Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация повторяющихся полинуклеотидных последовательностей в подсемействе Prunoideae в связи с видообразованием

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Организация повторяющихся полинуклеотидных последовательностей в подсемействе Prunoideae в связи с видообразованием"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. & Ф. КУПРЕВИЧА

На правах рукописи УДК 547. 963. 3:577. 113. %

ПАНЧУК ИРИНА ИГОРЕВНА

ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДШХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ПОДСЕМЕЙСТВЕ РШЮЮЕАЕ В СВЯЗИ С ВИДООБРАЗОВАНИЕМ

03.00.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на сосикание ученой степени кандидата биологических наук

ШНСК - 1992

Работа выполнена на кафедре биохимии Черновицкого государственного университета.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С. С. Костшин

академик АН Башкирии, доктор биологических наук В. А. Вахитов

кандидат биологических наук 0. П. Булко

, Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии

им. А. Н. Белозерского (МГУ)

Защита состоится ¿¿к? (-¿-Р 1992 г. в часов

на заседании специализированного совета К 006.04.01 по защите диссертаций на оосискание ученой степени кандидата биологических наук при Ордена Трудового Красного Знамени Интституте экспериментальной ботаники №1. В. Ф. Купревича АН Беларуси (220733, г. Шнек, ул. Скорины, 27).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа АН Беларуси. Автореферат разослан 1992 г.

Ученый-'секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Ус -/-И. В. Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время накоплен немалый объем сведений о структуре, Функциях и эволюции повторяющихся последовательностей (ПП) у растений. Однако эволюция ПП изучается часто в отрыве от эволюции на уровне организма, от видообразования. Еще не ясны вопросы взаимосвязи мекду молекуляр-; ной и хромосомной эволюцией, перестройками в геноме при гибри-гибридиэации и полиплоидии. Функции значительной Части ПП долгое время вызывают оживленные дискуссии. Среди прочих предложена гипотеза об участии ПП в работе хромосомного аппарата Если эти представления верны, то ПП должны играть важную роль в видообразовании растений, которое в значительной степени связано с изменением хромосом.

Вне поля зрения исследователей все еще остается обширные .группы цветковых растений, имеющие ваяние значение для систематики. Примером этого момэт служить семейство Rosaceче и, в частности, подсемейство Prunoideae. Это подсемейство является интересной экспериментальной моделью, так как представляет собой уникальный пример отдаленной гибридизации: описаны многочисленные гибридные формы между представителями различных видов и даже родов. Причем, гибридизация может происходить как на диплоидном уровне (рекомбинационное видообразование), так и путем аллополиплоидии. Сравнительная легкость отдаленной гибридизации в подсемействе Prunoideae ставит проблему о генетической и таксономической дистанции между его представителями. Связанный с этим вопрос о ранге таксонов, входящих в подсемейство, остается спорным со времен Ашнея.

Для решения упомянутых выше проблем мы использовали ряд методов молекулярной биологии и геносистематики.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является

изучение характера эволюции Ш в подсемействе Ргипо1с1еае, отличий в ПП у представителей подсемейства, связалых разной степенью родства (в том числе 7 у гибридных форм), а также использование полученных данных в решении вопросов филогении и таксономии Ргипо1<Зеае.

В связи с этим было запланировано: 1. Изучить скорость дивергенции и характер эволюции ПИ в подсемействе РгипсиЗеае. 2. Кгучить особенности организации, изменчивости и характера наследования рДНН у различных видов, сортов и гибридов; 3. Исходя из полученных данных, построить дендрограмму, отражающую филогенетические отношения в подсемействе РгипоШеае; 4. Предложить молекулярно-геяетичекие критерии для определения систематической принадлежноси представителей в подсемействе Ргипо1с1еае.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые исследована эволюция ПП в подсем. Ргил.о1<1еае. Показано, что скорость дивергенции ПП в подсемействе сравнительно низка Значительных перестроек генома посредством делеций-амплификация не обнаружено.

Исследована организация генов рДНК. Различия наблюдались в больном мекгенном спейсере, который состоит из четырех областей. Области отличаются по длине и наличию сайтов узнавания для рестриктаз, а также по скорости эволюции. Изучение спонтанных аллоплоидньвс гибридов и их предковых форм показало, что гибриды наследуют рДНК либо обоих, либо одного из родителей.

