Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ БИОРЕГУЛЯЦИИ КОНИДИОГЕНЕЗА В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭЛИТНОГО ИНФЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА СПОРЫНЬИ (CLAVICEPS PURPUREA (FR.) TUL.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ БИОРЕГУЛЯЦИИ КОНИДИОГЕНЕЗА В УСЛОВИЯХ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭЛИТНОГО ИНФЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА СПОРЫНЬИ (CLAVICEPS PURPUREA (FR.) TUL.)"



На правах рукописи

Савин Павел Сергеевич

Особенности биорегуляции конндиогенеза в условиях глубинного культивирования элитного инфекционного материала спорыньи (Claviceps purpurea (Fr.) Tul.)

03.00.23- Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

МОСКВА 2007.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР)

РАСХН

Научный руководитель:

доктор биолошческих наук, профессор

Шшш С, С.

Официальные оппоненты:

доктор биолошческих наук, профессор

Никитина 3. К. Краснопольская Л. М.

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Институт

«Прикладной биохимии и машиностроения» (ОАО «Биохиммаш»).

Защита состоится «14 2007 г. в « /Р » часов на заседании

диссертационного совета Д006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан « 12 » битлелА- 2007 г.

Ученый секретарь

АИ. Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Осуществление целенаправленной биорегуляции продукционного процесса с использованием двух биологических систем: растения и культуры гриба, является уникальным этапом во всей производственной схеме получения лекарственных препаратов на основе эргоалкалоидов.

В настоящее время ВИЛАР является единственным в России и странах СНГ учреждением, обладающим комплексной технологией от создания селекционных штаммов спорыньи Clavjceps purpurea (Fr) Tul до промышленного производства лекарственных препаратов.

В коллекции ВИЛАР имеются штаммы эрготамшювого (BKMF-2641Д}, эрготоксинового (ВКМР-2450Д), эргокриптинового (BKMF-3602Д) и эргокристинового (ВКМР-3401Д) типов. На основе всех перечисленных штаммов созданы ценные лекарственные препараты, находящие широкое применение в разных областях медицины.

Традиционное получение элитного инфекционного материала селекционных штаммов поверхностным способом на твердой питательной среде является трудоемким и длительным элементом во всей технологической схеме производства сырья спорыньи. Его продолжительность составляет около шести месяцев.

Для получения инфекционного материала необходимо разработать новые технологии, позволяющие ускорить и технологически усовершенствовать этот процесс, обеспечивающие сохранение конидиообразутощих способностей мицелия. Одним из такта современных технологических разработок является способ глубинного культивирования.

Мицелиальная культура спорыньи является сложной биологической системой двух взаимозависимых процессов: роста мицелия и конидногенеза. Непременным условием проводимых исследований является повышение продуктивности репродуктивных процессов мицелия, выращиваемого в контролируемых условиях, так как источником инфицирования растений ржи служит суспензия конидий.

Представленная работа является частью исследований, связанных с решением данной проблемы.

Особая актуальность проводимых исследований очевидна в отношении селекционного штамма эргокриптинового типа, который является основой получения

имени К.А. Тимирязева ЦНБ ичени Н.И. Железном ^t>oniL научнь$ ддтеоат^рн

№

Абергин нейрогормонального действия. Продуктивность конидиогенеза этого штамма существенно уступает штаммам других типов : зргот&чиновому, эр го крл стиновому и эрготокснновому

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является разработка способа получения инфекционного материала эргокрилтинового штамма методом глубинного культивирования в виде мицелиально растущей культуры гриба спорыньи с высоким потенциалом конидиогенеза.

Поставленная цель достигается решением следующих задач:

- изучить кинетику роста и конидиогенеза мицелиально растущей культуры гриба спорыньи;

- изучить действие на рост мицелия и процесс конидиогенеза объема и возраста инокулята, рН питательной среды, минерального состава и углеводной составляющей питательной среды;

- исследовать действие на процесс конидиогенеза и рост мицелия экзогенных фиторегуляторов;

- изучить кинетику поглощения углеводного компонента питательной среды и скорости потребления кислорода культурой в процессе роста;

- отработать условия культивирования мицелия и конидиоспор гриба в лабораторном ферментаторе;

- проверить в полевых условиях жизнеспособность конидиоспор гриба, выращенных в условиях глубинного культивирования;

-разработать инструкцию по получению инфекционного материала гриба спорыньи при глубинном способе выращивания.

Научная новизна. Впервые предлагается глубинный способ получения элитного инфекционного материала (ВКМР-3602Д) эргокриптиновой спорыньи для инфицирования посевов ржи.

