Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Опухоль-промоторный эффект полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Опухоль-промоторный эффект полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)"

иу- 1

2118

На правах рукописи

Болотина Наталья Александровна

ОПУХОЛЬ-ПРОМОТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (ПАУ)

03.00.25-гистология, цитология, клеточная биология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в НИИ Канцерогенеза Государственного учреждения «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Дубовая Татьяна Клеониковна Доктор биологических наук, профессор Кобляков Валерий Александрович Официальные оппоненты: Кандидат медицинских наук, доктор биологических наук,

профессор Кондратенко Вадим Григорьевич

Институт биоорганической химии им/академиков М.М. Шемякина и Ю.А, Овчинникова РАН РФ Доктор медицинских наук,

профессор Ивков Николай Николаевич

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Ведущее учреждение:

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН РФ

Защита состоится «_»_2008 г. в_14_часов на

заседании диссертационного совета Д.208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ " ' *» "стровитянова, д. 1

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А.И.Щегояев

Список используемых сокращений:

АФК - активные формы кислорода

БП - бензо/а/пирен

БеП - бензо/е/пирен

ДМБА - 7,12-диметилбенз/а/антрацен

МЩК - межклеточные щелевые коммуникации

3-МХ - 3-метилхолантрен,

а-НФ - а-нафтофлавон

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды АР-1 - activator protein-1

NF-kB - ядерный транскрипционный комплекс кВ

Общая характеристика работы. Актуальность проблемы.

В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии, клеточной биологи и биологии развития используются самые разные модели. Это обусловлено поразительным множеством и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологи, и для практической медицины. Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др. Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (Канцерогенез, 2004; Trosko, 2000; Loeb et all., 2008).

Среди химических канцерогенов имеются, так называемые, непрямые и прямые. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активный канцероген требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических канцерогенов выделяют «полные» и «неполные». Полные канцерогены способны индуцировать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами. Именно ПАУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей

внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр. Как известно, в течении химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициация, промоция и прогрессия. Что касается ПАУ, то в первую очередь следует обратить внимание на то, что до настоящего времени исследования по механизму их канцерогенного действия были направлены на изучение инициации, поскольку считалось, что именно эта стадия является определяющей в развитии опухоли при действии непрямых канцерогенов (ВоШУ/еП е1 а1., 1982; Тгоэко е1 а!., 1996). Попытки применения и разработка новых препаратов, ингибирующих стадию инициации (в первую очередь антиоксиданты, ингибиторы свободно - радикальных процессов) успеха не принесли. Исследования последнего времени дали основания считать, что стадией, определяющей канцерогенность ПАУ, является стадия промоции (ТЫИу W.2003). Поэтому изучение механизмов промоции при действии непрямых канцерогенов является важной и актуальной задачей, дающей в перспективе возможность создания профилактических и лечебных препаратов, препятствующих (или замедляющих) развитию опухолевого процесса.

Цель исследования - изучение механизмов опухоль-промоторного действия «полных» канцерогенов на примере ПАУ на модели культуры клеток гепатом. Задачи исследования:

1. провести сравнительное изучение действия канцерогенных ПАУ и их неканцерогенного аналога на функциональную активность межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК) в культуре клеток гепатом, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма и АЬ-рецептор.

2. исследовать образование активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при действии канцерогенных и неканцерогенных ПАУ;

3. сравнить экспрессию белков-супрессоров р21 и р27 в культуре клеток при действии ряда ПАУ.

4. исследовать влияние ПАУ на активацию транскрипционных факторов АР-1 (activated protein 1) и NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс кВ).

Научная новизна работы.

В нашей работе впервые использована в качестве сравнительной модели для изучения опухолевой промоции уникальная культура клеток гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

Проведенное сравнительное исследование показало, что наблюдаемые нами эффекты ПАУ, ассоциированные с промогорной стадией канцерогенеза (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционного фактора NF-kB) обусловлены действием исходной химически инертной молекулой вещества.

Мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

Впервые продемонстрировано существование ранее неизвестного механизма опухоль-промоторного действия канцерогенных ПАУ. Практическая значимость работы.

Известно, что в химическом канцерогенезе выделяют 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, нами установлено, что нарушение функционирования МЩК, активация некоторых белков, регулирующих клеточную пролиферацию и апоптоз на стадии опухолевой

промоции, вызываются исходной биологически инертной молекулой ПАУ, по ранее неизвестному механизму.

Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции.

Полученные результаты важны для экспериментальной онкологии, гистологии, биохимии и молекулярной биологии, кроме того, их целесообразно учитывать при разработке новых способов лечения и профилактики онкологических заболеваний.

Внедрение в практику Полученные диссертантом данные внедрены в лекционные курсы на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного факультета и биохимии РГМУ. Основные положения выносимые на защиту:

1. Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии АЪ-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

2. Выявление новых аспектов механизма канцерогенного действия ПАУ на стадии промоции опухолевого роста было возможно в связи с:

- сравнительным изучением действия ПАУ на модели культуры клеток гепатом с экспрессией АЬ-рецептора и цитохрома Р450 (НерС2) и без таковой (Г-27) как наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта ПАУ

- использованием комплексного методического подхода для оценки состояния клеток с применением морфологических, биохимических, биофизических, иммунологических, молекулярно-биологических методов

3. Канцерогенные ПАУ оказывают воздействие на ключевые функции клеток: подавляют функциональную активность МЩК, влияют на пролиферативную активность клеток и апоптоз.

4. Полученные результаты позволяют высказать предположение о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках неизвестного ранее фактора, взаимодействие с которым канцерогенных ПАУ нарушает гомеостаз, приводящий к промоции.

Апробация работы. Материалы исследования доложены и обсуждены на совместной научной конференции кафедр гистологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ и морфологии медико-биологического факультета РГМУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 7 из них - в центральной печати. Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения и глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и выводов. Работа проиллюстрирована - 21 рисунком, 2 таблицами. Библиографический материал включает в себя ссылки на 160 источников литературы, в том числе 20 отечественных и 140 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследований.

В экспериментах использовались клеточные культуры 2-х типов гепатом. Гепатома Г-27 - низкодифференцироваыная перевиваемая опухоль, вызванная диэтилнитрозамином (Швемберг 1970). Клетки гепатомы человека HepG2 были получены из АТСС (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA). Выбор данных клеточных культур объясняется отсутствием ферментов цитохрома Р450 и Ah-рецептора в клетках культуры Г-27 в отличие от клеток культуры HepG2. Благодаря чему, имеется возможность сравнить воздействие ПАУ на клетки в присутствии и отсутствии системы цитохрома Р450.

В экспериментах в качестве канцерогенных ПАУ использовались: бензо/а/пирен (БП), 3-метилхолантрен (3-МХ), 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) и неканцерогенный аналог БП - беизо/е/пирен (БеП).

В работе определялись нижеописанные параметры

Функциональная активность межклеточных щелевых контактов (МЩК). Проницаемость МЩК определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя Люцифера желтого СН (Sigma США) в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией распространения его в соседние клетки. Флуоресценция регистрировалась при помощи флуоресцентного микроскопа Axiolab (Zeiss, Германия) с фазово-контрастным освещением и 40 водно - иммерсионным объективом и видео камерой CCTV (Panasonic Япония), соединенной с компьютером. Окрашивание клеток происходило через 2 минуты после инъекции. Определение уровня бсизо/а/пирена (БП) и бензо/е/пнрена (БеП) в клетках производилось методом квазилинейной люминесценции при низких температурах. Количество БП определялось при Х298 ,0збу*дсни« и Х^оэфлуоресющни, а для БеП при

возбуждения И Хз88флуорссцснии>|.

Реакция связывания NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс 1(B) и АР-1 (Activator protein 1) с консенсусным олигонуклеотндом (Elcctrophorctic Mobility Shift Assay, EMSA). Белковый экстракт из ядер для проведения реакции получали как описано ранее (Lyakh et al., 2000). Реакцию связывания проводили следующим образом: инкубировали 10 микрограммов ядерного белка в 20 микролитрах связывающего буфера (HEPES (pH 7.5), 10 шМ; KCl - 80 mM; EDTA - 1 шМ; EGTA - 1 тМ; глицерол - 6%, nortH(dl-dC) - 0.5 мкг и консенсусного олигонуклеотида, меченого по 5'-концу фосфором згР (1 х 105 - 3 х 10! срт). Реакцию мечения проводили согласно протоколу производителя нуклеотидов (Promega Corp., Madison, США). Комплексы белок-олигонуклеотид анализировали в 6% нативном ПААГ, содержащем 0.25-кратный буфер ТБЕ. Высушею1ый гель экспонировали с пленкой Кодак при -80° в течение 1-7 суток.

Электрофорез и Иммуноблотгянг. Клетки на стадии формирования 80% монослоя промывали физиологическим раствором, снимали с чашек и получали клеточные экстракты как описано ранее (Красильников М.А. и др., 2004). Электорофорез образцов, содержащих по 60 мкг белка, проводили в 12,5% SDS-ПААГ геле и переносили на нитроцеллюлозные фильтры Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford, США) методом электропереноса.