Данные молекулярной гибридизации могут иметь значение для систематиков при определении филогенетической дистанции, а также использоваться для выработки оптимальной стратегии получения новых межвидовых гибридов. Наборы рестриктных фрагментов могут быть использованы в качестве молекулярных паспортов для идентификации видов и сортов.

Использованные методики успешно примегош^л при подготовке дипломных и курсовых работ, а тают - на практических эа-занятиях студентами кафедры биохимии Чериозицтго университета.

Апробация работы. Основное результаты работы были пред-тавлены и должны на всесоюзных конференциях молодых ученых (Москва, 1990 г., Уфа, 1089 г., 1991 г.). 1 Всесоюзной планово - отчетной конференции "Генная и карточная ингенерия" (Москва, 1331 г.). Всесоюзной конференции "Постижения "Зиотех-нологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991 г.)» Украинских генетическом (Полтава, 1992г.) и биохимическом (Киев, 1992 г.) съездах.

Публикации. Результаты опубликованы в в работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения полученных результатов я их обсуждения, выводов и списка литературы, включавшего 213 источников, в том числе 133 иностранных. Материал изложен на 14? страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный материал. Для изучения были набраны виды: Armeniaca vulgaris Lam. (сорт Краснощекий и несортовая Форма Кердель), Cerasus avium (L. ) Moench. (сорт Бигарро Франц Иосиф и дикорастущая форма), С. fruttcosa (Pall.) G. Woron. ,C. tomentosa (Thubg) Wall., C. vulgaris Mill, (сорта Гриот Остгейм-ский и Шпанка краскокутская), Laurocerasus officinalis Room , Padus avium, Pd. grayana, Pérsica vulgaris Mill, (сорт Памяти Юэвченко), Prunus corasi Tera Chrh. две одичавшие несортовые формы), Pr. domestica L. (сорта Венгерка обыкновенная. Анна Шлет,

■J

Ренклод келтый), Pr. spinosa L., Malus domestica (сорт Джонатан). Молодые листья, из которых выделяли ДНК, были любезно предоставлены М. К. Иолтуховскии ( Приднестровская станция УкрНИЙ Садоводства) и М. И. Вык."*.^ (Ботанический сад Черновицкого госуниверситета) или собраны в окрестностях Черновцов.

ДИК выделяли из щеточных ядер, полученных дифференциальным центрифугированием. Ядра лавировали и ДНК осаждали в присутствии цетавлона СНактинис и др., 19873. Для дополнительной очистки ДИК использовали хроматография на Сефароэе Cl 4 В или центрифугирование в градиенте плотности CsCl tМирошниченко, 1981, Raison, 10В23.

Ре-зссоциация и молекулярная гибридизация ДНК. З-Н-меченую ДИК получали методом ник-трансляции СЫаниатис, 1984]. Фрагмен-тирование ДНК осушрстгляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН [Петров, 1980]. Для разделения одно- и двунитчатой ДНК использовали хроматографию на оксиапатите tBritten, 1974, Штров,'19803. Радиоактивность фракций измеряли на сшштилля-ционном счетчлке "Бега" с использованием сцинтиллятора ЖС-8. Исходя из полученных данных, строили дифференциальные и ■интегральные кривые плавления гибридных дуплексов с учетом самосчяаьшания меченой ДНК и рассчитывали Т пл. дуплексов. Обработку результатов молекулярной гибридизации проводили на персональном компьютере типа IBMPC/AT. Для построения дендраграмм использовали пакет программ "PHYL.IP" (версия 3.2). Для картирования рДНК использовали рестриктаэы Eco R!, Eco RY, Bam Hî, Xba I, Hind III, Dra 1 производства Института прикладной энэимолсгии ; Литва) . Расщепление ДНК проводили при +37 ° с 8-14 часов. Разделение продуктов гидролиза проводили электрофорезом в 0,8Х или IX агарозном геле (U=3,0-3,5 В/см) при +4°С. Для электрофореза использовали 0,1 M трис-боратный буфер с

б

10 мМ ЭДТА (рН-8,0). Перенос фрагментов ча капроновыэ фильтры проводили по методу Саузерна С Маниати", 1984]. В качестве зонда исподьговадась 183-рРНК или 25S-pPHK кукурузы, по-полученная ранее в нашей лаборатории. Мечение изотопом 32-Р осуществляли с использованием полинуклеотидкиназы Т4. Бдот-ги-бридизацию проводили по стандартной методике СМаниатис, 1984].

