Клеточные и биохимические аспекты эмбриопатий человека с аномальным набором хромосом

Кухаренко, Валерий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Клеточные и биохимические аспекты эмбриопатий человека с аномальным набором хромосом
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клеточные и биохимические аспекты эмбриопатий человека с аномальным набором хромосом"

РТЬ ОД - 2 ПИВ №95

российская академия медицинских наук

Медико-генетический научный центр

На правах рукописи УДК 618.39-021.3:576.5

кухаренко валерия иванович

клеточные и биохимические аспекты эмбриопатий человека с аномальным набором хромосом

03.00.15 - Генетика 03.00. 04 - Биохимия

автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва. 1995 г.

- г -

Работа выполнена в Институте генетики человека (директор-профессор С.С.Шишкин) Медико-генетического научного центра Российской академии медицинских наук ( директор - член-корр. РАМН, профессор В.И.Иванов ).

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор И.И.Вотрин

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Ревазова

доктор биологических наук • А.Ф.Панасюк

Ведущее учреждение - Институт цитологии РАН

Защита состоится "_и ___ 1995 г. в_. часов

на заседании специализированного совета Д 001.16.01. при Медико-генетическом научном центре Российской академии медицинских наук по адресу: Москва. 115478. ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного "центра Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан "__"_ - ' • 1994 г.

Ученый секретарь ,

специализированного совета

доктор биологических наук, профессор Л. Ф. Курило

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что аномалии кариотипа являются частой патологией в пренатальном и постнатальном периодах развития человека. Спонтанным абортом заканчиваются до 15% всех зарегистрированных беременностей. После того как в 1961 г. впервые было обнаружено наличие аномального кариотипа (триплоидия) в клетках мацерированного спонтанного абортуса (Penrose and Delhanty, 1961), было опубликовано большое количество работ по цитогене-тическому исследованию спонтанных абортусов человека (Kajll et al.,1973; Boue and Boue.1976: Кулиев. 1975; Hassold et al.. 1980, 1983; Warburgton.1980,1987). Отмечено, что 50-60% спонтанных абортусов имеют аберрантный набор хромосом, с самого начала исследования этой проблемы стало ясно, что распределение типов аномалий кариотипа среди спонтанных абортусов значительно отличается от того, которое определено различными авторами при цитогенетическом исследовании десятков тысяч новорожденных детей. Используя данные цитогенетического исследования более 5 тысяч спонтанных абортусов было обнаружено следующее соотношение основных типов хромосомных аномалий; моносомия X - 15!?. трисомии аутосом - 52%, триплоидия - 2055. тетраплоидия - 6%.

Более Z/3 спонтанных абортов проходит в I триместре беременности, такая патология как трисомия по хромосоме 21 элиминируется во время эмбриогенеза на 70%, трисомии 13 и 18 - на 90-95%, триплоидия - до 100%, моносомия X - до 99%. Суммируя данные по частоте анеуплоидии в ооцитах, сперматозоидах человека и данные по спонтанным абортам, можно определить динамику снижения частоты аномальных эмбрионов в пренатальном периоде: момент оплодотворения (38%), предимплантационный период (29%), I триместр беременности (15%), III триместр беременности (0,6%) (Plachot.1991). Эти данные ясно показывают, что спонтанные аборты являются мощным средством ранней элиминации дефектных зигот.

Поскольку при хромосомных аномалиях ведущими стигмами являются нарушения морфогенеза, а главными участниками морфогенеза являются клетки и клеточные сообщества, то вполне оправдана попытка исследования основных функциональных стигм культивируемых клеток человека с аберрантным набором хромосом, полученных из материала спонтанных и медицинских абортусов.

С помощью культивируемых клеток человека имеется возможность анализа патогенетических механизмов не только на клеточном уровне, но и на молекулярно-биохимическом уровне. Используя культивируемые клетки человека с аномальным кариотипом. мы имеем принципиально новый подход к анализу клеточного феноти-

па. позволяющий сравнивать геномы человека в норме и при хромосомном дисбалансе и экспериментально изучать проблему эмбри-олетальности у человека.

Вся совокупность клинических исследований абортусов и детей с хромосомными синдромами свидетельствуют о том, что нарушения развития, вызванные хромосомным дисбалансом - это прежде всего нарушения морфогенеза. Основными процессами, лежащими в основе морфогенеза, являются такие клеточные процессы как пролиферация, морфогенетические движения клеток и приобретение клетками формы в ходе дифференцировки. Только имея сведения о факторах, влияющих на эти процессы во время эмбриогенеза. можно более реально представить патогенез эмбриолеталь-ности.

Важную роль в эмбриогенезе играют факторы роста и элементы межклеточного 'матрикса, которые продуцируются клетками уже на ранних этапах эмбриогенеза. Экспериментально доказана регуля-торная роль элементов межклеточного матрикса в эмбриогенезе. Известны основные функции экстраклеточного матрикса в эмбриогенезе: i) регуляция клеточного движения, участие в морфогенезе органов плода, 2) участие в дифференцировке клеток. 3) роль эмбриональных индукторов взаимодействия между тканями эмбриона. Нарушение синтеза элементов межклеточного матрикса может значительно отражаться на фенотипе носителя, так мутационные повреждения синтеза протеогликанов является причиной формирования пороков развития у мышей cmd/cmd, bra/Ьш ( Muir, 1983 ). Полная блокада транскрипции гена коллагена альфа 1(1) приводит к ранней гибели эмбрионов экспериментальных животных (Schnleke et al., 1983 ). В работе с трансгенными мышами, несущими сконструированный "мутантный ген коллагена альфа 1(1), было отмечено, что даже при наличии 10% мутантных цепей коллагена в организме наблюдалось формирование патологического фенотипа ( Stacey et al., 1988 ).

Имеется богатый экспериментальный материал, свидетельствующий. что тератогены, нарушающие синтез элементов межклеточного матрикса, приводят к развитию врожденных пороков развития у человека и животных ( в первую очередь речь идет о таких препаратах как талидомид, салйцилаты, кортикостероиды и т.д.). Если женщина во время беременности принимает противоэпилепти-ческий препарат фенитоин ( нарушающий синтез гликозоаминогли-канов ). то у ребенка могут развиться типичные для хромосомных синдромов черепно-лицевые аномалии ( широкая, плоская переносица. низко посаженные уши, эпикант, гипертелоризм и т.д. ) (Van Lang et al.. 1984 ).

В норме жизнедеятельность клеток находится под контролем

различных регуляторных систем, в частности, -системы циклических нуклеотидов. Циклический аденозин-З'. 5'-монофосфат ( цАМФ ) и циклический гуанозин-3.',5'-монофосфат ( цГМФ ) опосредуют действие на клетку ряда гормонов, факторов воспаления и других биологически активных веществ ( Северин и Кочеткова. 1985; Федоров, 1979 ). Процессы клеточного деления, роста, дифференцировки клеток сопряжены с изменением содержания цАМФ ( Cramer and Schultt. 1977 ).Активность ферментов, обеспечивающих биосинтетический путь, подавляется при повышении уровня цАМФ, а активность ферментов катаболизма повышается ( Северин и Кочеткова, 1985; Ткачук. 1583 ^. Таким образом. цАМФ участвует в обмене различных белков, в том числе и белков межклеточного матрикса. Показано, что увеличение содержания цАМФ в клетках приводит к снижению продукции коллагена (Baum et al.. 1980 ).

Суммируя имеющиеся данные, . можно констатировать, что такие важнейшие показатели как пролиферативная активность клеток. синтез основных экспортных белков клетки, уровень внутриклеточных посредников могут влиять на морфогенез плода, все эти показатели могут быть исследованы в экспериментах in vitro.

■ Существует мнение, что одной из причин развития аномального фенотипа плодов и новорожденных детей с трисомным карио-типом может быть не только дисбаланс структурных генов, картированных на дополнительных хромосомах, но и, такой фактор как нарушение в трисомной клетке соотношения структурных и регуляторных генов. В связи с этим представляет большой интерес изучение в клетках эмбриолеталей человека спектра таких регуляторных генов как гомеобоксные гены. Достаточно хорошо известно, что гомеобоксные гены являются регуляторами эмбрионального развития ( Tabln, 1991, Malvllllo. 1993 ). Сотрудники Медико-генетического научного центра РАМН Мглинец и Иванов (1976) в экспериментах на Drosophila показали, что мутации гомеобокс-ных генов приводят к различным нарушениям морфогенеза.

Все эти данные свидетельствуют о том, что исследование культивируемых эмбриональных клеток человека с аномальным ка-риотипом может по новому осветить такую проблему как исследование пат генеза эмбриолетальности человека. Изучение патогенетических механизмов развития хромосомных болезней является актуальной проблемой медицинской генетики (Witkowski and Schröck,1990) и изучение общих механизмов патофеногенеза хромосомных аномалий может оказаться полезным при исследовании тератогенного эффекта менделирующих генов.-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генетически детерминированные нарушения морфогенеза у человека занимают заметное место в наследственной патологии человека. До недавнего времени существовало только два подхода к феногенетическому анализу нарушений морфогенеза У человека - моделирование на животных и патомор-фологическое исследование с ретроспективным обращением к данным эмбриологии. Благодаря применению культивируемых клеток стал возможным экспериментальный подход к феногенетическому анализу нарушений морфогенеза у человека.

. В настоящее время накоплен значительный материал о фенотипе спонтанных абортусов, новорожденных и взрослых индивидов с аномальным набором хромосом, однако эти сведения но дают представления _ о патогенезе этой широко распространенной наследственной патологии. Имеющиеся в настоящее время данные не могут ответить на вопрос о причинах полиморфизма фенотипа носителей хромосомных синдромов, ' когда одна и та же аномалия кариотипа может привести к прекращению внутриутробного развития, может быть обнаружена у новорожденного ребенка с пороками развития или, как в случае болезни Дауна, привести к незначительным изменениям фенотипа, совместимыми с жизнью и даже фер-тильностью.

В настоящее время опубликовано значительное количество работ по изучению эффекта дозы триплицированных генов (Epsteln,1986). однако эти данные внесли мало нового в понимание патогенеза хромосомопатий. В последние годы предпринята попытка исследования проблемы эмбриолетальности на клеточном уровне ( Кулиев,1975 ). Понятно, что попытка изучить патогенез хромосомных болезней на клеточном уровне вместе с тем представляет собой попытку 'описать фенотип на • клеточном уровне.

Цель и задачи исследования.

Основной целью настоящей работы было изучение клеточных и биохимических параметров эмбриолеталей человека с аберрантным набором хромосом. В экспериментах использованы штаммы фиброб-ластных клеток, выведенных из материала абортусов человека с наиболее часто встречающимися типами аномалий кариотипа ( три-сомия, моносомия, триплоидия ). Были поставлены следующие основные задачи: исследовать синтез основных экспортных белков фибробластных клеток с аномальным кариотипом (белков экстраклеточного матрикса), изучить функционирование белоксийтезирую-щего аппарата этих клеток, исследовать систему вторичных внут-

риклеточных посредников. Для достижения поставленной цели в J' ходе исследования решались следующие конкретные задачи: 1

1. Пополнить клеточный банк Медико-генетического научного центра Российской академии медицинских наук панелью штаммов i эмбрионального происхождения с диплоидным и аномальным карио- ' типом.

2. Изучить продолжительность успешного культивирования и показатели пролиферативной активности штаммов с аномальным кариотипом.

3. С помощью коллагеназного теста исследовать синтез коллагена - основного белка межклеточного матрикса. изучить такие ( его показатели как внутриклеточный распад проколлагена. 'соотношение коллагена типа I и типа III. определение степени гид-роксилирования остатков пролина альфа-цепей коллагена типа I.

4. Исследовать синтез другого важного белка межклеточного • матрикса - фибронектина.

5. Исследовать синтез и распад гликозоаминогликанов в клетках с аберрантным набором хромосом, определить относительную продукцию гепарансульфата. дерматансульфата и хондроитин-сульфата с помощью метода электрофоретического Фракционирования гликозоаминогликанов на ацетатных пленках.

6. Исследовать соотношение мембраносвязанных и свободных полирибосом в клетках с аномальным кариотипом, определить время синтеза средней полипептидной цепи, определить фазность распада белков в клетках человека с аберрантным набором хромосом.

7. Определить концентрацию цАМФ и цГМФ в клетках с аномальным кариотипом.

8. Изучить экспрессию таких'регуляторов эмбриогенеза как гомеобоксные гены.

9. Сформулировать представление о клеточных аспектах реализации хромосомного дисбаланса у человека.