Антитела к 1кВ были получены из Santa Cruz Biotechnology Inc., США и к фосфо-5ег32-1кВ - из Cell Signaling Technology Inc, США и к p21ci|"Klp(Sigma) и p27Clp/K,p (Sigma). Инкубация с AT к 1кВ длилась 1,5 часа при комнатной температуре, а к фосфо -Ser32-IkB - 12 ч (в буфере без молока) при 25°С. Инкубация с AT к р21 и р27 длилась в

течение 12 часов при комнатной температуре. В качестве вторичных для AT к IkB и фосфо -Ser32- IkB использовались кроличьи AT, коныогированные с пероксидазой (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). В качестве вторичных для AT к р21 ир27 использовались мышиные AT, коныогированные с пероксидазой (Sigma). Проявление специфического сигнала осуществлялось с помощью системы ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция).

Для оценки интенсивности иммуноблотинга с AT к р21с'р/Кф и р27С|р/К|р использовали программу Scion Image (версия 4. 02) Scion corporation США.

Транзнторняп трансфекции н определение активности гена-репортера. Для

транзиторной трансфекции клеток использовалась плазмида, содержавшая ген-репортер-люциферазы под контролем промотора с NF-kB-чувствительным элементом, любезно предоставленной профессором A.B. Гаспарьяном.

Для контроля за эффективностью и потенциальной токсичностью процедуры трансфекции применялась котраисфекция клеток плазмидой, содержащей ген ß-галактозидазы. Клетки выращивались на 24-луночной плашке и на стадии формирования 50-70% монослоя трансфецировались плазмидами. В качестве трансфекционного агента использовался PolyFect (Qiagen). Через сутки после трансфекции клетки инкубировались в течение 24 часов с исследуемыми ПАУ в концентрации S мкг/мл среды. Далее клетки лизировались как описано ранее (см. Электрофорез и Иммуноблотинг).

Активность люциферазы измерялась по стандартному протоколу (Promega, США) на люминометре Turner BioSistems 20/20п (США).

Активность ß-галактозидазы измерялась по стандартной методике, основаной на использовании в качестве субстрата ß-галактозидазы ONPG (О-нитрофенил-b-D-галактопиранозидазы) (Sigma-Aldrich). Расчет относительной активности люциферазы проводили в условных единицах (отношение общей активности люциферазы к активности галактозидазы в исследованных образцах).

Определение влияния ПАУ на образование активных форм кислорода (АФК) в клетках гепатомы Г-27. Клетки выращивали на 60 миллиметровых чашках до монослоя 80%. За сутки до исследования к клеткам добавлялся БП или БеП. Затем к ним добавлялся флуоресцентный краситель диацетилдахлорофлуоресцеин до конечной концентрации 10 микромолей на миллилитр среды, клетки инкубировались с красителем в течение 30 минут при 37° С. Контрольные клетки после инкубирования с красителем промывались теплым раствором Хенкса и инкубировались с перекисью водорода 45 минут при 37° С в концентрации 2 милимоля на миллилитр среды. Среда

сливалась, клетки снимались холодным Версеном и переносились в холодный раствор Хенкса. Диацетилдихлорофлуоресцеин при проникновении в клетку и взаимодействии с АФК, например, такими как перекись водорода, гидроксильный и супероксидный радикалы, окисляется ими до флуоресцентного соединения.

Уровень образования АФК в клетках гепатомы Г-27 определяли методом проточной цитофлоуметрии после окраски клеток красителем дихлородиацетипфлуоресцеином в цитомстре FACSCalibur (Becton Dicinson, USA).

Дальнейшую компьютерную обработку данных проводили с помощью программы WinMDI 2.9 (Joseph Trotter, La Jolla, CA, USA). Результаты исследований н их обсуждение.

1.Ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии ПАУ в культуре клеток HcpG2.

Как ранее упоминалось, одним из событий опухолевой промоции является нарушение межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК). С целью изучения действия ПАУ на МЩК были выбраны клетки гепатомы человека HepG2 с достаточно высоким для опухолевых клеток уровнем функциональной активности МЩК.

Как видно из рнсунка 1, люциферовый желтый эффективно окрашивает рядом лежащие клетки, в которые ввели краситель. Рисунок l(c,d) демонстрирует, что часовая экспозиция бензо/а/ггарена (БП) в концентрации 5мкг/мл вызывает значительное подавление перетекания красителя в соседние клетки. Было установлено, что после часа воздействия БП отмечается выраженный (более 80%) эффект ингибирования МЩК (см. рис. 1), 3-метилхолантрен (3-МХ) демонстрирует слабый ингибирующий эффект на МЩК (см. таблица 1). Для исследуемых канцерогенов эффект ингибирования МЩК вызывали при 24 часовом воздействии на клетки. Наиболее сильный ингибирующий эффект продемонстрировали БП (до 100%) (см. рис. 1) и 7,12-диметилбенз/а/антрацен (ДМБА) приблизительно -75% (см. таблица 1). Неканцерогенный бензо/е/пирен (БеП) ингибировал МЩК после часа икубирования на 10% и на 19% после суток воздействия (см. таб.1; см. рис. 1).

Эффект БП на ингибирование МЩК в культуре клеток гепатомы Нер02 зависел от его концентрации. Эффект БП становится выраженным при

Рис. 1, Эффект БП и БеП на распространение лгоциферового желтого в культуре клеток Нер02, Концентрация обоих соединений составила 5 мкг/мл среды, (а, Ь) Контрольная культура; (с, с!) БП время инкубации 1 час; (е, £) БеП время инкубации 1 час; К) БеП, время инкубации 24 часа. Фазово-контрастные (а, с, е, g) и флуоресцентные изображения (Ь, с1, £ Ь) Крестиком указана метка, в которую введен краситель.

Как известно, одним из свойств опухолевых промоторов является обратимость их действия после прекращения воздействия. Этот феномен, характерный и для ПАУ, был продемонстрирован на примере БП. После инкубирования клеток в течение часа в среде с концентрацией БП 1.25мкг/мл путем трехкратной смены культуральной среды вещество удалялось. Е результате этого отмечалось восстановление МЩК с 29.4% до 65% пс сравнению с контролем. Частичное восстановление МЩК можно объяснит] только высокой липофильностью БП, так как полное его удаление и: клеточной мембраны требует более длительной отмывки. Для ответа на вопрос, связано ли нарушение функционирования МЩК по; действием ПАУ с образованием их активных метаболитов, был исследова! эффект ингибитора метаболизма ПАУ (а-нафтофлавона) на блокировани МЩК 3-метилхолантреном (3-МХ). Как видно из рисунка 2, сам а нафтофлавон (а-НФ) не влияет на МЩК и не изменяет ингибиторног

концентрации 0,6мкг/мл.

эффекта 3- метилхолантрена. Таким образом, ингибиторный эффект ПАУ на МЩК не связан с формированием его активных метаболитов.

Рис. 2 Эффект 3-метилхолантрена(3:МХ) и а-нафтафлавона(а-НФ) на распространение люциферового желтого в культуре клеток Нер02. Концентрация 3-МХ-5мкг/мл, а-НФ-5 мкМ; время инкубации 24 часа. Показаны фазово-контрастные (а, с, е, 8) и соответствующие им флуоресцентные изображения (Ь, с1, £ Ь). а, Ь-контроль; с, ё- 3-МХ; е, £ а-НФ; д, Ь- 3-МХ+ а-НФ. Крестиком показана клетка, в которуювведен краситель.

Таблица 1 Эффект различных ПАУ на прницаемость МЩК в клетках гепатом Нер02 и Г-27 при экспозиции 1ч и 24 ч. Эффект выражен в % окрашенных клеток к контролю.

ПАУ(5мкг/мл)а Клетки Время воздействия

1чпс 24 чпсл

беизо/п/пнреи (20рМ) НирСН 12.9 ±1.3 0

7,12-димстилбнзпнтряцен (20цМ) Нер02 98.9±1.1 36.3±0.7

З-метнлхолпнтрен (19цМ) Нер02 98.3 ±1.2 21.8 ±0.5

а-пяфтофлпвом (5дМ) НерС2 108.1 ±12.6

а-няфтофллвон (5цМ)+ 3-метилхолпнтрен (19цМ) Нербг 21.7 ±5.3

бензо/с/ппрен (20цМ) Нер02 91.5 ±8.8 81.0 ±1.0

беюа/я/пирси (20цМ) Г-27 11.5 ±3.4 0

В контроле за 100% принимается среднее (из 7-11 инъекций) количество окрашенных соседних клеток через 2 минуты после инъекции красителя в одну из клеток монослоя. В контроле для клеток Нер02 среднее количество окрашенных клеток составляет 11, а для Г-27 - 7 клеток.

2. Ингибирование межклеточных щелевых контактов ПАУ в культуре клеток Г-27.

Для ответа на вопрос о роли метаболизма ПАУ и АЬ-рецептора в эффекте беизо/а/пирена (БП) на функцию МЩК мы использовали культуру клеток гепатомы Г-27, в которой, как было показано, отсутствует экспрессия изоформ цитохрома Р450 и АЬ-рецептора. Рис 3(а,Ь) демонстрирует перетекание красителя в клетках гепатомы Г-27 без воздействия, а рис. 3(с,с1) показывает ингибирование перетекания красителя при воздействии 5 мкг/мл БП в течение 1 часа. Экспозиция БП клеток гепатомы Г-27 а течение 24 часов вызывает ингибирование МЩК на 100% (см. таблица 1). Неканцерогенный БеП в дозе 5 мкг/мл в течение 1 часа и 24 часов не влиял на функционирование МЩК. (рис. 3 е,Г; §,Ь)

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что ингибирование МЩК канцерогенными ПАУ осуществляется исходной неметаболизированной молекулой и не зависит от его взаимодействия с АЬ-рецептором.