После гибридизации блоты авторадиографировали СОстерман, 1983; Мал п; »тис, 1984] с использованием пленки РМ-В л усиливающих экранов ЭУ-ВЗ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И Ч:< ОБСУЖДЕНИЕ

ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМОВ И ДИВЕРГЕНЦИЯ ПП В ПОДСЕМЕЙСТВЕ PRUNO IDEAL Изучение кинетики реассоциации ДНК Prunoideae. На первом этапе наших исследований была изучена кинетика реассоциации коротких фрагментов ДНК Pr. domestica (сорт Венгерка об--'ловен-ная), С.avíum (сорт йранц Иосиф) и Pd.avium У всех трех изучения видов реассоциация ПП практически заканчивается при Cot= 50, Поэтому в гкспериментах по молекулярной гибридизации время инкубации рассчитывали, исходя иэ необходимости достижения именно этого значения Cot.

Гомология ПП медчу различными родами Prunoideae, Сопоставление полученых цифр показывает, что наибольшая дистанция меяду представителями различных родов выявлена в реакциях между ДНК Аг. vulgaris и Рг. spinosa - около 55% гомологичных последовательностей. В то дв время п большинстве реакций количество таких ПП было 60-8GX (табл. 1). Сопоставление литературных данных Г Волков и. др, , 4989; Lagu et al., 1Э863 для других растений с напмми результатами позволяет утверждать.

что Prunoideae являются группой, имеющей мало изменчивые ПЛ.

Гомология ПП в пределах рода. Сходство ПП было более подробно исследовано для видов из родов Cerasus, Prunus и Padus (табл. 2,3). Видно, что количество гомологичных последовательностей в ДНК негибридных видов одного рода леютг в пределах 80 -95%. Исключение составляет реакция между меченой ДНК С. fruti-cosa и немеченой ДНК С. tomentosa - 65%. В литературе отсутствует единая точка зрения на систематическое положение С. tomentosa. Одни авторы относят этот вид к подроду настоящих вишен СНуковский, 1971], другие - мелкоплодных вишен [Курсаков,19бб]. Наши результаты находятся в согласии со второй точкой арения.

Изучение термостабидъности гибридных дуплексов. Результаты по Т пл. дуплексов, полученных в гетерологичных реакциях, в основном согласуются с данными по проценту гомологии ПП: чем больше степень гомологии, тем выше Т пл. дуплексов.

Особо следует остановиться на реакциях с участием меченой ДНК L.officinalis. Во всех гетерологичных реакциях образуется относительно небольше количество гибридных дуплексов 65-70%, что свидетельствует об обособленном положении лавровишни в подсем. Prunoideae. В то же время Т пл. дуплексов в гетерологичных реакциях ненамного отличается от гомологичной - 0,8-2,1 С. Таким образом, в геноме L. offícínaiis практически отсутствуют сильнодивергировавшие ПЛ. От всех других изученных нами видов лавровишня отличается высоким уровнем плоидности - 18 наборов хромосом [Хромосомные числа ..., 1969]. Ранее было показано, что при формировании полиплоидного генома может происходить частичная утрата быстродивергиругацих ПП [Мирошниченко др., 19883. Очевидно, такое же явление имело место и при становлении генома L. offlclnalis.

Характер эволюции ПП у Prunoideae. Принято считать, что

Таблица 1.

Результаты гибридизации последовательностей ДНК представителей видов псдсем. Ргипо^йеае А - Относительная гибридиэуеюсть (X) побторявдйхся Б - Т пл. ( "С} гибридных дуплексов ПП ДНК

Источник меченой

днк

Источник немеченой ДНК

Аг. VIII ¡гаг 13

| С. аУ1ШП ! Ц оГП- { •Хюанп I СгпяНг I

•¿ванц Иосиф

Рс1. аугигя

I Г,

| Г2. У1Л'

) гапз

Рг. по;

зр]-

а

№ йоме-1 са

8 А V 1 г Ъ | А Б А В А 3 А 'Б А у—— А Е

| Аг. уи1еаг1з 100 64.0 80 79, а 65 81,6 73 81,8 — — 55 31,4 —

| С. аушт 73 73.1 100 ВО, 4 73 71,4 81 73,6 56 70,4 78 72,0 25 58,5

| оГГ 1С1г.а113 64 79,8 57 70,6 100 . 7 65 80 ,.5 73 60,9 68 30,7 оо £0.0 1

| Рй. аущт 83 76,8 80 77,3 70 75,2 100 ЙЭ, 5 54 73,8 70 75,3 30 .... ■

I Рз. уи^апз 74 80.3 78 78,8 64 79,5 75 79,1 100 85.1 57 73,8 30 82.1 |

3 Рг. зртоБа 55 80,6 77 73,7 64 75,9 60 77,7 68 76, б 100 84,4 34 ы,о !

