Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Организация и нуклеотидная последовательность гена гамма-субъединицы фоторецепторной цГМФ-фосфодиэстеразы человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Организация и нуклеотидная последовательность гена гамма-субъединицы фоторецепторной цГМФ-фосфодиэстеразы человека"

2 0 о;; а'-л,

академия наук ссср

ордена трудового крлского знамени

ИНСТИТУТ БИООГГЛИИЧЕСКОН химии им. М. М. ШЕМЯКИНА

Па правах рукописи

ПИРИЕВ Натик Ибрагимхалил оглм

ОРГАНИЗАЦИЯ II НУХЛЕОТПДП АЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА У- СУБЪЕДКШЩЫ ФОТОГЕ'аЕПТОРПОП цГМФ - ФОСФОДИЗСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

03. 00. 03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наугс

москва - 1551

Р-лсла HHü-Hin-üia н орден« Трудового Красного Знамони !i:ioiif.T"-» ^»••юргатигскоа химии им. М.М. Шемякина Атсг.1,Ч'.-м'.ч! наук СССР

ИиупшЛ pV!üii!o.!:.ir"Hjii, -- киндидпт химических наук II.В. Храмцои

«Ми'лкншшо оппонента: д.г.т.т хсшчнсккх наук - в.Л. RJ-имои кандидат хиянчлских наук - И.Л. лисшдан

оргашшпцкя - Институт волокулярной биологии АН СССР

r.;i::;in-ü диссертации состоится "J " 1991 г. в

Kl ччгяи) на меодании специализированного совета Д 002.35.01 но ях.»!т» диссертаций на соисканио' учоной степени доктора паук hj.и ¡'¡ютптуто .'иосрганической . химии им. М.М.Шемякина /.II СОСГ по пдрооу: 117R71. ГСП-7 Москпа, В-437, ул. Миклухо-

n.'üi, in/u).

С ¿шсаортатюП модао ознакомиться в библиотеке Института ft'.Mij.PhimwKoS Xl!i,тип им. М.М.Шемякина АН СССР.

АМм'г^.рЬТ раС'.ОСЛЙН MQJt 1991 г

.V'li-Itiül CüKp-VnpI. ГЦ. а.'. I.".. vaHldVi соьета

¡г- г' ■ г->ук

В.А. Несмеянов

'Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов трансдукции светового сигнала в фоторецепторных клетках сетчатки является одной из важнейших задач молокулярной биологш и современной биохимии.

В последнее десятилетие во многих лабораториях мира получены экспериментальные данные, вскрывающие молекулярные основы зрительного возбуждения. Каскад реакций в фоторецептор-ной клетке, приводящий к преобразованию энергии фотона в нервный импульс, включает функционирование трех белков - родопсина, трансдуцина и фосфоднэстеразы циклического ГМФ (ФДЭ). Кон-формациошше изменения в молекуле родопсина, вызвашше поглощением кванта света, приводят к активации сотен молекул трансдуцина с образованием комплексов а-субъедшшцы трансдуцина с ГТФ, каждый из которых, в свою очередь, активирует ФДЭ. ФДЭ из палочек сетчатки состоит из трех субъодшшц: а (88 кДа), (3 (84 кДа) и 7 (11 кДа). Ключевую роль в механизме светозависимой активации ФДЭ играет ее регуляторная 7-субъедшшца, инги-бирующее действие которой устраняется за счет взаимодействия с а-субъедшшцей трансдуцина. В результате этого, концентрация внутриклеточного цГМФ резко снижается, что приводит к спонтанному закрыванию цГМФ-зависимых натриевых каналов плазматической мембраны и возникновению нервного импульса.

Ранее в ИВХ им. М.М.Шемякина АН СССР были клонированы кДНК всех трех субъединиц ФДЭ из палочек сетчатки быка и определены аминокислотные последовательности соответствующих белков■

Изучение молекулярных хромосомных механизмов различных патологий и, в первую очередь, наследственных, приводящих к нарушению восприятия, передачи и усиления зрительного сигна-

ла, требуют детальной информации не только о строении белков, принимающих участие в этих процессах, но и о структуре, организации, хромосомной локализации и регуляции экспрессии их генов.

Цель работы. Данная работа проводилась в рамках осуществляемых в ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР комплексных структурно-функциональных исследований фоторецепторной фосфодиэстера-зы цГМФ и кодирующих его субъединицы генов.

Целью настоящей работы являлось клонирование, установление нуклеотидной последовательности гена 7-субъединицы фоторецепторной фосфодиэстеразы цГМФ (ФДЭ^) человека, определение его геномной организации.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате настящего исследования впервые установлена нуклеотидная последовательность гена ФДЭ^ человека, длина которого составляет около 6400 п.н. Определена экзон-интронная организация гена ФДЭ^. Установлена нуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей области гена, которая содержит потенциальные ре-гуляторные элементы - TATA- и СААТ- блоки. Методом Саузерн-блот гибридизации установлено, что ген ФДЭ^ человека является уникальным и не имеет в геноме гомологичных структур. Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей экзонов гена ФДЭ^ человека и кДНК ФДЭ^ быка и мыши, а также аминокислотных последовательностей соответствующих белков. Обнаружено соответствие экзонов гена ФДЭ^ человека структурным и функциональным доменам 7-субъединицы ФДЭ быка.

