівському НДІ педіатрії, акушерства та спадкової патології (Соганський 0.0. та 1н., 1989).

На наведеній нижче схемі зображено стадії процесу отримання препаратів метафазних хромосом "лімфоцитів" ембріонів

""'цини 6-12 тижнів внутр 1 шньоутроОного розвитку.

Схема

Принципи отримання препаратів метафазних хромосом "лімфоцитів" ембріонів людини 6-12 тижнів внутрІшньоутробного роз- • витку . '

I етап

Забір матеріалу; виділення печінки; наробка ''•'спензії клітин .

• ' , І

II е т а п .

Виділення лімфоідного кільця у фікол-верографіні; відму чшя суспензії від фікол-верографіну і

III етап

Інкубація лімфоцитів у середовищі Ігла протягом двох годин з колхіцином у кінцевій концентрації 10<Г/ мл

. І

IV етап

Стандартна фіксація 1 приготування метафазних хромосом ■

Важливим етапом отримання "лімфоцитів" ембріонів було виділення печінки, оскільки 80 7. абортусів при виконанні аборту перебувають у зруйнованому стані.Якщо ембріон не пошкоджений, то за допомогою мікрохірургічного пінцета та очного скальпеля розрізали черевну порожнину, виймали печінку 1 поміщали II у чашку Петрі із середовищем Ігла. Значно . складніше відшукати печінку в лотку, коли ембріон пошкожений. Обробку печінки проводили зразу ж після забору матеріалу, тому що при тривалому зберіганні печінки до моменту II обробки кількість метафаз значно зменшувалась. .

Препарати метафазних хромосом з фібробластів

шкірно-м'язової тканини отримували, попередньо культивуючи клітини in vitro за загальноприйнятою методикою (Hayflik K.L. et al., 1961). Клітини культивували в поживному середовищі Ігла з подвійним набором амінокислот, сироваткою крові великої рогатої худоби 1 пуповинною сироваткою крові людини. Через 3-4 дні після цього при утворенні моношару клітин, одну частину

клітин пересаджували у флакони Карреля, Іншу - у "слайд”-фла-

кони з поживним середовищем. Через 36-40 годин після пересадки клітин, у "слайд"-флакони-вводили lOf-ний розчин колхіцину та інкубували 2 години при ^+37®С. Проводили стандартну ф’ :ац1ю клітин.

Приготовані описаними вище методами препарати .-метафазних хромосом витримували 1-2 дні у термостаті при t -+37' С, а потім піддавали рутинному забарвленню (протягом 8 - 10 хв 2%-ним водним розчином барвника Гімзи).

Стать ембріонів визначали за допомогою G-методу диференціального забарвлення хромосом.

Для отримання повної інформації про препарати метафазних хромосом використовували метод реєстрації хромосомних аберацій, поліплоідних наборів , ендоредуплікантів 1 клітин з передчасним розходженням хроматид у вигляді схематичного зображення у зошиті. •

Результати дослідження піддавали математичній обробці з використанням загальноприйнятих методів варіаційної статистики. Обчислення проводили на ЕОМ "Злектроника”ДЗ-28. Еизкачали середні значення Ш), середне-квадратичне відхилення (б), середню стандартну похибку (т).

• 11.Результати дослідження та їх обговорення. Оцінку особ-

ливостей каріотипу соматичних клітин ембріонів людини проводили шляхом порівняльного дослідження частоти 1 спектра хромосомних аберацій, визначення частоти поліплоідних наборів 1 ендоредуплікантів, вивчення явища передчасного розходження хроматид у "лімфоцитах" печінки та фібробластах шкірно-м’язової тканини.

Цитологічно на препаратах метафазних хромосом ембріонів людини розрізняли аберації хромосомного та хроматидного типів.

У двох досліджених тканинах домінуючими по спектру були аберації хроматидного типу 1 складали у "лімфоцитах" - 77,5 %, а у фібробластах шкі, ..о-м'язевої тканини ембріонів - 72,8 7. від загальної кількості хромосомних аберацій.

