Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ОСОБЕННОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ НЕКОТОРЫХ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ У ТОМАТА

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ НЕКОТОРЫХ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ У ТОМАТА"

На правах рукописи

УДК «31.524 : 635.64

АНТОШ КИН Александр Александрович

ОСОБЕННОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ НЕКОТОРЫХ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ V ТОМАТА

Специальность: 06.01.05-селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных паук

МОСКВА-2005

Работа выполнена в 2003-2005 гт. во ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур РАСХН.

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук, ст. н. с, Т.С. Няуменко

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор, чл.-корр. АН РМ H.H. Балашова

доктор биологических наук, с. н. с. С.К. Темирбекчэва

Ведущее учреждение: Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

Защита состоится "27" декабря 2005 г. в 12 час на заседании диссертационного совета Д220.019.01 при ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл., Одинцовский р-н, п/о Лесной городок, пос. ВНИИССОК.

Факс (095) 599-22-77 E-mail: voiissok@mail. ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан ^ ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Е.Г. Добруцкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. При использовании разнообразных адаптивных структур имеются реальные возможности повысить адшшвносгь и экономичность накопления урожайных свойств путем совмещения коешзгггивных блоков генов и обеспечить весьма высокие уровни потенциальной продуктивности и экологической устойчивости в одном генотипе, в частности в гибриде Fj. Генетический анализ сложных хоояйственно ценных признаков и биологических свойств растений остается одной ш важных проблем селекшш. Реимгь ее возможно на основе фундаментальных знаний генетической и морфогенетическоЯ сущности этих признаков

Перспективы селекции неразрывно связаны не только с расшифровкой и познанием механизмов контроля рекомоинаш-юнных процессов, фактора определяющих элиминацию нетрадиционных рекомбинанкв, но и решением ряда биопогичеситх пробоем, весьма существенных с практической точки зрения. К их числу следует отнести выявление взаимодействия в системе «генотип-среда», взаимосвязи конкурентоспособности, гетерозисносги и рекомбинации выяснение генетической природы специфической и обшей устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам, картирование количественных, в том числе хоояйственно ценных признаков. Мало работ посвящено точной идентификации локализации генетических факторов, отвечающих за проявление количественных признаков. Большое число количественных признаков изучено недостаточно (Rick, 1982). Выявление генетических различий между контрастными по адаптивности формами томата, маркирование локусов, контролирующих различия по количественным признакам, возможно на сегодняшний день, с применением иэофермемтых и ДНК-маркеров. Использование маркерных фюиолого-биохимичесшх показателей представляется актуальным, так как проведение комплексных исследований дает возможность объективно оценивать генетически детерминированные биохимические особенности линий или сортов, сравнивать их между собой, контролировать и сокращать сроки селекционного процесса. Однако, несмотря на достигнутые успехи в исследовании сложных процессов регуляции генной экспрессии, до сих пор остаются неясными основные механизмы становления такого полигенного количественного признака, как продуктивность (Титок, 2002). Одним из возможных путей в решении этой проблемы является анализ связей между генотипнческими особенностями и

фенотипической изменчивостью, основанный на применении молекулярных и иэоферметных метопов исследований.

Целью работы является идентификация молекулярных и гаоферменгньк маркеров, выявляющих достоверную разницу количественного прюнака между аллелями контрастных по продуктивности форм томата.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: 1. Оценка генотиповтомалаи выявление наиболее информативных признаков, а) Подбор, идентификация исходного материала как компонентов для скрещивания, проведение межвидовых скрешгаакий род ительских линий томата в пленочной теплице для получения ме>№щовых гибридов.

б) Оценка линий, отбор трансгрессий из Fj межвидовых гибрнаов томата по некоторым количественным признакам для их дальнейшего насыщения по признаку "продуктивность" в пленочной теплице, выявление (еиболее информативных признаке® для проведения генетическою анализа.

в) Оценка параметров адаптивной способности и стабильности отобранных межвидовых трансгрессий.

Z Проведение насыщающих скрещиваний трансгрессий, отобранных m Fj межвидовых гибридов, выделенными гю продуктивности сортами.

3. Сеяекцжмно-генеточеская оценка и щенпфосацкя генотипов полученных гибридов томата посредством молекулярных и юоферментных маркеров

4. Выделение маркеров, выявляющих достоверную разницу изучаемых количественных признаков,

Научная новизна. В ходе исследований на культуре томата была апробирована методика ДВ. Потапова, ЕЛ. Салменковой (1998Х испытано двадщть юоферменгоа и четьфе RAPD -маркера. Сравнительный анатиз срадгих величин количественного прюнака в группах трансгрессивных генотипов Fj тсмата, объединенных по каждому отдельно взятому ферментному локусу, выявил 17 случаев достоверных различий, причем в 16-ти тестах значение признака в гегерозгаоте было больше, чем в гомозиготе. При этом максимальное увеличение значения признака ''продуктивности" шблюдали при гегерозиготности по локусам Got 3, Pgm 2,6-Pgd 2, рвеположенным в 4 и 7 хромосомах, и данные блоки так© отвечают за

s

существенную долю генотипической изменчивости исследуемых признаков. Проведена идентификация линий, полученных межвидовых гибридов и отобранных трансгрессий с использованием метода по определению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплификации ДНК с праймерами (RAPD), основанного на полимеразной цепной реакции (PCR). На праймерах OPA 8 и OPA 10 выявлен полиморфизм уникальных RAPD-фрагментов {OPA Ш00, OPA 8#900, ОРА8#450, OPA 1CW400, OPA 10#450). Фрагменты OPA 8#800, OPA 8#900 являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менделя.

Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований показана возможность подбора родительских пар при скрещивании на культуре томата на основе анализа исходного материала по выявленным изоферментным и ДНК ~ маркерам для определения генотипов не только на фенотипнческом, но и генетическом уровне. При использовании маркерных фнзяолого-биохимических показателей получена возможность объективно оценивать генетически детерминированные биохимические особенности линий или сортов, сравнивать их между собой, контролировать и сокращать сроки селекционного процесса.