Результаты работы могут служить основой для исследования механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии гена ФДЭ

человека, что необходимо для детального понимания функционирования ФДЭ в фоторецепторной клетке.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы две статьи, результаты исследований докладывались на Всесоюзном симпозиуме по химии белка (Тбилиси, 1990), I Всесоюзной конференции "Геном человека" (Переславль-Залесский, 1990), I Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (Рига, 1990).

Объем работы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного регуляции транскрипции эуквриотических генов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (/37ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

4

1. Свузерн-блот анализ геномной ДНК человека.

• Для выяснения возможности наличия нескольких генов, кодирующих разные изоформы ФДЭ^, а также для определения копийнос-ти гена в геноме был проведен Саузерн-блот анализ геномной ДНК человека. Учитывая высокий уровень гомологии для 7-субъедщшц ФДЭ разных млекопитающих, в качестве зонда для блот-гибридиза-ции рестриктов геномной ДНК человека был использован фрагмент кДНК ФДЭ^ быка (764 п.н.), меченый при помощи ник-трансляции.'

Высокомолекулярную геномную ДНК, выделе!шую из мозга человека, подвергали гидролизу эндонуклоазами рестрикциии ЕсоН I и ВатН I, а также их совместной комбинацией. Фрагменты

геномной ДНК разделяли электрофоретическим методом в 0,7% ага-розном геле и переносили на нитроцеллюлозннй фильтр для последующей гибридизации с ник-транслированным фрагментом кДНК ФДЭ7

е I

быка. '

У

— 21226

_ 5148 4973

* V — 4277

& — 3530

— 2027.

— 1904

Рис.1. Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК человека с ник-транслированным фрагментом кДНК ФДЭ быка.

Основываясь на результатах этого эксперимента, представленных на рис. 1, можно сделать вывод, что ген ФДЭ^ человека является уникальным, т.е. представлен одной копией и но имеет в геноме гомологичных структур.

2. Идентификация гена 7-субъединицы ФДЭ человека.

В ходе исследований была проанализирована геномная библиотека представительностью около 1.5»10б клонов, полученная Р.Л. Алликметсом. Для клонирования (в ВашН I - сайт вектора к EMBL3) использовались фрагменты размером 16-20 т.п.н., полученные в результате частичного гидролиза рестриктазой Sau ЗА высокомолекулярной геномной ДНК из мозга человека. ДНК фага Л, вводилась в бактериальные клетки (штамм E.coll гесА4" - DP50) при помощи фаговой инфекции.

в

Для идентификации рекомбинантных бактериофагов к был выбран наиболее часто применяемый метод гибридизации In attu фаговых бляшек (Benton, Davis, 1977) в модификации, предложенной Woo с сотрудниками (Woo, 1979), в соответствии с которой перед гибридизацией проводили амплификацию фагов прямо на нитроцел-люлозных фильтрах. При этом происходит обогащение фильтра фаговой ДНК, в результате чего радиоавтографический сигнал от положительных клонов становится более сильным.

" Для первичного скрининга геномной библиотеки в качестве зонда был использован фрагмент кДНК (764 п.н.) ФДЭ^ быка, меченый при помощи ник-трансляции. Использование ник-траислиро-ванного фрагмента кДНК позволяло: во-первых, увеличить вероятность выявления йкзонов, соответствующих как II-, так и С-кон-

цевой области бежа, и, во-вторых, - получить высокую удельную активность зонда (5« 10s - ЫО9 имп/мин/мкг ДНК), что является важным фактором при анализе геномных библиотек.

В результате первичного скрининга амплифицированной геномной библиотеки из ДНК мозга человека были выявлены и доведет до индивидуального состояния три клона AÍ7I, А.Р72, ЯР7З, дававшие положительный сигнал гибридизации с ник-транелирован-ным фрагментом кДНК ФДЭ^ быка. Для моноклонизации потенциальных позитивных, клонов проводили несколько последовательных циклов гибридизации, выкола зоны агара с фагами, дающими положительный сигнал, элюции фагов из агара, рассева элюата с меньшей плотностью, снятия реплик и их последующей гибридизации с соответствующим зондом. Фаговую ДНК из индивидуальных клонов выделяли по стандартному методу в модификации Забаров-ского (Забаровский, Турина, 1988). Основные преимущества этой модификации - воспроизводимость, быстрота и довольно высокий выход ДНК (1-3 мкг/мл), по качеству практически не уступающей ДНК, очищенной в градиенте CsCl.

Для получения общей информации о структуре геномных вставок выделенную ДНК клонов ХР71, AJ72, АР7З подвергли гидролизу эндонуклеазами рестрикции Hind III, EcoR I, BainH I и Sal I (сайты рестрикции для EcoR I, BamH I и Sal I в плечах фага X ЕМВЪЗ отсутствуют, а для рестриктазы Hlnd III в правом плече вектора имеется единственный сайт). Фрагменты -ДНК разделяли в 0,7% агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр по методу Саузерна для последующей гибридизации с ник-транслиро-ванными фрагментами кДНК ФДЭ^ или с олигодезоксирибонуклеотвд-ными зондами (все использованные в настоящей работе олигодезо-

ксирибонуклеотидные зонда синтезированы Н.С.Быстровым), мечеными при помощи [7~32Р]-АТР и полинуклеотидкиназы фага Т4.