Впервые изучена сопряженность роста мицелия и конидиогенеза при глубинном культивировании инфекционного материала эргокриптинового штамма спорыньи.

Изучено влияние ряда технологических показателей (объем н возраст инокулюма, рН питательной среды, коэффициент массопсредачи) на рост и конидиогенез мицелия гриба спорыньи эргокрилтинового штамма.

Впервые показана существенная зависимость конидиогенеза и роста от экзогенного гормонального фактора на культуре

промышленного штамма гриба спорыньи, выращиваемой в условиях глубинного культивирования.

Показана возможность получения инфекционного материала промышленного штамма гриба спорыньи в ферментаторах.

Научно-практическая значимость. На основании проведенных исследований разработана «Инструкция по получению элитного инфекционного материала спорыньи глубинным способом в колбах на качалке» (И-04868244-005-2006). Полученный материал служит основой для составления регламента на получение суспензии конидиоспор из мицелия гриба спорыньи, выращенного глубинным способом.

Разработанная технология позволяет усовершенствовать и ускорить процесс получения элитного инфекционного материала спорыньи для инфицирования посевов ржи спорыньей с использованием промышленных ферментаторов.

Инфекционный материал, полученный глубинным способом, обладает такой же активностью по инфицированию посевов ржи, как инфекционный материал, полученный традиционным поверхностным способом.

Связь темы диссертации с планом научных исследований.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2003-2006 гг.»

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на 3-й Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (г.Москва, 2005 г), на VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва - Пущино, 2005 г), на юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию ВИЛАР (г.Москва, 2006 г.)

Работа выполнена в лаборатории отдела биотехнологии ГУ ВИЛАР.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, освещающих основное содержание работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе изучения биологических особенностей сапрофитной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма, разработаны условия глубинного культивирования, обеспечивающие высокий уровень конидиогенеза с менее интенсивными темпами нарастания мицелия, что является важным при производственном получении инфекционного материала.

2. Установлены параметры экзогенной биорегуляции конидиогенеза сапрофитного штамма Claviceps purpurea (Fr) Tul в условиях глубинного культивирования. Оптимизирован состав питательной среды, позволяющий увеличить продуктивность конидиогенеза в 12 раз, сократить цикл максимальной репродукции мицелия до 10 суток.

3. Предложена технология получения инфекционного материала спорыньи эргокриптинового штамма, не уступающего по своим характеристикам инфекционному материалу, полученному традиционным способом, с сокращением времени цикла производства в 3 раза.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 21 таблиц, 27 рисунков. Работа состоит из введения, обзора данных литературы, 6 глав экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 106 наименований, из которых 50 на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты, материалы и методы исследований.

Экспериментальная часть работы выполнена путем постановки лабораторных и полевых опытов в отделе биотехнологии ВИЛАР в 2004-2006 годах. Объектом исследования служила мицелиальная форма гриба спорыньи, полученная из склероциев селекционного эргокриптинового штамма ВКМР-3602Д.

Для проведения исследования были использованы склероиии спорыньи с известным содержанием целевых алкалоидов (а и р изомеров эргокриптина не менее 0,7%). Из половинок склероциев

б

получали мицелиальную культуру в пробирках, на поверхности агаризованной питательной среды, в состав которой входили сахароза 10%, КН2Р04250 мг/л, Ре504-7Н20 20 мг/л, М^504 ■ 7 Н20 250 мг/л., 2п804-7Н20 15 мг/л, КС1 125 мг/л, Са(Ш3)2 1000 мг/л, аспарагин 10000 мг/л, дрожжевой экстракт 100 мг/л, триптофан 1000 мг/л, агар 18%.

Для постановки опытов в условиях глубинного культивирования применяли жидкие питательные среды - Тс следующего состава: сахароза 10%, КН2Р04500 мг/л., Ре804-7Н20 7 мг /л, 1^804 -7 Н20 500 мг/л, гл804-7Н20 6 мг/л, КС1 125 мг/л, Са(К03)2 500 мг/л, дрожжевой экстракт 100 мг/л, лимонная кислота 10000 мг/л; - Пс1 следующего состава: сахароза 4%, КН2Р04 500 мг/л, Ре504'7Н20 7 мг/л, -7 Н20 500 мг/л, 7л&0А-т20 6 мг/л, КС1

125 мг/л, Са(КОз)2 500 мг/л, лимонная кислота 10000 мг/л, МН^ЧСЬ 1000 мг/л. Питательные среды, приведенных составов, использовались ранее в исследовательских работах с сапрофитной культурой спорыньи эрготаминового штамма.