Определена возможность изучения основных механизмов становления такого пол и генного количественного признака, как продуктивность, при помощи анализа связей между генотипическими особенностями и фенотип ической изменчивостью, основанная на применении молекулярных и изоферментных методов исследований. На основе межвидовой гибридизации получен перспективный исходный материал томата (20 образцов).

Положения, выноснмыенаэащнту:

- научное обоснование способа подбора родительских компонентов, контрастных по некоторым количественным признакам у межвидовых гибридов с целью ускорения селекционного процесса, повышения его эффективности и качества исходного материала для селекции;

- экспериментальное обоснование использования иэоферментов в качестве генетических маркеров при оценке »сходного материала на проявление фенотипических особенностей;

- использование молекулярных маркеров для генетического маркирования хозяйственно ценных признаков контрастных по продуктивности форм томата.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции плодоовощного факультета, посвященной 90-летию кафедры овощеводства и плодоводства и 60 -летию кафедры виноградарства и виноделия (МСХА им. К.А. Тимирязева, М., 2004); Международном симпозиуме: "Современное состояние и перспективы развития селекции н семеноводства овощных культур" (ВНИИССОК, М., 2005); Международной научно-практической конференции: "Приоритетные направления генетики, селекции и биотехнологии семейства пасленовых" (Харьков, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Структур» и объем работы. Диссертация изложена на â$~ страницах и состоит из: введения, обзора литературы, глав; материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, предложения и рекомендации, список литературы и приложения. Библиография включает в себя Цё источников, в том числе Mi на иностранных языках. Работа проиллюстрирована таблицами, рисунками и фотографиями, В приложении приведено .и таблиц и .... графиков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования работы служила культура томат. В качестве материала использовали: линии томата из коллекции Института генетики АН РМ с контрастным проявлением количественных признаков (Нистру №21, Радуга Молдовы №29), репродуцированные во ВНИИССОК; одна из форм дикого вида томата Lycopersîcon hirsutum var. glabratum Л'гбб, маркированная изоферментными маркерами - Adh-1 (хромосома 4), Aat-2 (хромосома 7), Aat-4 (хромосома 8); образцы коллекции ВИР (Нистру №4284, Радуга Молдовы №4337, L. hirsutum var. glabratum №5038); образцы ВНИИССОК (Нистру, Радуга Молдовы), репродуцированные в Термезе; сорта томата селекции ВНИИССОК

(Патрис, Золушка, Грот), предоставленные лабораторией пасленовых культур. В качестве контроля в открытом грунте использовали сорт Дубрава. Родительские формы выращивали в 2 экологических средах:

а) умеренной зоне средней полосы России (ВНИИССОК, минская теплица),

б) умеренной зоне средней полосы России (ВНИИССОК, стеклянная зимняя теплица). Сорта для проведения насыщения отобранных межвидовых трансгрессий выращивали в открытом фунте. Томат выращивали по общепринятой агротехнике. Нумерация исходных линий приведена согласно номенклатуре Института генетики АН РМ (Бочарннкова, Козлова, 1992) и каталогу ВИР.

Оценку исходного материала проводили но признакам: "высота растения" (главный стебель), "количество листьев", "сумма длин первого и второго настоящих листьев", "количество кистей", "количество цветков на каждой киста", "количество плодов на растении", "средняя масса плода, продуктивность".

Параметры адаптивной способности определяли по методике, разработанной A3. Кильчевским и JI.B. Хотылевой (1985) на ПЭВМ в ППП "Sona". Гибридизацию исходного материала проводили в пленочной теплице ВНИИССОК по общепринятой методике (Йорданов, 1987), Выделение геномной ДНК из растительной ткани проводили микрометодом, разработанным ДБ. Дороховым и Э. Клоке (1997).

При таоферментном анализе использовали методику электрофореза в крахмальном геле (Политов, Салменкова, 1998). Разделение ферментов проводили в 13,5% крахмальном геле в трех универсальных буферных системах: трис-цитрат, трис-ЭДТА-борат, марфалин-гртрат. Выявление ферментов в гелях проводили гистохимическими методами (Левитес, 1986). Электрофоретическую подвижность ферментов идентифицировали на основании данных, приведенных в работе Rick (1983), а также собственного анализа линий, F„ Fi и популяций Fj. Определение генотипа растения (гомо- или гетерозигота) по изучаемым ферментным локусам проводили путем электрофоретического анализа не менее десяти семян и проростков самоопыленного потомства Fj. С

вероятностью 1-0,5* , где п — число семян или проростков, можно было утверждать, что исследуемый вариант гомозиготен по данному локусу.

Для полимеразной цепной реакции использовали наборы реактивов производства "Helicon" и "Btocom" (Москва). Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе "Терцин" ("ДНК-Технолошя", Россия). Электрофор« продуктов амплификации ДНК проводили в 1,5% агарозном геле с использованием 0,5 X трис-бо ратного буфера. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (5мкг/мл) и просматривали в УФ свете.

Статистическую обработку данных выполняли на ПЭВМ с использованием IIIIII "Биостат", MS Exell 97, кластерный анализ проводили с помощью компьютерной программы "STATISTICA" невзвешенным париогрупповым методом с арифметическим усреднением (UPGMA) по Ней и Ли (1976). Рассчитаны степени трансгрессии, подтверждающие наличие в поколении Fj трансгрессивных форм, а также коэффициенты вариации и определены соответствующие лимиты родительских форм. Степени трансгрессии рассчитывали по формулам: 1) (Mf-Mp)/Mp* 100%, Mf — max значение количественного признака в поколении F2; Мр - max значение количественного признака у лучшей родительской формы; 2) (rrij^mp)/mp* 100%, шр — min значение количественного признака в поколении Fi; mp - min значение количественного признака у худшей родительской формы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оценка генотипов томата и выявление наиболее информативных признаков.