Физическое картирования геномных вставок проводили при помощи одиночного (гидролиз ДНК одной рестриктазой), множественного (одновременный гидролиз двумя или тремя рестриктаза-ми) и последовательного (гидролиз выделенного фрагмента ДНК, полученного при действии первой рестриктазы) расщепления. При построении рестриктных карт использовали результаты гибридизации блотов фаговых рестриктов со специфическими зондами. Рест-риктный анализ клонов ХР71, и ХР7З показал их идентичность, что можно объяснить амплифицировашгостью скршшруемой геномной библиотеки. На рис. 2 приведена рестриктная карта геномной вставки (16.9 т.п.н.) клона АР?1.

б в в

ХР81 I I ХР^7

ев е в в ев б

_Ц_I_I 1 , I.,

5 е в

Ж-

е в в

ев в

Е В Е В Б

и_и_^

Рис.2. Физическая карта перекрывающихся геномных вставок клонов Л.Р71 и ЛР77. Ломаная линия - плечи фага А.. Большие прямоугольники соответствуют областям ДНК, содержащим фрагменты гена ФДЭ^. Маленькие прямоугольники соответствуют положениям олигодезоксирибонуклеотидных зондов I, II и ИТ. Буквами обозначены рестриктазы: В-ВагпН I, Е-ЕооП Т, С -За1 Т.

ВашН I - Sali - Фрагмент вставки клонов А.Р71, W72 и ХР7З длиною 3.3 т.п.н. гибридизовался не только с кДНК ФДЭ^ быка, но и с синтетическим олигодезоксирибонуклеотидным зондом I, соответствующим N-концевой области белка (с 1 по 30 нуклеотид кДНК ФДЭ^ быка; 5'-ATGAACCTGGAGCCACCCAAGGCCGAGATC). В то ке время, ДНК этих фагов не гибридизовалась с зондом II (с 241 по 270 нуклеотид кДНК ФДЭ7 быка; 5'-CTGGCCCAGTACGGCATCATCTAGCCC TGG) и с Stu I - Sma I - фрагментом (134 п.н.; 215 - 348) кДНК ФДЭ^ быка, соответствующим С-концевой области бежа. Основываясь на результатах этих гибридизаций мы пришли к выводу, что клоны W7I, ЛР72 и \?73 содержат только часть гена 7-субъеди-ницы ФДЭ.

Для поиска недостающей части гена, кодирующей С-концевую область белка, был использован метод "прогулки по хромосоме" (Bender et al., 1983). Этот метод требует внимательного подхода, поскольку используемый в качестве зонда фрагмент геномной ДНК может содержать различные повторяющиеся последовательности. Гибридизация геномной библиотеки с таким зондом приводит к выявлению как истинно позитивных, так и псевдополоштольных клонов. Простым и надежным методом отбора зондов является их предварительная блот-гибридизация по Саузерну с рестриктами геномной ДНК.

В настоящей работе в качестве зонда для вторичного скрининга геномной клонотеки был выбран краевой Nar I - Sal I -фрагмент геномной вставки фага Ä.P7I длиной 1.2 т.п.н. Рескри-нинг потенциальных положительных клонов с ник-транслированным Stu I - Sma I фрагментом кДНК ФДЭ^ быка позволил идентифицировать клон А,Рт7, ДНК которого гибридизовалась и с олигодезокси-

- Э -

рибонунлеотидными зондами I и II. Физическая карта геномной вставки (18.2 т.п.н.) клона ХР77, содержащей полноразмершй ген ФДЭ^, представлена на рис.2.

3. Структурный анализ гена 7-субгединицы ФДЭ человека.

Фрагменты ДНК клонов (Bairií I - Sal I - фрагмент длиною 3.3 т.п.н.) и Л.Р77 (EcoR I - EcoR I и BamH I - EcoR I -фрагменты длиною 6.8 т.п.н. и 2.6 т.п.н., соответственно) (рис.2), дававшие положительный сигнал гибридизации с ник-транслированными фрагментами кДНК ФДЭ^ быка и олигодезоксири-бонуклеотидными зондами I и II, были переклонированы в плаз-мидные векторы pSP65, pUC8, pUC19 и проведен их детальный рестриктный анализ. Нуклэотидная последовательность субклони-

рованных фрагментов определялась по методу Максама-Гилберта

«

(Maxam, Gilbert, 1977) в твердофазном варианте, разработанном Чувпило и Кравченко (Chuvpllo et al., 1984). Стратегия установления нуклеотидной последовательности показана на рис.3.

Сравнительный анализ установленной нуклеотидной последовательности фрагментов БашН I - Sal I (3.3 т.п.н.) и BamH I -EcoR I (2.6 т.п.н.), содержащих три экзона, которые несли информацию о полной первичной структуре белка, с недавно опубликованной последовательностью кДНК ФДЭ^ человека (Tutela et al.,'1990) показал, что лидерная последовательность представлена в гене, по крайней мере, двумя экзонами, поскольку экзон, кодирующий первые 49 аминокислотных остатка, содержит последовательность, соответствующую только части б'-нетранслируемой области. При помощи блот-гиОридизации рестриктов клоное ?„Р71 и

Р Р5 Е В Б М Р Б Б Р N Б Б X В Б Р Бр 1

-ЮООпн-

рРЯ97

рРЯ7

рРЯ67

рРГШ рРЯ107 рРЯ17 рРЯ27

рРЯ57 рРЯ77

рРЯ127

рРЯ 87

рРРШ

рРЯД7

0

1

Рис.3. Организация гена ФДЭ^ и стратегия установления его нуклеотидной последовательности. Черные прямоугольники соответствуют экзонам, заштрихованные -интронам. Показано расположение субклонов и указаны сайты рестрикции, исполь-зовашшо для субклонирования и секвенирования по методу Максама-Гилберта. Стрелки указывают направление секвенирования и их длина соответствует длине установленной нуклеотидной последовательности. Обозначения: В-ВагпН I, Е-ЕсоКГ, М-М1и I, №4Гаг I, Р-Руи II, Б-Бша I, Бр-БрИ I, Х-ХЬа I.