Для получения суспензионной культуры конидиоспоры, выращенные на агаризованной среде, высаживали на жидкую питательную среду , рН которой доводили аммиаком до 5,2.

Посадку проводили в боксе-ламинаре. В каждую колбу с жидкой средой порционно добавляли по 1мл инокулюма при помощи стерильной пипетки.

После посадки, колбы помещали в термостатическое помещение с постоянной температурой 26 °С на подвесную качалку с эллиптической траекторией качания, совершающей 98-100 об/мин.

Морфофизиологнческие исследования.

Для оценки скорости роста мицелия учитывали сухую массу в г/л питательной среды. Конидиогенез регистрировали методом микроскопии по числу конидий в мл. Подсчет конидий проводили при помощи камеры Горяева.

Для полной характеристики физиологического состояния культуры были использованы следующие показатели: абсолютная скорость роста /поглощения питательных веществ/,

логарифмическая скорость роста, продуктивность мицелия, дыхательная активность ( Лебедев С.И., 1988г. Перт СДж., 1978г.). Определение скорости потребления кислорода проводили

полярографическим методом (Полярографическое определение кислорода в биологических объектах, 1974.).

Биохимические исследования.

Определение содержания сахарозы в питательном субстрате проводили фенольным методом (Плешков Б.П., 1976г.),

Для качественной характеристики испытуемого объекта на присутствие и содержание производных индола применяли химический экспресс-метод анализа с реактивом ван-Урка (Волошина Д.А., и др. 1985г.; Комарова E.JL, Шаин С.С., 1998г.; Комарова EJI., Толкачев О.Н., 2001г.; Химический анализ лекарственных растений, М. Высшая школа 1983г.).

Масштабирование процесса.

Культивирование инфекционного материала спорыньи проводили в лабораторном ферментаторе АК -210, с рабочим объемом заполнения - 7,0л.

Определение массообмеиных характеристик культивационных сосудов (колб, лабораторного ферментатора) проводили по методу статической дегазации (Васильев H.H. и др., 1975 г.).

Планирование экспериментов и методы статистической обработки данных.

Планирование экспериментов осуществляли с использованием методов постановки факторных экспериментов (Доспехов Б.А., 1979г.). При статистическом анализе опытов использовали дисперсионный, регрессионный и корреляционный методы оценки (определяли средние значения, стандартные отклонения, ошибки средних, критерии Стьюдента, Фишера, коэффициенты регрессии и корреляции).

Использование математической модели обратимого равновесного автокаталитического роста (Васильев H.H. и др., 1975 г.) позволило определить запас субстрата в питательной среде, а также коэффициенты: метаболизма вещества, полезного использования питательного субстрата, массопередачи по кислороду.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Получение мицелиальной формы гриба спорыньи эргокриптпнового штамма и изучение морфофнзнологических показателей ее роста и интенсивности конидиогенеза.

Технологическая схема традиционного способа получения инфекционного материала гриба спорыньи включает в себя б этапов,

s

начинающихся от отбора исходных склероциев, и заканчивающихся получением водной суспензии конидий гриба. Этот способ длительный и трудоемкий.

В задачу наших исследований входило существенное сокращение этапов этой технологической схемы, завершающейся масштабированием инфекционного материала в колбах на качалке и его выращиванием в ферментаторе.

Следует отметить, что сам мицелий не является источником инфицирования растения. Его можно рассматривать как отработанный субстрат, лишь затрудняющий процесс отделения конидий. Поэтому, непременным условием проводимых исследований должно являться повышение продуктивности репродуктивных процессов мицелия, выращиваемого в глубинных условиях.

Первым и основным этапом получения инфекционного материала в искусственных условиях культивирования является-получение мнцелиальнон формы гриба спорыньи на твердом питательном субстрате.

Мицелий, образовывался вокруг высаженного на твердый агар кусочка склероция. Полученный мицелий использован» для дальнейших субкультиваций.

Визуально активный рост мицелия отмечали на 5-7 сутки культивирования. Микроскопическим анализом было установлено, что мицелий представлял собой рыхлую структуру и состоял из тонких, сплетенных гиф, белого цвета. В последующие сутки роста мицелий гриба обрастал не только с поверхности твердый субстрат, но проникал внутрь его и уплотнялся. С уплотнением мицелия цвет его изменялся от белого до сероватого, иногда с фиолетовым пигментом, диффундирующим в питательную среду. На 25 -30 сутки роста на поверхности мицелия появлялись гифы с конидиями. Таким образом, цикл развития культуры от роста мицелия до конидиогенеза на твердой питательной среде длился в среднем 30 суток.