а) Подбор, идентификация исходного материала как компонентов для скрещивания, проведение мелсеидовых скрещиваний родительских линии томата в пленочной теплице для получения межвидовых гибридов

Для проведения данных исследований были взяты контрастные по комплексу морфо-биологнческих признаков линии томата, изученные ранее, и при скрещиваниях которых были получены межвидовые гибриды F| по ряду количественных признаков (Урсул, 1992; Урсул, Жученко, Денисова, Левитес,

1993; Урсул, Науменко, 2002). Проведенный изоферментный анализ подтвердил отличия между линиями Нистру, Радуга Молдовы, Lycopersicon hirsutum var. glabratum №66 по изознмным маркерам Atlh-1, Pgm-2, Pgi, 6-Pdg, Mdh-4, Got-1, Got-3 на изучаемых количественных признаках.

Также была проведена идентификация линий Радуга Молдовы, Lycopersicon hirsutum var. glabratum №66 с использованием метода по определению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплификации ДНК с праймерами (RAPD), основанного на полимеразной цепной реакции (PCR).

Растения были проанализированы с 4 праймерами (OPA 8, OPA 10, OPN 1, OPN 13), что выявило в обшей сложности 48 локусов, 26 из которых оказались полиморфными (рис.1).

OPA 8 OPA 10

12345 12345

Рис.1. Оценка родительских линий томата молекулярными маркерами (RAPD-аналю) по праймером OPA 8, OPA 10, где: 1 - маркер матекулярных маос; 2,3 - Радуга Молдовы; 4,5 -Lycopersicon hirsutum var, glabrmun №66

Таким образом, была подтверждена контрастность взятого для исследований материала не только на фенотипическом, но и на генетическом уровне, что дает возможность использовать этот исходный материал в качестве компонентов для проведения межвидовых скрещиваний и эффекп шшго отбора полученных трансгрессий.

б) Оценка .тигле/ н отСюр трансгрхаш томата по пекопю/тыч количества шыч гцушшжам, выжил шс наиГхпее itHtjxp\иттвхых признаков йтя гцххшдения •хшяпическол» анализа

В сегрегирующих популяциях количественные признаки, как правило, характеризуются непрерывным (часто нормальным) распределением. Причем

наиболее информативными являются крайние варианты распределения (представленные особями с минимальным и максимальным значением величины, характеризующей признак), так как в них ожидается ассоциация однонаправленно действующих аллелей (уменьшающих нлн увеличивающих выражение признака). Индивидуумы из крайних вариантов распределения (положительные и отрицательные трансгрессии), учитывая отсутствие селекции по другим признакам, будут отличаться только по последовательностям геномов, отвечающих за формирование количественных признаков и по районам, непосредственно прилегающим к этим генам.

Изучение и оценку образцов томата проводили на основе морфологических маркеров по некоторым количественным признакам, представленным в таблице 1. Определены существенные различия почти по всем признакам, между родительскими формами и гибридами первого поколения, а также между гибридами, полученными от одних родителей из экологически разнокачественных семян. Для установления степени трансгрессии, подтверждающей наличие в поколении Р2 трансгрессивных форм, были рассчитаны коэффициенты вариации и определены соответствующие лимиты родительских форм (табл. 1). На основании полученных данных были отобраны трансгрессии томата из поколения Ра №1 межвидовых гибридов, полученных при скрещивании родительских форм: Радуга Молдовы (Москва, поле) х Ьусорешсм Ыгеишт уаг. glabшum №66 (пленочная теплица); из поколения ОД&24 (Радуга Молдовы (остекленная теплица) х ЬусореЫсоп ЫгаиЬлп уаг. glabпltшt^ №66 (пленочная тешпща).

В поколении Гг №1 по каждому признаку в отдельности были выделены некоторые трансгрессии, однако для дальнейшего использования в селекционной работе были выбраны трансгрессии, выделенные одновременно по нескольким признакам: №№1, 8, 10, 23 (табл. 2), При отборе трансгрессий подбирали как положительные, так и отрицательные трансгрессивные формы, что было необходимо для проведения генетического анализа, чтобы максимально широко охватить исследуемое потомство (крайние растения из исследуемых популяций).

В поколении Р2 №24 также по каждому признаку в отдельности были выделены некоторые трансгрессии, однако для дальнейшей селекционной работы были отобраны только те трансгрессии, которые были выделены одновременно по нескольким признакам: №№3, б, 7, 12, 15, 23 (табл. 3) и являлись положительными. Было определено, что положительных трансгрессий было выделено больше, чем отрицательных в том поколении, которое было получено из семян межвидовых гибридов с большими экологическими различиями (Р2№ 1: открытый грунт, тештаца), чем в поколении Рг№24 (родители получены в условиях теплицы), т.е. проявлялись средовые различия полученные семянами родительских форм.

Таким образом, на основе морфологической оценки исходных родительских форм и полученных поколений Р] и Рг, включая расчет степеней трансгрессий, были выделены трансгрессии по наиболее информативным признакам ("высота растения", "количество плодов", "количество листьев", "масса плодов на растении") для проведения генетического анализа. Использование морфологических маркеров, как способа для получения исходного материала, требует значительных затрат времени, которое снижается при использовании молекулярных и изо ферментных маркеров.

в) Оценка параметров адаптивной способности и стабильности отобранных межвидовых трансгрессий

Для определения вклада внешней среды па проявление количественных признаков отобранных межвидовых трансгрессий были определены параметры адаптивной способности и стабильности положительных н отрицательных трансгрессий по трем годам исследований (таблица 4). По всем признакам выявлено, что по параметру СЦП значения положительных и отрицательных трансгрессий контрастны по проявлению признака. Исключение составляет Рг№24 шах (СЦГ=0,12), что объясняется большим значением стабильности генотипов (5^=14,7). Таким образом, можно сказать, что отобранные нами положительные трансгрессии, сочетающие стабильность признака и

продуктивность, представляет интерес для включения в селекционный процесс на адаптивность.

Кроме того, проводили оценку параметров среда. Одним из важных параметров среды является ее продуктивность, которая оценивается по среднему значению всех генотипов в конкретных условиях среды. Продуктивность среды значительно отличалась по годам исследования, в связи с чем менялся ее показатель (¿О от низкопродуктивной {Москва, защищ. гр., 2004) до высокопродуктивной (Москва, защищ. гр., 2003).