Концентрационная зависимость действия БП на ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 идентична тому, что показано для клеток гепатомы Нер02, из чего можно сделать заключение, что в клеточных культурах обоих типов гепатом эффект БП вызывается действием через один и тот же клеточный центр. В клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия как цитохрома Р450, так и АЬ-рецептора. Таким образом, можно заключить, что механизм действия БП не связан с ранее известными механизмами действия, такими как активация АЬ-рецептора и функционирование цитохрома Р450.

Рис. 3. Эффект БП и БеП на распространение шоцифергового желтого в культуре меток Г-27. Концентрация обоих соединений составила 5мкг/мл. Показаны фазово-контрастные (а, с, е, соответствующие им флуоресцентные изображения (Ь, <1, £ Ь). а, Ь - контроль; с, с! - БП время инкубации 1 час; е, f - БеП время инкубации 1 час; g,h - БеП время иикубации 24 часа. Крестиком указана клетка, в которую введен краситель.

Различия в действии БП и неканцерогенного БеП может быть связано с неодинаковым накоплением этих веществ в цитоплазматической мембране клетки. Для проверки данного предположения мы измерили уровень БП и БеП в клетках после 1 и 24 часов воздействия. Из таблицы 2 видно, что накопление ПАУ в клетках зависит от времени и количества БП и БеП, выделенных из клеток, значительно больше после 24 часов воздействия, по сравнению с 1 часом.

Таблица 2. Определение степени накопления ПАУ в клетках гепатомы Г-27.

ПАУ Концентрация мкг/мл БП н БеП, выделенные из клеток

{нг/мнллнон клеток)

Время

1 чпс 24 чпса

Бензо/п/пнрек 5.0 136.6 ±22.2 237.8 ±24.6

Бенэо/п/ппрен 1.23 37.0 ±16.3 135.7 ±32.1

Еешо/п/пиреп 0.6 33.0 ±12.2 50.0 ±16.8

Бсизо/е/пирен 3.0 603.0 ±58.6 1356.0 ±64.0

Таким образом, зависимое от времени возрастание ингибирования МЩК в результате воздействия ПАУ связано с увеличением накопления этих соединений в клетке. Более эффективное накопление БеП в клетках свидетельствует о том, что различный эффект при воздействии БП и БеП на МЩК не является результатом степени их накопления в клеточной мембране.

3. Влияние ПАУ на экспрессию белков р21 и р27.

Белки р21 и р27 относятся к семейству белков-супрессоров семейства Cip/Kip, количество которых увеличивается на стадии G0 и уменьшается при получении клеткой митотического стимула. Как было показано в предыдущем разделе, БП вызывает стимуляцию пролиферации и снижает функциональную активность МЩК. Мы предположили, что эти эффекты могут сопровождаться изменениями уровня белков семейства Cip/Kip. Для исследования действия БП на уровень белков р21 и р27 клетки культивировались в течение суток без сыворотки для приостановки их роста, а затем добавлялась сыворотка в качестве контроля и БП на 4, 8 и 24 часа. Рисунок 4а показывает, что в клетках гепатомы Г-27 уровень белка р21 начинает падать после 4 часов воздействия БП и достигает своего минимума после 8 часов воздействии БП по сравнению с контролем. Из диаграммы на рис. 46 видно, что через 8 часов после воздействия БП уровень белка р21 уменьшается на 50% по сравнению с контролем.

Уровень белка р27 в клетках гепатомы Г27 в результате действия БП не меняется ни в одной из исследованных временных точках. Как показывает рнсунок 5а, уровень белка р27 в клетках гепатомы HepG2 падает через 8 часов приблизительно на 30% (рис. 56) после воздействия БП по сравнению с контролем.

Уровень р21 в клетках гепатомы HepG2 не меняется ни в одной из временных точек.

1 2 3 4 5 6 7 Рис 4а Влияние БП на уровень белка р21 в культуре клеток гепатомы Г-27. 1-контроль, 2- сыворотка 4 часа, 3-БП 4часа, 4-сьшоротка 8 часов, 5-БП 8 часов, 6-сыворотка 24 часа, 7-БП 24 часа.

Рис 46 Денситометрическое измерение интенсивности полосы, соответствующей р21 на рисунке 4а по отношению к контролю.

Ш№ШШШЯШШШЯ№- ИНГ,

1 2 3 4 5 Рис 5а Влияние БП на уровень белка р27 в культуре клеток гепатомы HepG2

Рис 56 Денситометрическое измерение интенсивности полосы, соответствующей р27 на рисунке 5а по отношению к контролю.

Таким образом, подавление функции МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка р27.

4. Влияние ПАУ на активность ОТ-кВ.

а. Влияние ПАУ на транскрипционную активность №-кВ, определяемую методом транзиторнон грансфекцин.

МБ-кВ является транскрипционным фактором, контролирующим такие важные клеточные процессы как, пролиферация клеток и апоптоз. Помимо этого, №-кВ влияет на способность опухолевых клеток к метастазированию и на ангиогенез.

В настоящее время в литературе недостаточно сведений о влиянии ПАУ на экспрессию ЫБ-кВ. Считается, что активация ЫР-кВ может играть определенную роль в промоции.

Для определения влияния БП на транскрипционную активность ЫР-кВ в культурах клеток гепатомы Г-27 и Нерв2 мы трансфецировали клетки плазмидой, содержащей ген-репортер люциферазы под контролем №-кВ-чувствительного промотора, с последующим определением активности люциферазы по стандартному протоколу.

В клетках Г-27 транскрипционная активность №-кВ в 3,6 раз возрастает по сравнению с контролем после культивирования клеток в течение 24 часов с БП. Культивирование клеток Г-27 с неканцерогенным БеП не влияло на транскрипционную активность ЫР-кВ.

В культуре клеток НерС2 канцерогенный БП и его некацерогенный аналог БеП не влияли на транскрипционную активность ОТ-кВ. В качестве положительного контроля клетки культивировались с известным активатором №-кВ - ТЫР-а. Активация ЮТ-а свидетельствует о том, что отсутствие эффекта БП не связано с отсутствием в клетках Нер02 белка кВ.

Для более детального изучения действия БП на активацию ЫР-кВ мы исследовали активацию ОТ-кВ с целью оценки способности связывания с консенсусным олигонуклеотидом.

б. Влияние ПАУ на активацию ОТ-кВ, определяемую методом ЕМБА.

Как и в предыдущем разделе, мы сравнили действие канцерогенного БП и неканцерогенного БеП на активацию №-кВ в клетках гепатомы Г-27 и Нер02.

Клетки обрабатывались изучаемыми веществами в количестве 5 мкг/мл среды, а затем проводилась реакция связывания фракции ядерных белков, выделенных из клеток, с консенсусным олигонуклеотиом к ОТ-кВ (см. рис. 6). Реакция с антителами (супершифт) показала, что обработка клеток БП вызывает связывание двух комплексов ОТ-кВ- р50/р50 и р65/р50 (см. рис. 6). Как показано на рис. 6, после добавления к клеткам Г-27 БП через 30 минут наблюдается усиление связывания ОТ-кВ, которое достигает максимума через 60 минут после добавления. Через 90 минут после добавления БП к клеткам Г-27 связывание ослабевает.

Обработка БП клеток Нер02 вызывает увеличение связывания №-кВ, хотя в очень слабой степени, также через 30 минут после добавления (см. рис. 6).

Рис. 6. Действие бензо/а/пирена (БП) (5 мкг/мл среды) на активацию ОТ-кВ в клетках гепатом Г-27 и НЕР02. К - контрольные клетки; 15', 30' 60' и 90' - время воздействия БП в минутах. Стрелками показаны места связывания №-кВ: р65/50 и р50/50.

Неканцерогенный аналог БП - БеП, как показывает рисунок 7, вызывает очень слабое усиление связывания через час после добавления к клеткам. В качестве положительного контроля активации №-кВ был использован его известный активатор ТОТ-а. Как видно из диаграммы (рис. 76), максимальная активация №-кВ при действии БП составляет 50% активации, вызванной Т№-а.

рЙ5/ц50 — р50*р50 ~

К

1ч 2ч Зч БП

1ч 2ч Зч БеП

Рис. 7. (а) Активация ОТ-кВ в клетках гепатомы Г-27, обработанных БП и БеП. К -контрольные клетки, время воздействия показано в часах. Стрелками показано связывание ОТ-кВ: р65/50 и р50/50, а также неспецифическое связывание с Эр-!.

К БП1ч БП 2 ч БП 3 Ч БеП 1 БаЛ 2 ВвП 3 TNF

Рис. 7 (б) Денситометрическое измерение интенсивности полосы, соответствующе! рб5/50 на рисунке 7(а) по отношению к контролю.