Полученная культура в дальнейшем сохранялась методом периодических пересевов каждые 30 суток. При таком режиме сохранения штамма образовывался мощный мицелий с полноценными зрелыми кон и дням и.

Вторым этапом разрабатываемой новой технологии являлся перевод мицелиальной формы гриба спорыньи, выращенной на агаре,

в условия глубинного культивирования. Для этого отмытые конидиоспоры гриба с косяка агара переносили в жидкий питательный субстрат. Глубинное культивирование гриба спорыньи проводили на питательной среде Пс1 в колбах объемом 500мл на подвесной качалке. О наличии роста мицелия свидетельствовало увеличение его биомассы за определенный срок культивирования.

Кривая роста мицелия гриба спорыньи представлена на рис. 1.

На этом рисунке видно, что развитие мицелиальной формы гриба спорыньи на жидкой питательной среде представляет собой 3-образную кривую, которую можно разделить на несколько участков. Анализ полученных результатов показал, что между инокуляцией и началом роста мицелия отмечался заметный лаг-период. Активный рост культуры начинался на 3 сутки и достигал своего максимального значения по массе на 15 сутки культивирования. В последующие сутки ростовые процессы приостанавливались, и после 16 суток масса мицелия снижалась.

1 -начальный период, 2-период регулярного роста, 3- период равновесия, 4- период дегенерации. Рис.1. Кинетика роста мицелия гриба спорыньи эргокриптинового штамма в условиях глубинного культивирования.

Более детальный анализ выделенного периода регулярного роста с использованием величины логарифмической скорости роста показал, что график зависимости логарифмической скорости роста от времени представлял собой прямую линию и имел обратно-

пропорциональную зависимость. Корреляционный анализ экспериментальных данных позволил установить высокую зависимость двух изучаемых показателей. Коэффициент корреляции составлял 0,92.

2, Оптимизация условий выращивания мицелнальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокрнптннового штамма.

Учитывая полученные данные, можно предположить, что отсутствие конидиогенеза связано с дефицитом компонентов питательной среды. Для уточнения этого предположения было решено апробировать среду Тс, содержащую большее количество питательных элементов.

На фоне более богатой питательной среды значительно активизировались рост мицелия гриба спорыньи и процесс конидиогенеза. Нарастание биомассы возросло до 19 г/л сухой массы, в то время как на среде Пс1 этот показатель не превышал 11 г/л сухой массы. Однако на среде Тс значительно была увеличена длительность цикла выращивания гриба (рис.2).

Рис, 2, Кинетика роста мицелия гриба спорыньи в условиях глубинного культивирования на среде Тс.

При таких условиях культивирования конидиогенез наступал на 16 сутки, а максимум продуктивности мицелия по конидиям регистрировали на 29 сутки роста. Следует отметить, что эта среда обеспечивала процесс развития культуры до конидиогенеза, но при

этом репродуктивные и ростовые процессы были не достаточно синхронизированы.

Продуктивность паразитарной спорыньи по конидиям в естественных условиях распространения достаточно высокая. Анализ проб медвяной росы, взятых в природных условиях, показали, что концентрация конидий достигала 4,11 -10е шт/г. В условиях искусственного культивирования, как показывают результаты проведенных опытов, этот показатель был значительно ниже.

В искусственных условиях выращивания культуры гриба спорыньи стимулами инициирования и оптимизации процесса конидиогенеза, могут служить такие факторы, как некоторые компоненты питательного субстрата, биологически активные вещества гормонального действия, а также рН питательной среды , объем и возраст инокулюма.

При изучении влияния объема и плотности инокулята было определено, что посадка суспензионной культуры триба спорыньи должна проводиться суспензией конидий объемом в 1 мл с плотностью не менее (20-30)-105 шт/мл. ( Рис. 3.)

Рис. 3 Влияние плотности инокулюма на конидиогенез и рост мииелиальной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма.

При изучении влияния начального значения рН было установлено, что рост культуры возможен в диапазоне начальных

Плотность «мокулюма, 10* шт/мл

¡ЕШ Масса мицелия сухая, г/л. ■ м ■ Конидии, шт^мл.)