й "3 aj

1 °

О

_ 514В ~ 4973 '- 4277

^ - 3530

Q О

20Й7 — 1904

Рис.4. Радиоавтограмма гибридизации рестриктов ДНК клона Х.Р71 с олигодеэоксирибонуклеотидним зондом III.

А.Р77 с олигодезоксирибонуклеотидным зондом III (с -99 по -83 -нукле'отид; 5*-GCACTCACAGCACAGCC), синтезировашшм на основе кДНК ФДЭ^ человека, бил выявлен ВашН I - EcoR I - фрагмент длиною 1.8 т.п.н. (рис. 4). Структурный анализ этого фрагмента подтвердил результаты блот-гибридизации и показал наличие эк-зона, соответствующего недостающей части б'-нетранслируемой

CTGGCTGTTCAGGGTCACACTTCTCTCCCTGTCCCGGCCCCATCTGCTGGGTGTCCTTCC бО

TTGGAGCCCTTGACAGCACCTGAGCCCCTCCTCTCCATCCCCTGAACCTTGGTGGTTGTG 120

CCCCCCCTCGGGGCCAACAATCTCATTAGGGTGGCACTGAGACGCCTAATCAGCTCATGA 1SO - *

AGCAGCGAGATAAAGGCCGGGGCTGGCACCCAGCACTCACAGCACAGCCCCCTGAGACCC 240

GCCCTGCACTTG gtgagtagtggccaaccccgctgtatttcctggcagccactttcccc 299

с

cagtgagtcagtgggggtctgctcatcacccaaggggcagagggagctgacaggctttta 359

ccaccgtggctgaggtctgcagatgcctacccgccaccctgttattcagaggggactcco 419

aeocaacotoctcototgotcccccatggtaaccagtgottccaccatcccaggccagtg 479

atggtctgggaaoctcaggccacgtgggctcagotgacctgagtgacgccagtcacaggo 539

tgggtcgggct&gggcagcgcaggcagcggtttccacatggatggcatctgatggttgga 599

gctccatcagggcccagagotgoccaggacagcccatgtcocagggctggagaagcagct 659

ggacggggcctgtgctatctaggatatcaggattgggtgccatgggatctgagcagctgg 719

gaccaccgggctcctgagtgctggttttgcacaggctggtgctggtcccagtcccgggaa 779

cagaggctgaaccttagtgagggaaggtgccatggcagggtccaccccaatccggtgcco 839

agcaccocttgcagagcccgogtccccoaaatgggcoacctgcocttgctttctgatoao 899

tctcacgoctgaagctcggcaaacagctggtagtagcccagggctggagtcaggaatccc 959

agccaaaaagaccaggggcaggaaaggggaccccaagaggtggtccctggggcatccagt 1019

gcgggcaagcagcccctcctgtctgtgtcatgtgcctccttccagaactttccggcagoa 1079

tgtgcagctgacagcagctcgatgggagattaggaattcttcctctgctgttaataggct 1139

taggggaagctgaactgcccttggcccoggtce.ctsssgagaggctgtagggagaggagg 1199

aggagaggccaccctgtgcagcagtgcagggacactgatctcgtccagagcggccgaggc 1259

cttcagccacgccacgccacgccaggcgggtgaccctgctccccgagctgactccagaca 1319

cagagngggcctgtgattcocccagcagggggaacacatgcccggcaccctccgtcccca 1379

aeocccagcttgtccctctatgaagtggggttggggaacgcagggcttcacagctcagca 1439

ocaagtctctgagacaggcccctttcccaggsgcgccgtgcctggggacccgcccccatt 1499

ttgtgggtcattctccatcagcactgcggggtgcccgtcatggtgctgcggsgctcaggg 1559

atgoctccgtgagtgggtgaagggaactgacagcaccccaactgcaaagcacagacaaga 1619

ggcagaaagoaataaacccatcaataagaatcasaggggttggccgggcgcagtggotca 1679

cgcctgtaatcccagcactttgggaggccaaggtgsgtggatcacgaggtcaggagatcg 1739 agaccatcctggctaacatggtgaaactccatctctactaaaaaatacaaaaaaaaaaaa 1799

taaattagccgggcgtggtgtcgggcgcc-tgtagtcccagctactggggaggctgaggca 1859

ggagaatgacgtgaacccaggaggtggagcttgcagtgagctgagatcgttgccactgca 1 91 9 ctctagcctgggcaacagagcgagactccgtctaaaaaaaaaaaaaaggtgagattccag 1979

ccacagctctggaataggatootaggggotactttggcaggtattaaaaottttttaggo 2039

cgggcgcggtggctcacgcctgtaatccctgcactttgggaggccgaggcgggtggatca 2099

caaggtcaggagtttgagaccagcctgaccaagatggtgaaaccccatctgtactaaaaa 2159

caoaaagaaaaattagotgggtgtggtggogcatgcotgtaatctgagotactooggagg 2219

ctgaggcaggagaattacttgaacccgggaggcagaagttgcagtgagccaagatctcgc 2279

caotgoactccaacctgggtgaoagagcaagactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaag 2339