Взаимодействие генотип-среда по-разному отразилось на выровнены ости количественных признаков. Анализ полиморфизма гибридных популяций наиболее затруднен в условиях среды защищенного грунта по признакам "количество листьев" и "сумма 1+2 настоящих листьев", для которых фон все три года был стабилизирующим. Только один раз из трех лет испытания формируется анализирующий фон для оценки по признакам: "количество кистей", "количество цветков". Константно дестабилизирующий эффект среды проявлялся относительно признаков (в возрастающем порядке): "высота растения", "количество плодов", "продуктивность", "средняя масса 1 плода".

Типичность среды по всем годам исследований почти по всем признакам отличалась незначительно. Тем не менее, по признакам проявились некоторые особенности: типичность среды практически не менялась для признаков: "количество кистей", "продуктивность". В большей степени типичность меняется для признаков: "количество листьев" и "количество плодов".

Таким образом, испытания в условиях закрытого грунта Москвы в течение трех лет позволяют получить информацию о полиморфизме межвидовых гибридных популяций по основным количественным признакам. Потенциал признаков проявляется реже: один раз в три года, т.е. испытания должны проводиться не менее трех лет. Незначительная изменчивость параметра типичности среды позволяет сокращать длительность испытания на заключительных этапах селекции до двух лет.

Таблица 1

Сравнительная характеристика по варьированию количественных признаков у линий и гибридных комбинаций

Радуга Молдовы х Ь. ЫгеиЬлп уаг. ¿ЫмаШт №66 при отборе трансгрессий, 2003г.

1 а Высота растения, см Количество листьеа, пгг Сумма 1+2 яаст, листьев, см Количество пгг.

Кистей на растешш Цветков на растении Плодов яа растешш

Х± Су, % пиитах Х± 8х Су, % пип-тах Х£ 5х Су, % тт-тах Х± в* Су, % Лнп-тах X* Су, % ш- шах Х£ Эх Су.% 1Ш-шах

Радуг» Молдовы 54,60 £ 1,65 11,7 4464 15,3± 0,57 143 12-20 31,0 ±0,56 7,0 28-35 5,1 £ 032 24,) 2-1 53 £ 0,27 19,6 3,873 4,1 £ 033 40Д 2-7

Ьусорсг-зкоо Ыгеи-(ит№66 76,15 ± 2,4 9,04 6591 13,7 ±03 733 12-15 3435 £1,71 143 24-43 4,0 ±03 22,1 3-5 12,7 ± 0,87 29,7 5,616,8 18,1 £ 0,83 17,8 16-25

135,9 1,81 731 121155 20,0 ±0,24 6,49 18-23 43,4± 0,91 11,5 29-57 537± 0,16 15,4 3-6 1и 026 12,4 8,7143 29,4 £ 1,40 26,0 16-45

р! № 24 103,0 ± 1,91 10,0 873 -125 17,1± 0Д2 7,05 15-19 3937 ±0,72 9,77 30-50 5,3«± 0,17 16,8 3-7 8,83 £ 035 21,1 5,512,4 23,9 £ 1,05 23,8 12-34

Примечание: Р<№1-гибридное поколение от скрещивания (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) х Ь. Ытйшп уаг.

£>1аЬгашт №66 (пленочная теплица)); Р] №24 - гибридное поколение от скрещивания (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплица) х Ь, Ыгзлшп уаг. ^аЪгаШш №66 (пленочная теплица))

Таблица 2

Степень трансгрессии Р2 № 1, %

№ it.it. растения Высота растения, см Количество листьев, шт Сумма длин 1+2 васт. листьев, см Количество шт.

Кистей на растении Цветков на растении Плодов на растения

Радуга Молдовы (поле, Москва) х Ь. Ыгеишт уаг. й!аЬга1иш №66 (остекл. тепл.)

1 41,8 -5 -14,0 -14 -40,5 157

8 -18,7 -20 21 0 31,5 -25

10 -9 -25 17 0 -57,9 -75

17 29,5 -15 -18,6 50 -50,6 -44

18 24,2 0 333 50 -40,5 -32

22 18,7 5 37,5 50 31,5 100

23 20,9 -10 29,2 -14 -393 144

Примечание: отбор трансгрессий на основе морфологических маркеров; выделены положительные и отрицательные трансгрессии из поколения р2 №1 (Разута Молдовы №29 (пояс, Москва) х I, ИгеШит унт. (ДаЬгаЬлп №66 (остекленная тешшца))

Таблица 3

Степень трансгрессии Р} №24, %

№п.п. растения Высота растения, см Количество листьев, шт Сумма длин 1+2 наст, листьев, см Количество шт.

Кистей на растении Цветков на растении Плодов на растении

^ № 24 (Рад. Молдовы (Гол. Теп.) х Ь. ЫгеиПт уаг. й1аЬгаГит №66 (Мин. т.)

1 27,5 -20 -93 -28,6 100 -28

2 143 -25 -16,3 100 57,9 • 16

3 50 0 -4,7 0 97,4 200

6 19,8 5 -3,6 -143 -13,7 200

7 42,9 -10 -7,1 100 18,4 150

10 1,1 -15 -11,6 -143 39,5 8

11 -23.1 0 21,4 50 -52,4 -12

12 54,5 83 3,6 50 -50,6 150

15 13,7 -5 0 0 -31,5 180

16 -17,6 -25 4.7 100 -49,4 200

18 -9,9 -15 -11,6 0 -34.5 -32

23 4,5 .9а 143 50 71,1 -60

30 43,2 8,3 21,4 -28,6 -53 -16

Примечание: отбор трансгрессий на основе морфологических маркеров; выделены положительные я отрицательные трансгрессии из поколения Тг №24 (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплица) х Ь. ЫгеиШт \аг, ¿[аЬгашт №66 (пленочная теплииа)).