Таблица 2

Результаты гибридизации последовательностей ДНК представителей родов Сегазиг и РаЗиэ А - Относительная гибридиэуемость (X) повторяющихся Б - Т пл. ( ° С) гибридных дуплексов ПП ДНК

Источник Источник немеченой ДНК |

меченой 1 ДНК С. avium Франц Иосиф С. avium дикая С. fruticosa С. vulgaris С. tomentosa Pd. avium Pd. gra-yana

А Б А Б А Б А Б А Б А Б А Б

С. avium Франц Иосиф 80,4 100 80,3 93 79.2 88 80,2 95 75,0 84 73,6 81 — --

С. fruticosa 74.7 96 74.9 93 74,5 100 75,2 99 72.5 70 70,7 68 — —

С. vulgaris . 82,6 99 81,4 96 82,3 91 83.8 100 80.1 78 — — — —

J Pd. avium 77.9 80 77,2 75 78,1 74 — — 78,9 69 80,5 100 80,2 93

Таблица 3

Результаты гибридизации последовательностей ДНК представителей рода Prunus А - Относительная гибридизуемость (X) повторяющихся Б - Т пл. ( 0 С) гибридных дуплексов ПП ДНК

Источник Источник немеченой ДНК

меченой ДНК • Pr. cerasifera Рг. dornest i са Венгерка Pr. domestica Анна Ейет Pr. domestica Ренклод жадтнй Pr. spinosa

А Б А Б А Б А В А Б

Pr. cerasifera 100 84,0 36 82,5 — — 92 83,0 89 82,5

Pr. domestica Венгерка 94 - 84,1 100 84,4 95 84,1 96 84,5 96 83,5

i Pr. spinosa 90 82,8 97 82,6 — 93 82,9 00 84,2

уменьшение процент. : смолоти с первую очередь связано с исчезновением отдельных ccï.îcKGTii llll а процессе дивергенции видов. Уменьшение Г пл. зависит от накопления в ДНК нуклеотидных замен [Петров, 19801. Таким образом, сопоставляя взаимосвязь между этими двумя параметра;,!'.; в разных группах растений, мокло судить о характере эволюции 121 Сравнение наших результатов с литературными данными для различных растения [Беридзе, 1985, Еол:сов и др, 1989] показывает, что при равных значениях Т пл. для плодовых характерны оодсо uucoirae значения уровня гомологии. Это позволяет сделать вывод, что в эволюции геномов Prunoideae (за исключением L.or'iicijialis) не обнаружено резких делеций-амшшфикаций Oil

РЯСТРЖГАЗНОК КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ рРНК.

Слэдугадим этапом наши исследований было изучение структуры генов 18 5 и 25 S рРНК (рДНК). Полученные результаты обобщены в виде рестрлктазных гарт на рис. 1,

Размеры генов рРНК. У большинства изученых форм повторяющиеся участки в рДНК различаются по длине - от 8,7 тпн до 12, 5 тпн. У нести видов - Аг. vulgaris, С. avium, С. fruticosa, L. officinal¡s, Pd. avium и PU. grayana - все повторы внутри генома одной длины. Оригинальной особенностью плодовых является присутствие в геноме одновременно нескольких вариантов рДШ, существенно отличающихся но длине. У пяти форм - С. vulgaris, Ps. vulgaris, Pr. cerasir'era, Mr. donwstica (сорт Венгерка) и Рг. spinosa - имеется по два варианта повторов, причем у Рг. сега-sifera и особенно Pr. domost ica, и Pr.spinosa интенсивность полос (а, следовательно, и число копий в геноме) для короткого варианта нимь, чем для длинного. У Ps. vulgaris и С. vulgaris количество коротких и длинных повторов практически одинаково.

12

;a i

н-с

25 3

fe в ei el4 " ТГ~5 3 ШТг Ärseniaca vulgaris - 10,5 тыс.пн

ЕГ

!J 5

25 S

тл>—T

6 ЙЁ1 sr Cerasu5 avlua - ll.ß тыс.пн

ёГ

н Н'

I !