Традиционный дуть активации ОТ-кВ предусматривает зависимое о фосфорилирования потеолитическое удаление ингибирующего белка 1к£ Поэтому мы решили исследовать уровень фосфорилированного 1кВ поел

воздействия БП. Обработка клеток Г-27 БП увеличивает уровень фосфорилированного ШЗ через 30 минут после воздействия. Деградация общего 1кВ наблюдается после 60 минут после воздействия БП. Для положительного контроля клетки обрабатывались известным активатором №ЧсВ - ТОТ-а, который вызывал более сильное фосфорилирование 1кВ. Из полученных результатов видно, что в отличие от клеток Г-27 с отсутствием системы метаболизма, в клетках с экспрессией ферментов метаболизма и АЬ-рецептора Нер02, отмечается более слабая активация №-кВ. Из этого можно заключить, что БП активирует №-кВ, находясь в исходной неметаболизированной форме и для его действия нет необходимости в активации АЬ-рецептора. Предыдущими исследователями показано, что ЫР-кВ взаимодействует с неактивированным АЬ-рецептором. В результате, по-видимому, ЫР-кВ будучи связан с АЬ-рецептором не может быть активирован. Поэтому в системе, где присутствует АЬ-рецептор (гепатома Нер02) ЫБ-кВ не активируется лигандом, а в отсутствии АЬ-рецептора (гепатома Г-27) наблюдается активация при действии БП.

5. Влияние ПАУ на активацию АР-1.

АР-1 является транскрипционным фактором способным, влиять на клеточную пролиферацию благодаря регуляции экспрессии и функции таких регуляторов клеточного цикла как циклины А, Е, белки р53, р21, р15, р19. АР-1 активируется при различных стимулах клеточной пролиферации. Нами было проведено исследование по влиянию БП на активацию транскрипционного фактора АР-1 в клетках гепатомы Нерв2 с экспрессией цитохрома Р450 и АЬ-рецептора и в клетках гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и АЪ-рецептора. Рисунок 8 демонстрирует, что в клетках гепатомы Нер02 БП усиливает связывание АР-1 через час после воздействия и достигает максимума через 2 часа. Обработка клеток гепатомы Г-27 БП не вызывает усиления связывания АР-1.(см. рис. 8)

I , WuWf4L ti *$ i

К 1ч 2ч Зч 4ч К 1ч 2ч Зч 4ч

гепптома 27 гепатома Hep 02

Рис. 8 Активация АР-1 в клетках гепатом Г-27 и HEPG2. Клетки обрабатывались БП (5 мкг/мл) или растворителем (контроль) в течение различного времени. Стрелкой показано связывание АР-1.

Из этого следует, что активация АР-1 при действии лигандов Ah-рецептора связана с активацией исключительно Ah-рецептора и/или образованием активных метаболитов и цитохрома Р450, и наблюдаемые нами эффекты канцерогенных ПАУ в клетках с отсутствием Ah-рецептора и цитохрома Р450 не распространены на активацию АР-1,

б.Влияиие ПАУ на образование активных форм кислорода. (АФК)

Одним из механизмов опухолевой промоции является образование АФК в клетке. Считается, что с формированием АФК связаны такие промоторные эффекты как ингибирование МЩК и стимуляция пролиферации. Образование АФК в клетке под действием промотора и разнообразных индукторов цитохрома Р450 (Akintobi et al., 2007; Jin et al., 2004) может быть обусловлено функционированием цитохрома Р450, однако, в клетках гепатомы Г-27 отсутствует экспрессия цитохрома Р450. В том числе не исключено, что формирование АФК может происходить в результате изменения других клеточных систем, продуцирующих АФК (например, дыхательная цепь митохондрий).

Возможность образования АФК в клетках гепатомы Г-27 под действием БП мы исследовали с помощью маркерного соединения дихлородиацетилфлуоресцеина (см материалы и методы).

Мы показали, что ни БП, ни его неканцерогенный аналог не вызывают увеличения уровня флуоресценции в клетках гепатомы Г-27, что свидетельствует об отсутствии образования АФК под действием БП. Из этих данных можно заключить, что описанные выше эффекты ПАУ на функции клеток (ингибирование МЩК, активация транскрипционных факторов АР-1 и NF-кВ) не связаны с образованием АФК.

ВЫВОДЫ.

]. Модель клеточной культуры гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) является наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).

2.Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

3. Канцерогенный эффект ПАУ обусловлен действием исходным (химически-инертным) состоянием его молекулы.

4. Используемые в работе канцерогенные ПАУ (БП- бензо/а/пирен, 3-МХ - 3-метилхолантрен, ДМБА - 7,12-диметилбенз/а/антрацен) и неканцерогенный аналог бензо/е/пирен оказывают различное влияние на функциональную активность межклеточных щелевых контактов (МЩК) гепатом, экспрессирущих (HepG2) и неэкспрессирующих (Г-27) Ah-рецептор и изоформы цитохрома Р450. При этом:

а) Канцерогенные ПАУ (в отличие от неканцерогенных) ингибируют МЩК в клетках обоих типов гепатом.

б) БП вызывает наиболее сильный ингибирующий эффект на МЩК по сравнению с другими изучаемыми канцерогенами.

в) В обеих клеточных культурах (Г-27 и HepG2) ингибирующее действие бензо/а/пирена на состояние МЩК не зависит от функционирования Ah-рецептора.

5. Ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка-супрессора р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка-супрессора р27. Это свидетельствует о различных механизмах стимуляции клеточной пролиферации в указанных гепатомах.

6. В клетках гепатомы HepG2 (с экспрессией цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен активирует транскрипционный фактор АР-1, тогда как эффект активации транскрипционного фактора NF-kB не наблюдается. В клетках гепатомы Г-27 (с отсутствием экспрессии цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен стимулирует активацию транскрипционного фактора NF-kB, а активация транскрипционного фактора АР-1 отсутствует. Таким образом, механизмы влияния бензо/а/пирена на такие составляющие опухолевой промоции, как стимуляция пролиферации и апоптоз, зависят от экспрессии в клетках цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

7.Действие канцерогенного бензо/а/пирена а также его неканцерогенного аналога не вызывает образования активных форм кислорода в клетках гепатомы Г-27. Из этого следует, что вышеописанное влияние ПАУ на различные функции клеток гепатом (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1) не связаны с образованием активных форм кислорода.

8. Полученные данные являются основанием для предположения о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках исследуемых гепатом фактора, при взаимодействии с которым канцерогенных ПАУ нарушается гомеостаз, приводящий к промоции.

Практические рекомендации. Целесообразно включение результатов исследования в практику научно-исследовательских подразделений, разрабатывающих проблемы канцерогенеза и лекционные курсы по гистологии и онкологии медицинских ВУЗов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шаровская Ю.Ю., Соломатина (Болотина) Н.А., Дубовая Т.К., Хитрово И.А., В.А.Кобляков. Ингибирование межклеточных щелевых контактов (ЩК) канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ./ Сборник научных трудов ГОУ ВПО «Смоленская Государственная Медицинская Академия МЗ РФ», 2004, с. 245-249.

2. Шаровская Ю.Ю., Вайман А.В., Соломатина (Болотина) Н.А., Кобляков В.А. Ингибирование межклеточных щелевых контактов канцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) в культуре клеток в отсутствии метаболического превращения ПАУ.// Биохимия -2004, 69:4, 511-518.

3. Kobliakov V., Solomatina (Bolotina) N., Vaiman A., Sharovskaya Y. Inhibition of gap junction intercellular communications (GJIC) and stimulation of cell proliferation in cell culture by carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) in the absence of PAH metabolism.// 18th Meeting of the European Association for Cancer Research, Proceedings, 2004, 105.

4. Кобляков B.A., Соломатина (Болотина) H.A., Шаровская Ю.Ю. Механизм промоторного действия «полных» канцерогенов.// Вопросы онкологии - 2005, 51:1, 11-12.

5. Соломатина (Болотина) Н.А., Гаспарьян А.В., Дубовая Т.К., Кобляков В.А. Активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1 в клетках гепатом канцерогеном бензо/а/пиреном.// Цитология - 2006, 48:9, 801-802.

6. Sharovskaya Y., Kobliakova Y. , Solomatina (Bolotina) N., Kobliakov V. Effect of some carcinogenic and non-carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communications in hepatoma cell cultures.// European Journal of cell Biology, 2006, 85: 387-397.

7. Болотина H.A., Гаспарьян A.B., Дубовая Т.К., Евтеев В.А., Кобляков В.А., Активация бензо/а/пиреном транскрипционных факторов NF-kB и АР-1, связанных с промоторной стадией канцерогенеза в культуре клеток// Биохимия - 2007,72: 5, 682 - 689.

8. Кобляков В.А., Волков М.С., Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А. Закономерности промоторной стадии канцерогенеза// Цитология - 2007, 49:9, 756.

9. Гаспарьян А.В., Евтеев В.А., Болотина Н.А., Кобляков В.А. Механизмы негенотоксического действия канцерогенов// Вопросы онкологии, 2007, 63, 10-11.

Подписано в печать 27 .10 . 08 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

__Тираж 100 экз. Заказ № 7 ре_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Болотина, Наталья Александровна

Введение 5 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Механизмы химического канцерогенеза.

1.2.Химические канцерогены окружающей среды.

1.3. Механизмы активации непрямых канцерогенов.

1.4. Стимуляция пролиферации как необходимое звено опухолевой промоции. (

1.5 Митогенный эффект активных форм кислорода.

1.6.Транскрипционный фактор NF-kB и его роль в пролиферации опухолевых клеток.

1.7.Межклеточные щелевые коммуникации и их ингибирование в ходе опухолевой промоции.

1.8. Апоптоз. 37 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Культура клеток.

2.2. Проницаемость щелевых контактов.

2.3. Определение уровня БП и БеП в клетках.

2.4. Реакция связывания NF-kB и АР-1 с консенсусным

Олигонуклеотидом (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA).