aatcafisegcaacaecccgggagacgcccaccagctcggaatcagggct»actcgacgcg г3 V >

tgatgagaagcggcaaatcagaacctaaggacacagtg^ctgcagggcggg/^gagacctc 2457

octgagcgggaattgagatggaggcagcccaactaaccatcaggaagíjgct£ctcagag,cj 251 ')

ctoctctgctgg^cctggcaggccoattoccagcaggagccaeagaggactttcatcogo 2579

gtagcagctgggccgggtgcggtggctcacgcctgtaataccagcactttgggaggctga 2639

Bgcgggtggatcatgaggtcaggagttcgagacaacctcgtcaacatggtgaaaccccgt 2699

Btctaotaaaaatgcaaaaatgcaaagattagccgggcatggtggcagacgccggtaatc 2759

scagotgctggggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccgggasccr.gagg'ttcgto 2819

agagccgagatagtgcoactgcacccagcccQggcaacaagagcaaaactctgtctcaaa 2879

ïacaaaacaaaacaaaaaaaacccagagtagcagttaaatgccgacgggagtcacgctto 2939

JCtggggtggggaacgcaggggaaggggcaggaagttg-tcagtggtcacccacaggsagg 2999

tggtgaggactccaggctcaggacctgccacaggttgggaggctaggtttgctgtirgatt 3059

ïtgsgccggggcgagggaggccaggacaggggggagtccggagctgtgtgtggccagcgi; 3119

tgcaggggggcatccactggcaaggggaatgggagcgtgcgggiggacccaagoaaagct 3179

jgcaggctggttacocoagggcggattgcaggggotgctgtotggatgaoso-tggagctg 3239

îcggggctgggtctcagcccctccaccggtgggttgagacccccacaagggttggaagca 3299

Sgagggotgactgggacccggggcctggtctgcccooag ACCGCAGCAGGAGGGAGTCC 3358

LGGAGCCAAGGTTGCCGCGGTGTCTCCGTCAGCCTCACCATGAACCTGGAACCGCCCAAG 3418

U M L S P P К 7

ÎCTGAGTTCCGGTCAGCCACCAGGGTGGCCGGGGGACCTGTCACCCCCAGGAAAGGGCCC 3470

AEFRSATRVAGGPVÏPRKGP 27

¡CTAAATTTAAGCAGCGACAGACCAGGCAGTTCAAGAGCAAGCCCCCAAAGAj'JiGGCGTT 3528

PKFKQRQTRQFKSKPPKKGV 47

¡AAGG gtaagoagagctgggggatggggcctctgaaagggaggaggcggtoctgaggol; 3597

Q G 49

¡cacaggaaggggagggcgcggcagagccagggccac-ttcactgggtgagtggtcccago 3657

itcacagctgggaaatagggcggtgccgagggctgagcagggatggaggagggggaaggg 3717

:aa"ttgggggctcctgtcacccgctccagatgctactgtcaaccatgc ttgaaatacagc 3777

:actgccggccaggcgcggtggctcagcgct;tgggaggctgaggtgggcasatcacctga 3837

•gtcgcgoccggoctaaaaaaagttttaatacotgooaaagtagccooctaggatogoga 3897

;tttgagaccagcctgacaaácatggagaaacctgtctctactaaaaatacaaatttago 3957

aggog-tggtggtgoacgcctgtaatoccagctactoaggaggotgaggcaggagaatcg 4017

ttgaatccaggaggcagaggttgtggtgagctgagatcgcgccattgcactcaggctgg 4077

icaacaagaagaacaaaactccgtctcaaaaaaacaaaagccgggggcggtggctcatgc 4137

tgtaatoccagcaotttgggaggocgaggogggcggatoaogacgtcaggagatogaga 4197

cattctggcta&gaaggtgaaaccctgtctctactaaaaaatacaaaaaat tagccggg 4257

gtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcgggaggotgaggoagsagaatggtgtg 4317

acccgggaggcagagcttgoggtgagocgagatcacgcoactgcactccagcctgggcg 437'."

cagagtgagactccgccaaataaataaaaaaaatacaaccactgccacccagggacagc 4 437

aatggcacaatgcaccgaggagtgtccactcacacatgcgcacacacgggcatctcgct 44'->7

coatcagtgcaccgaggagtgtcoactcaotcgtgtgcgcacacaggoaocgogctcco 4!;s ;

a. lúaactíaaccgtiggngtgtccactcacacgtgtgcgcaoaoacagggcatgacactctt 46

ti lgc&ca¡tacacgctcacacctccacatatgcacgtgagscacac1¡cacagacaagcoao 46'

t¡ l tuucaaa tetacactcagacc&tgoaccaaccacgcacccccccgtaotccoocaggg 47'

imúícaoo tgcccagcatcctgggacttgcaco toctt t totaggcc tcagccccatgat 47'

tí;> lo l(j:;;í:ca£oaí;actcaccttgggtc'tg-igagggüagcctcc'tcagatgcgccaagco 48!

o Ifi&u^ir.;: t t£ü;esaggaggcgggtctcgtcccactgggctcccagccaaacacctcatc 49

lii.^ latigtiHESC tagagatgacctcggcctcaggotgactgagccaggactgggcccggo 49'

isttttítccotKagtgctcietoottsoag GTTTGGGGACGACATCCCTGGAATGGAAGGC 50:

FGDDIPGMEO 59

ü'L'üGGAACAG gtatgacggctgccagtaccaacccgaggtctgcccaggtcoocccaga: 50'

L G T D 63

üUcacooafícacgoocaKggoccattgcagoocacotoggococoacotocccfcgctttt 51!

oac t tfifíjvjaccccoagcc tgtccatcact tet tccoccaaoaotgago tccagatccac 52

tggatct'^e^aí^tcsí'fíotgtccocatttgsgacaotttgcaocaggtgaggggaggfcg 52'

t ttí;í¿-naa¿'Kasdnaaoooo t cgctgcc tootccotcagcaagcoooaocctcctotEíí 53:

ttocctccactí:f;acctgGtgcaoccaccctoottccccaoagocagtgtgtbcccagag 53'

H'iBEfiooc.cao tccagcgtccgcacgtcccogotoatcaoactgtagggo tacaoo tggg 54!

o t¿5^í'as«aacañssocaca£gK3atgggsgggtcoctaggocgtgijgatcctctc tgat 55

ccgt££3cc£ tt le tcccaco&ACATCACAGTCATCTGCOCTTGGGAGGCCTTCAACCAC 55'

ITVICPY/EAFNH 75

GTGÜAGCTGCACGAGCTGGCCCAATATGGCATCATCTAGCACGAGGCCCTGCTGAAGTCC 56:

LELHELAQYGII *«« 87

AGACCCTCCCCCTCCTGCCCACTG'TGCTCTAAACCCTGCTCAGGA'rTCCTuTTüAGGAGA 56'

TGCCTCCCTAGCCCAGATGGCACCTGGACACCAGGATGGGACTGCAACCTCAGGTCTCCC 57!

CCTACATA'I'ÍVJVTACCAGTCACCAGGAGCCCACCACCTCCCTCTAGGATGCCCCCTCAGO 58

GTGGCCAGGCCCTGCTCAACATCTGÜAGATACAGGCCCACCCCTCAGTCCTGCCCACAGA 58'

GAGüC'rrGGTCGGTCTCCACTCCCAGGGAGAACGGGAAGTGGACCCCAGCCCGGGAGCCr 59:

GCTGGACCCCAGATCGTCCCCTCCTCCCAGCTGGAAAGCTAGGGCAGGTCTCCCCAGAGT 59'

GCTTCIT.CACCCCAGCCCCTGTCCTGCCTGTAAGGGGATACAGAGAAGCTCCCCGTCTCT 60!

GCATCCCTTCCCAGGGGGGTGCCCTTAGTTTGGACATGCTGGGTAGCAGGACTCCAGGGC 61

G'fGCACGGaGAGCÁGATGAGGCCCCAAGCTCATCACACCAGGGGGCCATCCTTCTCAATA 61'

CAGCCTGCCCTTGCAGTCCCTATTTCAAAATAAAATTAGTGTGTCCTTGCCTGTCTGTGG 62:

CATATn'GTGCATGGGACAGGGCCTGTGGTGGGGTCACTTGAGTTGAGCCGGAGGACATa 62!

GGGGÍAGGGGTCGGC AG'ÍGGGGCAGGAGGGGCTGGCCTGCCTGAGTGGGAAGCACGCCCT 63!

TGGGCTCACACTCTCACTGACCCTTGCTGGTGGCCCCAAGACACGCAATGTCAGGCCATG 64

GCl'GGGTGAAOGCAGA AGGCCTTGGTGCACACCCAGGGGCCATAGTCAACGAAGC 64'

T-i'.c. 5. 1{уклеот;даая последовательность гена ФДЭ.^ человека. Но, чс-г-кь-у:«: гюуыщяальюю рагулкторние аломенти- ("GAAT", "TATA" "и';") :: са,".т тюл^адег.илирозгашн ("ААТААА"). Стрежой указан нукл< о"::.:-, DCú'.-iiC'ro'i'iiyi'-ч-.'' первому нуклеотиду к.ДНК Ф.ЦЭ человека.

власти.

Таким образом, било установлено, что ген СДЭ человека

I

асполагаотся на участке ДНК размером около 6,4 т.п.н. и со-тоит из четырех экзонов (I, II, III и IV), разделенных тромп нтронами (рис.3, 5). Определение геномной организации гона ЦЭ^, человека не вызывает сомнений, во-первых, благодаря воз-эжости сравнетш нуклеотидных последовательностей гена и кДНК ЩЭ^ быка, мыши, а, впоследствии, и кДШ человека; во-вторых, з-за наличия характерных донорных и акцепторных сайтов сплай-шга на границах экзон-интрон. На рис. 5 приводена полная ну-теотидная последовательность гена ФДЭ^, а также соответству-;ая ей аминокислотная последовательность белка. Экзон I соот-»тствует части б'-нетранслируемой области и отделен от экзона '. наиболее протяжешшм интроном I (3087 п.н.). Экзон II со-фжит последовательность, соответствующую оставшейся части [дерной (59 п.н.), и кодирующую область (146 п.н.), вк.тачаю-ю кодоны первых 49 аминокислот (кодон 49-й аминокислоты Gly збиваотся интроном II (1462 п.н.)). Экзон III (39 п.н.) со-ветствует следующим 14 аминокислотным остаткам (кодон 63-й инокислоты Asp разбивается интроном III (491 п.н.)). йз-стно, что интронн чаще всего разбивают кодокы гидрофильных шюкнелот. В gтом отношении ген ФДЭ^ человека но составляет ключение. Последние - с 64 по 87 - кодоны, а также З'-не-анслируемая область представлены экзоном IV. З'-Нетранс-руемая область содержит консенсусную последовательность Г AAA (6204, рис.5), соответствующую сигналу полиаденилиро-шя mFHK .