значений рН 4,0-7,0. При этом наблюдалось стабильное нарастание мицелия, которое достигало по сухой массе 19,75 г/л. Конидиогенез сопутствовал росту гриба на всех изучаемых значениях рН. Оптимальным для конидиогенеза и роста мицелия гриба спорыньи является значение рН в пределах от 5.0 до 6,0. Полученные экспериментальные данные показали, что изменением значения величины рН питательной среды можно оказывать существенное влияние на процесс конидиогенеза. (Рис.4).

25!

. 20 +

Я I ' | 15 "

I 1 10 +

I § I к <*

М

о -

|емз Масса мицелия сухая. г/л, - > -Конидии, шт/ьч^ |

Рис. 4. Влияние рН питательного субстрата на конидиогенез и рост мицелиальной формы гриба спорыньи эргокриптинового штамма.

Для роста и развития спорыньи, как и для большинства микроорганизмов, требуется источник азота. В условиях искусственного культивирования в качестве источника азота в состав питательной среды вводили дрожжевой экстракт (среда Тс), являющийся комплексным нестандартным по составу веществом. В результате проведенных исследований было установлено, что при замене дрожжевого экстракта на минеральный азот в форме Т4Н4МОз, в концентрации 1000 мг/л, существенных различий по накоплению биомассы, а так же по уровню конидиогенеза не наблюдалось. Образование конидий фиксировали на 16 сутки роста, а к 20 суткам конидиогенез достигал своего максимального значения 3,0*105 шт/мл.

72 ъ !

рН с рады

Увеличение дозы азота в 5 раз угнетало рост мицелия и конидиогенез.

Можно предположить значимую роль в процессах роста мицелия и конидиогенеза углеводного компонента питательного субстрата (табл.2).

Таблица 2.

Влияние концентрации сахарозы на конидиогенез и рост мицелиальной формы гриба спорыньи эргокриптинового штамма.

Возраст мицелия, сутки. Показатели Концентрация сахарозы, %

2 4 6 10 (контроль)

16 Масса мицелия сухая, г/л 7,09±0,38 10,15±0,67 12,75*0,33 14.05±0.74

Конидии, шт/мл-к»4 нет нет 1,58±0,07б 0,084±0,ОД5

21 Масса мицелия сухая, гУл 6,14*0,86 9,15±0,70 11,69*1,23 15.67±0.7б

Конидии, шт/мл *106 нет Единичные конидии 3,18±0,069 0,19±0,004

26 Масса мицелия сухая, г/л 5,09±0,68 8,02±0,49 11,02±5,10 17.61 ±0.83

Конидии, шт/мл -106 нет Единичные конидии 4,03±0,13 0,28±0,03

Рассматривая влияние количества углевода в питательном субстрате на рост мицелия гриба, было отмечено, что низкие концентрации углевода неактивно стимулировали рост мицелия. К 16 суткам масса мицелия составляла всего одну треть от нарастания мицелия на полной питательной среде Тс. Повышение концентрации сахарозы в питательной среде до 6% существенно стимулировало ростовые процессы мицелия и приводило к началу процесса конидиогенеза.

Если сравнивать полученные результаты с ростом на среде с 10% содержанием сахарозы, то рост мицелия на обогащенной среде не

останавливался и на 30 сутки. Снижение содержания сахарозы до 6 % сокращало цикл выращивания культуры до 21 суток. Конидиогенез на обоих средах регистрировали на 16 сутки культивирования и он продолжался в течении 10 -12 суток. Однако на среде с 6% сахарозой продуктивность конидий на 21 сутки роста соответствовала 2,72-Ю8 шт/г, что на порядок выше продуктивности конидий на среде Тс. При этом следует отметить и синхронизацию ростовых и репродуктивных процессов во времени.

Представлялось целесообразным исследовать влияние экзогенных фиторегуляторов гормонального действия и ретардантов на развитие и продуктивность суспензионного мицелия эргокриптинового штамма спорыньи.

В схему опытов были включены четыре группы биологически активных веществ - фиторегуляторов и ингибиторов роста:

- регуляторы роста цитокининовой природы - кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП);

-регуляторы роста ауксиновой природы -индолилуксусная кислота (ИУК), Ь - нафтилуксусная кислота (НУК); -гиббереллин - ГК;

- ингибиторы роста -хлорхолинхлорид (ССС), 2-хлорэтилфосфоновая кислота (2-ХЭФК).

Экспериментально было установлено, что введение в питательный субстрат регуляторов роста ауксиновой группы значительно стимулировало процессы нарастания биомассы и конидиообразования. Малые концентрации фиторегуляторов оказывали наилучшее влияние па процессы конидиогенеза, чем более высокие концентрации.