2.5.Электрофорез и Иммуноблотинг.

2.6. Транзиторная трансфекция и определение гена-репортера.

2.7. Определение влияния ПАУ на образование АФК в клетках гепатомы Г-27. 45 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1.Ингибирование межклеточных щелевых контактов при действии

ПАУ в культуре клеток HepG2.

3.2.Ингибирование межклеточных щелевых контактов

ПАУ в культуре клеток Г

3.3.Влияние ПАУ на экспрессию белков р21 и р27.

3.4.Влияние ПАУ на активность NF-kB. а. Влияние ПАУ на транскрипционную активность NF-kB, определяемую методом транзиторной трансфекции. б. Влияние ПАУ на активацию NF-kB, определяемую методом EMS А.

3.5.Влияние ПАУ на активацию АР-1.

3.6. Влияние ПАУ на образование АФК. 72 4.0БСУЖДЕНИЕ.

5.ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Опухоль-промоторный эффект полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)"

Актуальность проблемы.

В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии, клеточной биологии и биологии развития используются самые разные модели. Это обусловлено поразительным множеством и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологии, и для практической медицины. Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др (11). Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (8, 17, 18). Среди химических канцерогенов имеются, так называемые, непрямые и прямые. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активный канцероген требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических канцерогенов выделяют «полные» и «неполные». Полные канцерогены способны индуцировать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами. Именно Г1АУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр. Как известно, в течении химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициация, промоция и профессия (16). Что касается ПАУ, то в первую очередь следует обратить внимание на то, что до настоящего времени исследования по механизму их канцерогенного действия были направлены на изучение инициации, поскольку считалось, что именно эта стадия является определяющей в развитии опухоли при действии непрямых канцерогенов. Попытки применения и разработка новых препаратов, ингибирующих стадию инициации (в первую очередь антиоксиданты, ингибиторы свободно - радикальных процессов) успеха не принесли. Исследования последнего времени дали основания считать, что стадией, определяющей канцерогенность ПАУ, является стадия промоции (151). Поэтому изучение механизмов промоции при действии непрямых канцерогенов является важной и актуальной задачей, дающей в перспективе возможность создания профилактических и лечебных препаратов, препятствующих (или замедляющих) развитие опухолевого процесса.

Цель исследования - изучение механизмов опухоль-промоторного действия «полных» канцерогенов на примере ПАУ на модели культуры клеток гепатом.

Задачи исследования;

1. провести сравнительное изучение действия канцерогенных ПАУ и их неканцерогенного аналога на функциональную активность межклеточных щелевых коммуникаций (МЩК) в культуре клеток гепатом, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма и Ah-рецептор.

2. исследовать образование активных форм кислорода (АФК) в клеточных культурах при действии канцерогенных и неканцерогенных ПАУ;

3. сравнить экспрессию белков-супрессоров р21 и р27 в культуре клеток при действии ряда ПАУ.

4. исследовать влияние ПАУ на активацию транскрипционных факторов АР-1 (activated protein 1) и NF-kB (ядерный транскрипционный комплекс кВ).

Научная новизна работы.

В нашей работе впервые использована в качестве сравнительной модели для изучения опухолевой промоции уникальная культура клеток гепатомы Г-27, в которой отсутствует экспрессия цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

Проведенное сравнительное исследование показало, что наблюдаемые нами эффекты ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционного фактора NF-kB) обусловлены действием исходной химически инертной молекулой вещества.

Мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

Впервые продемонстрировано существование ранее неизвестного механизма опухоль-промоторного действия канцерогенных ПАУ.

Теоретическая и практическая значимость. Известно, что в химическом канцерогенезе выделяют 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, нами установлено, что нарушение функционирования МЩК, активация некоторых белков, регулирующих клеточную пролиферацию и апоптоз на стадии опухолевой промоции, вызываются исходной биологически инертной молекулой ПАУ, по ранее неизвестному механизму.

Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции.

Полученные результаты важны для экспериментальной онкологии, гистологии, биохимии и молекулярной биологии, кроме того, их целесообразно учитывать при разработке новых способов лечения и профилактики онкологических заболеваний.

1 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Болотина, Наталья Александровна

5.Выводы.

1. Модель клеточной культуры гепатом с экспрессией Ah-рецептора и цитохрома Р450 (HepG2) и без таковой (Г-27) является наиболее перспективной для изучения механизмов опухоль-промоторного эффекта полициклических ароматических углеводородов (ПАУ).

2.Стадия промоции является определяющей в развитии опухоли при действии ПАУ. Эффект канцерогенных ПАУ реализуется в зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Ah-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях.

3. Канцерогенный эффект ПАУ обусловлен действием исходным (химически-инертным) состоянием его молекулы.

4. Используемые в работе канцерогенные ПАУ (БП- бензо/а/пирен, 3-МХ - 3-метилхолантрен, ДМБА - 7,12-диметилбенз/а/антрацен) и неканцерогенный аналог бензо/е/пирен оказывают различное влияние на функциональную активность межклеточных щелевых контактов (МЩК) гепатом, экспрессирущих (HepG2) и неэкспрессирующих (Г-27) Ah-рецептор и изоформы цитохрома Р450. При этом: а) Канцерогенные ПАУ (в отличие от неканцерогенных) ингибируют МЩК в клетках обоих типов гепатом. б) БП вызывает наиболее сильный ингибирующий эффект на МЩК по сравнению с другими изучаемыми канцерогенами. в) В обеих клеточных культурах (Г-27 и HepG2) ингибирующее действие бензо/а/пирена на состояние МЩК не зависит от функционирования Ah-рецептора.

5. Ингибирование МЩК в клетках гепатомы Г-27 под воздействием БП сочетается с падением уровня белка-супрессора р21, а в клетках гепатомы HepG2 с падением уровня белка-супрессора р27. Это свидетельствует о различных механизмах стимуляции клеточной пролиферации в указанных гепатомах.

6. В клетках гепатомы HepG2 (e экспрессией цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен активирует транскрипционный фактор АР-1, тогда как эффект активации транскрипционного фактора NF-kB не наблюдается. В клетках гепатомы Г-27 (с отсутствием экспрессии цитохрома Р450 и Ah-рецептора) бензо/а/пирен стимулирует активацию транскрипционного фактора NF-kB, а активация транскрипционного фактора АР-1 отсутствует. Таким образом, механизмы влияния бензо/а/пирена на такие составляющие опухолевой промоции, как стимуляция пролиферации и апоптоз, зависят от экспрессии в клетках цитохрома Р450 и Ah-рецептора.

7.Действие канцерогенного бензо/а/пирена а также его неканцерогенного . аналога не вызывает образования активных форм кислорода в клетках гепатомы Г-27. Из этого следует, что вышеописанное влияние ПАУ на различные функции клеток гепатом (подавление функциональной активности МЩК, активация транскрипционных факторов NF-kB и АР-1) не связаны с образованием активных форм кислорода.

8. Полученные данные являются основанием для предположения о существовании (кроме Ah-рецептора и цитохрома Р450) в клетках исследуемых гепатом фактора, при взаимодействии с которым канцерогенных ПАУ нарушается гомеостаз, приводящий к промоции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Болотина, Наталья Александровна, Москва

1. Белицкий Г.А. Будунова И.В. Культуры клеток печени мыши и человека как возможные объекты для ускоренного тестирования канцерогенных соединений // Экспериментальная онкология. — 1980. -№3. С. 39-46.

2. Будунова И.В., Миттельман Л.А., Белицкий Г.А., Возможность выявления опухолевых промоторов по их ингибирующему действию на межклеточный обмен люциферовым желтым // Бюллетень экспериментальной онкологии и медицины. 1987. - №11. - С. 717719.

3. Васильев Ю.М. Клетка как орхитектурное чудо. Ч. 2: Цитоскилет способный чувствовать и помнить // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 4. - С. 4-10.

4. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. 2 Клетки строят ткань // Соросовский образовательный журнал. 1997. - № 5. - С. 20-25.

5. Васильев Ю.М. Опухолевые клетки и их микроокружение.// Вопросы онкологии // 1984. № 30920. - С. 96-103.

6. Гельштейн В.И. Регуляция пролиферации нормальных и опухолевых клеток в культуре. Явления индукции и дифференцировки при опухолевом росте. М., 1981. - 340с.

7. Гужаева E.J1. Роль индукторов цитохрома Р-450 в регуляции активности белков детоксикации ксенобиотиков и пролиферации клеток гепатом.// Дис К.м.н. 1998.

8. Канцерогенез / под ред. Заридзе Д.Г. М.: Медицина, 2004.- 500 с.

9. Кобляков В.А. Индукторы суперсемейства цитохрома Р-450, как промоторы канцерогенеза // Биохимия. 1998. - № 63. - С. 885-898.

10. Кобляков В.А. Цитохром Р-450 в опухолях и в процессе канцерогенеза //Биохимия. 1995.-№60.-С. 1747-1764.

11. Копнин Б.П. Онкгены, антионкогены и канцерогенез // Архив патологии. 1990. - № 9. - С. 3-12.

12. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000. -№65. С. 5-33.

13. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 1. - С. 8-12.

14. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия М.: Медицина, 1998. - 288с.

15. Пролемы экспериментальной онкологии лейкозов человека и животных / Под ред. JI.M. Шабада В.П. Шишкова. М.: Колос, - 1979. - 85с.