Найбільш часто .раплялися як у "лімфоцитах", так 1 у фібробластах ембріонів людини одиночні фрагменти. Серед конфігурацій обмінного типу у фібробластах ембріонів спостерігали повні міжхромосомні хроматидо-хроматидні симетричні обміни.

Аберації хромосомного типу у двох досліджуваних тканинах були представлені як простими, так 1 обмінними конфігураціями. Серед аберацій хромосомного типу у соматичних клітинах ембріонів переважну більшість складали ацентричні фрагменти, а також точкові делеції. Найрідше спостерігалися міжхромосомні обміни ( дицентричні хромосоми).

Результати обліку частоти 1 спектра хромосомних аберацій у лімфоцитах і Фібробластах ембріонів людини представлені в табл.1.

На основі наведених у табл. 1 даних ми можемо стверджувати з ймовірністю Р > 0,05 про відсутність міжтканинних відмінностей по частоті аберацій як хроматидного, так 1 хромосомного типів у "лімфоцитах" печінки 1 культивованих in vitro фібробластах шкірно-м’язової тканини ембріонів людини. Не виявлено також різниці по спектру хромосомних аберацій за еинятком наявності у фібробластах обмінних конфігурацій хроматидного типу.

У зв'язку з використанням у работі ембріонів людини як чот->вічоі, так 1 жіночої статі, провели порівняльне вивчення частоти хромосомних аберацій у цих двох групах. Отримані результати свідчать про відсутність залежності частоти хромосомних аберацій від статі у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів людини. '

Для того щоб особливо чітко оцінити міжтканинНі особливості частоти 1 спектра хромосомних аберацій, провели дослідження метафазних хромосом двох тканин одних 1 тих же ембріонів людини.

Результати дослідження розподілу частоти аберацій хромосомного і хроматидного типів по соматичних клітинах двох

Таблиця 1

Результати порівняльного дослідження частоти 1 спектра ' хромосомних аберацій у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів людини

Тип Частота, хромосомних аберацій

хромосомних аберацій "лімфоцити" : М + m фібробласти М + m Р

хроматидний прості '2,25 + 0,24 2,35 + 0,30 > 0,05

■ обмінні - 0,10 + 0,0? > 0,05

хромосомний прості ТД АФ 0,22 + 0,09 0,34 + 0,1 0,4 + 0,13 0,4 + 0,13 > 0,05 > 0,05

_ обмінні д 0,09 + 0,05 0,1 і 0,07 > 0,05

Загальна кількість хромосомних аберацій 2,91 + 0,26 3,35 + 0,44 > 0,05

Кількість досліджених клітин - п 3300 . 2000

Примітка. ТД - точкові делеції; АФ - адентрйчні фрагменти; Д - дицентричні хромосоми.

тканин одних 1 тих же ембріонів людини фактично підтверджують дані, отримані на різних ембріонах. Однак у культивованих in vitro фібробластах удвічі частіше, ніж.у "лімфоцитах”, виявлено ацентричні фрагменти. Крім того, аберації хроматидного типу в фібробластах ембріонів людини більш різноманітні за спектром порівняно з "лімфоцитами”.

При вивченні особливостей каріотипу соматичних клітин "лімфоцитів" та фібробластів ембріонів людини було виявлено, крім хромосомних, і геноми 1 мутації, представлені поліплоїд-ними наборами 1 єндоредупл1кантами.

■ - 12 -Порівняльне дослідження частоти поліплоідних наборів та ендоредуплікані ;в у клітинах двох тканин ембріонів людини в стані in vivo 1 при культивуванні in vitro показало, що Існує міжтканинна дмінність по частоті поліплоідких наборів хромосом 1 ендоредуплікантів у різних ембріонів людини. На основі досліджень 1 статистичних розрахунків можна стверджувати з ймовірністю Р<0,001, що достовірно більше поліплоїдіє спостерігали у фібробластах (2,45 + 0,54) ембріонів порівняно в "лімфоцитами"(0,59+ 0,13). Частота ендоредуплікантів у фібробластах ембріонів (1,15 ± 0,32 ) також перевищувала частоту ендоредуплікантів у "лімфоцитах" ембріонів людини ( 0,13 + 0,07; Р< 0,001).