Таблица 4

Параметры адаптивной способности и стабильности трансгрессий

Трансгрессия Среднее значение Общая адаптивная способность Специфическая адаптивная способность Стабильность Пластичность (Ы> Селекционная ценность генотипа

Высота растения, см

Рз№1 Мах 116,77 32,78 17,61 3,59 3,16 84,58

Р*№1 Мт 53,83 -30,15 11,08 6,18 0,92 2830

Р2№24 Мах 113,0 29,02 57,0 6,68 -0,22 55,10

Р;№24 Мт 5233 -31,65 2533 9,62 0,15 13,73

Количество листьев, шт

Р1№1 Мах 18,0 2,42 1,00 5,56 0,74 11,22

Р2№1 Мт 11,43 -4,15 0,56 6,56 0,66 6,34

Р}№24 Мах 20,10 4,52 8,68 14,66 2,46 0,12

Рг№24 Мт 12,80 -2,78 0,12 2,71 0,14 10,45

Сумма длин 1+2 настоящих листьев, см

Рг№1 Мах 41,60 7,82 8,68 7,08 1,41 25,48

р2№1 Мт 26,0 -7,78 17,44 16,06 1,82 3,16

Р?№24 Мах 41,67 7,88 7,58 6,61 034 26,60

Р2№24 Мт 25,87 -7,92 3,10 6,81 0,43 16,23

Количество кистей, шт

рг№1 Мах 5,67 137 0,33 10,19 0,91 3,75

Рг№1 Мт 2,50 -1,80 0,03 6,93 -0,01 1,92

Ь№24 Мах 6,10 1,80 1,03 16,64 1,79 2,73

Р2№24 Мт 2,93 -137 0,60 26,48 132 0,35

Количество цветков на 1 кисти, шт

Р2№1 Мах 11,70 3,52 1,17 9,25 1,87 6,26

Р}№1 Мт 4,53 -3,65 0,41 14,18 1,25 130

Рг№24 Мах 12,03 3,85 1,04 8,49 1,07 6,90

Ъ№24 Мт 4,47 -3,72 0,12 7,86 -0,19 2,70

Количество плодов, шт

Р2№1 Мах 30,17 I 11,03 265,58 54,02 1,79 6,12

Р2№1 Мт 4,70 -14,43 0,13 7,67 -0,04 4,17

Рг№24 Мах 37,67 18,53 38633 52,18 2,17 8,66

Р2№24 Мт 4,00 -15,13 0,75 21,65 0,08 2,72

Примечание: Р2№1 (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) х Ь. Ыгеишт уаг. ^аЬгаШго №66 (пленочная теплнца)); Р2 №24 (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплица) х Ь. Ыгзийип уаг. ^аЬгашт №66 (пленочная теплнца)).

2. Отбор сортов во признаку "продуктивность" для насыщения межвидовых трансгрессий

Доя проведения насыщающих скрещиваний с целью увеличения продуктивности (количества плодов на растении или массы одного плода) отобранных трансгрессивных форм, мы изучили крупноплодные и высокоурожайные сорта томата селекции ВНИИССОК, представленные в таблице 5. Для насыщающих скрещиваний по итогам исследований в течение 2003-2005 гг. были выделены крупноплодные сорта Дубрава и Грот.

Таблица 5

Подбор материала дня насыщения межвидовых трансгрессий, 2003-2005 гг.

Образец ПРОДУКТИВНОСТЬ

Кол-во плодов, шт/раст. Масса плодов, г/раст. Средняя масса 1 плода, г

Дубрава (контроль) 34,4±0,35 1802,1±72,9 57,8±1,19

Грот 33,(№0,83 1942,4±116,6 59,5±1,27

Патрис 35,5±0,84 1540,9±52,0 44,3 ±0,39

' Золушка 36,3 ±0,69 1638,4±67,7 45,3*1,32 ■

НСРМ 2,39 276,10 3,80

Таким образом, на основании трехлетних данных отобраны крупноплодные сорта селекции ВНИИССОК для насыщения межвидовых трансгрессий.

Были отобраны межвидовые трансгрессии по признаку "количество плодов1* и проведены насыщающие скрещивания выделенными сортами Дубрава и Грот по схеме, представленной в таблице 6. Была получена гибридная комбинация Г (трансгрессия №15.6 из поколения Р>№24 х Дубрава), в которой средняя масса плода на растении достигала 22,5 граммов; по другом комбинациям значение этого признака значительно ниже. Однако' почти во всех комбинациях были получены отдельные плоды, достигающие 25 граммов, что является значительным, так как они получены на основе скрещивания с Ьусоретасоп ЫгеиШт уаг, §1аЬгаШт №66, имеющего мелкие плоды.

Таблица 6

Оценка гибридов томата, полученных на основе(,-к ы таю щихкрещивани й, 2005 г.

Комбинация скрещивания Кол-во пледов, 1пт/рлст. Кол-во плодов в их общем количестве с массой более 20 г, ЦП Масса плодов, г/раст. Средняя масса 1 плода, г

Г1 (15.6 х Дубрава) 16 9 404,4 22,5

Г2 (15.6х Грот) 15 5 214,2 13,4

Г 3 (20.15 х Дубрава) 16 5 212,4 133

Г4 (20.15 х Грот) 10 2 121,2 12,1

Г 5 (18.1 х Дубрава) 6 1 67,5 113

Г б (18.1 х Грот) 13 4 186,3 143

Г 7(18.3 х Дубрава) 11 3 147,0 13,4

Г 8(18.3 х Грот) 12 3 158,5 13,2

Г 9 (13.15 х Дубрава) 10 3 84,5 8,5

Г 10(13.15 хГрот) б 1 73,4 12,2

Примечание: {№№15.6,20.15 -трансгрессии изР2№1); Р3 №24 (№№18.1,

18.3,13.15 - трансгрессии из ^ №24).

В результате й^шща.с¿^скрещивания были выделены 'о^чк (Г 1, Г

2, Г 3), которые могут быть использованы для дальнейшей селекционной работы

(табл. 6). Количество плодов массой более 20г говорит о том, что вероятность

прохождения процесса рекомбинации выше у перечисленных трансгрессий, так как

они более выровнены по массе плодов.