16. Турусов B.C. Прогрессия опухолей: этиологические, морфологические и молекулярно-биологические аспекты // Архив патологии. -1992. № 7. -С. 5-14.

17. Шапот B.C., Биохимические аспекты опухолевого роста. М: Медицина, 1975.-304с.

18. Шапот B.C. Молекулярно-биологические аспекты неопластического превращения // Весстн. АМН СССР. 1979. - С. 48-55.

19. Швемберг И.Н. Перевиваемый штамм гепатомы крысы Г-27 // Цитология. 1970. - № 12. - С. 1057-1059.

20. Якубовская Р.И. Современные представления о механизмах канцкрогенеза и опухолевой прогрессии как основа для разработки новых методов терапии злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал. 2000. - №6. - С. 42-50.

21. Abe J., Takahashi М., Ishida М., Lee J.D., Berc B.C. C-src is require for oxidative stress-mediated activation of big mitogen-activated protein kinase 1. // J. Biol. Chem., 1997, 15: 272, 20389-20394.

22. Akintobi A.M., Villano C.M., White L.A. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) exposure of normal human dermal fibroblasts results in

23. AhR-dependent and -independent changes in gene expression. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007, 1: 220, 9-17.

24. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P. Molecular Biology of the Cell. 2002.

25. L'Allemain G., Lavoie J.N., Rivard N., Baldin V., Pouyssegur J. Cyclin D1 expression is a major target of the cAMP-induced inhibition of cell cycle entry in fibroblasts. //Oncogene. 1997, 24:14, 1981-1990

26. Baker Т.К., Kwiatkowski A.P., Madhukar B.V., Klaunig J.E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in rat hepatocytes. // Carcinogenesis, 1995, 16:23212326.

27. Bauman J.W., Goldsworthy T.L., Dunn C.S., Fox T.R. Inhibitory effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on rat hepatocyte proliferation induced by 2/3 partial hepatectomy. // Cell Prolif., 1995, 28: 437-451.

28. Bock K.W., Kohle C. Ah receptor- and TCDD-mediated liver tumor promotion: clonal selection and expansion of cells evading growth arrest and apoptosis. // Biochem. Pharmacol. 2005, 69:1403-1408.

29. Beg A.A., Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death. // Science, 1996, 1: 274, 782-784.

30. Bennett M.V., Barrio L.C., Bargiello T.A., Spray D.C., Hertzberg E., Saez J.C. Gap Junctions: new tools, new answers, new questions. // Neuron 1991, 6:305-320.

31. Berenblum I. Cancer research in historical perspective: an autobiographical essay. // Cancer Res. 1977, 37:1-7.

32. Blaha L., Kapplova P., Vondracek J., Upham В., Machala M. Inhibition of gap-junctional intercellular communication by environmentally occurring polycyclic aromatic hydrocarbons. // Toxicol. Sci. 2002, 65:43-51.

33. Blankenship A., Matsumura F. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced activation of a protein tyrosine kinase, pp60src, in murine hepatic cytosol using a cell-free system. // Mol. Pharmacol. 1997, 52:667-675.

34. Boffetta P., Jourenkova N., Gustavsson P. Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. // Cancer Causes. Control., 1997, 8:444-472.

35. Bohnenberger S., Wagner В., Schmitz H.J., Schrenk D. Inhibition of apoptosis in rat hepatocytes treated with 'non-dioxin-like' polychlorinated biphenyls. //Carcinogenesis. 2001, 22:1601-1606.

36. Buchmann A., Stinchcombe S., Korner W., Hagenmaier H., Bock K.W. Effects of 2,3,7,8-tetrachloro- and 1,2,3,4,6,7,8-heptachlorodibenzo-p-dioxin on the proliferation of preneoplastic liver cells in the rat. // Carcinogenesis, 1994, 15:1143-1150.

37. Cascio M., Kumar N.M., Safarik R., Gilula N.B. Physical characterization of gap junction membrane connexons (hemi-channels) isolated from rat liver. //J. Biol. Chem., 1995, 270:18643-18648.

38. Chapham D., and Schiller C. Dose-related effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in C57BL/6J and DBA/2J mice. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 1985, 78:147-157.

39. Chramostova K., Vondracek J., Sindlerova L., Vojtesek В., Kozubik A., Machala M. Polycyclic aromatic hydrocarbons modulate cell proliferation in rat hepatic epithelial stem-like WB-F344 cells. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 2004, 196:136-148.

40. Chen S.C., Pelletier D.B., Ao P., Boynton A.L. Boynton Connexin43 reverses the phenotype of transformed cells and alter their expression of cyclin/cyclin-depended kinases. // Cell Growth Differ., 1995, 6:681-690.

41. Chen F., Castranova V., Shi X. New insights into the role of nuclear factor-kappaB in cell growth regulation. // Am. J. Pathol., 2001, 159:387-397.

42. Christensen J.G., Gonzales A.J., Cattley R.C., Goldsworthy T.L. Regulation of apoptosis in mouse hepatocytes and alteration of apoptosis by nongenotoxic carcinogens. // Cell Growth Differ., 1998, 9:815-825.

43. Conway J.G., Cattley R.C., Popp J.A., Butterworth B.E. Possible mechanisms in hepatocarcinogenesis by the peroxisome proliferator di(2-ethylhexyl)phthalate. // Drug. Metab. Rev., 1989, 21:65-102.

44. Davis J., Lauer F., Burdick A., Hudson L., Burchiel S. Prevention of apoptosis by 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in the MCF-10A cell line.//Cancer Res. 2001, 61:3314-3320.

45. Dietrich C., Faust D., Budt S., Moskwa M., Kunz A., Bock K.W., Oesch F. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-dependent release from contact inhibition in WB-F344 cells: involvement of cyclin A. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2002, 183:117-26.

46. Dogra S.C., Whitelaw M.L., May B.K. Transcriptional activation of cytochrome P450 genes by different classes of chemical inducers. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1998, 25:1-9.

47. Elferink C.J., Ge N.L., Levine A. Maximal aryl hydrocarbon receptor activity depends on an interaction with the retinoblastoma protein. // Mol. Pharmacol. 2001, 59:664-673.

48. Ek-Vitorin, J. F., Calero G., Morley G. E., Coombs W., Taffet S.M., and Delmar M. PH regulation of connexin43: molecular analysis of the gating particle.//Biophys J. 1996, 71:1273-1284.

49. Flohe L., Brigelius-Flohe R., Saliou C., Traber M.G., Packer L. Redox regulation of NF-kappa В activation. // Free Radic. Biol. Med., 1997, 22:1115-1126.

50. Fitzegarld D.J., Mesnil M., Oyamada M., Tsuda H., Ito N. and Yamasaki H. Changes in gap junction protein(connexin32) gene expression during rat liver carcinogenesis. // J. Cell Biochem. 1989, 41:97-102.

51. Gasparian A.V., Yao Y., Kowalezyk D., Lyakh L.A., Karseladze A., Slaga T And Budunova I.V. The role of IKK in constitutive activation of NF-kappaB transcription factor in prostate carcinoma cells. // J. Cell. Sci., 2002, 1:115, 141-151.

52. Ge N., Elferink C. A direct interaction between the aryl hydrocarbon receptor and retinoblastoma protein. // J. Biol. Chem. 1998, 273:2270822713.

53. Gill J.H., James N.H., Roberts R.A., Dive C. The non-genotoxic hepatocarcinogen nafenopin suppresses rodent hepatocyte apoptosis induced by TGFbetal, DNA damage and Fas. // Carcinogenesis. 1998, 19:299-304.

54. G6ttlicher M., Cikryt P., Wiebel F.J. Inhibition of growth by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in 5L rat hepatoma cells is associated with the presence of Ah receptor. // Carcinogenesis, 1990, 11:2205-2210.

55. Hay den M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kappaB. // Genes Dev., 2004, 15:18,2195-2224.

56. Hess J., Angel P. and Schorpp-Kistner M. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. // Journal of Cell Science, 2004, 1 17:5965-5973.

57. Hoffer A., Chang C.Y., Puga A. Dioxin induces transcription of fos and jun genes by Ah receptor-dependent and -independent pathways. // Toxicol. Appl Pharmacol., 1996, 141:238-47

58. Holder, J.W., Elmore E. and Barrett J.C. Gap junction function and cancer. // Cancer Rec., 1993, 53:3475-3485.

59. Huang G., Elferink C.J., Multiple mechanisms are involved in Ah receptor-mediated cell cycle arrest. // Mol. Pharmacol., 2005, 67:88-96.

60. Jansen L.A., Jongen W.M. The use of initiated cells as a test system for the detection of inhibitors of gap junctional intercellular communication. // Carcinogenesis, 1996, 17:333-339.

61. Janssen-Timmen U., Traub O., Dermitzel R., Rades H.M. and WiПеске К. Reduced number gap junction in hepatocarcinomas detected by monoclonal antibody. // Carcinogenesis, 1986, 7:1475-1482

62. Jin D.Q., Jung J.W., Lee Y.S., Kim J.A. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin inhibits cell proliferation through arylhydrocarbon receptor-mediated G1 arrest in SK-N-SH human neuronal cells. // Neurosci. Lett., 2004,363:69-72.

63. Kalimi G.H., Lo C.W. Communication compartments in the gastrulating mouse embryo. //J. Cell Biol., 1988, 107:241-255.

64. Karin M., Cao Y., Greten F.R., Li Z.W. /NF-карраВ in cancer: from innocent bystander to major culprit. // Nat. Rev. Cancer, 2002, 2:301-310.