Аналіз попарного дослідження частоти поліплоідних наборів хромосом у двох тканинах одних 1 тих же ембріонів людини повністю підтверджують результати, отримані на різних

ембріонах ( рлс.і). _ _ _ _ ______ ____

% ' ' ~ ' to -

9

6 г

7 6 5 4 З 2 1 О

З _В

я

І

І

||!

І и

1 $ & Jtl їй

а й І

5 6 7

8 9 Ю II 12 13

Рис. 1. Розподіл поліплоідних наборів хромосом при дослідженні "лімфоцитів" та фібробластів одних 1 тих же ембріонів людини § - оцити* ембріонів; £3 - <;іСрс-бласті: ембріонів Особливо чіткою є різниця в частоті поліплоідних наборів

' - 13 - •

хромосом по двох тканинах (рис.1) при дослідженні ембріонів N 7,9,10,12. Тільки у декількох випадках даний показник був одинаксЕий як у"лімфсцктах", так 1 у фібробластах ембріонів людини. ' ■

Особливості ендоредуплікації при дослідженні двох тканин одних 1 тих же ембріонів людини свідчать про значно вищу частоту ендоредуплікацій у фібробластах порівняно з "лімфоцитами" ембріонів. Для "лімфоцитів" ембріонів ендоре-дуплікація - феномен, що рідко спостерігається.

У зв’язку з тим, що кількість поліплоідних наборів та ен-доредуплікантів збільшена в культивованих in vitro клітинах, можна припустити, що саме ці явища характерні для клітин, що тривало культивуються 1 практично відсутні у стані in vivo. З метою перевірки цієї гіпотези підраховано поліплоїдії 1 набори хромосом і ендоредупліканти ка декількох пасажах (табл.2).

Як бачимо з табл.2, чим тривав.ше культивування фібробластів ембріонів людини in vitro, тим більша кількість поліплоїдів 1 ендоредуплікантів нагромаджується у клітинах.

Тенденцію до збільшення частоти поліплоїдів при культивуванні in vitro можна пояснити, використовуючи гіпотезу Loffler (1987), згідно з якою кількість поліплоїдів та ендоредуплікантів залежить від тиску кисню. Збільшення частоти даних явищ 'в клітинах солідних пухлин автор пов’язує з наявністю гіпоксичних умов. Оскільки процес тривалого культивування клітин in. vitro можна вважати моделлю гіпоксичного стану, в якому перебувають клітини, то отримані нами результати узгоджуються з даною гіпотезою. З іншого боку, - для приготування суспензії фібробластів порівняно з "лімфоцитами" додається така стадія обробки як зняття клітин з поверхні скла за допомогою трипсину 1 версену. Останній зменшує рівень двовалент- . них катіонів, а саме Са. Зміна транспорту іонів Са може призводити де порушення мітотичного апарату (Petrelt Ch.,1985), а трипсин порушує цілісність клітинної мембрани. У зв’язку з цим неодноразова обробка трипсином і версеном при тривалому куль-тивуванп. зумовлює збільшення частоти поліплоідних наборів та ендоредуплікантів у наступних пасатах, що й було нами проде-монсїроЕано на фібробластах ембріонів людини.

Таблиця 2

Частота поліг, .оїдів 1 ендоредуплікантів у фібробластах ембріонів людини на різних пасажах культивування ' клітин in vitro.

N П/П N пасажу .Частота явища %

поліплоїдія єндоредуплікац і я

І 0 1

1 II 1 1

IY 2 1

9 3

2 II 10 . 3

IY 21 7

YI 29 10

І ' 2 3 .

3 II 2 • 3

IY 7 4

І 4 1

II 4 ■ 1

4 III 6 . 1

IY ’ 6 2

Потенційно шк ,ливі речовини не діють безпосередньо на організм,що розвивається, а опосередковано, через материнський. Сумарна дія факторів навколишнього середовища, а також зміна гормонального статусу організму, що відбувається під час вагітності,.є причиною індукції різних за типом хромосомних аберацій як у хромосомах матері, так 1 в хромосомах ембріонів. Існуючий фетоплацентарний бар'єр не є абсолютним від проникнення шкідлибих рєчоеин, токсинів, бактерій.