Научная новизна работы.

Одним из итогов выполненной работы явилось значительное пополнение коллекции штаммов человека с аномальным кариотипом и контрольных диплоидных штаммов. Штаммы.получены из материала спонтанных, медицинских абортусов, биопсий кожи пациентов с генными и хромосомными синдромами. Проведен цикл работ, дающих комплексное представление о пролиферативных особенностях диплоидных и анеуплоидных штаммов человека, выведенных из биопсий эмбрионов; получены данные, свидетельствующие о снижении жизнеспособности клеток абортусов с аномальным набором хромосом.

Впервые проведено комплексное исследование основных ком-

понентов межклеточного матрикса серии эмбриональных штаммов с диплоидным и аномальным кариотипом, полученные данные свидетельствуют о наличии измененной структуры межклеточного матрикса в штаммах с аномальным кариотипом, что может быть одной из причин нарушения развития плода.

Впервые в фибровластных клетках абортусов с аномальным кариотипом исследована система внутриклеточных посредников (цАМФ и цГМФ), изменение в этой системе приводит к нарушению каскада реакций, регулирующих активность многих ферментов.

Впервые при исследовании белоксинтезирующого аппарата клеток спонтанных абортусов показано, что наличие в кариотипе дополнительных хромосом нарушает программу координированной работы различных генов.

Показана возможность изменения экспрессии во время эмбриогенеза человека таких регуляторов морфогенетических процессов-как гомеобоксные гены.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что в клетках с аномальным кариотипом. полученных из материала спонтанных абортусов, значительно изменено функционирование важнейших клеточных систем и эти изменения носят однотипный характер, что позволяет предположить наличие "канализированного механизма" реализации хромосомного дисбаланса в случае эмбриолеталь-ности. Следует отметить, что результаты большинства проведенных экспериментов на материале абортусов человека были получены впервые в мире, что обеспечивает приоритетность информации о клеточной реализации хромосомного дисбаланса при исследовании проблемы эмбриолетальности у человека.

Научно-практическая ценность работы.

Представлен перечень метаболических нарушений, обнаруженных в клетках эмбриолеталей человека, эти нарушения и также обнаруженные изменения пролиферативного потенциала эмбриональных клеток с аберрантным кариотипом могут быть основой формирования аномального фенотипа плода. Получены данные, развивающие представления о клеточных аспектах реализации хромосомного дисбаланса у человека. Полученные приоритетные данные значительно расширяют наши представления о патогенетических механизмах эмбриолетальности у человека, они могут быть использованы для создания концепции генетически детерминированных клеточных механизмов морфогенеза и его нарушений у человека. Результаты исследования клеток с аномальным набором хромосом позволяют выявить возможные последствия, которые могут 'возникнуть в функционировании диплоидных клеток человека при введе-

нии экзогенных фрагментов ДНК.

Положения, выносимые на защиту.

1-. Культивируемые клетки с аномальным кариотипбм. полученные из плодного материала эмбриолеталей человека, характеризуются снижением жизнеспособности.

2. В культивируемых клетках эмбриолеталей нарушен синтез основных компонентов межклеточного матрнкса: коллагена, фибро-нектина, гликозоаминогликанов.

3. Эмбриональные клетки с аномальным карнотипом имеют значительные нарушения внутриклеточного катаболизма белков, что проявляется в изменении скорости деградации белков, в изменении соотношения быстрообменивающихся и медленнообменивающихся белков.

4. Трисомные клетки имеют измененный уровень внутриклеточного посредника цАМФ, что может свидетельствовать о нарушении функционирования мембранного комплекса клеток и может приводить к каскаду реакций, нарушающих активность различных ферментов.

5. Показана возможность изменения спектра гомеобоксных генов, регулирующих морфогенез плода, в эмбриогенезе человека.

Внедрение результатов работы.

В результате проведенной работы значительно пополнился клеточный банк Медико-генетического научного центра РАМН. В процессе работы в клеточном банке были заморожены образцы культивируемых фибробластных клеток с диплоидным и аномальным кариотипом, а также клетки от больных с генными мутациями. В. настоящее время в клеточном банке хранится более 800 клеточных'.' штаммов.. Все клеточные штаммы доступны как для отдельных исследователей, так и для научных коллективов, ведущих разработку научных программ. • Данные по клеточному банку опубликованы в "Каталоге всесоюзной коллекции клеточных культур" (Ленинград, "Наука", 1991 г.). Наши данные вошли в широко известный учебник по генетике человека (F.Vogel, A.G. Mo tu1sky. Human Genetics, Problems and Approaches. 1979, 1982). На русском языке этот учебник вышел в 1989 г.

По материалам работы .подготовлены и изданы (МЗ СССР,1990) "Методические рекомендации по культивированию клеток для диагностики наследственных болезней человека", которые внедрены в областных медико-генетических кабинетах Российской Федерации и стран СНГ, а также глава в книгу "Методы культивирования кле-

ток" (Ленинград. "Наука", 1987 г.).

Опубликованные нами данные могут быть использованы для изложения лекционного материала о клеточных аспектах эмбриоле-тальности человека.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на IV, V, VI съездах ВОГиС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982, Москва, 1987, Минск, 1992), на I и II съездах общества медицинских генетиков (Киев, 1984, Алма-Ата, 1990), II и III Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1985, 1987), V и VI конференциях участников программы "Ген" (Москва, 1982, 1983), XIV международном генетическом конгрессе (Москва, 1978), на Всесоюзных симпозиумах "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983, 1987), на симпозиуме "Структура и функция лизосом" (Тбилиси, 1986), симпозиуме "Профилактика наследственных болезней" (Вильнюс, 1986), 7 Всесоюзном совещании эмбриологов (Ленинград, 1986), I съезде медицинских генетиков УССР (Львов, 1988). VI Celostany zlazd lekarske genetlky (Banska Bystrica, 1988). Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток (Зеленоград, 1989), 3 National Congress of Medical. Biology and Genetics (Varna, 1990), Всесоюзных конференциях "Геном человека" (Переяславль-Залесский, 1990, 1991), 8 International Congress of Human Genetics (Washington, 1990), 18 Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation (Budapest. 1992), 24, 25, 26 Annual Meetings of European Society of Human Genetics (Elsinore, 1992; Barselona, 1993; Paris, 1994). 5 International Congress on Cell Biology (Madrid, 1992), на Ученом Совете ИМГ АМН СССР (Москва, 1987, 1988), на Ученом Совете МГНЦ РАМН ( Москва. 1990. 1991, 1993 ).

Публикации.

По теме диссертации опубликована 51 работа в отечественной и зарубежной печати.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы. В экспериментах использованы штаммы эмбрионального происхождения, выведенные в лаборатории клеточной феногене-

тики наследственной патологии Медико-генетического научного центра РАМН. Клеточный банк, в котором находятся эти штаммы, является частью Государственной клеточной коллекции. 8 штаммов были получены из плодного материала спонтанных абортусов человека с моносомным, трисомным и триплоидным кариотипом (табл.1), 3 штамма - из плодного материала медицинских абортусов с триплоидным набором хромосом, 18 штаммов - из материала медицинских и спонтанных абортусов с диплоидным кариотипом.

Таблица I. Некоторые данные об изученных эмбриональных'штаммах с моносомным. трисомным и триплоидным кариотипом.

Штаммы, кариотип

Происхождение штамма

Возраст эмбрионов

ЛЦЧ-105 (47, XY.+14)

ЛЦЧ-162 (47.XY.+7)

ЛЦЧ-400 (47.XY.+9)

ЛЦЧ-431 (45.XV,-21)

ЛЦЧ-446 (47.XY.+7) ЛЦЧ-478 (69.XXY) ЛЦЧ-522 (47.XY.+7) ЛЦЧ-707 (69,XXX) ИМГ-1046 (69.XXX) ИМГ-1062 (69,XXX) ИМГ-1211 (69.XXY)

спонтанный абортус-спонтанный абортус спонтанный абортус спонтанный абортус

спонтанный абортус спонтанный абортус спонтанный абортус спонтанный абортус медицинский абортус медицинский абортус медицинский абортус

8 нед

9 нед 10 нед 24 нед

(длина 10 мм) 9 нед 13 нед 8 нед И нед 8 нед 8 нед 6 нед

По мере необходимости, в некоторых экспериментах были использованы 6 диплоидных штаммов, выведенных из биопени кожи предплечья индивидов различного возраста. Пассирование штаммов проводили по общепринятой методике (Hayfllck. Moorhead.1961). Проводился стандартный контроль на заражение штаммов микоплаз-менной инфекцией (Глан и Неустроева. 1968; Chen.1977). Полученные штаммы замораживали в жидком азоте, в качестве криокон-серванта"использовали диметилсульфоксид.

Исследование пролиФеративных показателей. Большинство исследователей, в силу определенных причин, предпочитают работать на трансформированных клетках человека и животных, в работах других авторов исследуется какой-то один параметр пролиФеративных особенностей диплоидных штаммов человека. В связи с этим представлялось необходимым перед началом цикла работ по

исследованию различных биохимических показателей культивируемых клеток человека с диплоидным и аномальным набором хромосом провести комплексное исследование пролиферативных особенностей изучаемых штаммов.

Методика постановки экспериментов по динамике изменения таких показателей эмбриональных штаммов как индекс митотичес-кой активности и индекс клеток, входящих в фазу синтеза ДНК описана ранее ( Кухаренко и др., 1977 ).

Поставлены эксперименты для определения динамики интенсивности синтеза ДНК и белка в различные промежутки времени после субкультивирования клеток, использованы предшественники синтеза ДНК (3Н-тимидин) и белка (14С-лейцин). Экспозиция с изотопами в течение 20 мин до фиксации клеток.

Метод определения пролиферативного пула исследованных штаммов описан ранее (Kukhareriko et al., 1978).

Для определения продолжительности успешного культивирования штаммы с аномальным кариотипом культивировали до перехода клеток в III фазу роста, когда в течение 14 дней после субкультивирования клеток не происходило удвоение клеточной популяции даже при неоднократной смене питательной среды.

Продолжительность митотического цикла и его отдельных Фаз определяли методом меченых митозов (Quastler and Sherman, 1959).

Определение белка и ДНК в клеточных гомогенатах. Количество белка в клеточных гомогенатах определяли по методу Лоу-ри. Определение количества ДНК проводили флуориметрическим методом по методике Brunk et al. (197Э).

Определение синтеза и распада коллагена. Для определения синтеза коллагена клетки культивировали на бессывороточной среде с аскорбиновой кислотой (50 мкг/мл) и 3Н-пролином (Amersham). Методика постановки коллагеназкого теста описана ранее (Peterkofsky, 1972), использована коллагеназа из Clostridium hystolitlcum, очищенная по методу Peterkofsky and Die-gelroann (1971), время инкубации 2 час при 33°С.

Определение коллагена типа I и типа III проводили по методу Goldberg (1977).

Определение деградации проколлагена проводили по методике Baum et al. (1980). Количество 1Ч-оксипролина в образце определяли на колонке с Amlnex Q-150S.

Для определения степени гидроксилирования коллагена в альфа-цепях коллагена типа I, брали диски полиакриламидного геля, соответствующие положению цепей альфа-1 и альфа-2, гид-ролизовали в 6 N НС1 в течение 24 ч при 108°С. Гель вымораживали при -20°С, освобождались от него центрифугированием , а

надосадочную фракцию высушивали под вакуумом и растворяли в 0,5 мл 0.1 N НС]. Разделение 14С-лролина и 14С-гидроксипролина осуществляли на колонке (0.9 х 30 см! со смолой Aminex Q-150S 0.2 М Na-цитратным буфером, pH 3.25. Во фракциях. соответствующих пиходу гидроксмпролина п прашша, определяли общее количество 'радиоактивности. Этот раздел работы выполнялся совместно с A.A. Дельвигом.

Исследование синтеза фибронектина. Содержание фибронекти-на в клеточном монослое и в культуральной среде определяли при помощи реакции иммунопреципитации с двойными антителами (Белкин и др.. 1985). . •

Исследование синтеза и распада глнкозоаминогликанов. Для мочения клеток использовали питательную среду, содержащую изотопы Na2[S35]04 (IsaKomme it. Radiactivo Isotopes. Германия) и D[6-H3]-глюкозамин "(Amersham). Экспозиция с изотопом - 48 ч. Дальнейшую обработку клеток и питательной среды проводили по методике Vogel and Kendall, 1980. Гиалуроновую кислоту и суль-фатированные гликозоаминогликаны. прецппитированные на нитро-целлюлозных фильтрах (Mllllpore), разделяли по методике Saarnl and Tamml (1977). З53-меченые гепарансульфат, дерматансульфат и хондроитинсульфат разделяли с помощью электрофореза на ацетатных пле"ках (Serva). Методика разделения 3Н-гликозоаминог-ликанов с помощью метода двумерного электрофореза описана ранее (Одинокова и др.,1986).