Ы'

-Г

i t

ev

н- н 1—I_L

Ь bei в b & ЕГ

Cerasus fruticosa - 12,5 тыс.пн

Ei

:г ег ЕГ li Ь' t

sr

н

а bei ¿г

X ЕV

| ^ и 5

25 5

л—Г

1_L

_L

Ё1

ег

I I

Ь ¡г

ТЕ

25 5

н- К I I

1~ь 5 ЕГ

Cerasus vulgaris - 12.5 тыс.пн и 11.5 тыс.пн

012 345678

¿г ¿г кг i ь

9 10 11

12

13 "КС. ПН

Рис. I. Локализация сайтов дзнаввания рестриктаз Ваш HI (В), Dra I CD), Есе 81 (EI), Ecu RU (EU), Hind III (Н) и Xba I (X) в рДНК Prunoidcae. Значком ' птмачены сайты, дстойчивие к действие ферыектов в части рДНК.

EY

1 I» 5 ~~j ■ ' - ¡ Z5 5

i ЁГЙ fr Ь F

H ff ff

I I I

IT

Laurocerasus officinalis - 12,4 тыс.пн

19 s

D'EV

JL

HS

ь" оÈx II-1 é Ь "fr Padus auiuii - 10,6 тыс.пн

D'ÏV

» s "T-ty-T " "i 3ïx ei ¡Ш iF~ Padus grayana - 10,6 тыс.пн

X EV

f

n s

1 ill

5

TI §~

X

EV

15 S

25 s

1 FIS kr 3~Б Г

Ti

I

X' H

! I

№

ki

№ ff

EIETD ff --[

si с

¿1« l

EI

TT

EI

Pérsica vulgaris - 11,4 тыс.пн и 3.7 тыс.пн

012 345678

-с

-г

10 и

13 ТЫС. ПК

Рис. 1 Спродоляение).

X

! ,,И~Г t t »s 1-1-1-py-p-

S BEI ET 3 В 1t fei ET D ЕГ X EV

1' in ~j—j—j гъ s --[ tunor

' § er i~5 5 Si

Prunus cerasifera - 11,0 тнс.пн и 8,9 тнс.пн

x ev н ff №

ii s -— » 5

¡rrtr

CT.

& Ш. FT i il EI

x ev h ff

l' »s j—Ц гь s 1—-I—i-1—r-j-[ Hinor

S i?ii 5 Ei ЕГ Ei' D EI'

Prunus doaestica (Венгерка), Prunus spinosa - 10,7 тнс.пн и 9,3 тнс.пн

X EV ff н ff

Г in НЧ n» -j ' ' 1-,-1-Г

й й-fii b b Й- £T Ar b

Prunus doaestica (Ренклод гелтый) - 10,7 тыс.пн

Ol г 3456 7 89 10 U 12 тыс. ПН

1__!_I_I_I_I_1-1-1-1-1-1-1

Рис. 1 (окончание).

Кодирующая часть рДНК и ¡¿алий ыежгенный спейсер ( MMD), Взаиморасположение в этих участках сайтоЕ узнавания Eco RI, Dra I, Xba I и грех сайтов для Bare Ш совпадает с таковым для большинства двудольных растений [Борисюк и др., 198Э, Eckenrùde, 1985, Learn et al. , 1987, Kiss et al., 19893 , что лишний раз свидетельствует об эволюционной консервативности кодирующих областей. Исключение составляет сайт Bam HI, соседствующий в гене 18 S рРНК с сайтом для Eco RI. По-видимому, дополнительный Ват HI-сайт в гене 18 S рРНК является специфичным для представителей подсем. Prunoideae (а, воамоюга, и всего сем. Rosaceae).

Незначительные различия обнаруживаются в ШС. У некоторых видов и форм здесь присутствует сайт узнавания для Eco RI, который расщепляется ферментом лишь в части рДНК. Исключение составляет Pd. grayana, у которой происходит полное расщепление по этому сайту. Последнее обстоятельство может быть связано с различной степенью метилирования сайта у разных форм. Кроме

I

того, в ШО для части повторов у Padus оЭнару.тавается дополнительный сайт Dra I. Размеры ММС одинаковы у всех изученных форм и составляет 0,8 тпн.

Организация большого меягенного спейсера (БЫС). Упомянутые выше различия в длине повторяющихся участков в рДНК Prunoideae связаны с разницей в организации ВМС. Сопоставление рес-триктааных карт для разных видов позволяет выделить в пределах ВМС по крайней мере 4 области - А, В, С и D (рис. 1). Область А охватывает участок от конца гена 25 S рРНК до первого сайта Hind III.в ИС и имеет размер 0,5-1,3 тпи. Принято считать, что в этой области расположены последовательности, обеспечивающие тершиацию транскрипции рРНК [Rogers, Bendich, 19871.