Структура участков границ экзонов и интронов (структура

таблица 1. Участки сплайсинга гена 7-субъединицы ФДЭ человека.

Номер интрона

I

II

III

Последовательность в области участка сплайсинга:

Экзон

Интрон

5'-донорная 3'-акцепторная

Экзон

252

АСТГО gtgagta..,

3543

САЛСС gtaagca.., ИпО!

5046

ААСАО £га12ас. ТИгА

. 3086 п.н. . 1462 П.н. .. 491 п.н.

,.сссссав АССвО

..cttgcag СТТТС уР1ге

.сссасая АСАТС зрИе

5'- и 3'- сплайс-сайтов) совпадает с канонической последовательностью, приведенной в литературе и отвечает СТ/АИ правилу (рис. 5, Таблица 1). Как известно, для многих генов на расстоянии 10-40 нуклеотидов от 3*-конца интрона выявляется еще одна общая последовательность СТдА^, которая наряду с 5'- и 3'-сплайс-сайтами участвует в процессе сплайсинга про-мРНК (ин-трони группа II). Эта последовательность обнаружена также в интронах гена ФДЭ^ и локализована: в интроне I (СТвАС - 3306) на расстоянии 28 нуклеотидов, в интроне II (СТОАС - 4956) -49 нуклеотидов и в интроне III (СТСАТ - 5511) - на расстоянии 22 нуклеотидов от 3'- конца интрона (рис. 5).

Предполагаемая промоторная область (51-фланкирующая область гена) содержит потенциальные регуляторные элементы -ТЛТЛ-блок (АТААЛ - 189) и СААТ-блок (СААТС - 138) (рис. 5).

Кроме того, в 5'-нетранслируемой обла.ти (экзон I) обнаружена последовательность (СССССС - 238), соответствующая СССССС-ге-ксануклеотиду (в инвертированной форме) - сайту взаимодействия с транскрипционным фактором Бр1. Однако, необходимо отметить, что ОС-элемент характерен для промоторов генов, работающих конститутивно и обеспечизающих общеклеточннэ функщш (гены "домашнего хозяйства" или ТюивекеерЬщ гены), тогда как, ген 7-субъединицы фоторецапторной фосфодиэстеразы цГМФ является высокоспециалязированным и относится к генам "роскоши". Опре-делегаую ясность в вопрос об участии этих последовательностей . (АТААА; СААТ; ССССССС) в регуляции генной экспрессии,, могут внести результаты дополнительных экспериментов (например, ДМС или ДНКаза I футпринтинг анализ, метод линкерного сканирования и др.).

Анализ последовательности экзонов гена ФДЭ^ человека и ее сопоставление с кДНК ФДЭ^ быка и мыши (рис. 6) выявило высокий уровень гомологии между кодирующими областями (с кДНК ФДЭ^, быка - 92,05й, с кДНК ФДЗ^ мыши - 90,15%). Довольно высокая степень гомологии наблюдается и в области соответствующей 5'-нз-транслируемой: с кДНК быка - 75% и с кДНК мыши - 50,9®, причем, интересен тот факт, что если уровень гомологии между Б'-нетранслируемой областью кДНК мыши и соответствующей последовательностью экзона II гена ФДЭ^ человека достигает 76,3%, то по отношению к экзону I это значение составляет всего 21,3%. Наименее консервативной является З'-нетранслируемая область (уровень гомологии между последовательностями ФДЭ^ человека и быка - 20,4%, между последовательностями ФДЭ^ человека и мыки - 22%).

и ...........................................

1 CCAGCACTCACAGCACAGCCCCCTCAGACCCGCCCTGCACTTG gtga£a...KHTpoH I (306611.н.).. . 111 CAGCGCCGG'iTATCTGTCCAGTGCTTGCCTCCATGAGGACACC