Методика определения деградации глнкозоаминогликанов описана ранее (Kukharenko et al., 1991).

Определение уровня цАМФ и цГМФ. Содержание цАМФ и цГМФ определяли, используя стандартные наборы предназначенных для этой цели реактивов фирмы Amersham. полученные результаты соотносили к количеству клеточного белка или к количеству клеток в монослое. Этот раздел работы выполнялся совместно с Ю.В. Хохловой.

Определение содержания свободных и связанных полирибосом. ■ Для получения фракций свободных и связанных полирибосом клетки метили 3Н-уридином, клетки разрушали гомогенизацией в растворе. содержащем 10 мМ трис-HCl pH 7,5. 3 мМ KCl. 1.5 мМ MgCl-,. циклогексимид 50 мкг/мл. Фракционирование гомогената проводили по методике Ramsey and Steel (1976). Свободные и связанные полирибосомы осаждали центрифугированием через слой 1 М сахарозы, приготовленной на 0,01 М трис-HCl pH 7.5, 0,25 М KCl и 0,005 М MgCl2 (17 4 при 190000 g).

Определение скорости деградации белков. Клетки метили 14С-пролином 3 час. Этапы методики были описаны ранее ( Подобед и др., 1988 ). Этот раздел работы выполнялся совместно с О.В.По-

добед.

Определение времени синтеза средней полипегттилной цепи. Методика и принципы построения графиков определения времени синтеза средней полипептидной цепи ( tc ) описаны ранее ( Лей-тин и Лерман, 1977; Подобед и др.. 1985 ).

Изучение экспрессии гомеобоксных генов. В клетках с диплоидным и аномальным кариотипом, находящихся в стационарной фазе роста, изучен качественный спектр экспрессии гомеобоксных генов. Экстракция РНК проводилась гуанидинизоционатным методом с помощью набора фирмы Promega, образцы выделенной РНК хранили под спиртом при -70°С, дальнейшая обработка материала проведена с помощью ДНКазы ( Promega, 1 мг/мл, 37°С, 1 час ), в конце этой процедуры проведена тепловая инактивация ДНКазы. Используя реверс-транскриптазу MoMLV, олиго-dT праймеры, РНКазин, проводилась реакция реверс-транскрипции полученных образцов ( 37°С, 60 мин ), в пробирку позитивного контроля добавляли pAV/109 RIJA. Цепная полимеразкая реакция (PCR) выполнялась согласно методики Innls and Gel fand, 1990. Для проведения PCR использовали смесь 4 типов dNTP, 1 мкМ каждого праймера и Taq ДНК-полимеразу московского производства. С помощью "PCR Optimizer Kit" проведен анализ условий, оптимальных для этой реакции. Установлено, что для системы праймеров UP6-LP2 желательно использовать температуру отжига 54°С и буфер F ( pH 9,0, концентрация Hg=2MM ). Использовался термоциклер фирмы Perkln-El-mer (температура денатурации - 94°С, 1 мин; отжига - 54°С, 1,5 мин; элонгации - 72°С, 1,5 мин; 30 циклов). Амплифицированный . продукт анализировали, используя 6% полиакриламидный или 1,5% агарозный гели, в качестве свидетеля - 123 bp DNA Ladder (GIB-CO BRL), окраска этидиум бромидом. Для анализа электрофореза использована "The Imager" компьютерная система и видеопроцессор (Mltsubisl). Праймеры были синтезированы на установке Ар-lled Biosystems 381А. Последовательность использованных грай-меров:

up-primer UP6 - CGGATCTACCCCTGGATGC.

down-primer LP2 - CGCCTGTTCTGGAACCAG.

Следует отметить, что с помощью системы праймеров UP6-LP2 можно обнаружить экспрессию гомеобоксных генов Deformed (Dfm), Sex combs labial (Ser), Antennapedia (Antp), Ultrabitorax (Ubx).

ДНК из вырезанных полосок геля экстрагировали с помощью GES буфера в течение ночи. Продукт цепной полимеразной реакции клонировали в плазмидный вектор pCR™ (Mead et al., 1j91), для лигирования использовали Т4 ДНК лигазу. также входящую'- в набор фирмы Invltrogen, в этом же наборе был бактериальный штамм.

используемый для трансформации клонированного материала. Бактериальный материал переносили на чашки Петри с агаром LB с канамицином (50 мкг/мл) и X-gal (40 мкг/мл). Отобранные колонии переносили в пробирки с жидким питательным агаром, плаз-мидную ДНК изолировали согласно методике Holmes and Qulgley. 1981. Секвенирование полученного материала проводили совместно с Г.Н.Морозовым по методике Sanger et al.(1977).

Сравнение ДНК последовательностей проводили, используя данные GenBank (GenBank.1991) • и также другие . данные (Kappen. 1989. Gindills et al.. 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЛЙФЕРАТИВНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛЕТОК ЭМБРИОНАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

Все изученные штаммы эмбрионального происхождения во время постановки экспериментов находились во II Фазе роста, имели активный пролиферативный потенциал. Пассирование штаммов осуществляли, как правило, один раз в неделю после достижения клетками состояния плотного монослоя.

Достаточно хорошо известно, что если культивируемые клетки характеризуются наличием такого показателя как насыщающая плотность клеток, то пролиферативные способности штаммов зависят от таких параметров как. количество участвующих в пролиферации клеток и продолжительности митоти-ческого цикла, наибольший прирост количества клеток происходит

Рис.1. Изменение митотического индекса (пунктирные линии) и индекса меченых 3Н-тимидином клеток (сплошные линии) двух эмбриональных диплоидных штаммов через различные интервалы 'времени после субкультивирования. По оси абсцисс - время после субкультивирования ( в час ), по оси ординат: слева - индекс меченых клеток (в %), справа - митотический индекс (в %о)

в логарифмической фазе роста клеточной популяции. На рис.1 для двух эмбриональных диплоидных штаммов представлены данные по динамике таких пролиферативных показателей как митотическая активность и индекс импульсно меченых 3Н-тимидином клеток (свидетельствующий о количестве клеток, находящихся во время мечения в стадии синтеза ДНК). Отмечено, что изменения этих показателей носит волнообразный характер. Данные экспериментов, в которых были использованы эмбриональные штаммы с трисо-мией 7, трисомией 9 и триплоидией, свидетельствовали о том, что параметры вхождения клеток с аномальным кариотипом в фазу синтеза ДНК и динамика прохождения клеток по этой фазе совпадают с данными, полученными при исследовании диплоидных штаммов. На основании этих данных определен промежуток времени, максимально удобный для импульсного введения 3Н-тимидина при изучении параметров митотического цикла штаммов.

Проведение мечения изотопами клеточных белков, дальнейшее выделение этих белков, а также определение динамики синтеза белков возможно только при культивировании клеток на бессывороточной среде с мечеными аминокислотами. Для этих целей проведено исследование по определению с помощью изотопов интенсивности синтеза белка и ДНК в клетках диплоидного штамма в условиях смены стандартной питательной среды на бессывороточную на 18 час, на 27 час и на 51 час после субкультивирования клеток. Показано, что интенсивность синтеза белка сохраняется на достаточном уровне при смене среды с сывороткой на бессывороточную среду на 2-й день после субкультивирования клеток (рис. 2). На рис. 3 представлены данные по интенсивности синтеза ДНК в этих же клетках в аналогичных условиях.

Отмечено (табл.2), что только один штамм с аномальным набором хромосом переходил в фазу роста III при прохожденчи более чем 30 пассажей. Наши данные и данные Терехова (1984) показывали. что контрольные эмбриональные диплоидные штаммы переходят в фазу III роста после 42-67 пассажей, что соответствует также данным, полученным еще ранее Хейфликом (1965).

Нами проведен цикл работ по определению параметров митотического цикла эмбриональных штаммов с диплоидным и аномальным кариотипом. При постановке одиннадцати экспериментов по определению параметров митотического цикла в эмбриональных диплоидных штаммах были получены данные о продолжительности фаз клеточного цикла, также показано, что продолжительность фаз практически не меняется при культивировании диплоидных клеток до 60 пассажа ( переход клеток в III фазу роста ). Все исследованные эмбриональные аберрантные штаммы, так же как и контрольные диплоидные штаммы, имели выраженную?вторую волну

валы времени после субкультивирования. Клетки импульсно метили 14С-лейцином. Плотность клеток на поверхности стекла при постановке эксперимента ( после проведения процеду-дуры субкультивирования ) - 20 тыс. клеток/смг. Сплошная линия - рост клеток на питательной среде с 10% сыворотки, пунктирная линия - клетки с 27 час после субкультивирования переведены на бессывороточную среду. По оси абсцисс - время после субкультивирования ( в час ), по оси ординат количество импульсов/мин.

Таблица 2. Продолжительность успешного культивирования эмбриональных штаммов с аномальным кариотипом

Штаммы, кариотип Продолжительность успешного

культивирования штаммов

ЛЦЧ-105 (47, ХУ, +14) дегенерировал на 34- пассаже

ЛЦЧ-162 (47, ХУ. +7) дегенерировал на 29 пассаже

ЛЦЧ-400 (47,ХУ,+9) дегенерировал на 29 пассаже

ЛЦЧ-431 (45, ХУ, -21) дегенерировал на 23 пассаже

ЛЦЧ-446 (47, ХУ, +7) дегенерировал на 25 пассаже

ЛЦЧ-478 (69, ХХУ) дегенерировал на 17 пассаже

ЛЦЧ-522 (47. ХУ.+7) дегенерировал на 27 пассаже

ЛЦЧ-707 (69, XXX) дегенерировал на 19 пассаже

1800

3000

600

кед

Рис.3. Интенсивность синтеза ДНК в клетках эмбрионального диплоидного штамма ИМГ-820 через различные интервалы времени после субкультивирования. Клетки импульсно метили 3Н-тимидином. Другие обозначения те же. что на рис. 2.

меченых митозов.

В двух штаммах ЛЦЧ-162 (47.XY.+7) и ЛЦЧ-431 ( 45/XY.-21 ) найдены значительные статистически достоверные отклонения в параметрах митотическогг цикла ( табл. 3 ). В обоих штаммах наблюдалось увеличение длительности постсинтетического периода, сопровождавшееся резким уменьшением продолжительности стадии синтеза ДНК, эти отклонения в длительности фаз митотического цикла были обнаружены и при повторных экспериментах.

Индекс меченых клеток при длительной инкубации клеток с 3Н-тимидином был высоким во всех штаммах с аномальным кариоти-пом, что свидетельствовало о высокой потенции к размножению клеток этих штаммов.

Суммируя данные раздела по исследованию пролиферативных особенностей эмбриональных клеток с аномальным набором хромосом, следует отметить, что после субкультивирования клетки с аберрантным кариотипом в тот же промежуток времени, как и диплоидные штаммы, входят в стадию синтеза ДНК. Продолжительность успешного культивирования ( до перехода клеток в III фазу роста ) у аномальных штаммов ниже, чем у диплоидных штаммов, что было отмечено также и другими авторами (Cure ,et al., 1974).

Таблица 3. Параметры митотического цикла эмбриональных штаммов с аномальным кариотипом

Штаммы

Фазы митотического цикла (в час) ( М ±о- )

С2+1/2 М Б С1+1/2 М

ЛЦЧ-105(47,ХУ, +14) 19 6.0 9.0 ' 4.0 -

ЛЦЧ-162(47,ХУ, +7) 21 9,8 р<0,001 9,2 р<0.001 8,2 р<0.001 7,2 р<0,001 4.6

ЛЦЧ-400(47, ХУ, +9) - 5.2 9,1 -

ЛЦЧ-431(45, ХУ,-21) ■ 18 7.3 р<0,001 6.4 р<0.001 7,5 р<0,001 3,2

ЛЦЧ-446(47,ХУ,+7) ЛЦЧ-478(69,ХХУ) 19 18 5.4 4.8 9.2 9,9 4,4 3,3

Контрольные диплоидные штаммы 18-20 5, 4+0.32 10.0+0,61 2,5-4,3

Т - продолжительность митотического цикла С], Б, , М - пресинтетический период, период синтеза ДНК. постсинтетический период, митоз.