3. Идентификация генотипов полученных гибридов посредством нзофермеяткых маркеров При анализе элаарофоретических различий, особенно в потомстве межвидовых гибридов, обнаруживаются генотипы с новыми компонентами в бетогаомшеетре,нешбтодаемыминиу родительских ферт (Р1 или Р2), ни в Г). Выделяются особи, в спеюре которых отсутствуют полосы, характерные для обоих рошгелей и Р]. Таким обраюм, метод элегарофореза позволяет выявить реюэмбигаты с качественно новыми спектрами белков, которые нельзя спрогнозировать, так как их образование не является результатом простого комбинирования полос спектров Р1, Р2, ^ Не влияя на камественный состав белков, определяемых езруктуртыми

генами, модификаторы изменяют активность последних и тем самым количественные соотношения фракций. Учет этих соотношений, которые можно рассматривать как обычные количественные признаки, позволяет дать более полную характеристику генотипа. Индуцирование рекомбинаций за счст воздействия на гибридный материал и расширения спектра изменчивости потомства путем перераспределения обменов в те зоны генома, где кроосинговер в норме не происходит, имеет исключительное значение для селекции, Дтя семи из десяти изученных иэоферметньк систем был выявлен полиморфизм. Показаны четкие межлинейные различия, их зимограммы легко интерпретируются на основании данных литературы, характеризующих зги ферменты. Они удобны дтя генетического анализа (рис. 2). Из потомства Р; высокогетерозисных пйриоов Р| были отобраны трансгресаганые генотипы по нечаемым количественным признакам и потучены семена поколения р> Иэоферменшый анализ семян позволил установить генотип (гомо- и гетерозигота) отобранных трансгрессий Р* по семи тестируемым ферментным системам (табл. 7).

Лаь Pgm

■Т *

* *«*

¡■г:,}.--.' • >

I 3 4 5 6 7 3 1112 13 1516 18)9:02122 123 4 6 7 89 !0 П 12 14 15 16171819 202!2223

Рис 2. Оценка по лок^'са.и А^к-! (слева) и (справа) популяции Р? , по лученной при межвидовом скрещивании исходных линий томата:

А<1И-1 -АН - Радуга Молдовы (Москва, поле), Л?3 - Ь. Ыгеишт чат, е!аЬга1ит №66. ЛзЛЫ-Л -Р; №1 (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) х L ЫгзШит уаг. §1аЬгатт №66 (пленочная тепли иа)): ЛгЛ4/1-17 - №24 (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплица)) х Ь. Ыгеитит уаг. е!аЪга1ит №66 (пленочная теплица»; Ж\%!Н-22 - Рз №21 (Нистру №21 (поле, Москва) х I. ЫгеШит уаг. ц1аЬгач1т №66 (пленочная теплица));

Р^т-2 • ЛЫ-6 - ?! №1 (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) х 1.. Ыг$и1ит уаг, 5!аЬшит №66 (пленочная теплина). трансгрессия №18.14); 7-10- Р.5№1 (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) х Ь, Ыгкишт уаг. gtabпstum №66 (пленочная теплица), трансгрессия №18.15); ЛЬ.\?И-13 -р! №1 (Радуга Молдовы №29 (поле, Москва) \ Ь. Ыгзишт уаг. £|аЬга»ит №66 (пленочная теплица), трансгрессия №13.4); 16-20 - Рз№24 (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплииа)) х и Ыг5Шит уаг. £)аЬгатт №66 (пленочная теплица), трансгрессия №15.5): Ле№2/~23 - №24 (Радуга Молдовы №29 (остекленная теплица)) х I,. Ыгзишт чаг. 51аЬга1ит №66 (пленочная геплнца), транарессня №20.8),

Все проанализированные растения были сгруппированы в 7 классов гетерозиготности, где первый класс — гомозигота, а последний - гетерозигота по всем локусам. Далее по каждому классу рассчитывали средние величины количественных признаков. Для выяснения "вклада" каждого ферментного локуса или сцепленных с ними генов-модификаторов на величину количественного признака, все генотипы разделили на группы гомо- и гетерознгот по изозимам, В каждой группе определили средние величины по каждому количественному признаку (табл. 8). Сравнительный анализ средних величин количественного признака в группах трансгрессивных генотипов Рд томата, объединенных по каждому отдельно взятому ферментному локусу, выявил 17 случаев достоверных различий, причем в 16-и тестах значение признака в гетерозиготе было больше, чем в гомозиготе. При этом максимальное увеличение значения признака "масса плодов с растения" наблюдали при гетерозиготности по локусу воКЗ, Р^*2, 6-Рз<1 -1. Менее выраженные, но также значимые отличия получены по признакам; "высота растения", "количество плодов на растении" при гетерозиготности по локусам воЫ, Оог-З, А(Ш-1. Обнаруженные взаимосвязи не случайны, что подтверждается и литературными данными (Потокнна , Чесноков, 2005). Можно предположить, что локусы (1о1-3, Рвт-2. 6-Рв<Н расположены в 4 хромосоме {Левитес Е.М^ 1986), сцеплено наследуются с генетическим л о кусом (<?ГЬ), который при любых условиях привносит свой вклад в формирование продуктивности.

Таким образом, можно выделить для дальнейшего использования в селекции на получение продуктивных и адаптивных сортов в одном генотипе трансгрессию №20.8 по нескольким признакам, поскольку по большинству ферментных систем она гомозиготна по данному локусу (табл. 7). Перспективной является трансгрессия №18.15, но отбор трансгрессивных форм иа ее основе необходимо продолжить.