Действие ауксина ИУК на рост и конидиогенез мицелия спорыньи было аналогично действию цитокинина - кинетина, с той лишь разницей, что максимум продуктивности конидий на среде с кинетином соответствовал 12 суткам роста, а с ИУК - 16 суткам роста.

Ростовые показатели культуры во всех вариантах опытов были невысокие. Если же сравнивать влияние ГК с действием выделенных оптимальных доз изучаемых «итокининов и ауксинов, то уровень прироста мицелия от воздействия ГК был практически в два раза ниже. Однако продуктивность конидий увеличивалась до 4,3-10 -5,4 '109 шт/г, что на порядок выше, чем при использовании других фиторегуляторов, а так же даже выше, чем концентрация конидий в

природных условиях в каплях медвяной росы на колосьях ржи, По-сравнению с контрольным вариантом (без фиторегуляторов) продуктивность конодногенеза, в зависимости от концентрации фиторегулятора, возрастала в среднем в 12-15 раз, а удельная продуктивность - в 30 раз. (рис. 5).

10 17 22

Возраогткам* сутки

нам Число «он>щ|лй, 10, ил/мл (ГК) С22ЕЗ Число кошщий, 10 цл*мп (контроль) —•— Масса иицалия. г/л (ГК) ■ - Масса иицетя, г/л (нентрогъ)

Рис. 5 Влияние ГК на процесс конидиогенеза и рост мицелия гриба спорыньи Claviceps purpurea.

Невысокий уровень массы мицелия с высоким выходом конидий представляет собой более технологичный вариант, так как процесс отделения мицелия от конидий в общей технологической схеме производства инфекционного материала является самым трудоемким процессом. Варьируя концентрацией ГК от 0,1 до 0,5 мг/л. , можно влиять на сокращение времени индуцирования мицелиальной продуктивности гриба по конидиям до 10 суток. Сокращение цикла выращивания позволяет повысить продуктивность процесса в расчете на конечный продукт и существенно снизить вероятность инфицирования мицелиальной массы, опасность которого весьма высока при выращивании культуры гриба спорыньи в ферментаторах.

Таким образом, поэтапная оптимизация состава питательной среды с использованием экзогенных фиторегуляторов позволила

ускорить наступление процесса конидиогенеза и достигнуть его максимальных показателей в мицелиальной суспензионной культуре гриба спорыньи эргокриптинового штамма.

После изучения действия стимуляторов роста па нарастание мицелия и на конидиогенез гриба спорыньи представлялось целесообразным рассмотреть влияние на эти процессы ингибиторов роста, а именно ССС и 2-ХЭФК.

Можно отметить, что в вариантах с изучаемыми концентрациями ССС и 2-ХЭФК наблюдалось подавление роста мицелия гриба. Микроскопический анализ показал, что на протяжении всего опыта конидиогенез под воздействием обоих ингибиторов роста не наступал.

На фоне торможения ростовых процессов и ингибирования процесса конидиогенеза было установлено, что ретарданты оказывали влияние на процессы метаболизма гриба. Методом ТСХ удалось зарегистрировать присутствие в культуральной жидкости триптофана.

3. Изучение зависимости процессов конидиогенеза и роста мицелиальнои суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма в оптимизированных условиях культивирования.

В результате ранее проведенных опытов в качестве оптимальных были определены следующие условия культивирования:

- инокулюм равный 1мл, представляющий собой суспензию конидий плотностью (20-30)'103шт/мл;

- значение рН не менее 5,0 и не более 6,0;

- введение в состав питательной среды минерального азота в форме N^N04 в количестве 1000 мг/л.;

- концентрация сахарозы 6%;

- фиторегулятор ГК 0,1 мг/л.

На этом этапе мы сочли необходимым определить кинетику нарастания мицелия и конидиогенеза в новых условиях и сравнить их с соответствующими показателями полученными ранее при культивировании культуры на среде Пс (рис. 6). Приведенные данные свидетельствуют о том, что кинетика роста мицелия практически не отличалась от кинетики роста на среде Пс1, результаты которой были приведены на рис.1. Однако в данном случае в онтогенезе культуры

актнвно шел процесс вегетативного размножения путем образования конидий.

' i* 4

I" i-

a f * ti t* ч м

Tiifatt мм^п". nritT*

Рис 6. Кинетика конидиогенеза и роста мицелия Claviceps purpurea эргокриптянового штамма в оптимизированных условиях глубинного культивирования.