Некоторые штаммы с аномальным кариотипом имели изменения длительности фаз митотического цикла, а также снижение величины пролиферативного пула.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ШТАММОВ С АНОМАЛЬНЫМ КАРИОТИПОМ.

Коллаген является главным экспортным белком фибробластных клеток, это самый распространенный белок организма, он составляет' до 33% общего белка и, следовательно, около 6% всей массы

тела. Коллаген представлен во всех органах и играет важную роль на всех этапах онтогенеза и в поддержании гомеостаза в норме.

Изучена динамика изменения синтеза коллагена и меколлаге-новых белков в диплоидных и анеуплоидных штаммах эмбрионального происхождения. В табл. 4 показано, что относительный синтез коллагена как в диплоидном, так и в трисомном штаммах увеличивается в стационарной фазе роста клеток ( 5-8 день после субкультивирования клеток ) по сравнению с логарифмической фазой роста ( 2-3 день после субкультивирования клеток ). но в диплоидных клетках на всех этапах культивирования процент синтезируемого коллагена был гораздо выше, чем в клетках с аномальным кариотипом.

Таблица 4. Включение 3Н-пролина в коллаген и неколлагеновые белки в диплоидных и анеуплоидных клетках в зависимости от плотности культуры и времени культивирования клеток

Штаммы, кариотип

Длите- Плот-льность ность культи- куль-вирова- туры, ния, мкг дни ДНК ка чашку Петри

Включение 3Н-проли-на в коллаген, имп/мин на

1 мкг ДНК

Включение 3Н-проли-лина в неколлагеновые белки, имп/мин на 1 мкг ДНК

коллагена

ИМГ-814(46, ХУ)

ЛЦЧ-162(47,ХУ,+7)

2 21 26200

3 35 13700

4 46 10400 6 55 7300 8 60 3800

2 21- 13300

3 38 12500

5 43 12700 8 66 8600

41100 10,5

26000 8,9

16000 1С,7

6600 16,9

4500 16,0

42700 5,6

35900 6.0

30900 7,1

21400 7.0

Увеличение синтеза коллагена в диплоидном штамме обусловлено дифференциальным подавлением синтеза неколлагеновых белков, которое проявляется после прекращения митотической актив-

ности вследствие контактного торможения клеток. Анеуплоидные клетки после прекращения пролиферации не способны дифференциально подавлять аутосинтетические процессы.

Такая же динамика синтеза коллагенового и неколлагеновых белков была обнаружена при исследовании триплоидного штамма ЛЦЧ-478,-

В экспериментах с использованием нескольких диплоидных штаммов было показано, что в стационарной Фазе роста клеток значительно увеличивается относительная доля синтезированного коллагена по сравнению с логарифмической Фазой роста. клеток (с 8,8% до 14,7%). Сходные данные по динамике изменения уровня синтеза коллагена в зависимости от стадии роста диплоидных штаммов ранее были получены и другими авторами (Aumailley et al.. 1980; Klrchohfer et al., 1986). Однако, в наших опытах было отмечено, что при' одинаковых условиях постановки экспериментов, но в зависимости от того, насколько быстро клетки входили в стационарную фазу роста, может зависите и уровень достижения максимальных данных по синтезу коллагена. Зная, что большинство штаммов с аномальным кариотипом медленнее достигают стационарной фазы роста, то исследуя эти параметры на определенном дне стационарной фазы роста клеток, мы непроизвольно занижали бы данные по относительному синтезу коллагена в штаммах с аномальным кариотипом. В связи с этим, все дальнейшие эксперименты по исследованию относительного синтеза коллагена в штаммах с диплоидным и аномальным кариотипом проводили в логарифмической фазе роста клеток, когда все изучаемые штаммы находились в одинаковых физиологических условиях.

В табл. 5 представлены данные трех серий экспериментов по изучению относительного синтеза коллагена в трисомных и трип-лоидных штаммах в логарифмической фазе роста клеток. Полученные данные свидетельствуют о том. что продукция коллагена в штаммах с аномальным кариотипом была снижена на 30-60Я по сравнению с контрольными данными .

Предпринята попытка выяснить вопрос - за счет чего могло произойти такое резкое снижение синтеза коллагена в штаммах с аберрантным набором хромосом. Известно, что коллагены типа I и типа III составляют более 95% всего синтезируемого фибробласт-ными клетками коллагена. Для того чтобы исключить возможность того, что снижение синтеза коллагена в штаммах с аномальным кариотипом произошло за счет снижения уровня синтеза одного из типов коллагена. нами проведено исследование соотношения 14С-коллагена типа I и типа III в культуральной среде диплоидных, трисомных и триплоидных штаммов. В нескольких экспериментах на диплоидном штамме ИМГ-814 нами было показано, что доля

Таблица 5. Процент 3Н-коллагена в клетках и культуральнол среде в диплоидных и цитогенетически аномальных штаммах в логарифмической фазе роста клеток

Серия Штаммы Количество Коллаген

экспе- исследований ( % )

римен- (Mi©")

тов

4 диплоидных штамма 18 8,8 + 1.0 а

1 2 трисомных штамма

ЛЦЧ-162 (47, ХУ,+7) 5 5.1 + 0.9 Ь

ЛЦЧ-400 (47,ХУ,+9) 3 5,5 + 0.8 с

3 диплоидных штамма 5 6,1 + 0.4 d

2 2 трисомных штамма

ЛЦЧ-522 (47,ХУ,+7) 4 4,3 + 0.5 е

ЛЦЧ-446 (47,ХУ,+7) 1 3,4

2 диплоидных штамма 4 6,5 + 0,5 Г

3 2 триплоидных штамма

ЛЦЧ-478 (69.ХХУ) 4 4,3 + 0,5 В

ЛЦЧ-707 (69,XXX) 4 2.4 ± 0.5 h

Различия пар a-b. а-с, d-e. f-g. f-h - статистически достоверны ( pco.ooi )

коллагена типа III в культуральной среде клеток, находящихся в логарифмической и стационарной фазах роста практически не изменяется и составляет 7,7%. В связи с тем, что в стационарной фазе роста клеток можно получить значительно больше меченого 14С-коллагена - все дальнейшие эксперименты по определению доли коллагена типа III проведены на клетках в стационарной фазе роста.

Ранее было показано, что при исследовании некультивированной кожи эмбрионов человека доля коллагена типа III может составлять до 50% всего коллагена, в коже взрослых индивидуумов она может снижаться до 25% (Epstein, 1974). Сходные данные были обнаружены и другими авторами (Sykes et al.. 1976). Также показана независимость регуляции синтеза коллагена типа I и типа III фибробластами кожи человека ( Hata et al., 1984 ). В связи с этим представлялось необходимым при определении соотношения коллагена типа I и типа III в штаммах эмбрионального

происхождения с диплоидным и аномальным кариотипом в качестве второго контроля взять диплоидные клетки постнатального происхождения. Данные табл. 6 свидетельствуют о том, что при определении доли коллагена типа III в культуральноп среде анеупло-идных и диплоидных штаммов различного онтогенетического происхождения статистически достоверных различий не получено..

Известно, что часть секреторных белков подвергаются деградации внутриклеточно. Внутриклеточные процессы деградации белков могут играть важную роль в регулировании количества секретируемых белков. При нормальных условиях культивирования клеток подвергаются деградации до 25% молекул инсулина, от 15% до 70% молекул коллагена, паратиреоидного гормона, казенна, пролактина (Bienkowski, 1983). Также отмечено, что в диплоидных Фибробластах человека скорость внутриклеточного распада проколлагена сходна при использовании среды для культивирования клеток с различной концентрацией сыворотки (Narayanan and Page, 1987).Чтобы попытаться выявить причины снижения синтеза коллагена в штаммах с аномальным кариотипом, в этих клетках нами был изучен распад проколлагена (табл. 7). Отмечено, что в клетках с аберрантным набором хромосом на 30-40% увеличен распад проколлагена, что хотя бы частично может объяснить резкое снижение сгчтеза коллагена в этих штаммах.

Таблица 6. Относительное содержание коллагена типа III в куль-туральной среде диплоидных штаммов и штаммов с ■ аномальным кариотипом

Штаммы Коллаген типа III (%)

(М J; Ш)

6 эмбриональных диплоидных штаммов ' 12,7 ± 1,78 а

3 постнатальных диплоидных штамма 10,3 ± 1,74 ь

5 эмбриональных штаммов с аномальным набором хромосом (3 трисом-ных штамма - ЛЦЧ-162, 400, 522 и два триплоидных штамма - •

ЛЦЧ-478, 707 ) 13,9 + 1.29 с

Различия пар а-Ь, а-с - статистически недостоверны.

Таблица 7. Внутриклеточная деградация вновь синтезированного 14С-проколлагена в логарифмической фазе роста штаммов с диплоидным и аномальным кариотипом

Количество Деградация Штаммы исследований проколлагена (50

( М +аг)

Пять диплоидных штаммов: 19 51.4 ± 8,5 а

ИМГ-814, 820, 845, 862, 943 Четыре трисомных штамма: ЛЦЧ-162, 400, 446,

522 15 68.4 ± 9,0 ь

Два триплоидных штамма:

ЛЦЧ-478, 707 6 72. 3 + 4, 7 с

Различия а-b, а-с - статистически достоверны ( р<0,01 )

Таблица 8. Гидроксилирование остатков 14С-пролина в альфа-1(1) и альфа-2(1) цепях коллагена типа I в диплоидных и трисомных штаммах в логарифмической фазе роста клеток ( М ±С)

Число

Штаммы 14С-пролин/14С-гидроксипролин наблю-------------------------------- дений

альфа-1 цепь альфа-2 цепь

3 диплоидных штамма 1,05 + 0,07 а 1,11 + 0,09 ь 6 ИМГ-814, 820, 845

4 трисомных штамма ЛЦЧ-162, 400,

446, 522 0,97 + 0,07 с 1,00 + 0,07 d 7

Различия пар a-b, c-d, а-с, b-d -недостоверны

статистически

Биодеградация проколлагена йвляется сложным процессом с многоступенчатой регуляцией на различных уровнях, в частности, высокий уровень распада проколлагена зависят от недогидрокси-лирования пролиновых остатков прсколлагена ( Bennart et al., 1982; Berg et al.. 1983 ). Однако нами не было обнаружено значительных различий в соотношении 14С-пролин/14С-гидроксипролнн в альфа-1 (I) и альфа-2 (I) цепях коллагена типа I. который был выделен из среды для культивирования клеток, при сравнении трисомных штаммов с диплоидным контролем (табл. 8). Поэтому моясно предположить, что повышенный распад проколлагена в штаммах с аберрантным набором хромосом имеет другие причины.

Другим важным компонентом межклеточного матпикса является фибронектин - высокомолекулярный гликопротепд полифункцпональ-ной природы. Обладая высоким сродством к коллагену и другим компонентам внеклеточного матрикса (Engbail and Kuoslahti, 1977; Vaheri and Mosher, 1978 ), Фибронектин играет важную роль во взаимодействии клеток с субстратом и между собой, в поддержании нормальной клеточной морфологии, в клеточной днф-ференцировке и эмбриональном развитии ( Hynes and Vainada. 1982; Guenburg and Hay. 1982 ). Снижение биосинтеза Фибронек-тина и его содержания в плазматической мембране клеток приводит к существенным изменениям морфологии и биологических свойств клеток. В экспериментах in vitro показана важная роль домена RGDS и участка CS1 молекул фибронектина в адгезии, миграции и распластывании клеток нервного гребня (Dufour et al.. 1988).

На рис. 4 представлен график, свидетельствующий с линейном включении 14С-пролина в фибронектин в течение более чем 24 ч. Как в опытах по определению синтеза коллагена, так и з экспериментах по определению синтеза фибронектина были использованы клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Количество фибронектина в среде для культивирования клеток и в клетках в трисомных и триплоидном штаммах было в 1,5-2 раза ниже, чем в диплоидных штаммах ( табл. 9 ). Так как показано, что Фибронектин препятствует деградации коллагена коллагеназой (Menzel and Borth, 1983). то недостаточное количество этого белка в штаммах с аномальным кариотипом может способствовать повышенной деградации в них проколлагена.

Соединительная ткань богата также прстеогликанами. которые связывают катионы и воду, образуют основное вещество соединительной ткани. Полисахаридные цепи протеогликанов (гликозоами-ногликаны) построены из повторяющихся дисахаридных единиц ( глюко замша или галактозамина ).