Таблица 7

Отбор исходных форм для характеристики селекционного материала томата

Адлельное состояние ферментных локусов Высота растения, см Количество листьев на растении, ШТ. Количество плодов на растении, шт. Продуктивность, г/растения

Генотип Pei Pgm2 Adh 6Pgd Mdh Gotl Got3

Fj№l 2 2 2 - 2 2 - 12V 163 19,5 87,0

F] №24 2 2 2 2 2 2 - 108,2 15,5 11,1 57,1

№18.14 2 1 1 2 2 2 2 162,0 20,0 9,0 86,0

Xsl 8.15 2 - 1 2 2 2 2. 172,0 19,0 41,0 114,0

№13.4 1 1 - 1 2 1 1 98,0 16,0 6,0 25,0

1615.5 2 t 1 2 1 2 1 106,0 15,0 7,0 32,0

ЛЙ0.8 I - 2 2 f 1 1 158,0 20,0 35,0 101,0

Примечание: ] - гомозигота по данному локусу, 2 - гетерозигота;

№№ 13.4, 18.14; 18.15 - трансгрессии, отобранные из популяции F2 Ш (Радуга Молдовы (Москва, поле) х L kirsutum var.glabratum №66 (пленочная теплица)); J&№15.5; 20.8 - трансгрессии, отобранные из популяции Fi №24 (Радуга Молдовы (остекленная теплица) х L hlrsutum var. glabratum Мбб (пленочная mewtutfa)). Проводился изоферментный анализ их потомства (семян и проростков Fj).

Таблица 8

Средняя величина количественного признаке у групп трансгрессивных генотипов Fi

Ферментный локуе Аллельно е состояние локуса Номер генотипа Высота растения Коли* честно листьев Количество плодоафас т. Продуктивно сть, r/раст.

Фосфоглю-гоиэомераза (Р») 1 13.4; 20.8 128,№30,0 18,0±2,0 20,5±14,5 63,0*38,0

2 Fi N»1; F,№24; 18.14; 18.1 S; 15.5 134,4± 13,8 17,2*0,99 17,5±6,2 75,2*14,1

Фосфогто- комутаэа <Pgm2) 1 18.14; 13.4; 15.5 122,0 ±20,0 17,0ttl,5 7,3*0,9 47,7± 1

2 Fi №1; Ft№24 116,1 ±7,9 15,9±0,4 15,3±4Д 72,1 ±15,0*

Алкоголвде-гиарогеяаэа (Adh) 1 18.14; 18,15; 15.5 146,7*20,5 * 18,0±1,5 19,Ott] 1,0 77,3±24,1

2 F,№1; Fi№24; 20.8 130,0 ±14,7 17,3*1,4 21,ft*7.0 81,7*12,9

б-Фосфо-глюконатде-гидрогеназа (6Pgd) 1 13.4 98,0 16,0 6.0 25,0

2 Ft№24; 18.14; 18.15; 15.5; 20.8 141,2*14,1 * 17,9*1,1 20,6±7,2 78,0±14,9 *

Малатде- гядрогенаэа <Mdh) ■ . 1 15.5; 20.8 132,0*26,0 17,5±+2,5 21,0*14,0 66,5*34,5

2 Fi №1; F,№24; 18.14; 18.15; 13.4 132,8±14,6* 17,4±0,9 17,3*6,3 73,8± 15,2

Глутамат-оксалотравс-амнназа 1 (Göll) 1 13.4; 20.8 128.0±30,0 18,C±2,0 20,5*14,5 63,0*38,0

2 Fi №1; Fi№24; 18.14; 18.15; 15.5 134,4*13,7 I7,2±0,99 17,5±6,2 75,2±14,1

глутаматок-салотранс-амнназа 3 (Gol3) 1 13.4; 15.5; 20.8 120,7*18,8 17,0±!,5 16,0±9,5 52,7*24,3

2 18.14:18.15 167,0*5,0 * 19,5±0,5 25,0± 16,0 100,№±14,0 •

Примечание: 1 - гомозигота по данному локусу, 2 - гетерозигота; *- среднее значение признака гомозигот значимо отличается от гетерозигот при Г < 0,05. f&M 13.4, 18.14; 18.15 - трансгрессии, отобранные из популяции F3 Ml (Радуга Молдовы (Москва, пом) х L htrsutum var.glabratum Мбб (пленочная теплица)); ММ 15,5; 20.8 - трансгрессии, отобранные из популяции Fi №24 (Радуга Моядовы (.остекленная теплица} х L. hlrsulum vor. glabratum М/66 (пленочная теплица)).

за

4. Идентификация генотипов полученных гибридов с использованием молекулярных маркеров

Применение методов молекулярно-генешчесюэго маркирования (RAFT), RFLP) пошалило сделзть генетическую карту томата сшной из самых насыщенных карт. Насыщенность любой генетической кртл зависит от полиморфизма между родительскими формами, которые используются для ее создания. Генетические карты томата основаны, главным образом, на межвидовых гибридах, так как внутривидовой полиморфизм L. esculentum не достаточен для этих целей. Наибольший полиморфизм генома томата бьт выявлен с помощью RAPD-технатогии. Была проведена идентификация линий, полученных гибридов и отобранных трансгрессий С использованием метода по определению полимсрфшма донн рестрикцноннБК фрагментов амплификации ДНК с праймерами (RAPD), основанного iti гюлимеразнсй цепной реакции (PCR). Растения были проанализированы по 4 преймерам (CPA 8, CPA 10, OFN 1, ОЙЧ 13). Ш праймерах OPA 8, OPA 10 был выявлен полиморфизм, электрофореграммы с использованием других маркеров показывали мономорфтость материала. Был проведет кластерный анализ, рассчитаны генетические расстояния по Ней и Ли (1976), ш результатам которых построены дендрограммы по праймером ОРА8 и OPA 1 Ov наглядно отражающие степень различий между КАЮспегарами. Использование RAPOPCRc праймером OPAS позволило кдеетнфицировагь межввдовой гибрид Fi, полученный при (жрешивании ввдов L. eaculentum (Радуга Молдовы) и I* hirsutum. Применение праймера ОРА10 не всегда позволяло проводил, четкую идентификацию гибрида, а праймеры - QPN1 и QPN13 - не выявляли полиморфизма. Это было связано с Tai, что некоторые праймеры не выявляли гатешческий метами ЬЬквиштвКАРО-профитяхРь а иногда их применение приводило к появлению фрагментов, не выявлявшихся ни у дикой формы, ни у Радуги Молдовы. Поденный результат, вероятно связан с гетерогенносгыо L. husutum, поэтому в ходе эвотюцга! происходи-намплего»; генегаческих изменений.