Область В охватывает участок ВМС между сайтами Hind III.

Ее размеры колеблются у разных родзг пт 0,6 до 1,7 тпн. Область В отсутствует у минорного варианта рДНК Pr. donestica (Венгерка обыкновенная), что обуславливает уменьшение его размера. Центральную часть БШ занимает область С. Она характеризуется присутствием сайтов Eco RI и (или) Dra I различной локализации. Изменения в длине повторов рДНК связаны в основном с изменениями областей В и С.

И;область D, имагацая размер около 1,6 тпн и примыкающая к гену 18 3 рРНИ. У всех исследованных форм в этой области на расстоянии'1,6 тпн от начала гена 18 S рРНК присутствует сайт Dra I. Считается, что область БМС, непосредственно примыкавшая к гену 18 S рРНК, является так называемым внешним транскрибируемым спейсером( ВТС), в котором находятся последовательности, отвечающие за инициацию и регуляцию транскрипции генов рРНК. Можно считать, что область D как раз и является ВГС.

"Короткие" варианты рДНК. Необходимо отметить, что у Ps. vulgaris и у Pr.ceraslfera имеется варианты генов малой длины не имеющие в БКС сайтов узнавания ни одной из вести использования рестриктаз. Вероятно, эти варианты появились з результате делецни значительной части ЕЖ, в том числе - участков, несущих сайты узнавания рестриктаз. Но одной только дэлецией большей части Б.ЧС объяснить исчезновение всех сайтов невозмояга, поскольку в этом случае короткие варианты доллшы Выли бы иметь еще меньшие размеры. Другое объяснение - полное метилирование цитозина в этих сайтах.

ИЗМЕНЕНИЯ ГОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ФИЛОГЕНИЯ ПОДСЕМЕЙСТВА PRUNO IDEAE.

Как указывалось выше, дивергенция НП у Prunoi deas невелита. В связи с этим необходимо напомнить, что систематики не при-

шли к единому «.« .ил о таксонотчеса:ом статусе входящих и подсемейство групп. Hú¿¡i данные но дивергенцииПП у Prunoideae могут служить подтверждением справедливости взглядов тех систематиков, которые предлагают понизить таксономический ранг Armera аса, Cerasus, Laurocersus, Padus, Pérsica, Prunus до подрода.

Изучение межвидовой гибридизации у Prunoideae позволило придти к выводу, что сравнительно легко удастся скрэздиания между близкими видами С Жуковский, 19713. Гибриды вполне жизнеспособны и фертильны. По нааим данным, такая ситуации наблюдается для форм, имеювдх уровень гомологии ПП порядка 80-100%. По-видимому, сходство геномов является одной из причин, способствующих гибридизации. При больших дистанциях - 60-80% гомологии - получить в результате скрещивания нормальные растения трудно. Гибриды, ка1-{ правило, нежизнеспособны, стерильность пыльцы высокая, семена имеют низкую всхожесть. В этом случае успех может быть достигнут при повышении уровня плоидностя и формирования аллоплоидной формы, как это имело место в природе в отношении Рг. domestica и С. vulgaris.

Происхождение адлоплоидных видов и изменения ПЛ. Среди изученных наш видов два - Pr. domestica и С. vulgaris - имеют гибридное происхождение. Поиааано С Рыбин, 1967], что гексапло-идный геном Pr. domestica содержит четыре набора хромосом терна Рг. spinosa и два набора - алычи Pr. ce ras i fera Культурная вишня С. vulgar is возникла в результате объединения двух геномов С. avium и двух - С. fruticosa [Жуковский, 1971].

Из наших данных следует, что у Prunoideae аллоплоиды наследуют 9?-1002 ПП родительских форм. Очевидно, это связано со значительным сходством наборов ПП у родительских форм (табл. 2, 3), поэтому при формировании гибридного генома отсутствует необходимость существенных перестроек генетического материала.

Наследование рДНК у адлоплоидных г.орм. Оолосхаьление ре-стриктааных карт и наборов фрагментов на радкоа^то! рафах показывает, что один из вариантов рДНК у С. vulgaris иде)п.1чан таковому у С. avium, который является одним из его родителей, тогда как второй унаследован от другого родители - С. fr.iticosa

Полученные нами данные можно рассматривать как молекуляр-но-генетичеекое подтверждение правильности гипотез о происхсж-дении Pr. doinestioa и С. vulgaris.