имп^мин • 10

Рис.4.'Включение 14С-пролина в фибронектин, секретируе-мый эмбриональными диплоидными фибробластами в культуральную среду. По оси абсцисс - время инкубации клеток с 14С-проли-ном. по оси ординат - включение 14С-пролина в фибронектин.

Таблица 9. Относительный синтез фибронектина в диплоидных и аномальных фибробластах в логарифмической фазе роста -клеток

Штаммы Фибронектин'(%) ( М ¿С') Число

--------------------------------------наблю-

культуральная клетки дений • среда

3 диплоидных штамма: 15,6 + 1.1 а 5,0 + 0,7 й . 6 ИМГ-745, .814, 820

3 трисомных штамма:

ЛЦЧ-162, 400, 522 8,0 + 1,3 ь 2,2 + 0,4® 6

триплоидный штамм

ЛЦЧ-707 10.3 + 1.9 ° 3.2 + 0.5 1 4

Статистически достоверны различия пар а-Ь, (3-е (р<0,001) и пар а-с, сЗ-Г (р<0.01)

На рис. 5 представлены данные по зависимости синтеза гли-козоаминогликанов от плотности культивируемых клеток. Включение 3И-глюкозамина в гликозоаминогликаны было максимально в логарифмической фазе роста клеток и имело тенденцию к снижению в клетках, "ходящих в стационарную фазу роста.

Для того чтобы унифицировать условия постановки экспериментов по синтезу гликозоаминогликанов ( в тем числе исключить влияние таких параметров как время культивирования клеток и плотность клеток ), штаммы с диплоидным и аномальным кариоти-пом рассевали на 24-луночные платы с высокой плотностью клеток, чтобы перед введением изотопа ( на 2 день после субкультивирования клеток ) все штаммы находились в стационарной фазе роста.

Данные репрезентативных экспериментов по синтезу гиалуро-новой кислоты и сульфатированных гликозоаминогликанов представлены в табл. 10. Показано, что включение 3Н-г.чюкозамша в гна-луроновую кислоту было в 3,4-8,0 раз ниже зо всех штаммах, полученных из спонтанных абортусоз и в двух из трех штаммах с триплоидией. выведенных из биопсий медицинских абортусов

8000

6000

4000

2000

2 4 6

Рис.5. Влияние плотности клеток на синтез гликозоаминогликанов в эмбриональном диплоидном штамме ЛЦЧ-814 ( сплошные линии ) и триплоидном штамме ИМГ-1046 ( пунктирные линии ).

A. - Включение 3Н-глюкозамина в гликеззакиногликаны.

По оси абсцисс - дни после субкультивирования клеток, по оси ординат - включение 3Н-глюкозамика (ерш/мкг ДНК).

B. - Роет клеток после субкультивировання. По оси абсцисс - дни после субкультивирования, по оси ординат -количество ДНК ( мкг/лунка ).

--в

Таблица 10. Включение 3Н-глюкозамина в гиалуроновую кислоту и сульфатированные гликозоаминогликаны в штаммах" с диплоидным и аномальным набором хромосом ( М +СО

СульфатироЕанные Гиалуроновая Соотношение

Штаммы гликозоаминогли-' кислота (ГК) Б-ГАГ/ГК

каны (Б-ГАГ) (срш/мкг ДНК)

(срт/мкг ДНК) '

Серия 1

3 диплоидных

штамма: 5280 ± 630 18960 + 550 0,30 + 0,06

ИМГ-814, 821,

845

Триплоидия

ЛЦЧ-478 10820 + 850 2360 + 520 4,71 + 1,22

р<0.001 р<0, 001 р<0,001

ЛЦЧ-707 3810 ± 125 5550 + 150 0,69 + 0,04

р<0,05 р<0,001 р<0,001

ИМГ-1046 3810 + 630 5210 ± 360 0,73' + 0, 10

р<0,05 р<0,001 р<0,001

■Трисомия 7

ЛЦЧ-522 8780 ± 370 4760 ± 800 1,89 + 0,36

р<0,001 р<0,001 р<0,001

Серия 2

3 диплоидных

штамма: 11270 ± 2340 ' 25260 + 4600 0,46 + 0.13

ИМГ-821,- 822,

1075

Триплоидия

ИМГ-1062 13970 + 1480 * 24420 + 3750 0,56 ± 0,08

ИМГ-1211 13550 + 1300 4300 + 2820 4,65 ± 3,41

р<0,001 р<0,05

* Различия по всем параметрам между диплоидными штаммами и триплоидным штаммом ИМГ-1062 - статистически недостоверны

( суммарно по всем сериям экспериментов это снижение варьировало от 2.6 до 5.3 раз ). В добавление к резкому снижению синтеза гиалуроновой кислоты в этих же штаммах с аномальным кари-отипом отмечено значительное повышение соотношения сульфатиро-ванные ГАГ/гиалуроновая кислота. В триплоидном штамме ИМГ-1062. полученном из материала медицинского абортуса, не обнаружено всех вышеперечисленных аномалий в синтезе ГАГ. Внутриклеточная деградация гиалуроновой кислоты в диплоидных фибробдастах была в 1,5-3,0 раза выше, чем в исследованных по этому параметру штаммах с трисомией 7 и триплоидией (рис. 6), но внутриклеточная деградация сульфатированных ГАГ в этих аномальных штаммах значительно не отличалась от контрольных данных ( время полужизни сульфатированных ГАГ в этих штаммах составляло примерно сутки). Эти данные совпадают с результатами, полученными ранее другими авторами в экспериментах на эмбриональных легочных фиб-робластах и на культивируемых клетках десен (Vogel and Kendal. 1980; Kantor and Hassell. 1983). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что низкий уровень синтеза гиалуроновой кислоты в клетках с аномальным кариотипом нельзя

Рис.6. Внутриклеточная деградация гиалуроновой кислоты и сульфатированных гликозоаминогликанов в клетках двух эмбриональных диплоидных штаммов ( ИМГ-820. 845 )( сплошные линии ) и в клетках с трисомией 7 ( ЛЦЧ-522 ) и триплоидией ( ЛЦЧ-707) ( пунктирные линии ).

A. - по оси абсцисс - время ( час ). по оси ординат - доля меченой гиалуроновой кислоты ( в 1 ), оставшейся в клетках.

B. - по оси абсцисс - время ( час ). по оси ординат - доля меченых сульфатированных гликозоаминогликанов ( % ). оставшихся в клетках.

Рис.7. Продукция гепарансульфата ( НБ ), дерматансульфа-та ( ОБ ) и хондроитинсульфата (.Ш5 ) в эмбриональных диплоидных штаммах ( ИМГ-820, 845 ) и триплоидных штаммах ( ЛЦЧ-707 и ИМГ-1046 ). По оси абсцисс - НБ. ОБ, СйБ, по оси ординат -% НБ, ББ, СГ^Б.

объяснить скоростью внутриклеточного распада гиалуроновой кислоты в этих клетках.

Двумерный электрофорез 3Н-ГАГ, синтезированных двумя диплоидными штаммами (ИМГ-820 и 845) и двумя триплоидными штаммами (ЛЦЧ-707 и ИМГ-1062 с нарушенным и нормальным синтезом ГАГ, соответственно) подтвердил данные, представленные в табл. 10; включение 3Н-глюкозамина в гиалуроновую кислоту в триплоидном штамме ЛЦЧ-707 составляло 16% общего включения изотопа в 3Н-ГАГ, в то время как-в триплоидном штамме ИМГ-1062 и в двух диплоидных штаммах величина этого включения была сравнимой и составляла, примерно, 55%.

При изучении триплоидных штаммов обнаружено уменьшение доли синтезируемого дерматансульфата ( р<0,02 ) и увеличение доли, синтезируемого хондроитинсульфата ( р<0,001 ) (рис.7).

3. ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛ0КСИНТЕЗИРУЮЩЕГ0 АППАРАТА ФИБРОБЛАСТОВ ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА С АНОМАЛЬНЫМ КАРИОТИПОМ Известно, что до 40% всего количества секретируемых фиб-робластами белков составляют коллаген и фибронектин. Полагают, что экспортные белки фибробластов синтезируются на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулюмом. В предыдущей главе были представлены данные о резком снижении синтеза этих белков в клетках с аномальным кариотипом. Одной из причин снижения

синтеза белков могло быть уменьшение доли мембраносвязанных рибосом, на которых транслируется мРНК этих белков. С целью проверки этой гипотезы было исследовано соотношение свободных и мембраносвязанных полирибосом в культивируемых клетках 5 спонтанных абортусов с аномальным кариотнпом: изучены клетки 3 абортусов с трисомным кариотипом ( трисокия 7 и 9 ) и 2 абор-туса с триплоидией, в качестве контроля использованы 3 диплоидных штамма эмбрионального происхождения (ИМГ-786, 820, 821).

Установлено, что в диплоидных клетках на долю мембраносвязанных полирибосом приходится 78,6 ±, 2.1" от общего числа свободных и мембраносвязанных рибосом, в клетках с аномальным кариотипом - 78,6 + 1,2% (в трисомных клетках - 79,2 + 1.0%, в триплоидных клетках - 77.7 + 2.7%), различия между диплоидными и анеуплоидными штаммами статистически недостоверны. Это соотношение заметно не менялось при переходе клеток из логарифмической фазы роста в стационарную фазу.

В фибробластах человека регуляция синтеза белка проявляется в определенной мере на уровне трансляции. Поэтому в цикле работ по изучению некоторых характеристик белоксинтезирующей системы клеток с аномальным кариотипом нами было проведено не только исследование рибосомного комплекса, но и времени синтеза средней полипептидной цепи. Регуляция синтеза белка на уровне трансляции может осуществляться путем изменения времени инициации, времени элонгации и времени терминации. Нами было определено время синтеза средней полипептидной цепи, являющейся суммой времени элонгации и терминацин, в клетках штаммов с диплоидным и трисомным кариотипом ( трисомия 7 ) на различных стадиях роста культуры клеток. С этой целью исследовали кинетику включения радиоактивного предшественника в растущие и завершенные полипептиды. Полученные данные свидетельствуют

0 том. что время синтеза средней полипептидкой цепи одинаково в диплоидных и трисомных клетках и не зависит от фазы роста культивируемых клеток ( I = 5,0 я 4,9 мин для логарифмической и стационарной фаз роста диплоидного штамма ИМГ-814,

1 = 4,9 и 4,9 мин для логарифмической и стационарной фаз три-сомного штамма ЛЦЧ-162 ).

Для сравнения скорости трансляции в различных клетках необходимо, кроме времени синтеза средней полипептидной цепи, определить размеры синтезируемых полипептидов. поскольку при равных значениях этого показателя реальная скорость синтеза белка выше в клетках, синтезирующих полипоптиды меньшего размера. Размеры синтезируемых полипептидов оценивали по результатам электрофореза в ПААГ. Суммарные полипептиды, выделенные из клеток диплоидного и трисомного штамма имеют сходное расл-

ределение по молекулярным массам (табл. И). Полученные результаты не исключают возможность того, -что некоторые индивидуальные белки синтезируются с различной скоростью в разных фазах роста диплоидных и анеуплоидных клеток.

Для выяснения вопроса, меняется ли относительная скорость обмена внутриклеточных белков в процессе роста культуры клеток с 'диплоидным и трисомным кариотипом. применяли метод двойного мечения. При таком методе отношение 3Н/14С быстрообмениваю-щихся белков выше по сравнению с медленнообменивайщимися вне зависимости от абсолютной удельной радиоактивности белка (Glass and Doyle, 19-72). Данные, представленные на рис. 8 свидетельствуют о том, в логарифмической фазе роста отношение метки 3Н/14 С и. следовательно, скорость обмена белков в три-сомных клетках выше по сравнению с диплоидными Фибробласта-ми. При переходе диплоидных клеток в состояние покоя скорость обмена -РНК и белка увеличивается ( Епифанова, 1979 ). Повышение скорости обмена макромолекул в покоящихся клетках в условиях прекращения синтеза ДНК направлено на поддержание постоянной внутриклеточной концентрации РНК и белка и является важным адаптивным механизмом гомеостаза, повышающим устойчивость клетки к повреждающим внешним воздействиям. Ранее было показа-

Таблица 11. Среднечисленные молекулярные массы полипептидов, синтезируемых диплоидными и трисомными фибробластами в логарифмической и стационарной фазах роста клеток ( М +СО

Среднечисленная молекулярная масса полипептидов

время мечения изотопом 24 часа 3 часа

ИМГ-814 логарифми-

(46,XY) .ческая 39050 + 467Q 39950 + 7720

стационарная 34420 + 3620 36200 + 2520

ЛЦЧ-162 логарифми-

(47, XY, ческая 38850+3370 39800+2130

+7) стационарная 32750 + 990 ' 36350 + 6990

Штаммы, кариотип

Фазы роста клеток

la Т 'V

Рис.8, относительный обмен внутриклеточных белков в логарифмической и стационарной фазах роста двух эмбриональных диплоидных штаммов ( ИМГ-814, 3?Л ) ( пунктирная линия, линия с точками ) и штамма с трисомией 7 (ЛЦЧ-162) ( сплошная линия ). 3К-пролин вводили в питательную среду на 3 час, 14С-про.п;гн - на 24 час. Отношение 3Н/14С определяли в кислотонерастворпмой фракции клеток. По оси абсцисс - дни после субкультивирования клеток, по оси ординат - соотношение 3Н/14С меченых белков.