Можно видеть, что на фоне оптимизированной питательной среды образование конидий соответствовало периоду регулярного роста культуры. Интенсивность конидиогенеза возрастала параллельно с интенсивностью роста мицелия. Максимальный уровень накопления конидий происходил на 5 суток раньше формирования наибольшей массы мицелия, при снижении его абсолютной скорости роста.

Опыты, устанавливающие зависимость процессов роста и конидиогенеза от кинетики поглощения углевода и кислорода из питательного субстрата представлены на рис. 7.

Можно считать, что активное образование конидий наступало в период замедления ростовых процессов мицелия, на фоне истощения питательного субстрата углеводным компонентом. Интенсивное потребление из субстрата сахарозы вполне объяснимо, так как углеводы являются тем энергетическим продуктом, который активно используется при дыхании. В то время, когда на концах гиф отшнуро вывал ось большое количество конидий, интенсивность дыхания культуры достигала своего максимального значения. После достижения максимальной продукции конидий мицелием процессы дыхания и потребления сахарозы замедлялись.

is

Рис.7.

А- Кинетика скорости потребления сахарозы и накопления конидий мицелиальной культурой гриба спорыньи Claviceps purpurea эргокриптанового штамма. Е- Кинетика скорости потребления кислорода и продукции конидиогенеза мицелиальной культурой гриба спорыньи Claviceps puipurea эр гокриптинового штамма.

4. Изучение процессов масштабирования роста мицелиальной суспензионной культуры гриба спорыньи эргокриптннового штамма.

Располагая величинами скорости потребления кислорода или дыхательной активности мицелия гриба, можно определить значение требуемого коэффициента массопередачи, знание которого необходимо при отработке режимов выращивания культуры в культивационных сосудах.

Мицелий выращивали в колбах объемом 500 мл при заполнении средой в соотношении 1/5 (100 мл) на качалке, совершающей 98-100 об/мин., с эллиптической траекторией вращения. Экспериментально было установлено, что данным условиям соответствовал коэффициент массопередачи, равный 30,4 ч"1, Известно, что коэффициент массопередачи показывает уровень растворенного кислорода, необходимый для роста культуры в глубинных условиях культивирования. Расчетная максимальная величина коэффициента массопередачи достаточно высокая и соответствует 60 ч'1' Экспериментально мы поддерживали рост культуры при низких

значениях Ко2. При таких условиях, мицелиальная культура испытывала дефицит по кислороду, чем лимитировались ее ростовые процессы. Можно предположить, что варьируя концентрацией сахарозы с 10% до 6%, как основного источника энергии, при низком уровне в субстрате растворенного кислорода, процессы метаболизма, происходящие в клетках мицелия, обеспечивали вегетативное развитие гриба спорыньи преимущественно путем конидиообразования. Процесс вегетативного увеличения массы мицелия был подавлен. При этом рост культуры и процесс конидиогенеза не были сильно растянуты во времени, т.е. достаточно синхронизированы.

Опыты по масштабированию культивирования мицелиальной культуры гриба спорыньи проводили в ферментаторе типа АК-210 с рабочим объемом заполнения 7 литров. Проведенная культивация в лабораторном ферментаторе, при соблюдении установленных оптимальных условий роста, показала возможность получения инфекционного материала спорыньи глубинным способом в аппаратах большего объема. Конидиогенез при выращивании мицелия в ферментаторе проходил не с такой активностью как в колбах на качалке, максимальное число конидий составляло 2,8-107шт/мл. В ферментаторе наблюдался усиленный рост мицелия. Его сухая масса достигала 25 г/л, что было практически в 2 раза выше значений, полученных в колбах. Данный факт может быть вызван тем, что система выращивания биообъектов в ферментаторах является открытой. Постоянное обновление газового субстрата может изменять метаболические процессы, проходящие в клетках мицелия, и этим оказывать значительное влияние на его развитие.

В целом результаты проведенного опыта показали возможность выращивания в лабораторных ферментаторах на оптимизированной нами питательной среде мицелиальную культуру гриба спорыньи эргокриптинового штамма в качестве инфекционного материала.

Получение таким способом инфекционного материала соответствовал нормативному документу «Концентрация конидиоспор промышленных штаммов спорыньи на зерновой питательной среде ( элитный инфекционный материал)» ( ТУ 9729146-04868244-02).

По традиционной технологии выращивания элитного инфекционного материала спорыньи на твердых питательных средах

только процессы размножения инфекционного материала продолжаются в течении 90-120 суток ( весь цикл длится 6 месяцев). С учетом наших разработок весь цикл получения элитного инфекционного материала в условиях сапрофитного культивирования занимает 45-75 суток.