Построение филогенетического дрена. Ш oeuobciiiiiii полученных нами в экспериментах по молекулярной гиоридшацяи 1Ш данных южно построить безкорневые дендраграмлы (программа "Fitch"), отражающие филогенетические отношения мевду изученными формами (рис. 2,3). Стандартное отклонение для этих денд-рограмм лежит в пределах 10-?8 X. Исключение составляет древо, построенное для различных родов на основании данных по Т пл. -47% (рис. 2а). Мы попытались разобраться в( причинах, вызвавших столь высокое отклонение. Было решено построить денцрограмму, допустив появление на ней ветвей отрицательной длины. В результате произошло некоторое снижение стандартного отклонения (39Х), а длина звена, примыкаюпэгр к L. officinalis, приобрела отрицательное значения. Анализ табл. 1, содержащей исходные данные для построения указанного древа, показал, что снижение Т пл. в гетерологичных реакциях с участием 3-Н-ДНК L. officinalis по сравнению с гомологичной реакцией является неожиданно низким и значительно отличается от соответствугацих реципрокных реакций. Поэтому решено бнло построить ешэ одну дендрограмму, исклочив данные для L.officinalis (рис. 26). у полученного /¡рева отсутствует ветви отрицательной длины; стандартное отклонение уменьшилось до 23%. Таким образом, анализ цендрограм ещэ раз свидетельствует о том, что эволюция высо-

Рис. 2. Филогенетические дистанции между представителями различных родов Prunoideae, рассчитанные на основе данных ш относительной гибридиэуемости (%) ГШ (Arvl

- Armenlaca vulgaris; Ceav - Cerasus avium; Lcof

- Laurocerasus officinalis; Pdav - Padus avium; Psvl

- Pérsica vulgaris; Prdm - Prunus spinosa; Mldm -Mai us domestica). ____

Рис. 3. Филогенетические дистанции медду представителями раз-

'личных родов Pruno)deae, рассчитанные на основе данных по температуре плавления дуплексов, образовавшихся при гибридизации ПЛ. --~

2ü

Рис. 3.

коллоидного генома лавровишни имела свои специфические особенности, в частности - делеции значительтельных групп быстроди-вергируюшдх ПП, о чем уже говорилось выше.

Рассмотрение построенных дендрограмм показывает, что расстояния мехду точками ветвления меньше, чем длина ветвей, ведущих к отдельным родам. Это означает, что становление родов произо'.^п на ранних этапах эволюции подсемейства и современные роды шт-и одновременно дивергировали от общего пред!».

Мы поставили перед собой вопрос: происходили ли изменения ПП у Prunoideae с постоянной скоростью (концепция "молекулярных часов") или нет? Для этого были построены дендрограммы с использованием программы "Kitsch" и сопоставлены получение стандартные отклонения с таковыми для соответствующих "Fitch"-дендрограмм. Оказалось, что отклонение для "Kitsch''-древа, построенного на основании данных по проценту гибридизации лишь незначительно больше (17% против 15%) (рис. 16). При использовании в рассчетах данных по Т пл. предположение о постоянной скорости молекулярной эволюции приводило к резкому возрастания стандартного отклонения - до 74%. Исключение данных для L. officinalis вело к снижению стандартного отклонения до 32% (рис. 2в), но оно все же оставалось выше, чем у "Fitch"-древа (23%).

Эволюция подсем. Prunoideae и изменения рДНК. Если сопоставить полученное нами филогенетическое древо с рестриктазными картами, то можно сделать вывод, что эволюционно-генетическая близость коррелирует с рядом особенностей рДНК. Так, в линии ведущей к Armem аса-Pad us повторы имеют одинаковый размер и несут дополнительные сайты узнавания Dra I в гене 25 S рРНК. Armeniaca, Padus и Cerasus характеризуются близкими размерами области В. Общей чертой Prunus и Persica является наличие в геноме двух вариантов рДНК, один из которых - повтор малой

длины, не несущий в ВМС сайтов узнавания для использованных реетрикгаз. С другой стороны, длинный вариант рЩК Ps. vulgaris сходен с рДНК L. officinal is по размеру области В (рис. 1).

Изменчивость рДКК. у Pruno и ее использование для определения систематического положения. Сравнение между собой наборы полос на радиоавтографах показало, что они являются специфичными для большинства изученых форм. Наиболее четко отличаются между собой различные роды, но более тонкие суличил обнаруживаются и мещу близкими .видами и дало сортами.