Дня изучения иаслешуемосш некоторых полиморфных ИАИ>фрашенгов (ОРА8#800, ОРА8#900, OPA 1Ш400,ОРА10Й450) (Pite. 3223, 322.4) были исследованы родительские форма пйрнды Fi, Fi и популяции F> Фрагмент OPAS#SOO присутствовал во всех обретдас родителей, F], bFi расщепление по налнчию данного фрагмента достоверно не отличалось от соотношения 3:1 (х1 = 1,07; 0,25<Р<(,5). Фрагмент ОРА8#900 присутствовал во всех образцах

аз

гибриде® Г,; в Из - 3:1 = 1,03; 0,25<Р<0,5). Фрагмент ОРАЮМОО присутствовал во всех образадкйщуги Молдовы и тбрцдав Рь

Фрагмент ОРА10#450 присутствовал у образцов Ь. Мтэишт, в популяции Рэ, (№¡13,4). Таким образом, г^овеаенные исследования показали, что фрагменты ОРА8#800; 900 являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менаеля.

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3435 36 37 38 3940 41

Рис.3. Оценка исходных линий и потомков томата по прайм еру ОРА8

Примечание: №№1 - маркер молекулярных масс, №№2-3 - Радуга Молдовы (Москва, поле); №№4-7 - L. hirsutum var. glabratum №66, №№8-12 - F( №1 (Радуга Молдовы (Москва, поле) х L, hirsuium var.glabrawm №66 (пленочная теплица)); №№13-17 - Fj №1; №№18-25 -отобранные трансгрессии Fj №1 (№13.4); №№26-32 - Fj №1 (№18.14); №№33-40 - F} №1 (№18.15); 41 - контроль (HiO).

Характеристика родительских форм и потомков свидетельствует о том, что в качестве маркеров могут быть использованы фрагменты OPA8#800 и 900, которые являются доминантными и наследуются по законам Менделя.

выводы

1. Наибольшая частота отбора положительных трансгрессивных форм возможна в гибридных популяциях, полученных от арешивания родительских гар, выращенных га семян межвидовых гибридов с резкими зкспоготгеиегическими различиями. Малые эколого-генетические их различия ведут к большему формированию отрицательных трансгрессий в поколении Fj. Выделен целый реи положительных трансгрессий по наиболее информативным признакам (высота растений, количество листьев, количество плодов и продуктивность) для проведения генетического анализа с целью ускорения процесса селекини.

2. С целью интенсификации селекционного процесса подготовлен селекционный материал для изучения взаимодействия генотиткреда с помощью изофермекгньк и молекулярных маркеров,

3. Ферментные системы, определенные на основе иэофермееттного анализа (Got-3, Pgm-2, 6-pgd-l, Got-1, Adh-U выявляют достоверную разницу количественного признала. Максимальное значение признака "прсеукшвности" наблюдается при гетерсаиготност по лскусу Got-3, Pgm-2, 6-pgd-l, которые расположены в 4 хромосоме. Локусы Got-3, Pgm-2, б-Pgd-1 сцеплено наследуются с генетическим локусом (QTL), который при любых условиях Ipи№Ccигcюйвкmвфop^шpoвaниeпpшшкaпpoayктивжcгI^.

4. RAPD-анализ ДНК резных генотипов томата позволяет обнаружить полиморфные RATO-фрагменты, определить наследуемость полиморфных RAPD-фратеягов (ОРА8ЩХ1, ОРА8#ЕЮО, ОРА8#450, OPA 1 (#400, OPA 3 0¡W50)l Фрагмент ОРА8Я450 присутстеошл только в RAP&cneKipax образцов с минимальным значением признака. Подготовлен материал для анализа генетических дистанций с целыо его использования при построении генетических карг.

5. Продуктивность среды защищенного грунта в Московской области по среднему значению всех генотипов за исследуемые годы значительно меняется по годам от иизмогродукгивной (Москва, закр^ гр.,2004) до вьгсокопродукгивной (Москва, закр, грц 2003).

6. Взаимодействие генотп-среда по-разному отражается на выродоенности количественных признаков, Аюлтсз полиморфизма гибридных популяций наиболее затруд нен в условиях среды защищенного трута по признакам: "количество листьев" и "сумма длин

перпого и второго настоящих листьев", для которых фон три года из трех - был стабилизирующий.

7. Г1фаметры типичности среды изменчивы незначительно, что позволяет сократить длительность испытания на заключительных этапах селекции до двух лет.

1. Для ускорения селекции на продуктивность применять анализ исходных форм томата с помощью юоферментного метода при оцегеж линий на проявление фенологических особенностей, используемых селекционером; проводить идентификашво сортов и гибридов томата. ■

2. Дм обоснованного подбора родительских пар при скрещиваниях применять информативный метол по определению полиморфизма длин фрагментов амплификации ДНК спраймерами{КАРО).

3. Для создания перспективных сортов, сочетающих устойчивость к абиотическим факторам среды с продуктивностью использовать в качестве исходного материала отобранные, на основе скрещиваний с датой формой томата,трансгрессии.

1). Антошкин АА, Шумейко Т.С Особенности идентификации некоторых количественных признаков у томата //Докл. ТСХА. - Выл.277. - М: МСХА, 20CW. - С.436-440.

2). Антошкин АА, Шумейко Т.С, Попитов ДВ. Июферментный анаши некоторых количественных признаковтомата // Межа. симпозиум; Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства овоииых культур,- М, 2005,- Т-2. - G389-396.

3). Антошкин АА, Науменко Т.С Характеристика линий и гибридов томата на основе молекулярных форм ферментов // Межд. науч. пракг. конф,: Приоритетные направления генетики, селекции и биотехнологии семейства пасленовых.- Харьков, 2005 (находится в печати).

Рекомендации

Список пуйпнкяций по лнееотгга ни н

Тнпография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 тел.: 937-86-64,156-40-84 Подписано в печать 23.11.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 Бумага «Снегурочка» 1,5 печл. Заказ № П 844