В 2006 году был проведен полевой мелкоделяночный опыт, в котором изучали действие инфекционного материала спорыньи, выращенного в колбах и в лабораторном ферментаторе типа АК -210. Данные представлены в таблице 3. В результате инфицирования растений ржи спорыньей инфекционным материалом, выращенным в условиях глубинного культивирования, были получены зрелые склероции эргокриггпшовой спорыньи, отвечающие предъявляемым требованиям по качеству сырья (табл. 3.)

Таблица 3.

Действие на растения ржи инфекционного материала спорыньи

эргокриптинового штамма, полученного разными способами.

Показатели Урожайность склероциев, г/м2 Содержание суммы алкалоидов,%

Глубинное культивирование колбы 9,2±0,8 0,927

ферментатор 11,6±0,65 0,936

Поверхностное культивирование Колбы-матрацы 12,02±0,7 0,992

ВЫВОДЫ

1. На основе изучения биологических особенностей сапрофитной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма, разработаны условия глубинного культивирования, обеспечивающие высокий уровень концдиогенеза с менее интенсивными темпами нарастания мицелия, что является важным при производственном получении инфекционного материала,

2, Биологически обоснованными для условий инициации

процесса конидиогенеза и накопления мицелия являются

использование инокулюма в объеме 1мл с плотностью конидий не

менее (20-30) 105шт/ мл на 100 мл питательной среды и начальные значения рН среды в пределах 5,0-6,0.

3. Определены возможности экзогенной регуляции процесса конидиогенеза за счет изменения концентрации сахарозы в питательной субстрате до 6% и замены дрожжевого экстракта на минеральный азот в форме NH* NOj в концентрации 1000 мг/л питательной среды.

4. В целях обеспечения экзогенной регуляции процесса конидиогенеза и роста мицелия в состав питательной среды необходимо вносить фиторегулятор ГК в концентрации 0,1 мг/л питательной среды, которая инициировала активизацию продуктивности конидиогенеза в 12 раз, удельной продуктивности конидий в 30 раз, а так же способствовала сокращению цикла максимальной репродукции мицелия до 10 суток.

5. Установлено, что фиторегуляторы, ингибиругощие ростовые процессы ССС и 2-ХЭФК, блокируют процесс конидиогенеза. При их внесении в питательный субстрат происходит изменение биосинтетической активности культуры,

6. Впервые установлена взаимосвязь процессов поглощения из питательного субстрата сахарозы и кислорода с процессами конидиогенеза и нарастания мицелия гриба спорыньи эргокриптипового штамма.

7. Определены оптимальные параметры условий глубинного культивирования гриба спорыньи эргокриптинового штамма , которым соответствует коэффициент массопередачи по кислороду в пределах 20-30 ч'1.

8. Показана возможность роста мицеяиальной культуры гриба спорыньи эргокриптинового штамма с активизированным процессом конидиогенеза в лабораторных ферментаторах.

9. Предложена технология получения инфекционного материала спорыньи эргокриптинового штамма, не уступающего по своим характеристикам инфекционному материалу, полученному традиционным способом, с сокращением времени цикла производства в 3 раза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Савин П.С. , Шаин С.С., Савина Т.А. Характеристика роста мицелия и конидиоспор гриба спорыньи ( Claviceps purpurea (Fr)Tul) в сапрофитных условиях глубинного культивирования. Сборник

научных трудов «Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты», М 2005, Вып. 13, с. 36-45.

2. Савин П.С. Усовершенствование технологии выращивания инфекционного материала спорыньи в сапрофитных условиях культивирования. VI Международный симпозиум. «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» 13-17 июля 2005г., т.Ш, с. 424-426, М. 2005.

3. Савин П.С. Регуляция конидиогенеза в сапрофитной культуре спорыньи Claviceps purpurea (Fr)Tul, Сборник научных трудов. Химия, технология, медицина. Материалы международной конференции, посвященной 75-летию образования Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений. Том XVII, Москва 2006, с. 91-97.

4. Савин П.С. «Технология выращивания инфекционного материала спорыньи пурпуровой (Claviceps purpurea (Fr.) Tul.) в условиях глубинного культивирования». Доклады РАСХН, 2007г., №2, с. 21 -23.

Подписано в печать ) 0.04.2007 г. Исполнено 11.042007 г. Печать трафаретная.

Заказ №271 Тираж: 100 экз.

Типография «11 -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 уу>у\у. autorefefat.nl