65. Karin M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. // Nature, 2006, 25, 441:431-436.

66. Karin M., Liu Z., Zandi E. AP-1 function and regulation. // Curr. Opin. Cell. Biol., 1997, 9:240-246.

67. Kato J.Y., Matsuoka M., Polyak K., Massague J., Sherr C.J. Cyclic AMP-induced G1 phase arrest mrdiated by an inhibitor(pp7Kip 1) of cyclin-depenent kinase 4 activation. // Cell, 1994, 79:486-496.

68. Kew M.C. Synergistic interaction between aflatoxin B1 and hepatitis В virus in hepatocarcinogenesis. // Liver Int., 2003, 23:405-409.

69. Kim D.W., Gazourian L., Quadri S.A., Romieu-Mourez R., Sherr D.H., Sonenshein G.E. The RelA NF-карраВ subunit and the aryl hydrocarbonreceptor (AhR) cooperate to transactivate the c-myc promoter in mammary cells. // Oncogene, 2000, 16:19, 5498-5506.

70. Kirk G.D., Bah E., Montesano R. Molecular epidemiology of human liver cancer: insights into etiology, pathogenesis and prevention from The Gambia, West Africa. // Carcinogenesis, 2006, 27:2070-2082.

71. Kistler J., Bond J., Donaldson P., Engel A. Two distinct levels of gap junction assembly in vitro. // J. Struct. Biol., 1993, 110:28-38.

72. Knerr S., Schaefer J., Both S., Mally A., Dekant W., Schrenk D. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin induced cytochrome P450s alter the formation of reactive oxygen species in liver cells. // Mol. Nutr. Food. Res., 2006, 50:378-384.

73. K00 S.K., Kim D.Y., Park S.D., Kang K.W., Joe C.O., PKC phosphorilation disrupts gap junctional communication at GO/s phase in clone 9 cells. //Mol. Cell Biochem., 1997, 167:41-49.

74. Kolluri S.K., Weiss C., Koff A., Gottlicher M. p27Kipl induction and inhibition of proliferation by the intracellular Ah receptor in developing thymus and hepatoma cells. // Genes Dev., 1999, 1:13, 1742-153.

75. Krutovskikh V. and Yamasaki H. The role of gap junctional intercellular communications (GJIC) disorders in experimental and human carcinojenesis. // Histol. Histopatol., 1997, 12:761-768.

76. Krutovskikh V.A. and Yamasaki H. /Ex vivo dye transfer assay as an approach to study gap junctional intercellular communication disorders in hepatorarcinogenesis. // Elsever Science, 1995: 93-97.

77. Krutovskikh V.A., Oyamada M., Yamasaki H. Sequentional changes of gap junctions intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo. // Carcinogenesis, 1991, 12:1701-1706.

78. Laird D.W., Yancey S.B., Bugga L., Revel J.P. Connexin expression and gap junction communication compartments in the developing of mouse limb. //Dev. Dyn., 1992, 195:3725- 3734.

79. Laird D.W. Connexin phosphorylation as a regulatory event linked to gap junction internalization and degradation. // Biochim. Biophys Acta., 2005, 10: 1711, 172-182.

80. Lake B.G. Mechanisms of hepatocarcinogenicity of peroxisome-proliferating drugs and chemicals. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1995, 35:483-507.

81. Lampe P.D., Lau A.F. Regulation of gap junctions by phosphorylation of connexins. // Arch. Biochem. Biophys., 2000, 15:384, 205-215.

82. Lawrence T.S., Beers W.H., Gilula N.B. Transmission of hormonal stimulation by cell-cell communication. //Nature, 1978, 272:501-506.

83. Lee S.F., Huang Y.T., Wu W.S., Lin J.K. Induction of c-jun protooncogene expression by hydrogen peroxide through hydroxyl radical generation and p60SRC tyrosine kinase activation. II Free Radic. Biol. Med., 1996, 21:437448.

84. Lee S.W., Tomasetto C., Paul D., Keyomarsi K. and Sager R. Transcriptional downregulation of gap junction proteins blocks junctional communications in human mammary tumor cell lines. I/ J.Cell Biol., 1992, 188:1213-1221.

85. Loewenstein W.R. Junctional intercellular communication: the cell-cell membrane channel. //Physiol. Rev., 1981, 61:829-913.

86. Li Y., Leung L.K., Spear B.T, Glauter H.P. Activation of hepatic NF-kappaB by phenobarbital in rats. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 229:982-989.

87. Li J., Chen H., Ke Q., Feng Z., Tang MS., Liu В., Amin S., Costa M., Huang C. Differential effects of polycyclic aromatic hydrocarbons on transactivation of AP-1 and NF-kappaB in mouse epidermal cl41 cells. // Mol. Carcinog., 2004, 40:104-115.

88. Ma C., Wang J., Luo J. Activation of nuclear factor kappa В by diesel exhaust particles in mouse epidermal cells through phosphatidylinositol 3kinase/Akt signaling pathway. I I Biochem, Pharmacol., 2004, 15:67, 19751983.

89. Melendez-Colon V.J., Luch A., Seidel A., Baird W.M. Cancer initiation by polycyclic aromatic hydrocarbons results from formation of stable DNA adducts rather than apurinic sites. // Carcinogenesis, 1999, 20:1885-1891.

90. Mehta P.P., Hotz-Wagenblatt A., Rose В., Shalloway D., Loewenstein W.R. Incorporation of the gene for cell-cell channel protein into transformed cells leads to nonnalization of the growth. // J. Membr. Biol., 1991, 124:207-225.

91. Mehta P.P., Bertram J.S., Loewenstein W.R. Growth inhibition of transformed cells correlates with their junctional communication with normal cells. // Cell, 1986, 44:187-96.

92. Mesnil M., Krutovskikh V., Piccoli C., Elfgang C., Traub O., Willecke K., Yamasaki H. Negative growth control of HeLa cells by connexin genes: connexin species specifity. // Cancer Res., 1995, 1: 55, 629-639.

93. Nebert D.W., Puga A., Vasiliou V. Role of the Ah receptor and the dioxin-inducible Ah. gene battery in toxicity, cancer, and signal transduction. //Ann. N. Y. Acad. Sci., 1993, 23:685, 624-640.

94. Murray S.A., Fletcher W.H. Hormone-induced intercellular signal transfer dissociates cyclic amp-dependent protein kinase. // J. Cell. Biol., 1984, 98:1710-1719.

95. Neumann H.G. Aromatic amines in experimental cancer research: tissue-specific effects, an old problem and new solutions. // Crit. Rev. Toxicol., 2007,37:211-236.

96. Neumann H.G., Hammerl R., Hillesheim W., Wildschutte M. Role of genotoxic and nongenotoxic effects in multistage carcinogenicity of aromatic amines. // Environ. Health Perspect., 1990, 88:207-211.

97. Neveu M., Hully J., Paul D. and Pitot H. Reversible alterations in the expression of the gap junctional protein connexine32 during tumor promotion in rat liver and its role during cell proliferanion. // Cancer Communic., 1990, 2:21-31.

98. Neveu M.J., Babcock K.L., Hertzberg E.L., Paul D.L., Nicholson B.J., Pitot H.C. Colocalized alterations in connexin32 and cytochrome P450IIB1/2 by phenobarbital and related liver tumor promoters. // Cancer Res., 1994, 15:54,3145-3152.

99. Neveu M.J., Hully J.R., Babcock K.L., Hertzberg E.L., Nicholson В .J., Paul D.L., Pitot H.C. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver. // J. Cell Sci., 1994, 107:83-95.

100. Nicholson В., Dermietzel R., Teplow D., Traub O., Willecke K., Revel J.P. Two homologous protein components of hepatic gap junction. // Nature, 1987, 329:732-734.

101. Ohde G., Schuppler J., Schulte-Hermann R., Keiger H. Proliferation of rat liver cells in preneoplastic nodules after stimulation of liver growth by xenobiotic inducers. //Arch. Toxicol. Suppl., 1979, 2:451-455.

102. Omori Y., Krutovskikh V., Mironov N., Tsuda H., Yamasaki H. Cx32 gene mutation in chemically-induced rat liver tumor. // Carcinogenesis, 1996, 17:2077-2080.

103. Omori Y., Mesnil M., Yamasaki H. Connexin32 mutations from X-linked Charot- Marie-Tooth disease patients; functional defects and dominant-negative effects. // Mol. Biol. Cell, 1996, 7:907-916.

104. Park J.Y., Shigenaga M.K., Ames B.N. Induction of cytochrome P4501A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin or indolo(3,2-b)carbazole is associated with oxidative DNA damage. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 19:93,2322-2327.

105. Pastan I.H., Johnson G.S., Anderson W.B. Role of cyclic nucleotides in growth control. // Annu Rev Biochem., 1975, 44:491-522.

106. Pei X.H., Nakanishi Y., Inoue H., Takayama K., Bai F., Hara N. Polycyclic aromatic hydrocarbons induce IL-8 expression through nuclear factor kappaB activation in A549 cell line. // Cytokine, 2002, 19:236-41.

107. Pei X.H., Nakanishi Y., Takayama K., Bai F., Hara N. Benzoa.pyrene activates the human p53 gene through induction of nuclear factor kappaB activity. // J. Biol. Chem., 1999, 3:274, 35240-35246.

108. Puga A., Barnes S.J., Chang C., Zhu H., Nephew K.P., Khan S.A., Shertzer H.G. Activation of transcription factors activator protein-1 and nuclear factor-kappaB by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. // Biochem. Pharmacol., 2000, 58:997-1005.

109. Ren P., Mehta P.P., Ruch R.J. Inhibition of gap junctional intercellular communication by tumor promoters in connexin43 andconnexin32-expressing liver cells: cell specificity and role of protein kinase C.//Carcinogenesis. 1998, 19:169-175.

110. Ren P., Ruch R.J. Inhibition of gap junction intercellular communication by barbiturates in long- term primary cultured rat hepatocytes is correlated with liver tumor promoting activity. // Carcinogenesis, 1996, 17:2119-2124.

111. Risek В., Klier F.G. and Gilula N.B. Developmental regulation and structural organization of connexins in epidermal gap junctions. // Dev. Biol., 1994, 164:183-196.

112. Saez J.C., Martinex A.D., Branez M.C., Conzalez H.E. Regulation of gap junction by protein phosphorilation. // Braz. J. Med. Biol. Res., 1998, 31:593-600.

113. Sakamoto H., Oyamada M., Enomoto K. and Mori M. Differential changes in expression of gap junctions protein connexin26 and 32 during hepatocarcinojenesis in rats. //Jpn. J. Cancer Res., 1992, 83:1210-1215.

114. Sanson M., Marcaud V., Robin E., Valery C., Sturtz F., Zalc B. Connexin 43-mediated bystander effect in two rat glioma cell. // Cancer Gene Ther., 2002, 9:149-155.

115. Savas U., Griffin K.J., Johnson E.F. Molecular mechanisms of cytochrome P-450 induction by xenobiotics: An expanded role for nuclear hormone receptors. // Mol. Pharmacol., 1999, 56:851-857.

116. Schmidt K.N., Amstad P., Cerutti P., Baeurle P.A. The roles of hydrogen peroxide and superoxide as messengers in the activation of transcription factor NF-kappa B. // Chem. Biol., 1995, 2:13-22.

117. Schrenc D., Schmitz H.J., Bohnenberger S., Wagner В., Womer W. Tumor promoters as inhibitors of apoptosis in rat hepatocytes. // Toxicol. Lett., 2004, 149:43-50.

118. Schrenk D., Karger A., Lipp H.P., Bock K.W. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin and ethinylestradiol as co-mitogens in cultured rat hepatocytes.// Carcinogenesis, 1992, 13:453-456.

119. Schuller H.M., Orloff M. Tobacco-specific carcinogenic nitrosamines. Ligands for nicotinic acetylcholine receptors in human lung cancer cells. //Biochem. Pharmacol., 1998, 55:1377-1384.

120. Schuller H.M. Nitrosamines as nicotinic receptor ligands. // Life Sci., 2007, 30:80, 2274-2280.

121. Schwarz M., Buchmann A., Bock K.W. Role of cell proliferation at early stages of hepatocarcinogenesis. // Toxicol. Lett., 1995, 82-83:27-32.

122. Shaulian E., Karin M. AP-1 in cell proliferation and survival. //

123. Oncogene, 2001, 30:20, 2390-2400.

124. Shipley J.M., Waxman D.J. Aryl hydrocarbon receptor-independent activation of estrogen receptor-dependent transcription by 3-methylcholantrene. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 2006, 213:87-97.

125. Shubik, P. The growth potentialities of induced skin tumors in mice. The effects of different methods of chemical carcinogenesis. // Cancer Res., 1950 10:713-717.

126. Solan J.L., Lampe P.D. Connexin phosphorylation as a regulatory event linked to gap junction channel assembly. // Biochim. Biophys. Acta., 2005, 10:1711, 154-163.

127. Solhaug A., Refsnes M., Lag M., Schwarze P., Husoy Т., Holme J. Polycyclic aromatic hydrocarbons induce both apoptotic and anti-apoptotic signals in Hepalclc7 cells. // Carcinogenesis, 2004, 25:809-819.

128. Spray D.C., Moreno A.P., Kessler J.A. and Dermietzel R. Characterization of gap junction between cultured leptominengeal cells. // Brain Res., 1991, 568:1-14.

129. Stauffer K.A. The gap junction proteins Bl-connecsin(connecsin-32) and B2-connecsin(connecsin-26) can form heteromeric hemichannels. // J. Biol. Chem., 1995, 270:6768-6772.

130. Stauffer K.A., Kumar N.M., Gilula N.B., Unwin N. /Isolation and purification of gap junction channels.//J. Cell Biol., 1991, 115: 141-150.

131. Tan Z., Chang X., Puga A., Xia Y. Activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) by aromatic hydrocarbons: role in the regulation of aryl hydrocarbon receptor (AHR) function. // Biochem. Pharmacol., 2002, 64:771-780.

132. Tanaka Т., Yamasaki H., Mesnil M., Induction of bystander effect in HeLa cells by using a bigenic vector carrying vira\l thymidine kynase and connexin32 genes. // Mol. Carcinogen., 2001, 30:176-180.

133. Tannheimer S.L., Barton S.L., Ethier S.P., Burchiel S.W. Carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons increase intracellular Ca2+ and cell proliferation in primary human mammary epithelial cells. // Carcinogenesis, 1997, 18:1177-1 182.

134. Tateno С., Ito S., Tanaka M., Oyamada M. and Yoshitake A. Effect of TCDD on hepatic gap junction intercellular communication in rats. // Carcinogenesis, 1994, 15:517-521.

135. Tharappel J.C., Cunningham M.L., Spear B.T., Glauert H.P. Differential activation of hepatic NF-kappaB in rats and hamsters by the peroxisome proliferators Wy-14,643, gemfibrozil, and dibutyl phthalate. // Toxicol. Sci., 2001, 62:20-27.

136. Thilly W. Have environmental mutagens caused oncomutations in people? //Nature Genetics, 2003, 34:253-258.

137. Tian Y., Ke S., Denison M.S. Rabson A. B. and Gallo M. A. Ah Receptor and NF-B Interactions, a Potential Mechanism for Dioxin Toxicity. //J. Biol. Chem., 1999, 274: 1,510-515.

138. Tian Y., Rabson A.B., Gallo M.A. Ah receptor and NF-kappaB interactions: mechanisms and physiological implications. // Chem. Biol. Interact., 2002, 20:141, 97-115.

139. Traub O., Look J., Dermietzel R., Brummer F., Hulser D. and Willecke K. Comparative characterization of the 21 kD and 26 kD gap junction proteins in murine liver and cultured hepatosytes. // J. Cell Biol., 1989, 108:1039-1051.

140. Trosko J.E. and Goodman J.I. Intercellular communication may facilitate apoptosis: implications of tumor promotion. // Mol. Cancinogen., 1994, 11:8-12.

141. Trosko J.E., Ruch R.J. Cell-cell communication in carcinogenesis. // Front Biosci., 1998, 15:208-236.

142. Turpaev K.T. Role of transcription factor AP-1 in integration of cellular signalling systems. // Mol. Biol. (Mosk). 2006, 40:945-961.

143. Upham В., KoskiT., Rummel A., Wilson M., Horvath A., Trosko J.E. Differential roles of 2, 6, and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. // Cancel-Lett., 2003, 191:27-34.

144. Upham B.L., Weis L.M., Rummel A.M., Masten S.J., Trosko J.E. The effects of anthracene and methylated anthracenes on gap junctional intercellular communication in rat liver epithelial cells. // Fundam. Appl. Toxicol., 1996, 34:260-264.

145. Vaziri C., Faller D.V. A benzoa.pyrene-induced cell cycle checkpoint resulting in p53-independent G1 arrest in 3T3 fibroblasts. // J. Biol. Chem., 1997, 272:2762-2791.

146. Vrzal R., Ulrichova J., Dvorak Z. Aromatic hydrocarbon receptor status in the metabolism of xenobiotics under normal and pathophysiological conditions. // Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky., 2004, 148:3-10.

147. Wilson C.L., Safe S. Mechanisms of ligand-induced aryl hydrocarbon receptor-mediated biochemical and toxic responses. // Toxicol. Pathol., 1998, 26:657-671.

148. Witlock J. Genetic and molecular aspects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin action. Ann. Rev. // Pharm. Toxicol., 1990, 30:251-277.

149. Whitlock J.P. Jr., Okino S.T., Dong L., Ко H.P., Clarke-Katzenberg R., Ma Q., Li H. Cytochromes P450 5: induction of cytochrome P4501A1: a model for analyzing mammalian gene transcription. // FASEB J., 1996 10:809-818.

150. Whitfield J.F., Boynton A.L., MacManus J.P., Sikorska M., Tsang B.K. The regulation of cell proliferation by calcium and cyclic AMP. // Mol. Cell Biochem., 1979, 27:155-179.

151. Worner W., Schrenc D. Influence of liver tumor promoters on apoptosis in rat hepatocytes induced by 2-acetylaminofluorene, ultraviolet light, or transforming growth factor beta 1. // Cancer Res., 1996, 56, p.1272-1278.

152. Weis L.M., Rummel A.M., Masten S.J., Trosko J.E., Upham B.L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of Gap junctional intercellular communication. // Environ. Health Perspect., 1998, 106:17-22.

153. Wolfle D., Becker E., Schmutte C. Growth stimulation of primary rat hepatocytes by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. // Cell Biol. Toxicol., 1993, 9:15-31.