но, что прекращение пролиферации в культуре фибробластов, вызванное контактным ингибированием. сопровождается ускорением распада белков (Dean and Cockle, 1981; Cockle and Dean. 19S2). Результаты наших экспериментов показали, что з стационарной фазе роста средняя скорость внутриклеточного обмена белков в диплоидных фибробластах повышается ( рис. 8 ), увеличивается отношение 3Н/14С при переходе клеток из логарифмической фазы роста в стационарную.

Исследование характера изменения относительней скорости обмена белков в трисомных фибробластах при переходе из логарифмической в стационарную фазу роста выявило глубокие нарушения метаболизма белков в этих клетках. После прекращения пролиферации трисомных фибробластов скорость обмена белков не только не повышается, но. напротив, статистически достоверно снижается (р<0,02).

Данные экспериментов свидетельствуют о том, что при переходе трисомных клеток в стационарную Фазу роста имеет место инвертированный характер изменения скорости обмена белков. В логарифмической фазе роста фибробласты с аномальным карис-типсм отличаются повышенной скоростью обмена белков, свойственной диплоидным клеткам в состоянии покоя. Снижение скорости обмена белков при переходе трисомных фибробластов в стационарную фазу роста свидетельствует о дефекте регуляторного механизма, под-

держивающего скорость обмена белков на уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности клеток.

Не исключено, что повышенная внутриклеточная деградация проколлагена при трисомии причинно связана с обнаруженными нами повышением общей скорости внутриклеточного обмена белков в логарифмической фазе роста клеток с аномальным кариотипом.

'С помощью 3Н-пролина исследовали распад белков в стационарной фазе роста штаммов с триплоидией. Данные, представленные в табл. 12, свидетельствуют о том, что в клетках с 'триплоидным набором хромосом в полтора раза увеличена скорость полураспада белков по сравнению с контрольными данными.

Полученные данные позволяют предполагать, что клетках с аномальным набором хромосом нарушена регуляция катаболизма белков, но не нарушена работа белоксинтезирующего аппарата клетки.

Таблица 12. Время полураспада белков в эмбриональных штаммах с триплоидным и диплоидным набором хромосом

Количество Время полураспада Штаммы исследований белков (час)

( M ±С)

4 диплоидных штамма: ИМГ-821, 822, 1075,

1214 7 19,3 + 2.72 а

2 триплоидных штамма: '

ЛЦЧ-478, ИМГ-1062 7 13,3+1,21"

Различие пары а-b - статистически достоверно (р<0,001)

4. ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ВТОРИЧНЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПОСРЕДНИКОВ ( ЦАМФ и цГМФ ) АНЕУПЛОИДНЫХ ФИБР0БЛАСТ0В ЭМБРИОНОВ

ЧЕЛОВЕКА

Результаты нескольких серий экспериментов по определению уровня цАМФ в клетках с аномальным кариотипом и в диплоидных штаммах представлены в табл. 13. Данные этих экспериментов свидетельствуют о том, что уровень цАМФ в трех штаммах с три-сомией 7 ( ЛЦЧ-162, 446 и 522 ) и в штамме с трисомией''9 (ЛЦЧ-400 ) на 40% выше контрольных данных при перерасчете на 1 мг

белка и на 100S гите при перерасчете ка 1 млн клеток. В триплоидных и диплоидных штаммах уронень цАКФ i"- пересчете на 1 мг белка не различался, а б пересчете на ! млн клеток в триплоид-ных клетках был на 50% выше. Определен уровень иГМФ в трех диплоидных штаммах ( ИМГ-320, 821 и 845 ) - !2.2i0,55 пмсль на 1 мг белка, в трех трисомных штаммах ( ЛЦЧ-162, 400 и 522 ) -9. li.î.16 пмоль на 1 мг белка, в трах триплоидных штаммах (ЛЦЧ-478, 707, ИМГ-1046) - 12,0+1,24 пмпдь на 1 мг белка: различия между диплоидными и трисомными клетками был;: статистически достоверными ( р<0,05 ). Также достоверны различия между диплоидными и трисомными штаммами по определению соотношения цАМФ/цГМФ ( 3,3+0,66 и 7,5+1,41, соогаотсгвенн'. р<0.С5 }. Различий между диплоидными и триплснлнымп штаммами не найдено как по уровню цГМФ ( при пересчете на клеточный белок ), так и по соотношению цАМФ/цГМФ ( 3,3+0,66 и 3,7+0,3. соответственно ).

Таблица 13. Содержание цАМФ s диплоидных, трисомных и триплоидных клетках

N серии ! ! Уровень цАКФ (M ± гг, )

экспери-! Штаммы !------------------------------------------

ментов ! ! пмоль на 1 мг I пмоль на 1 млн

! ! белка ! клеток

1 5 диплоидных штаммов: ИМГ-795. 814, 820, 821, 845 44,4 + 3,32 15. 1 ¿ 1. АО ■

4 трисомных штамма: ЛЦЧ-162, 400, 446, 522 64,4 + 8,84 р<0,02 30,2 +, 5, р<0,02 40

2 4 диплоидных штамма: ИМГ-814, 820, 821, 845 50,5 + 4,31 32, 5 i 3. 38

4 триплоидных штамма: ЛЦЧ-478. 707, ИМГ-1046, 1062 50, 9 + 5, 03 49.8 + 4, р<0.01 79

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ГОМЕОБОКСНЫХ ГЕНОВ.

На основании имеющихся экспериментальных данных, полученных при исследовании эмбриональных штаммов с аномальным кариотипом, можно предположить, что существенную роль в изменении .биохимического патерна этих клеток играет нарушение деятельности регуляторных генов. Чтобы проверить это предположение, нами был исследован с помощью системы праймеров 1!Р6-ЬР2 спектр гомеобоксных генов в культивируемых клетках с диплоидным и аномальным кариотипом. Известно, что гомеобоксные гены двляются регуляторами эмбрионального развития.

Нами изучен только качественный спектр экспрессии гомеобоксных генов. Изучен спектр этих генов в эмбриональных диплоидных штаммах, полученных из материала медицинских абортусов первого триместра беременности и в диплоидных штаммах, выведенных из биопсии кожи пациентов различного возраста ( 1 год - 28 лет ). Данные табл.14 свидетельствуют о том, что гомеобоксные гены обнаруживаются в клетках рожденных пациентов и что идет значительное изменение спектра экспрессирующихся генов с периода первого триместра беременности ( гены А7, В4, В5. С6 ) до постнатального периода ( экспрессия только одного гена - В5 ).

Таблица 14. Экспрессия гомеобоксных генов (НОХ) в эмбриональных и постнатальных штаммах с диплоидным набором хромосом

Количе- Количе- Количе- Типы НОХ

Штаммы ство вы- ство ство

• деленных клонов клонов А7 В4 В5 С6

для ана- со встав- с НОХ

лиза ками

клонов

Эмбриональные

штаммы:

ИМГ-821 . 14 8 5 1 3 1 -

ИМГ-1075 22 16' 14 1 7 4 2

Постнатальные

штаммы:

ИМГ-881 22 18 14 - - 14 -

ИМГ-1036 14 13 13 - - 13 -

ИМГ-1563 23 16 15 - - 15 -

----ирб-- _____

1 АТС ТАС ССС ТСС АТС. сс.с ААА етт САС его АОС АСЙ ст* ААС ССС ДАТ ТАС гсс

11« Ту1 Рго Тгр Мо1 Агд Ьуя V» • !,!■ Уа1 7П1 '/п 1 Авп Рг<- Авп Туг А!«

1 1 ч Р и ¡1 Р к V 11 V £ т V Ы п N \ А

Нох04 ССС АЛЯ сзс тст ССС АСС ЙСС ТАС АСП ССС САЗ САЗ ОТС ТТЛ САС

: > 1 ; 1 : : 1 I : 1 : 1 1 1 11 1 1 1 > 1 1 с ; I 1 1 1 . 1 1 1 1 1 1 111 I I •

55 ЯСС сгс ПАЙ ССС ААО с:'.С ТСТ С СП АС с ССС тле АСС с.;с ело ОАО СТС гге и»с

С1у б!и Рго Ьуэ ТПг АХп Туг ТЬг А.'Ч С1п Ьеи С,1и

19 я 0 Е Р X К 5 я т А у т Л 0 с V ъ 2

апн---- ---> '—-■ ----- - Ноггс-П^отлэ 1 а-

НохВ4 ста- ела ААС САА ттт САС ТАС ААС ССС "АС сто АСА ссс ССС ССС АСО ста СА1

111 1 1 I 111 11 1 11 I 1 11 1 ! 1 I 11 111 111 1 11 1 ■ 1 111 ; I г 111 111 111 1 1 :

104 ста сна \л.; ';АА ттт С АС ТАС аас его 'ГАС ста АСА ССС АС<5 СТС САС

!.еи Щи С1и ГМе Н13 Туг Аэп Агч туг ТЬГ А1Ч Аг,) Агд V»! 31 и

37 I, Е К Е г Н Г N а г ь Т а Я я г V Е

НОХ04 АТС ссс САС ссв ССС ТСС СТС тсс ОАС ССС САС АТС л.« АТС тсс •гге САЗ ААС

1 : ( 1 11 С *. 1 11 : 1 11 111 : 1 1 111 1 : : 11: 1 1 1 ■ 11 ---

163 АТС ¿¿с САС оса стс ТСС СТС тсс САС СЙС САЦ АТС ЛАО атс гот ттс С А ,-. АЛС

!1а А1 а Н1» А1л Се и Су» Ьеи 5ег С1'1 Aгq Я1п Не И» 11я Тгр рь« Авп

55 I А Н А С ь Е К 0 1 к 1 ? 0 Я

нохв4 сой са

хк I I

217 АСК Сб

Рис.9. Данные секвенирования гсмеоОоксного гена НОХ В4 ( клон 4-1 эмбрионального штамма с триплоидией ЛЦЧ-478 }.

Таблица 15. Влияние ретнноидной кислоты (¡0"а М) на экспрессию гомеобоксных геног; (НОХ) в клетках эмбрионального штамма с трисомией 7 гдцч-445)

Количе- Количе- Количе- Типы НОХ

Штамм ство вы- ство ство ----- ------- ------ —

ЛЦЧ-446 деленных клонов клоноз А7 В4 Б5 Со

для ана- со встав- с НОХ

лиза ками

клонов

До обработки

ретиноидной

кислотой 24 19 18 9 8 - 1

После обра-

ботки ретино-

идной кислотой 45 35 23 9 8 6 -

Можно только догадываться, сколь значительные изменения качественных и количественных показателей экспрессии гомеобоксных генов могут регистрироваться в клетках эмбрионов человека на

самых ранних стадиях развития. В штаммах с трисомией 7 и 9 (ЛЦЧ-400. 446), а также в клетках с триплоидией (ЛЦЧ-478, ИМГ-1062) также обнаружена экспрессия генов А7, В4. В5, Сб. На |эис. 9 представлены данные секвенирования гена НОХ В4 в клетках с . триплоидией. В табл. 15 представлены данные по экспрессии го-.меобоксных генов в клетках с трисомией 7 (ЛЦЧ-446) до и после воздействия такого регулятора активности этих генов как рети-ноидная кислота. Данные этой таблицы свидетельствуют о том, что, по-видимому, в клетках с трисомией 7 более выражено представительство гена НОХ А7, картированного на хромосоме 7 (7р15). После воздействий ретиноидной кислоты несколько увеличивается представительство гена НОХ В5 в исследованных трисомных клетках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования хромосомных болезней, в основном, ведутся на достаточно удаленных друг от друга уровнях: уровень организма ( клинические и патоморфологические исследования ) и молекулярный уровень. Совершенно ясно, что между ними должен находиться еще один уровень - клеточный - без которого трудно получить полную картину патогенеза хромосомопатий. Кроме того, многие важные показатели ( в частности, пролиферация и движение клеток) вообще могут быть получены только при исследовании клеточных популяций.