Порівняльне вивчення особливостей каріотипу провели в

лімфоцитах крові вагітних жінок 1 в "лімфоцитах" печінки різних ембріонів людини (умови in vivo), а також у культивованих in vitro фібробластах шкірно-м’язової тканини ембріонів людини. Крім того, цитогенетччно досліджували вагітних жінок та ембріони, які отримували саме від них. У зазначених вище групах визначали частоту хромосомних аберацій, поліп.юідій та ендсредуллікацій.

Результати порівняльного вивчення частоти хромосомних аберацій у лімфоцитах вагітних жінок 1 "лімфоцитах" ембріонів людини свідчать про те, що за загальним рівнем хромосомних аберацій лімфоцити вагітних жінок 1 "лімфоцити" ембріонів людини достовірно відмінні. Основу цієї відмінності складає різниця по частоті аберацій хроматидного типу 1 по ацент-ричних фрагментах. Загальна кількість хромосомних аберацій у "лімфоцитах" ембріонів становить 2,91 + 0,26 , що вище, ніж у лімфоцитах крові вагітних жінок ( ? 0 + 0,31; Р < 0,05).

Досить Ілюстративним виявилося вивчення розподілу хромосомних аберацій між "лімфоцитами".ембріонів 1 лімфоцитами вагітних жінок, від яких вони були отримані.

Згідно з даними дослідження, показники частоти аберацій хромосомного типу в "лімфоцитах" ембріонів перевищували показники в лімфоцитах матерів. Основу різниці складали ацентричні фрагменти.

Порівняльне вивчення частоти хромосомних аберацій у фібробластах шкірно-м’язової тканини ембріонів людини 1 в лімфоцитах вагітних кінок проводили, використовуючи ембріональні клітини,отримані після 1-го пасажу культивування у поживному середовищі. Отримані результати дослідження свідчать про достовірно вищий рівень хромосомних аберацій у культивованих in vitro фібробластах ембріонів людини (3,35 + 0,44) порівняно з лімфоцитами крові Еагітних ж ок (2,00 + 0,31; .

Р< 0,05). Не виявлено достовірної різниці в досліджуваних групах лише по частоті точког'х делецій 1 дицентричних хромосом.

Відмінності по частоті хромосомних аберацій між ембріонами людини та вагітними жінками можуть бути пов’язані з такими факторами як швидкість всмоктування, поширення, виведення ! трансформації речовин, з якими контактує материнський ор-

ганізм, або швид сть, . з якою вони проникають через ворсини хоріона чи біотрансформуються е них. Крім того, очевидно, у цьому відношенні мають значення маса 1 розміри ембріона порівняно з масою матері. Тому навантаження факторів зовнішнього середовища, з яким безпосередньо контактує організм ембрісна, повинне відрізнятися від такого при дії на організм вагітної жінки, а отже 1 частота досліджуваних нами явищ може відрізнятися у матері порівняно з ембріоном.

При вивченні особливостей каріотипу в клітинах різних тканин ембріонів 1 в соматичних клітинах вагітних жінок спостерігали, крім хромосомних аберацій, явище поліплоїдії. Провели також облік частоти ендоредуплікантів у клітинах ембріонів людини 1 їх матерів. Статистична обрс.ка даних підтвердила наявність достовірно вищої частоти поліплоідій у "лімфоцитах " (0,59 + 0,13) 1 фібробластах ( 2,45 + 0,54 )

ембріонів порівняно з лімфоцитами вагітних жінок (0,09 + 0,06;Р <0,001). Виявлено відсутність будь-якої рівниці по частоті наборів хромосом з ендоредуплікаці ями між "лімфоцитами" ембріонів (0,13 + 0,07) та вагітними жінками (Р>0,05). По частот! ендоредуплікацій між фібробластами ембріонів (1,15 +0,32) 1 лімфоцитами вагітних жінок Існує достовірна

різниця з ймовірністю Р< 0,001.

Перевірка тенденцій розподілу частот різних явищ при порівняльному визченні особливостей каріотипу різних тканин одних 1 тих же ембріонів і вагітних жінок, від яких вони отримані: показала, що найвищі показники частоти хромосомних абе-

рацій характерні для клітин ембріонів людини. Особливо суттєва різниця по частот: хромосомних аберацій між фібробластами

ембріонів і лімфоцитами крові матерів. Менше відрізняються по частоті хромосомних аберацій лімфоцити матері та ембріонів.

Хромосомні набори вагітних жінок характеризувалися повною відсутністю пслішіоідів і ендоредуплікантів у представлених випадках, тоді як у фібробластах ембріонів кількість поліплоідних наборів склала .в'ід 1 до 7 7, . Отже ■ існує значна різниця по частоті поліплоідів у різних тканинах одних них тканинах одних і тих же ембріонів людини, а також між клітинами ембріон*- і лімфоцитами матерів.

■ - 17 - •

Дослідження особливостей каріотипу соматичних клітин ембріонів людини 1 вагітних жінок показало, що поряд з присутністю у них описаних вище ябищ, спостерігається феномен передчасного розходження хроматид - ПРХ. У літературі явище описане в нормі 1 при деяких патологічних станах в культивованих in vitro клітинах індивідів постнатального періоду розвитку. У клітинах ембріонів 1 вагітних жінок особливості 1 частота ПРХ практично не вивчені.

У хромосомних наборах ембріонів людини спостерігали явище передчасного розходження хроматид, при якому всі, або ж частина хромосом представлені хроматидами, що розійшлися.

За способом просторового розміщення хроматид у хромосомних наборах з ПРХ у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів людини можна виділити дві групи:

1) хроматиди лежать паралельно одна до одної на незначній відстані;

2) хроматиди розміщені на значній відстані одна від одної, не паралельні. .

Для фібробластів більш характерним є наявність групи І, а в лімфоцитах трапляються обидві вищеназвані групи. '

Провели облік кількості метафаз з ПРХ , враховуючи лише набори з повним ПРХ у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів як чоловічої, так 1 жіночої статі.

На основі проведених нами досліджень було виявлено міжтканинну варіабельність по частоті ПРХ у "лімфоцитах" 1 фібробластах ембріонів людини, причому достовірно вища частота метафаз з ПРХ спостерігалась у "лімфоцитах" ембріонів людини (16,34 + 2,68) порівняно з фібробластами (2,0 + 0,50;Р < 0,001) Розмах міжтканинної варіабельності по частоті ПРХ ми спостерігали 1 при дослідженні даного явища у двох тканинах одних 1 тих же ембріонів людини. ' ,

Згідно з даними (N.L.Rudd et al.(1983) порівняльне вивчення передчасного розходження центромер (хроматид) у культурі фібробластів 1 лімфоцитів фенотипічно нормальних індивідів показало на вність ПРХ у лімфоцитах крові 1 повну відсутність явища в фібробластах шкіри. • Це означає, що по даному феномену иоже l-снувати тканинний мозаїцизм 1 в постнатальному періоді

розвитку. '

Однак, крім міжтканинних відмінностей, в ембріонах ми спостерігали різний розподіл ПРХ залежно від статі. Кількість клітин з ПРХ б "лімфоцитах" ембріонів жіночої статі перевищувало показники частоти ПРХ в ембріонів чоловічої статі. Найбільш яскравим доказом цієї особливості соматичних клітин періоду внутрішньоутробного розвитку людини стало дослідження одностатевих та різностатевих ембріонів-близнят. Одинаковий гестаційний вік та ідентичні умови розвитку ембріон їв-близнюкїв дають змогу значно поглибити розуміння ряду явищ, характерних для ембріонального періоду розвитку. По-пер-се, виявлено існування різниці по частоті клітин з ПРХ між різностатевими ембріонами-близнятами в межах пари, ..л-друге, показано, що показники частоти ПРХ у "лімфоцитах" ембріонів жіночої статі перевищують показники частоти ПРХ лімфоцитів ма-. тер!. Необхідно зазначити, що в літературі відсутні дані по цитогенетиці ембріонів-близнят.

Порівняльне вивчення частоти ПРХ у вагітних жінок 1 в соматичних клітинах різних тканин ембріонів свідчить про відсутність різниці по частоті ПРХ між лімфоцитами вагітних жінок ( 2,35 + 0,62) 1 фібробластами ембріонів людини

(1,75 ±0,89 ; Р >0,05 ). Однак у "лімфоцитах" ембріонів частота даного феномену достовірно вища, ніж у лімфоцитах крові вагітних жінок. Особливо наглядно цю різницю видно при дослідженні лімфоцитів матерів 1 ембріонів, отриманих від них ( рис. 2).

Отже, в одному й тому ж типі.клітин ( лімфоцити вагітних', жінок 1 ембріональні "лімфоцити") достовірною є різниця по частоті ПРХ між ідивідами постнатального періоду розвитку і ембріонами. Наявність такої різниці можна пояснити, використовуючи данні літератури. По-перше, показано, що існує прямий зв'язок між часом розходження центромер і кількістю прицентромерного гетерохроматину (Ятапг А.,1987;Уіг Б.К. еЬ аі., 1989). З цієї ж причини У-хромосома розходиться пізніше, ніж аутосоми, тому що має більше' гетерохроматину. По-друге, встановлено достовірно менші розміри прицентромерного гетерохроматину у ембріонів людини порівняно з новонародженими дітьми ( Акопяг '1.Р., 1988). Отже, чим менші розміри прицент-

Рис.2.Частота ПРХ.у "лімфоцитах" ембріонів 1 їх матерів □ - лі.лфоцши крові латєрів

2 -'лС/фоцьши:'єхвріонів ромерного гетерохроматину, тим швидше розходяться центромери 1 хроматиди. Узагальнюючи викладені' дані зазначимо, що мія соматичними клітинами ембріонів людини 1 вагітними жінками Існують відмінності ( по частоті хромосомних аберацій, поліпло-Iді в у двох досліджуваних тканинах ембріонів, крім того, по частоті ПРХ у "лімфоцитах "1 по частоті ендоредуплікацій у фібробластах ембріонів порівняно з лімфоцитами вагітних жінок) (рис.З). '

ХРОХОСОУНі

АБЕРАЦІЇ

ПОЛІПЛОЇДІЯ

ШСРЕДШі НАЦІЯ

Р

МЕРЕДЧАСНЕ РОЗХОДЖЕННЯ ХРОМАТИД

ІЕЕЗ .'£Ш \шш І їй

ІЕаХ ^

2.911 0,26 2,00і 0,31

3,35 і 0,26 2,00 ± 0,31

0,58±0,06

0,09±0,06

2,45*0,54

0,09x0,06

0.І2І 0,СІЇ О .

1,751 0,32 О

Р <0,05 Р< 0,05

Р< 0,001 Р< 0,001

Р>0,05 РсО.ООІ

з І6,34± 2,68

2,35 + 0,0,62 Р<0,001

1,75 ± .0.89

2,35 + 0,62 Р>0,05

Рис. 3. Схематичне зображення результатів порівняльного вивчення особливостей каріотипу соматичних клітин . ембріонів, і вагітних жінок

СЗЗ -"ЛіЛфОХЩІШ ЄЛбріОНів

- Фібробласти елбріонів " ІЯ’ЧЯ Лілфошжи крові вагітних жінок

- 21 - .

ВИСНОВКИ

1. Спонтанний рівень хромосомних аберацій у соматичних клітинах ембріонів людини ("лімфоцитах" 1 фібробластах) достовірно вищий, ніж у лімфоцитах крові вагітних жінок.

2. У "лімфоцитах" ембріонів людини частота поліплоїдких наборів хромосом достовірно вища порівняно з лімфоцитами вагітних жінок. По частоті ендоредуплікантів різниці між лімфоцитами вагітних 1 ембріонів не виявлено.

3. У фібробластах ембріонів людини частота поліплоідних наборів хромосом 1 ендоредуплікантів достовірно вища порівняно з лімфоцитами вагітних жінок.