Сопоставляя имеющиеся данные с нашими результатами, модно считать сливовые групой изменчивой по организации рДНК: в подсемействе нами обнаружено большое разноообраэио вариантов рДНК, специфические с груктурные особенности имеются у всех изученых видов. В широких пределах изменяются и размеры повторов. Все эти различия возникли за счет преобразований структуры ВМС, они имели различный характер в изученных родах и затрагивали разные области спейсера.

ВЫЕОДЫ

1. Результаты молекулярной гибридизации ДНК видов Pruno-ideae показывают, что для подсемейства характерна сравнительно низкая скорость дивергенции ПЛ. Явления делений-амплификаций не играли существенной роли в эволюции этой фракции генома.

2. Низкий уровень изменчивости ПП находится в соответствии с точкой зрения, согласно которой таксономический ранг Armenlaca, Ceгasиз, Laurocerasus, Padus, Pérsica, Prunus должен быть понижен до подрода.

3. Сходство геномов различных представителей Prunoldeae моякт являтся одним из факторов, обуславливающих широкое распространение межвидовой гибридизации в подсемействе.

4. Природные аллэплоидные гибриды Pr. doirestica и

С. vulgaris наследуют практически Есе ПП родительских форм. рДНК наследуется одно- или двурэдительски.

5. рДНК в пределах подсемейства Prunoideae вариабельна Размер повторяюшегося участка лежит в пределах 8,7 - 12,5 тпн. Эти различия связаны с преобразованиями структуры EMC и выра-тотся в изменениях его длины и локализации сайтов узнавания растриктчз. У Ps. vulgaris и видов рода Prunus имеется по два варианта повторяющегося участка рДНК.

6. Сопоставление рестриктазных карт позволяет выделить в БИС рДНК Prunoideae четыре различных области.

7. Эволюционные изменения затронули различные области и имели разный характер у изученных видов. Наиболее изменчивой является центральная часть ВМС, наиболее консервативной -примнкапшзя к гену 18S рРНК.

8. Мзкду близкими видами и сортами можно выявить тонкие различия в организации рДНК, что позволяет использовать наборы рестрикткых фрагментов на радиоавтографах в качестве молекулярных паспортов для идентификации сортов в селекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Волков Р. А., Панчук И. И. , Шелифост А. Е. Молекулярноге-. нет".1ческие маркеры плодовых культур подсемейства сливовых// Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов. Тез. научн. конф. - Уфа, 1989. - ЧЕ - С. 104.

2. Волков Р. А., Панчук и. И. Изменчивость рДНК у растений подсемейства сливовых// IV Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки. Тез. докл. - М. ,1930.-С. 12.

3. Панчук И. И. , Ксстышин С. С. , Волков Р. А. Дивергенция повторяющихся полинуклеотидных последовательностей в подсе-

мействе сливовых // Черновиц. ун-т. - Черно,-'.у, 1991. - 15 с. Деп. в УкрНЮШГИ 04. 09.91, N0 1259 - УК 91.

4. Панчук II И., Волков Р. Л. Дивергенция повторяющихся последовательностей ДШС в подсемействе сливовых// Изучение и рациональное испольвование природных ресурсов. Тез. научн. конф. - Уфа, 1991. - С. В.

5. Волков Р. А. , Косты!и:н С. С., Еанчук И. И.. РогозинскиЯ М. С., Толсткк С. М., Шелкфост А.Е. Разработка способов плуче-ния и оценкн селекциснно-ценных форм сельскохозяйственных растений на основе биотехнологических подходов // Тез. д^кл. 1 Всесоюзной планово - отчетной конференции "Генная и кл^. лчная инженерия". - М., 1991. - 3.91.

6. Паячук И. И. , Костышин С. С., Волков Р. А. Полиморфизм рднк у плбдовых культур подсемейства косточковых // Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу. Тез. докл. Всесо-юзн. конф. - Черновцы, 1991.- Т. I - С. 9.

7. Панчук Л. И. , Костышин С. С., Волков Р. А. Отдале"ная гибридизация и изменчивость повторяющихся последовательностей в подсемействе, сливовых//Укр. ген. съезд - Полтава, 1992.- С. 76.

8. Волков Г. А. , Костишин С. С. , Панчук Г. I. Зм1ни посл1-довностей, ср повториться у род1в шдродини сливових // Тез. допов. Укр. бюх!М. з' 13д. - ки1в, 1992. - С. 9,