Одной из основных задач клеточной генетики является поиск ответа на вопрос - каким образом генетические факторы влияют на количество клеток в клеточных системах и на основные клеточные функции, каким образом генетические факторы изменяют свойства клеток так, что это приводит к нарушению развития от эмбриолетальности до болезней зрелого возраста.

Достаточно хорошо известно, что одним из основных морфо-генетических процессов является пролиферация клеток. Максимально упрощая взгляд на этот процесс, можно сказать, что одним из условий формирования врожденных пороков развития во время эмбриогенеза является отсутствие в нужном месте, в нужное время достаточного количества клеток.

Скорость размножения клеточной популяции зависит от множества факторов: типа клеток, параметров митотического цикла, величины пролиферативного пула клеток, наличия достаточно хорошо выраженной подложки межклеточного матрикса и т.д. Как наши собственные данные, так и данные других авторов свидетельствуют о снижении пролиферативного потенциала клеток эмбрионов с аномальным кариотипом.

Одной из первых работ по изучению пролиферации клеток с аномальным кариотипом являлась работа Cure ( Cure et al..1974). Было показано, что время удвоения клеточной популяции штаммов, полученных из материала спонтанных абортусов человека с аберрантным набором хромосом, значительно больше, чем в контрольных диплоидных штаммах. Пролиферация клеток эмбрионов мышей с трисомией 13 также была замедленна ( Hongell, 1981 ). в другой работе было отмечено, что время удвоения клеток эмбрионов мыши с трисомией 12 и трисомией 19 также было увеличено ( Nielsen et al.. 1985 ).

В нашей лаборатории проведено клонирование 43 штаммов эмбрионального и постнатального происхождения с диплоидны:/, и аномальным кариотипом и показано, что клоногенность клеток, полученных от спонтанных абортусов с аберрантным кариотипом, была резко снижена по сравнению с эмбрионалыжми диплоидным;: штаммами, в то время как хромосомный дисбаланс в клетках постнатального происхождения не приводил к уменьшению клоногеннос-ти ( Гринберг и Терехов, 1935). При исследовании штаммов с аномальным кариотипом, выведенных из спонтанных абортусов, отмечена низкая продолжительность успешного культивирования этих штаммов ( наши данные совпадают с данными Cure et al.,1974 ), обнаружено резкое снижение миграции этих клеток в условиях подавления пролиферагивной активности (Фрейдин и др., 1988 ), нами также было показано, что некоторые штаммы имеют изменения параметров митотического цикла. Все эти данные свидетельствуют о значительном изменении пролиферативных возможностей эмбриональных клеток с аномальным кариотипом.

Показана важная роль таких элементов межклеточного мат-рикса как фибронектин, коллаген, гликозоамнногликаны в миграции и дифференцировке клеток нервного гребня эмбрионов ( Lacy. 1983, Ruoslahti et al., 1985, Duband et al., 1986, Zagrls et al., 1989 ). На модельных объектах было показано, что на ранних этапах эмбриогенеза высокий уровень гиалуроновой кислоты ингибирует клеточные взаимодействия и стимулирует клеточную миграцию. В дальнейшем происходит снижение уровня гиалуроновой кислоты и только после этого начинается такой важный процесс как агрегация клеток. Гак как известно, что кости, хрящи черепа и лица являются производными клеток нервного гребня (Lacy. 1983), то можно предположить, что наличие факторов, нарушающих миграцию клеток нервного гребня, может приводить к формированию у человека черепно-лицевых аномалий. Нами были получены данные о резком снижении синтеза коллагена, фибронектина и гиалуроновой кислоты в клетках эмбриолеталей человека. Можно предположить, что нарушение синтеза межклеточного матрикса.

нарушение пролиферативной активности клеток эмбрионов с аномальным кариотипом может служить причиной значительного нарушения морфогенетических процессов, приводить к формированию пороков развития.

Одной из основных стигм хромосомопатий у человека являет-' ся задержка роста, гипотрофия плода и новорожденного ребенка, что, отчасти, может быть объяснено уменьшением количества клеток в различных органах детей с аутосомными трисомиями ( Na-еуе, 1967 ), у плода отмечается наличие низкого веса плаценты. Также и у эмбрионов мышей с трисомией 16, начиная с 14 дня развития, вес и размеры головного мозга, сердца, печени значительно ниже нормы ( Fúndele et al., 1987 ). Общей чертой спонтанных абортусов человека с аномальным кариотипом является гипоплазия хориона, сосудов хориона (Philippe and Boue, 1969, Honore et al.,1976). Известно, что в формировании и функционировании сосудоб важную роль играет межклеточный матрикс ( Re-llly and HcAusan, 1988, Kadar and Arvay, 1989 ). Можно предположить, что обнаруженное нами снижение синтеза элементов межклеточного матрикса в клетках эмбриолеталей приводит к аномальному формированию сосудов плода и плаценты.

В клетках спонтанных абортусов человека с трисомным карио.-типом нами обнаружено увеличение уровня цАМФ и изменение соотношения цАМФ/цГМФ. • Увеличение уровня цАМФ обнаружено также у больных с синдромом Дауна, уменьшение уровня цГМФ найдено в клетках амниотической жидкости плодов с трисомией 21 ( Sproles, 1973, Karlsson et al., 1990 ). Имеются сведения о наличии гиперчувствительности клеток больных с трисомией 21 и клеток эмбрионов мыши с трисомией 16 к адренергическим веществам (McSv/lgan and Sheppard, 1980, Scott and Balazs, 1987 ). В клетках больных с синдромом Дауна показано снижение активности АТФаз, в частности, мембранной Na/K АТФазы. -наличие аномальной реакции этого фермента на уабаин ( McCoy et al., 1974, McCoy and Enns. 1980, Ql-mlng et al., 1984 ). Все эти данные могут свидетельствовать о том, что в клетках человека с трисомным кариотипом нарушены механизмы функционирования мембранного комплекса, что может приводить к каскаду реакций, нарушающих активность различных ферментов.

В последнее время интенсивно разрабатывается теория, основанная на понятии "канализация развития", которую предложил Waddington (1942), он полагал, что генотип обладает некоторой буферностыо, развитие "канализировано" и обычно идет по определенному пути, этот путь варьирует по своей стабильности в зависимости от степени "канализации": В настоящее время эта теория разрабатывается на примере хромосомных трисомий. Пред-

полагается, что в результате наличия трпсомного набора хромосом нарушается баланс в генотипе и степень "канализации" уменьшается. Отсюда следует, что те признаки, которые слабо "канализированы", при трисомии будут'изменены в большей степени, чем жестко "канализированные", это предположение подтверждено путем изучения различных стигм у больных с синдромом Дауна ( Shapiro, 1983). Этот феномен назван "разветвленной нестабильностью развития". Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что у больных с трисомннм кариотипом некоторые пороки развития встречаются с частотой подчас в десятки раз превышающие обще-популяционные частоты ( Nara апД Nn'ra, 1972 ).

Канунго ( 1980 ) суммировал данные по биохимическим и клеточным стигмам, которые изменяются при старении Фиброблас-топ человека. Штаммы с аномальным кариотипом, использованные в наших экспериментах, имеют целый ряд стигм старения, отмеченных в этом списке: низкий пролиферативный и клоногенный потенциал, высокую относительную скорость обмена белков в логарифмической фазе роста клеток, высокий уровень цАМФ. низкий уровень синтеза коллагена и гликозоампногликаиов. увеличенные размеры клеток. Таким образом, суммируя наши данные по исследованию штаммов с аномальным кариотипом. полученных из материала эмбриолеталей человека, можно предположить, что мы имеем дело с одним из вариантов преждевременного старения клеток на эмбриональном уровне.

Ранее нами было высказано представление о механизме реализации фенотипического эффекта хромосомных аномалий ( Grin-berg and Kukharenko, 1992 ). Б результате эффекта дозы гена, причем как избытка, так и недостатка (при трисомиях и мокосо-миях), происходят изменения метаболического гомеостаза в клетках. Разные клетки на разных стадиях онтогенеза отличаются по своей толерантности к этим изменениям. Но поскольку постулируется наличие генетически детерминированной изменчивости ограниченного количества белков, обеспечивающих несколько параметров клеток ( например, локомоцию, внутриклеточный транспорт, форму ), то эти изменения метаболического гомеостаза реализуются в виде нарушений элементарных морфогенетических реакций. Наличие аномального набора хромосом в клетках эмбрионов, приводящее как к изменению физиологии отдельных клеток, так. вероятно, и к изменению, поведения клеточных сообществ - все это может приводить к нарушению "канализации развития" эмбриона.

ВЫВОДЫ

1) Штаммы с аномальным кариотипом. выведенные из материала эмбриолеталей человека, характеризовались снижением жизнеспособности культивируемых клеток, в некоторых" из них выявлены однотипные изменения параметров митотического цикла.

2) В штаммах с аномальным набором хромосом снижен синтез белков межклеточного матрикса: коллагена ( на 30-60% ) и фиб-ронектина ( в 1.5-2,0 раза ). Снижение синтеза коллагена не сопровождалось изменением соотношения коллагена типа Т и III, также не отмечено изменения степени гидроксилирования пролино-вых остатков цепей коллагена типа I. Обнаружено повышение внутриклеточного распада проколлагена в эмбриональных штаммах с трисомным-и триплоидным кариотипом.

3) В большинстве штаммов с аномальным набором хромосом резко снижен синтез гиалуроновой кислоты ( в 3,4-8,0 раз ) и резко повышено соотношение сульфатированные гликозоаминоглика-ны/гиалуроновая кислота. Скорость внутриклеточной деградации гиалуроновой кислоты в контрольных эмбриональных диплоидных штаммах в 1,5-2,0 раза выше, чем в клетках с аномальным кариотипом. При исследовании триплоидных штаммов отмечено изменение соотношения дерматансульфата и хондроитинсульфата.

4) В трисомных клетках выявлено изменение скорости обмена белков. В штаммах с триплоидией отмечено увеличение в полтора раза скорости распада белков.

5) В связи со значительными изменениями белкового синтеза исследован белоксинтезирующий аппарат клеток с аномальным кариотипом. В штаммах с трисомным и триплоидным набором хромосом не отмечено изменений в соотношении свободных и мембраносвя-занных полирибосом, время синтеза средней полипептидной цепи в клетках с аномальным кариотипом сходно с данными, полученными при исследовании диплоидных клеток.

6) В штаммах с трисомным кариотипом уровень цАМФ на'40% выше, чем в контрольных диплоидных клетках, трисомные клетки имели более высокое соотношение цАМФ/цГМФ. В клетках с триплоидным набором хромосом при расчете на 1 млн клеток уровень цАМФ был на 50% выше контрольных данных.

7) Во время эмбриогенеза происходит изменение экспрессии таких регуляторов морфогенетических процессов как гомеобоксные гены.

8) Сформулировано представление о механизмах реализации хромосомного дисбаланса на клеточном уровне. Наличие аномалий

. кариотипа может приводить к нарушению ."канализированно'сти развития" эмбриона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. KuMevA.M., Kukharenko V.I., Grinberg К. N:. Va'sileysky S. S., Terskikh V. V;, Stepanova L.G. Morphological. autoi'adlog-raphlc, immunochemical and cytochemical investigation of a cell strain with trisomy 7 from a spontaneous abortus. // Humangenetik. - 1973. - V. 17. - P. 285-286.

2. Kuliev A.M., Kukharenko V. I., Grlnberg K.N.. Terskikh V^V., Tamarkina A. D.. Bogomazov E.A., Redkln P.S., Vas'lleysky S.S. Investigation of a ceil strain with trisomy 14 from a spontaneously aborted human fetus. // Humangenetik. - 1974. -V. 21. - P. 1-12. r

3. Кухаренко В. И., Кулиев A.M., Терских В.В. Параметры ми-тотического цикла диплоидных штаммов эмбриональных клеток человека. // ЦИТОЛОГИЯ. - 1974. - N 7. - С. 814-819.

4. Kukharenko V.I., Kuliev A.M., Grlnberg К.N., Terskikh V.V. Cell cycles in human diploid and aneuplold strains. // Humangenetik. - 1974. - V. 24. - P. 285-296.

5. Кухаренко В.И., Кулиев А.М., Гринберг К.Н., Терских В. В. Комплексное исследование штаммов клеток человека с аномалиями кариотипа. Сообщение II. Параметры митотического цикла. // Генетика. - 1975. - N 8. - С. 139-145.