4. Спонтаний рівень хромосомних аберацій у "лімфоцитах” 1 фібробластах ембріонів людини достовірно не відрізняється. Не виявлено різниці по частоті хромосомних аберацій у досліджуваних тканинах ембріонів різної статі. У цьому відношенні "лімфоцити", як 1 фібробласти можна і..вноцінно використовувати для генетичного моніторингу.

5. Існує міжтканинна варіабельність по частоті

поліплоїдних наборів хромосом 1 ендоредуплікантів у соматичних клітинах ембріонів людини: у фібробластах ембріонів дані явища трапляються достовірно частіше, . ніж у "лімфоцитах". У процесі культивування in vitro кількість поліплоідів і ендоре-дуплікантів збільшується Із зростанням номера пасажу. '

6. Кількість метафаз а передчасним розходженням хрома-

тид -ПРХ достовірно виша у "лімфоцитах" ембріонів людини порівняно з лімфоцитами вагітних жінок. Не виявлено різниці по частоті ПРХ між фібробластами ембріонів 1 лімфоцитами вагітних жінок. • ■

7. У ."лімфоцитах" ембріонів людини достовірно частіше трапляється ПРХ, ніж у фібробластах ембріонів. Виявлено залежність частоти ПРХ від статі ембріона: кільі-..сть метафаз з ПРХ в ембріонів жіночої статі значно перевищує кількість метафаз

з ПРХ в ембріонів чоловічої статі. Феномен ПРХ є нормою функціонування геному ембріонів людини в умовах in vivo.

8. .;г.тогенетичне еивчєння ембріонів-близнят може служити зручною моделлю для дослідження особливостей явища передчасно-

го розходження хроматид. •

СПИСОК РОБИ , ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Давыдов Л.Я., ЯвориЕская О.М., Созанский О.А., Евтушенко А.В., лозинская М.Р. Медико-генетический подход*к оценке повреэдащего воздействия факторов окружалцеЯ среды ка ранних этапах беременности // В сб.: Антенатальная охрана плода и пути снижения перинатальной смертности: Тез. докл. Тернополь,

25-26.05. 1989,- Киев, 1989.- С.118-120. '

2. Sozansky 0.0, Lozynska M.R., Yavorivska О.М. Premature

centrorere division in maternal-fetal cells// 22nd Symposium on Cytogenetics with international parcicipation. 28-30 August 1989. Bratislava,1989.- p.43. '

3. Лозинская M.P., Созанский O.A., Ковалышин Б.И. Изучение хромосомных аберраций в системе мать-плод //В кн.:

Тез. докл.2-ого Всесоюзного съезда медицинских генетиков: Алма-Ата, 1990.- С.259-260.

4. Лозинская М.Р., Акопян Г.Р. Состояние метафазных хромосом лимфоцитов и фибробластов эмбрионов человека, как показатель мутагенного влияния на плод // В сб.: Медицинская генетика. Киев, 1990.-. С.93-97. . «

5. Созанский О.А., Яворивская О.М., Лозинская М.Р., Гав-рылюк Ю.И., Седнева И.А. Хромосомный анализ абортного материала для оценки возможного мутагенного влияния факторов окружаю-сцей среды: Методические рекомендации. Львов, 1990.- 10 с. .

6.Акопян Г.Р., Гаврилюк Ю.И., Гнатейко 0.3., Лозинська

М.Р., Сатурська А.Б., Седаева І.А., Созанський 0.0., ЯЕорІвсь-ка О.М. Генетичний моніторинг населення в зв'язку з забрудненням навколишнього середовища: Методичні рекомендації. Львів, 1991.- 14 с. '

7.Sozansky 0., HnateikoO., Lozynska М., Siednieva I. Mutagenic and Teratogenic Effects in Tissue of Human Embryo. //Europen Assotiation of Gynaecologists and Obstetricians, 6th Meeting iioskow, 1991, June 5-8.М., 1991,- P. 184.

в.Гаврилюк Ю.Я., Созанський 0.0., Акопян Г.P., Лозинська М.Р., Сєдкеьа I.А., Глинка П.А.. Яворівська О.М., Грицюк І.І. Генетичний моніторинг в аспекті Чорнобильської катастрофи //Цитологія 1 генетика.- Київ, 1992.-Т.26, N4.- С.15-19. .