......CCCTCAGGCAGTCCAGAAGCTCAAGGTCAMCCGGGATCTCTGCCAACCTCCCC 'ATG

.....cccag ACCGCAGCAGGAGGGAGTCCAGGAGC CAAGCTTGCCGCGGTGTC1CCGTCAGCCTCACC ATG

AGCCCAGCCTGACACAGTCCAGAAGCTAAGCGTCAMGCAGTCTCTCTGCCAGCCTCACC ATG

ААС стс GAG CCA CCC AAG CCC GAG АТС CCG TCG GCC ACC АСС CTG ATG CGC CGA CCC

« • • • • • «« a

ААС CTG GAA CCG CCC AAG CCT GAG TTC CCG TCA GCC ACC AGG GTC CCC GGC CGA CCT

« • • • * • •• • «

ААС CTG CAG CCA CCC AAC GGT GAG ATT CCG TCA CCC ACC AGG GTC ATA GGA GCA CCA

GTC ACT ССС AGG AAA CCC CCC CCG АЛА TTT AAG CAG CGG CAA ACC AGG CAG TTC AAG

СТО АСС ССО AGG AAA gcg CCC CCT AAA rre AAG CAG CGA CAG ACC ACC CAG TTC AAC

СТО АСС ССС AGG AAA CGA CCA CCT AAG ИТ AAG CAG CCG CAA ACC AGG CAG TTC AAG

AGO AAG ССС CCC AAG AAA CCT GTC CAA CG G

АСС AAG ССС CCA AAG AAA GGC GIT CAA GG gtaag..нитрон II (1462П.Н.). . tgcag С

AGO AAG ССО CCC AAG AAA CCG CTG САЛ GG G

ТТТ ССТ CAT CAC АТС OCT CGA ATG CAA GGC CTG GCA АСА С

ТЭТ CCG САС CAO АТС CCT GCA АТС GAA GGC CTG GGA АСА

ТГТ CGG GAT CAC АТС COT CGA ATG GAA GGC CTG CGG АСА С

- AC ATO ACC GTC АТС ТСС CCG TGC GAG GCC TTC

...нитрон III <491П .11.), ....cucag AC АТС АСА GTC АТС тсс CCT TUG CAG CCC TTC

AT АТС ACC CTC АТС тсс CCT TCG CAG CCC TTC

ААС САС CTG GAG ctg CAC GAG CTG CCC CAA TAC CCC АТС АТС TAC

ААС САС CTG CAG CTG CAC GAG CTG GCO CAA TAT GGC АТС АТС TAC

ААТ САС СТА ■ CAG CTG CAC CAC ctc CCC CAG TAT CGC АТС АТТ TAG

l'no.G. Сравнение нуклеотидной последовательности экзонов ФДЭ^ 40jiohjj;a (I) с последовательностями кДНК ФДЭ^ бика (II) и мы-li.u (III). 3'-Нотранслируемья область не приводена, поскольку

гомолог::« с sto?. области практически отсутствует.

Выведенная из нуклеотидной последовательности омпноки-слотная последовательность ФДЭ^ человека содержит 87 аминокислотных остатка и имеет 97,7% гомологии с последовательностью 7-субъедшпщы Оыка (в ФДЭ^ быка в 10 положении аминокислота Не и в 17 положении - Met), и 96,6 % с последовательностью 7-субъединицы мыши (в ФДЭ^ мыши в 8 положении аминокислота Gly, в 10 и 17 положениях - аминокислота lie).

Результаты сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей ФДЭ быка, жги и человека гюка-зали их высокую консервативность.

Обнаружена корреляция экзошюй структуры гена 7-субъеди-ниш со структурой функциональных доменов белка. Данные, полученные при изучении мутантных форм ФДЭ быка, свидетельствуют, что N-концевой домен белка (1-44 аминокислотных остатка), кодируемый вторым экзонсм, содержит активные центры, ответственные за связывание с транедуцином и каталитическими субъединицами ФДЭ, а С-концеЕой домен, кодируемый четвертым зкзоном, принимает участие в процессе ингибированля каталитических субъединиц и в связывании транедуцина. Таким образом, 7-субъ-единица ФДЭ является еще одним примером, подтверждающим гипотезу Гилберта, Блейка и Го о соответствии экзонов структурным и функциональным доменам белка.

Анализ сравнительных данных о распределении аминокислотных замен в ФДЭ^ человека, Сика и мыш показывает, что М-кон-цевой домен белка, ответственный за связывание с транедуцином и каталитическими субъединнцами ФДЭ, является наименее консервативным и более подвержен эволюционным изменениям.

ВЫВОДЫ.

1. В геномной библиотеке человека найдены клопы, содержащие перекрывающиеся фрагменты полноразмерного гена 7-субъеди-ш'цц фоторецепторной цГМФ-фосфодиэстеразы.

2. Установлена полная нуклеотидная последовательность гена 7-субъодиницы ФДЭ человека (6.4 т.п.н.) и определена его окзои-интронная структура. На основании первичной структуры гена выведена" аминокислотная последовательность 7-субъеди-ницц ФДЭ человека. . .

3. Установлено, что ген 7-субъединицы ФДЭ человока является уникальным,' т.е. представлен одной копией и не имеет в гономэ гомологичных структур.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Пириев II.И., Пуришко В.А., Храмцов Н.В., Липкин В.М. Организация гена 7-субъединицы фоторецепторной фосфодиэстера-зы циклического ГМФ человека. - Доклады АН СССР, 1990, т.315, J61. с.229-231.

2. Plriev N.I., Khraintaov N.V., Lipkln V.M. Organization and. nucleotide sequence of the human rod. photoreceptor cGMP. phosphodiesterase 7-subunlt gene. - Biomedical science, 1991, in preas.

3. Пириев Н.И., Торговццкий Д.A., Пуришко В.А., Храмцов H.B., Липкпн В.М. Клонирование, организация и нуклеотидная последовательность гона 7-суСъедшшщ! фоторецепторной фосфоди-

эстеразн циклического ГМФ человека. - Сборник тезисов I Всесоюзной конференции "Геном человека", Переславль-ЗалесскиП, 1990, стр.129.

4. Храмцов Н.В., Атабекова Н.В., Пириев II.И., Пуришко В.А., Липкин В.М. Структурные исследования фоторецепторной фо-сфодиэстеразы циклического ГМФ. - Сборник тезисов Всесоюзного симпозиума "Химия белков", 1990, стр.119.

5. Пириев Н.И., Пуришко В.А., Торговицкий Д.А., Храмцов Н.В., Липкин В.М. Организация гена, кодирующего 7-субъедшшцу фоторецепторной фосфодиэстервзы циклического ГМФ человека. -Сборник тезисов IV Всесоюзной школы-семинара молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии", Рига, 1990, стр.13.