6. Kuliev A.M., Kukharenko V.I.. Grlnberg К.N., Mlkhailov А. Т., Tamarkina A. D. Human trlploid cell strain. Phenotype on cellular level. // Humangenetik. - 1975. - V. 30.- P. 127-134.

7. Кухаренко В. И.. Ворсанова С.Г.. Гринберг К.Н. Динамика изменения митотической активности и индекса меченых клеток в диплоидных эмбриональных штаммах фибробластоподобных клеток человека. // Лабораторное дело. - 1976. - N 2. - С. 73-74.

8. Кулиев A.M., Кухаренко В.И.. Гринберг К.Н.. Михайлов А.Т.. Кулаженко В.П., Тамаркина А.Д., Богомазов Е.А. Комплексное ( эмбриоморфологическое, цитоморфологическое, биохимическое ) исследование при триплоидии у человека. //II конференция патологоанатомов. - Гродно. 1976. - С. 138-139.

9. Кухаренко В.И., Гринберг К.Н., Кулиев A.M. Митоти-ческие циклы в диплоидных штаммах фибробластоподобных клеток человека. // Цитология. - 1977. - N 8. - С. 924-926.

10. Kuliev A.M., Grlnberg K.N., Kukharenko V.I.. Kulazenko V, P., Bogomazov E.A. Monosomy 21 in a human spontaneous abortus. Morphogenetlc disturbances and phenotype at the cellular level. // Human Genetics. - 1977,- V. 38.- P. 137-145.

' И. Гринберг К.H., Кулиев A.M.. Кухаренко В.И. Проявление

наследственной -патологии на клеточном уровне. //114 Международный генетический конгресс. - Москва. 1978. - Часть 1. - С. -316.

12. Kukharenko V.l., Grlnberg К.N.. Kuliev A.M. Mitotic cycles in human cell strains with sex chromosomes aneuploidy. // Human Genetics. - 1978. - V. 42. - P. 157-162.

13. Кухаренко В.И. Коллекция мутантных клеток в связи с изучением генетики человека. // IY Съезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова. - Кишинев, .1982. - С. 57-58.

14. Дельвиг A.A., Кухаренко В.И.. Гринберг К.Н., Дебов С. С. Отсутствие эффекта дозы гена для коллагена типа Г и типа III в фибробластных клетках с трисомией по хромосоме 7, полученных из спонтанного абортуса человека. //. Вопросы медицинской ХИМИИ. - 1983. - N 3. - С. 25-29.

15. Кухаренко В.И., Дельвиг A.A. Динамика синтеза и распада коллагена в культурах эмбриональных диплоидных штаммов человека. // Цитология. - 1983. - N 9. - С. 1085-1086.

16. Дельвиг A.A., Кухаренко В.И., Подобед О.В., Пичугина Е.М., Гринберг К.Н., Дебов С.С. Биохимические проявления геномных мутаций в фибробластах человека. // Молекулярная генетика. микробиология и вирусология. - 1983. - N 12. - С. 39-43.

17. Кухаренко В.И., Дельвиг A.A. Изучение соотношения коллагена типа I и типа III, синтезированного диплоидными фиб-робластными клетками индивидуумов различных возрастных групп. // I Всесоюзный съезд общества медицинских генетиков. - Киев, 1984. - С. 181-182.

18. Kukharenko V.L. Delvig A.A.. Grlnberg K.N. Disturbances In collagen synthesis • In trisomie cells from spontaneously aborted embryos. // Human Genetics. - 1984. - V. 68. - P. 269271.

19. Белкин В.M., Кухаренко В.И., Володарская С.М., Гринберг К.Н., Мазуров В.И. Изменение биосинтеза фибронектина в эмбриональных человеческих фибробластах с трисомией по хромосомам 7 и 9. // Вопросы медицинской химии. - 1985. - N 1. -С. 125-130.

20. Кухаренко В.И., Белкин В.М.. Дельвиг A.A. Синтез коллагена и фибронектина в логарифмической и стационарной фазах роста диплоидных штаммов человека. // II Совещание по культивированию клеток животных и человека. - Пущино, 1985. - С.' 33.

21. Подобед О.В., Пичугина Е.М.. Кухаренко В.И.. Дельвиг A.A. Сравнительная характеристика белоксинтезирующего аппарата диплоидных и анеуплоидных фибробластов эмбрионов человека. // ■ Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -ч1985. -

N 11. - С. 38-42.

22. Гринберг К.H., Кухаренко В.И. Банк клеток человека с генными и хромосомными мутациями: его место и роль в системе профилактики наследственных болезней. // Всесоюзный симпозиум "Профилактика наследственных болезней". - Вильнюс, 1S86. -С. 29-30.

23. Кухаренко В.И., Дельвиг A.A. Исследование синтеза коллагена в клетках, полученных из материала спонтанных абортусов человека с аномальным набором хромосом. // Акушерство и гинекология. - 1986. - N 6. - С. 63-64.

24. Белкин В.М., Кухаренко В.И.. Володарская С.М.. Мазуров В.И. Снижение биосинтеза фибронектина в трисомных и трип-лоидннх фибробластах спонтанных абортусов человека. // 7 Всесоюзное совещание эмбриологов. - Ленинград. 1986. - Часть II.-С. 27.

25. Подобед 0.В., Соловьева Н.В.. Кухаренко В.И.. Дельвиг А.А. Участие лизосомальных ферментов в деградации белков в эмбриональных фибробластах человека с хромосомными аномалиями.// III Всесоюзный симпозиум "Структура и функция лизосом". - Тбилиси. 1986. - С. 158-159.

26. Подобед 0.В., Кухаренко В.И.. Соловьева Н.В., Пичуги-на Е.М., Дельвиг А.А. Особенности внутриклеточного метаболизма проколлагена и других белков в фибробластах эмбрионов человека с трисомией по хромосоме 7. // Биохимия. - 1987. - Т. 52. -N 1. - С. 82-88.

27. Delvlg А.А., Kukharenko V.I., Belkln V.M.. Mazurov V.l., Grinberg К.N., Debov S.S. Collagen and flbronectln synthesis by trisomie and trlplold fibroblasts from human spontaneous abortuses. // Molecular and General Genetics. -

1987. - V. 209. - P. 592-595.

28. Кухаренко В.И., Дельвиг A.A.. Белкин В.M. Триплоидия у человека. Синтез основных элементов межклеточного матрикса -коллагена, протеогликанов, фибронектина. // Y Сьезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова. - Москва, 1987. - Том II. - С. 63-64.

29. Гринберг К. Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н.. Терехов С.М., Пичугина Е.М.Фрейдин М. И., Черников В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней. // В книге: "Методы культивирования клеток". - Ленинград, 1987. - С. 250-257.

30. Кухаренко В.И., Хохлова Ю.В. Исследование уровня цАМФ в клетках спонтанных абортусов человека с аутосомными трисоми-ями. // I Съезд медицинских генетиков Украинской ССР. - Львов.

1988. - С. 147-148.

31. Фрейдин М.И., Соловьева Н.В., Кухаренко В.И.. Дельвиг A.A. Секреция 14С-проколлагена эмбриональными фибробластами

человека с диплоидным и трисомным набором хромосом. // Вопросы МеДИЦИНСКОЙ ХИМИИ. - 1988. - N 2. - С. 72-75.

32. Подобед 0.В.. Голубева Н.В., Кухаренко В.И., Дельвиг A.A. Кинетика распада белков в диплоидных и трисомных фиброб-ластах человека. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1988. - N 5. - С. 41-45.

33. Кухаренко В.И. Синтез протеогликанов в штаммах фиб-робластных клеток, полученных из абортусов человека с трипло-идным набором хромосом. // Акушерство и гинекология. - 1989. -N 1. - С. 69-71.

34. Кухаренко В.И., Хохлова Ю.В. Уровень цАМФ и цГМФ в клетках спонтанных абортусов с трисомным и триплоидным карио-типом. //Вопросы медицинской химии. - 1989. - N 4. - С. 73-75.

35. Кухаренко В.И., Пичугина Е. М., Дельвиг А.А. Соотношение коллагена типов I и III в штаммах фибробластных клеток человека с диплоидным и аномальным набором хромосом. // Вопросы медицинской химии. - 1989. - N 5. - С. 94-96.

36. Кухаренко В. И.,. Пичугина Е.М., Фрейдин М.И. Синтез гиалуроновой кислоты в соматических клетках человека с аномалиями кариотипа различного онтогенетического происхождения. // Всесоюзная конференция по генетике соматических клеток в культуре. - Звенигород, 1989. - С. 114.

37. Кухаренко В.И., Фрейдин М.И., Терехов С.М. Особенности культивируемых эмбриональных фибробластов человека с триплоидным набором хромосом. // III Всесоюзное совещание "Культивирование клеток животных и человека". - Пущино, 1990.-С. 31.

38. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Золотухина Т.В. Методические рекомендации по использованию культивируемых клеток для диагностики наследственных болезней человека. - Министерство здравоохранения СССР, Москва, 1990. - С. 1-26.

39. Кухаренко В.И., Пичугина Е. М., Подобед 0.В. Соотношение свободных и мембраносвязанных рибосом в клетках спонтанных абортусов человека с аномальным кариотипом. //II Всесоюзный съезд медицинских генетиков. - Алма-Ата, 1990. - С. 236.

40. Голубева Н.В.. Подобед 0. В., Кухаренко В. И., Дельвиг A.A. Исследование вклада лизос'омных ферментов в деградации коротко- и долгоживущих белков эмбриональных фибробластов человека с аномальным набором хромосом. // Вопросы медицинской химии. - 1990. - N 5. - С. 41-43.

41. Кухаренко В.И. Спонтанные и индуцированные абортусы с триплоидией: синтез гликозоаминогликанов. // III National Congress of Medical Biology and Genetics. - Varna, 1990. - P. 61.

42. Kukharenko V.l., Pichugina E.M.. Freidin M.I., Klrll-

lova E.A.. Smlrnova O.A.. Delvlg A.A. Synthesis of glycosaml-noglycans from abortuses with trisomy, trlploldy, and from children with Down's syndrome. // Human Genetics. - 1991. -V. 87. - P. 592-596.

43. Kukharenko V.I. Human spontaneous abortuses with abnormal Karyotype - biochemical aspects of embryolethallty.// Amer. J. Hum. Genet. (Suppl.). - 1991. - V.49; - P.268.

44, Grlnberg K.. Kukharenko V.I. Phenotyplc effects of human aneuploldy: hypothesis of nonspecific teratologlcal Interaction. // 24th Annual Meeting of European Society of Human Genetics. - Elslnore. Denmark. 1992. - P. 81.

: 45. Kukharenko V.. Sheleg S. . Freldln M. Synthesis of hyaluronic acid In fibroblasts from children with trisomy 21. 18 and 13. // Gesellschaft fur Humangenetlk. 4 Tagung. Mainz. - 1992. - P. 177.

46. Kukharenko v.. Sheleg S.. Freldln M.. Plchuglna E. Synthesis of extracellular matrix components In the cell strains derived from patients with trlsomic karyotype. // 5th International Congress of Cell Biology. Madrid. - 1992. -P. 183.

47. Kukharenko V.7. Proliferation of cell strains obtained from human spontaneous abortuses. // Cell Proliferation. - 1992. - V. 25. -N 5. - P. 520.

48. Grlnberg K.N., Kukharenko V.l. The cellular aspects In development of stigmata of chromosomal syndromes. //Proc. 25th Annual Meeting European Society of Human Genetics. Barselona. - 1993. - P. 106.

49. Delvlg A., Lambert Ch.. Kukharenko V.. Kusgens B., Laplere Ch. Expresslonof an additional pro-a2(l) collagen gene, in human fibroblasts with trisomy 7. // Proc. 25th Annual Meeting European Society of Human Genetics. Barselona. -1993.-P. 95.

50. Kukharenko V.. Sheleg S.. Freudlne M., Plchuglna E.. Delvlg A. Down's syndrome, Edwards's syndrome. Patau's syndrome - synthesis of glycosamlnoglycans. // Human Genetics. -1994. - V. 94. - P. 80-82.

51. Kukharenko V.. Podobed 0.. Delvlg A. Total protein and collagen degradation In human cell strains with trlploldy.// Proc. 26th Annual Meeting European Society of Human Genetics. Paris. - 1994. - P. 121.

Заказ » 1070 Ткркж 100 экз. АООТ "Эксяосгроймжш"

Информация о работе

Кухаренко, Валерий Иванович
кандидата медицинских наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы