Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO"

J №?>э

На правах рукописи

МОЗАФАРИ АЛИ АКБАР

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЦЕННЫХ ГЕНОТИПОВ ЗЕМЛЯНИКИ IN VITRO

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство; 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре сетекции и семеноводства овощных, плодовых и декоративных культур, на кафедре биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева,

Научный руководитель - доктор сельскохозяйственных наук,

Г Ф Говорова

Официальные оппоненты - доктор сельскохозяйственных наук,

И С Исаева

кандидат биологических наук, Л М Хитрова

Ведущее учреждение - Брянская государственная сельскохозяйственная академия

Защита диссертации состоится " 3~0 "декабря 2004 года в **// часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Московской сеіьскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, И - 550, ул Тимирязевская, 49, Ученый совет МСХА

Автореферат разослан "_ " '004 г

Ученый секретарь ^ j7 S

Диссертационного совета ' Г И Карлов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы . широко распространен-

Земляника является ценной ягодной ^турой, широко>рР*

ной но всем мире. Популярность этой

пластичностью. nn.„VKTbl их переработки непре-

Большим тормозом в продвижении метоЯом и

производство является длительность размножения их традицио

= - трудностей зн—~

использование метода микроклонального РаЗМ™"гетов и Бредителей, пе ТОлько оздоровить размножаемые — Д т„

но и получить до 3 млн. штук рассады в год от одною исходи р

, 1000 увеличить коэффициент Р=кен^^^о этот метод д. н. Говоров, М. д. к^иженкова ^

является достаточно трудоемким и ареоует оол ^ ЭКШюмисй

Вместе с тем высокая рентабельность выр„а„«я

• „лошадей культивационных ^—ем" качества

пастений увеличением коэффициента размножения, У1 У

Продукции,^также ВОЗМОЖНОСТЬЮ з^^щиси, которые

Метод культуры тканей позволяет размнож^ь сор in vitro

плохо или совсем не размножаются "лешии на иммунитет, •фуД„0 переоценить на конечном ОТаПе " „^ИОННМХ фонов. после

осуществляемой с использованием КРо-«о необходимо

ме того, размножение и внедрение быстрым, чтобы опережать йчивых к болезням сортов ^^"^Z^^rc,™

возникновение в природе новых эксплантатов позволяет

„—- е-= ---

Ф Говорова, Д М Говоров, В В Мазин, М Д Калиженкова, 2000, Г Т Морозова, 2ООО, В VI Тюленева Н В Сотовых, 1499, В М Тютенева Н В LojioBb.x, и ip ^ показал чю при микроклональном размножении

земляники может наб податься модификационная изменчивость и возникновение мутации Это может привести к потере исходного генотипа в условиях отсутствия надлежащего авторского контроля и свидетельствует о необходимости предваритепьного изучения поведения конкретного генотипа при микроклональном размножении прежде чем приступить к массовом} размножению его in vitro При тгом важно простелить поведение генотипа на всех этапам размножения in vitro от пробирок до получения плодоношения регенерантов в поле, а не ограничиваться оценкой их в молодом возрасте в теплице, что часто к сожалению, наблюдается в производстве

Таким образом, изучение микроклональной изменчивость перспективных ,пя сельскохозяйственного производства сортов и гибричов актуально чю и обусловило nociaHOBKv 1емы цетей и задач данною исс гедования Цель исследований:

Оптимизация ускоренного масштабного размножения in vitro новейших ценных для производства высокоурожайных сортов земляники с комплексной усШЙЧИВОСТЬЮ к ботезням и вредителям Задами исследований:

1 По ¡учить ретенерангы от генетических различающихся ценных сорюв и гибридов земляники с комплексной устойчивостью к болезням и вредите тям

2 Размножить исходные генотипы земтяники и их регенераты

3 Провести сравнитетьное изучение исходных генотипов и их регенерантов НО морфо-фи ¡политическим И ХОЗЯЙС1ВеННО-НеН1!ЫМ признакам и свойствам ды оиредетения степени сгабильносш и ж изменчивости генотипов при микроклональном размножении

4 Установить целесообразность размножения новых ценных генотипов земляники методом in vitro

5 На основе новых разработок в процессе исслетования оптимизировав массовое размножение in vitro новых высокоурожайных 1еноги-пов зем 1яники с комп [екснои устойчивостью к цато1 енам и вреди гс i-ЯМ Д 1Я ускорения их внедрения в (-етьскохозяйственное произволе!ВО

Научная новизна исследовании:

1) Впервые нрименшетыш к новым ненным сортам и шбридам земляники отработана технология размножения m vitro, изучено последействие фитоюрмонов на рост и развитие растений-ре1енеранюч, усыновлены степень приживаемости мериыем разных

генотипов земляники в условиях пробирок, число микропобегов из одной меристемы и сила их роста, а также развитие корневой системы в условиях in vitro; изучены морфо-физиологические признаки регенерантов в пробирке, в теплице и в поле; установлен коэффициент размножения изучаемых генотипов и их мериклонов в условиях защищенного и открытого грунта; установлена корреляции силы роста растений-регенерантов в пробирке и в открытом грунте;

2) Изучена изменчивость регенерантов в сравнении с исходными генотипами по морфо-физиологическим и хозяйственно-ценным признакам;

3) Установлены стабильные при размножении in vitro генотипы, которые могут быть включены в производственное размножение этим методом.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволили оптимизировать технологию ускоренного размножения земляники in vitro и выявить степень стабильности генотипа новых ценных сортов и гибридов земляники при микроклонольном размножении, что позволит ускоренно размножить их методом in vitro для ускоренного внедрения в сельскохозяйственное производство. Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы доложены на юбилейной научной конференции молодых ученых и специалистов (г. Москва, 2003); на международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (г. Москва, 2004); на 15-ой международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Анатолия Григорьевича Волузнева «Ягодоводство на современном этапе» (г. Минск, 2004); на научной конференции МСХА им. К. А. Тимирязева 3-5 декабря 2003 года «Доклады ТСХА» (г. Москва, 2004); на научной конференции молодых ученых и специалистов (г. Москва, 2004); на 4th international, Iran and Russia Conference "Agriculture and Natural Resources" (shahrekord, Iran, 2004); на 12th Iranian Researchers Conference in Europe (Manchester, 2004);). По материалам диссертации опубликовано семь научных статей.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, трёх разделов, выводов и рекомендаций, списка литературы, включающего 164 наименования, в том числе 63 - иностранных авторов. Экспериментальная часть включает два раздела. Текст диссертации изложен на 155 страницах, содержит 32 таблицы, 81 рисунок и 8 фотографий. Список используемой литературы включает 164 наименования.

2. ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Место исследования. Эксперименты проводились в 2002 2004 годах на кафедре селекции и семеноводе гва овощных, плодовых и декоративных культур, на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии, на Лесной опытной даче, в габоратории цветоводства, в лаборатории плодоводства Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева (МСХА)

Объекты исследования. Объекты исследования - новые copia перспективные шбриды земляники и их регенераты, а также элементы технотогии их размножения m vitro

Для исследования были подобраны новые сорта и гибриды, полученные селекционером Г Ф Говоровой в результате осуществления многолетней приоритетной программы целевой селекции на комплексную устойчивость к болезням и вредителям и ошечающие критериям современного сорта сорта Ьогема Карнавар Рхсъ Мамочка Вечная Весна Говоровская Снежана и гибриды Ь 39 66 96 178 270 280 520 520 и 700 Кроме того, изучали перспективные сорта других селекционеров Царскосельская Бахнти Э ¡ьвира Всего изучено 10 сортов и 10 гибридов

Регенераты изучали в пробирках, а также в сравнении с исходными

ГеНОПШаМИ В ТеПЛИЧНЫХ И ИОЛеВЫХ УСЛОВИЯХ ПО 41 Морфо-физио ЮГИЧсСКОМУ

признаку и по основным хозяйственно-ценным ко шчественным признакам Повторность опытов 3-кратная, агротехника, принятая в Московском ретоне Полевые учеты проводили по методике ВНИИСПК (1999) Метеорологические данные представлены по данным метеостанции МСХА Статистическая обработка результатов исследований проведена методом лисперсионного анализа (О В Масюкова 1979, Б А Доспехов, 1985 M Vah/adeh, M Moghadam, 1ЧЧЗ) Биохимические анализы ягод проводили по меючике(В И Полегаева, 1998)

Анализ данных и биометрическая обработка сделаны на компьютерных программах MS Excel и SPSS 10

Условия культивирования. Размер вводимого в культуру верхушечною апекса составлял 0 3 0,5 мм Стерилизацию растите ibHoi о материала осуществляли в 1%-ном растворе гипох юрита кальция с •женозинией 15-20 минут Культивирование -жеплантон проводили на модифицированной Г Ф Говоровой и M Д Калиженковой питательных средах Мурасига и Скуге (1962) осуществляли в соответствии с методикой В M Тюленева (1996)

Состав сред на этапах введения меристем - питательная сре ы М\расиге -CKvia (MS) с добавками фитогормонов 6-БАП 1мг'л, ИМК и ГК в

концентрации 0,1 мг/л; на этапе укоренения - 'A MS с добавлением ИМК в концентрации 0,05 мг/л. Длина регенерантов измерялась в пробирках в день высадки в грунт спустя 1 месяц после пересадки на укоренение.

Пробирки с меристематическими эксплантами закрывали пробками и фольгой и культивировали при освещении 3 тыс. лк при температуре 25-27°С и относительной влажности 70-80%. Источники освещения: в световой комнате - лампы типа ЛДЦ-20, в теплице - лампы накапливания мощностью 400 Вт. Освещенность в теплице составляла утром и во второй половине дня по 2,5 тыс. лк, в полдень - 4-5 тыс. лк.

В качестве питательных сред для выращивания тканевых культур на этапе регенерации использовали два варианта агаризованной среды Мурасига-Скуге (MS) с добавками эффективных фитогормонов: 1) 6-БАП 1мг/л, ИМК 0,1мг/л и ПС 0,1 мг/л; 2) кинетин Змг/л, ИМК 0,1мг/л и ГК 0,1мг/л. Эксиланты и регенеранты содержали при температуре 25-27 0 С и 16-часовом освещении. На этапе укоренения регенеранты помещали на питательную среду с ИМК 0,01 мг/л при температуре 25-27 "Си 16-часовом освещении, считающимися оптимальными, по данным ряда авторов (С. JI. Расторгуев, В. М. Тюленев, 1995; Г. Ф. Говорова, М. Д. Калиженкова и др., 2000).

Высадку пробирочных растений земляники в нестерильные условия проводили в два этапа. Сначала укорененные пробирочные растения пересаживали в кассеты, заполненные стерилизованным почвенным субстратом, состоящим из смеси песка и торфа в соотношении 1:1; для поддержания высокой влажности кассеты накрывали плёнкой, которую периодически открывали. Затем, примерно через 3-4 недели, такие растения земляники пересаживали в горшочки со стерилизованным почвенным субстратом, состоящим из смеси дерновой земли, почвы и песка в соотношении 1:1:1 и переносили в условия отапливаемой теплицы. В конце мая растения высаживали в открытый грунт.

Учёты и наблюдения. В ходе экспериментов in vitro учитывали влияние состава питательной среды, в частности фитогормонов, на показатели роста и развития регенерантов различных генотипов: коэффициент размножения; регенерацию вегетативных органов (листьев, побегов, корней) с учётом их числа на экспланте и числа эксплантов, проявивших морфогенетические реакции; укореняемость почек (или побегов) и т. д.

У растений-регенерантов в полевых условиях проводили сравнение мериклонов с исходными формами по следующим показателям: число усов, розеток, цветоносов, цветков, плодов; время выдвижения цветоносов, цветения, созревания; морфо-физиологические признаю* листьев; масса, форма, окраска поверхности и мякоти, плотность, вкус и аромат, лежкость,

погруженность и окраска семянок плода, содержание Сахаров и кистот в п юдах, устойчивость к весенним заморозкам, зимостойкость, устойчивость к болезням и вредителям, потенциальная и фактическая урожайность

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Иссчедование проводили по оригинальной схеме (рис 1) Исходные растения - супер-суперэтитные, суперэлитные и эчитные в зависимости от этапа селекционного процесса были отобраны для исследования нами совместно с автором сортов и гибридов селекционером Г Ф Говоровой

3.1. Опенка peienepaiiTOB различных генотипов земляники по

морфо-физиоло! ическим признакам в условиях пробирок н теплицы

3.1.1. Поведение меристемы III vitro

Степень приживаемости меристемы на питательной среде значите 1ьно в шяет на чисто получаемых растений-регенерантов и производство посадочного материала Для изучения приживаемости меристем исстетуемых генотипов в устовияч in vitro помещали меристему на цитате 1ьн\ю среду цо прописи Мурасига-Скуга с добавками фитогормонов 6-БАП и ИМК 10 1 Полученные результаты показали существенные разтичия сортов и гибридов по этому показателю Наибольшая приживаемость меристем отмечена у jKciuiaKjOH гибридов 700 и 8 (100 %), а наименьшая - у сорта Карнавал (52 6 %) Полученные нами результаты соответствуют сообщениям ;ipvi их исс 1едоватечей (Zong R John С Sanford, 1488, Е Д Бондаренко, Н И киссеть, 2002) о том, что у всех сортов земляники, наблюдается высокая степень приживаемости, а поведение жеплантов в культуре in vitro обус товлено i енот ипом сорта

Важную роль при размножении copra через кун,туру ткани шраег ею регенерационный потенциал Как показали исследования Г Ф Говоровой и VI Д Калиженковой (2000), наиболее высоким регенерационным потенциалом из исследуемых генотипов отличаются сорта Вечная Весна, Говоровская, Богема у которых средний выход регенератов на 1 меристему состави i 39 4 25 0 и 18,8 шг соответственно а самым низким - сорт Царскосельская (7,6 пгг) Сорта Баунти, Карнавал, Мамочка заняли промежуточное положение но этому ноказате по Стедоватетьно можно потучить регенеранты у всех генотипов размножат/, их т vitro При этом степень приживаемости меристем и котичес гво получаемых побеюв на питательной среде сильно зависит от генотипа

Рис. 1. Схема изучения сравнительного поведения регенерантов земляники и исходных генотипов

3.1.2. Изменчивость генотипов земляники в зависимости от сроков введення меристемы в культуру тканей

Для изучения изменчивости регенерантов в зависимости от срока введения меристемы в культуру, они были разделены на 6 групп по времени введения меристемы в культуру и изучены по морфо-физио югическим признакам

Из литературных источников известно, что регенерационная способность апексов земляники зависит от срока и места их вычленения (Н J Sivart7 J Ruth (1987), Н И Медведева, Н А Паскеев (2000), С Э Семенас, Н В Кухарчик (2000), Н А Посев (2001) ) Однако, нет единою мнения исс іедователеи по оптимальным срокам введения земляники в культуру ткани Так, по мнению С Э Семенас, Н В Кухарчик (2000), Н А Лосева (2001), лучшие результаты достигаются при инициации культуры весной (в апреле мае), а, по мнению Н И Демидова, Н А Паскеева (2000) - в августе и сентябре

Оценка средней длины побегов растений-регенератов в пробирках перед высадкой их в грунт спустя 1 месяц после пересадки на укоренение in vitro не позволила установить оптимальный срок для всех генотипов (табл 1) Выявлены гфедпочтительные сроки введения в культуру ткани отдельных і енотииов Для большинства генотипов лучшим периодом для введения в культуру оказался конец января Однако, этот вопрос требует дальнейшею более vi лvбдehhoio изучения

Таблица 1

Средняя длина побегов растении-регенерантов в пробирках в зависимости от срока введения меристем в культуру тканей см (2002 2003 гт)

т ¡Сорт Ьогема Группа 1 15 05 2002 ¡Группа 2 27 01 2003 'Группа 3 |5 10 2002 ¡Группа 4 11 05 2003 Среднее по ¡ген отипу

4,9-0,3 5,6—0,7 4,4±0,8 !5,7*1,0 5,2*0 7

Говоровская !5,5±0,5 16 0*0,9 |4,9І0,7 І5,5Ч).7 ,

Карнавал 3 9±0,3 5 7=tl,3 4,3-t0,9 4,6*0,8 1

Снежана |4,1-Ь0,8 ,3,9±0,4 ¡5,7±0,8 S,1±0,S 4,7*0 6

'Вечная Весна 4,2±0,6 ¡5,6±0,6 5,4±0,6 15,4*0,8 5 2*0 7

.Мамочка 5,1x0,9 5 8-0 9 ¡6,1-0,8 '6 3±0 8 '5,8±0 9

Установление, что у бо ¡ьшинства других изученных нами морфо-физиологических признаков (общая длина листа с черешком, длина черешка листа, длина и ширина центральной доли листа) в 1-й группе у всех генотипов показатели значительно выше, чем в 6-ой группе (табл 2) Исключение составляет Гибрид 8 по признаку «длина центральной доли листа» По

остальным признакам (длина черешка центральной доли, высота и число зубцов центральной доли листа) генотипы существенно не отличаются друг от друга на 5% уровне значимости (таблица 2).

Таблица 2

Сравнение морфо-физиологических параметров листьев регенерантов земляники в зависимости от срока введения в культуру, среднее (2002-2004гг.)

Сорт, Дата гибрид I введения в ! культуру ( | Общая длина листа с черешком ,мм Длина черешка листа, мм Длина центральной доли листа, мм Ширина центральной доли _пиг,та _ мм Длина черешка центральной доли, ММ Высота зубчика центральной доли, мм -Іисло зубцов центральной доли писта, шт.

Карнавал 05.05.02 117,1* 87,0* 28,9* 30,0* 5,2 4,1 11,2

' 117.02.02 98,9 75,4 23,9 22,5 4,5 2,7 9,7

Гибрид 8 |05.05.02 154,6* 118,9* 36,2 36,7* 3,3 4,0 12,2

117.02.02 142,9 110,4 32,0 29,2 2,3 3,4 10,5

Гибрид 700 05.05.02 129,5* 97,9* 31,6* 31,0* 1,8 ! 4,0 1 11,6

! 17.02.02 105,7 82,5 23,3 20,5 1,8 1 2,6 і 8,8

3.13. Влияние состава питательной среде на рост и развитие растений-регенерантов земляники

В 2002-2003 годах проведено изучение особенностей поведения регенерантов сортов Богема и Снежана в зависимости от состава питательных сред.

Мы изучали влияние фитогормонов на поведение регенерантов различных генотипов в пробирках, а затем в теплице. Оценивали' общее состояние регенерантов, рост, развитие, окраску листьев, черешков, корней, изменчивость этих признаков и, по возможности, сравнивали его с исходным генотипом. Весго изучено около 1000 регенерантов.

В таблице 3 представлены основные результаты этого эксперимента.

- Следует отметить, что хорошее развитие корневой системы мери клонов наблюдается на обоих средах. Установлено, что на средах и с 6-БАП и с кинетином регенеранты сорта Снежана значительно варьировали по признаку «окраска черешков», а сорта Богема - были однотипными и не отличались от исходного генотипа (таблица 3). Длина регенерантов (без корней) сортов Богема и Снежана, при использовании на этапе регенерации питательной среды с 6-БА1І, была значительно больше, чем на среде с кинетином (рисунок 2). В тоже время следует отметить, что длина побегов сорта Богема на обоих средах больше, чем у сорта Снежана. Регенеранты обоих сортов по силе развития

корневой системы на среде с кинетином варьировали сильнее, чем на среде с 6-БАП У обоих сортов при добовленым кинетина в среду на этапе побегообразования, корневая система развивалась в дальнейшем лучше чем при использовании 6-БАП (таблица 3)

Рис 2 Влияние фитогормонов на рост побегов регенерантов ¡емтяники ш

vitro

Габчица 3

Влияние фиюгормонов на варьирование ре1енерашов сортов зем шники Снежана и Богема на среде «\1Svi, % (2003г )

Сорт

Снежана

Бо1 ема

о 3 с. о

я

я S

о.

£С 6-БАП

Окраска Черешка

Развитие корневой

системы

Листа

антоциан

і J

I 5 "J

f- і -з

I л 1 E: О I

г

69

Кинетин I 91

6-БАП I Кинетин

!jool

і g 2 I r Oj,

92

71

с 1С

85 29

0 0

100

I

100 ,

17 0

cf

Si CU

10 67

33

6L

17 67

J

С іе іоваге іьно после іейсівие фитогормона кинетина на росг и развитие корневой системы регенератов было более сильным, чем 6-БАП

Таким образом выявлено значитечьная степень варьирования морфо-физиояогических признаков у мериклонов в зависимости от генотипа земляники и состава питательной среды Установлено, что влияние фиююрмонов на морфо физиологические признаки специфично іля кажіото гепошіи что еще раз говорит о необходимости иредваршетьною подбора нитатечьной среты для массового размножения каждого генотипа in vitro

З 1.4. Корреляция силы роста растений земляники in vitro и in vivo От ілї ш роста растений-регенерантов в пробирках и после пересадки в u04bv земляники інвисіп успех размножения земляники Поэтому очень важно выявиіь возможные корреляции силы роста растений регенерантов в in vitro и in vivo

Нами vcTaHOBJieHa положительная корреляция силы росга риенерантов разтичных генотипов в пробирках (in vitro) и в горшках (in vivo) на уровне значимости Ioо В частности, корретяции сорта Карнавал 76,4%, (рис 2) Порченные данные почночяют лучше ориентироваться при выборе реіснерангов дія дальнейшего размножения и использования в научных и производственных целях

Длина регенерантов in vitro vim

Рис 3 Корреляция сичы роста регенерантов земляники in vitro и in I, vivo в зависимости от генотипа

3.2. Сравнительное изучение исходных генотипов и их мериклонов в полевых условиях

3 2.1. Изменчивость генотипов земляники по зимостойкое I и и повреждению цветков весенними заморозками после размножения ш vitro.

Устойчивость к заморозкам обычно сопутствует зимостойкости, однако, встречаются незимостойкие сорта, устойчивые к заморозкам и наоборот. Снижение температуры в позднеосенний период до -10 °С и в начале весны до -7 °С при отсутствии снежного покрова вызывает подмерзание растений земляники, а при понижении до -15 °С - их гибель (Д. Бурмистров,1985; М. Turner, К. К. Tanino, С. Stushnoff, 1993; Н. Daugaard ,1998; Р. Palonen, L. Linden, 2001). Зимние повреждения растений и весенняя гибель цветков от заморозков представляют серьезную проблему во многих районах выращивания земляники, в том числе и в Московском регионе, поэтому мы считали необходимым изучить исходные генотипы и их мериклоны по этим признакам.

Осение-зимний период 2002-2003 года был суровым. Уже осенью 2002 года морозы достигали -18--25°Св течение 10 дней при отсутствии снежного покрова, что позволило достоверно оценить зимостойкость изучаемого материала в критической ситуации.

Исследование показало, что изучаемые новые сорта и гибриды проявили значительную зимостойкость. Степень зимостойкости растений-регенерантов было на уровне исходного генотипа.

В весенний период 2002 г. и 2003 г. заморозки не наблюдались и повреждение цветков у генотипов и их мериклонов не отмечено. Весной 2004 года в мае температура воздуха во время цветения в течении 3-х дней была минусовой (-3 °С ), что вызвало повреждение первых цветков особенно у ранних генотипов и их мериклонов в пределах 0,0-16,3 %. Однако, уровень повреждения цветков мериклонов и исходных сортов был одинаков. Исключение составили гибриды 39, 96, 270, 521 у которых погибло цветков на 4-8% больше, чем у их мериклонов.

Таким образом, отмечено даже некоторое преобладание устойчивости цветков у мериклонов, что по-видимому, связано с эффектом оздоровления гибридов при размножении in vitro.

3.2.2. Изменчивость фенологических признаков генотипов земляники после размножения in vitro

По срокам цветения и началу созревания плодов мериклоны, как правило, существенно не отличались от исходных форм. Только в 2003 году ранние гибриды 39 и 96 созрели раньше, а позднеспелый гибрид 270 - позднее исходных генотипов, однако в предыдущий и последующий годы отклонений не отмечено. Выявлено запаздывание массового плодоношения на 4-5 дней в 2003-2004 гг. у мериклона Мамочка и более ранее созревание у мериклонов сорта Русь - в 2003г. Растения-регенеранты остальных сортов и гибридов созревали практически одновременно с исходными генотипами.

3.2.3. Изменчивость ieiiomiioB земляники по устойчивости к болезням и вредителям после размножения m vitro

В литературе описано более 76 грибных заболеваний различных органов растений земтяники 19 - тистьев, 24 - корней, корневой шеики, болезни увядания KVCTa 33 - плодов (Г Ф Говорова, 2000, 2004)

Основные болезни и вредители, которые наносят большой ити значите хьной ущерб земляники - бетая пятнистость, бурая пятнистость, vi юватая пятнистость, вертициллезное и фузариозное увядание, серая жиль и земтяничный клещ Поэтому мы изучали устойчивость к ним исходных i енотипов и их мериклонов в полевых условиях Московского региона

Трехлетние исстедования показали, что устойчивость к видам бе юй, ÓvpOH и угловатой пятнистости, к серой гнили, мучнистой росе и бо 1езням увядания си 1ьно зависит от генотипа и приншшиатьно не измени ись под влиянием микроклонального размножения

3.2.4. Изменчивость генотипов земляники по продуктивности II биохимическим показателям после размножения m vitro

В цечом, количество цветоносов и цветков у мериктонов было больше, чем V исходных генотипов При этом наиболее существенное увеличение чиста иве юносов отмечено у мериклонов сорта Говоровская, Г 270, а цветков - у сорта Карнавал и Гибрид 270 Это соответствует резутьтатам других исс 1едоватеаей, - М J Hennertv, S A Hunter, Vi 1 f-oxe (1987), V M Tyulenev, N V Sotovyh (1947), - которые установили, что при кутьгуре тканей на рас!ении формируется больше цветков

i Ipoitui i ¡авязываемосш цветков у мериклонов был выше, чем у исхо [пых форм, кроме сорта Карнавал и гибрида 46

Ряд исстедователеи отмечают уменьшение размеров плодов у земляники посте кутьтуры ткани (J Dijkstra, 1987) Полученные нами данные показывают, что масса первых плодов мериклонов обычно cooTBeTCTBveT HeXOTHOMV генотипу или таже нескотько отклоняется в сторону уветичения V рас1ении peienepaHTOB сортов Карнавал, Богема и Гибрида 96, что соогве1С1вует данным, отученными другими учеными - Р Boxus 1986, А Minkowski, G Bartoszewski, Е Skorska, 1998

В нашем исследовании уменьшение средней массы плода по сравнении с исходным генотипом отмечено только у одной группы регенерантов copra Вечная Весна Установлено, что мериклоиы как правило, значите гьно урожайнее исхо даых генотипов (таблица 4) что согтасуется с сообщениями дру! их исстедоватетей (Н П Веретенниковой, 1998, О В Матушкина И Н Пронина, 2001 и др )

Нами отмечено некоторое снижение урожайности только у мериклонов сорта Мамочка в 2003 г. и гибридов 96 и 270 в 2004 г.

Таблица 4

Сравнение мериклонов землянки с исходными формами по массе плодов

и урожайности в полевых условиях Московского региона.

Сорт, гибрид Средняя масса первой Урожайность, т/га

ягоды, г.

2002г. 2003г. 2004г. 2002г. 2003г. 2004г.

н. о. Д. н. о. д.

Вечная Весна 17,0 19,0 24,7 4,1* 19,2* 27,8*

Мериклон 19,0 21,8 21,8 8,1 18,6 30,6

Мамочка 16,0 23,7 18,3 6,8* 15,3* 25,6

Мериклон 18,0 21,7 19,1 7,8 14,4 25,1

Говоровская 13,0 17,0 17,1 5,1* 10,8 17,2*

Мериклон 14,0 18,5 19,3 5,8 10,8 18,6

Русь 20,5 28,3 27,3 6,4 13,5* 20,1*

Мериклон 19,0 29,0 28,2 65 13,1 22,8

Карнавал 20,0* 23,0 32,4 6,2 12,4* 24,1

Мериклон 25,0 26,5 30,5 8,4 13,6 25,2

Богема 25,0 31,7* 33,5* 7,8* 18,8* 36,9*

Мериклон 27,0 36,7 39,7 8,9 22,5 37,9

;Гибрид 39 17,2 16,7* 20,4 50,9 11,0 18,8

Мериклон 19,3 21,7 23,3 65,5 10,8 19,2

Гибрид 96 16,0 19,0* 21,4 4,9 7,2 12,9,

Мериклон 15,4 23,0 23,9 5,2 7,6 11,8

, Гибрид 270 23,0 122,7 ¡22,1 4,9* 8,6* 21,7*

. Мериклон 21,5 121,2 124,0 5,6 9,0 20,9

- примечание: ' — отклонение Мериклонов от исходного генотипа существенны на 5% уровне значимости

Н-новосадка О — однолетние растения Д - двулетние растения

Проведенные нами биохимические анализы достоверно свидетельствуют о соответствии биохимических показателей мериклонов исходным генотипам.

J. Dijkstra (1987); С. A. Sims, С. К. Chandler, J. S. Eastridge, R. R. Golaszweski (1997) отмечают более высокое качество ягод на плантациях, закладываемых посадочным материалом, полученным методом культуры тканей. По нашим данным, качество ягод после культуры ткани больше зависит от генотипа.

3.2.5. Изменчивость генотипов земляники по усообразоватслыюи способности после размножения in vitro

Земляника является вегетативно размножаемым растением, поэтому важным показателем генотипа является усообразоватетьная способность В связи с этим мы провети изучение этого признака у исходных генотипов и их мериклонов В ус ЮВИЯХ ЕСПТИЦЫ и поля

Установлено повышение усообразоватечьной способности у рас1ений регенерантов сортов Вечная Весна, Говоровская и Гибрида 66 по сравнению с исходными генотипами Мериклоны всех генотипов формировали больше розеток, чем исходные формы, но статистически достоверные ОТТОЧИЯ отмечены только у мериклонов сортов Вечная Весна, Говоровская и Гибрида 66 Общий выхо I рассады у мериклонов был существено выше ити на уровне исходных форм На выход стандаргаой рассады микроклональное размножение смцеогненно не повлияло (табчица 5)

Таблица 5

Сравнительная усообразоватетьная способность исходных сортов и гиоридов !см 1яники и их мериклонов в полевых условиях Московского региона

Геношп Среднее чисто на 1 Чисто ' Общий і Вычо і

1 куст, шт ро ІЄТОК выход стандартной

1--- __ на 1 рассады, рассады (%)

усоплетейі розеток усоплеть тыс

шт /га

2003 г 2003 г 2003 г 2003 г 2003 г

Вечная Весна 46 0* 313,4* 68 14923 8* 53*

Мерик ЮН S1 2 324 2 63 15438 1 _ ЬЗ

Говоровская 26,7* 250 7* 9,4 11438,1* 74*

Мериклон 31,6 263,1 83 12528,6 68

Русь 14.3 150,0 10,5 і 7142,9 65

Мерик юн 15 2 t 140 1 9 8 7100 0 __63

Карнавал 35 0 357,0* 10,2 17000 0 62

Мериктон 37 2 375,5 10,1 17880 9 59

Богема 30 7 45,1* 1,5 2147,6* 49

Мериклон 33,0 546__ __1_,7 2600,0 48

I ибрид 66 25.3* 161,3* ~ 6,4 7680,9* 77*

Мериклон 28 8 186,2 66 8860,7 71 _

примечание * - отклонение мериклонов от исходного генотипа

существенны на 5% уровне значимости

Анализируя полученные нами экспериментальные данные по стабильности или изменчивости различных генотипов после культуры ткани.

мы пришли к следующему заключению. В 2002 году мериклоны различных сортов и гибридов или не отличались от исходных генотипов или имели отличия в пределах от 1 до 10 признаков. Во второй и третий годы все или некоторые отклонения у полученных растений-регенерантов исчезли. Как видно из таблицы 6, у Гибрида 96, из 10 изменившихся признаков в первый год выращивания, на второй год измененными остались только 2 признака, а остальные отклонения исчезли. На третий год выращивания у мериклонов гибридов 39 и 96 сохранилось только по одному измененному признаку, у гибрида 520 и 521- два признака. Все сорта - Богема, Карнавал, Мамочка, Вечная Весна, Говоровская и гибрид - 270 были стабильными, (таблица 6).

Таким образом, нами установлено, что сорта Богема, Карнавал, Мамочка, Вечная Весна, Говоровская и гибриды 270, 39, 96, 520 и 521 могут быть включены в промышленное размножение методами in vitro, не опасаясь изменений исходного генотипа.

Большинство измененных признаков методом культуры ткани являются эпигенетическими. Степень стабильности растения in vitro сильно зависит от генотипа. Сорта были более стабильными, чем гибриды.

Таблица 6

Число отклонения признаков от исходных генотипов у регенерантов.

Сорт, гибрид Число признаков, шт. Пригодность метода in vitro для масштабного размножения генотипа*

Всего Улучшающих Ухудшающих

2002г. 2003г. 2004г. J 2002г. 2003г. 2004г. 2002г. 2003г. 2004г. 2002г. 2003г. 2004г.

Русь 2 1 0 2 1 0 0 0 0 ++ ++ ++

Богема 1 0 0 1 0 0 0 0 0 ++ ++ ++

Карнавал 1 0 0 1 0 0 0 0 0 ++ ++ ++

Мамочка 3 1 0 2 1 0 1 0 0 ++ ++ ++

Вечная Весна 6 0 0 5 0 0 1 0 0 +- ++ ++

Говоровская 4 1 0 2 1 0 2 0 0 ++ ++ ++

Гибрид 39 6 1 1 4 1 1 2 0 0 - ++ ++

Гибрид 96 10 2 1 6 2 1 4 0 0 - -н- ++

Гибрид 270 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -н- ++ ++

Гибрид 520 8 - 2 4 - 2 4 - 0 - +-

Гибрид 521 4 - 2 4 - 2 0 - 0 ++ ++

•-Примечание

++ Пригоден генотип целиком сохраняется после размножения in vitro, изменения связаны с улучшающими количественными признаками (урожайность и т д )

»--Условно пригоден изменчивость носит модификационной характер — Непригоден генотип после микроразмножения сильно изменен

Таблица 8

Проявление хозяйственно-значимой мериклональной изменчивости у разных сортов и гибридов земляники в полевых условиях _

I Сорта, гибриды

I Изменение признаков у чериютонов в сравнении с исходными 'генотипами

улучшающие признаки

ухудшающие признаки

гч о о

I (в

и Ü

X ее

I «

U о

Р о

и аз

<Я з

О. х

О о

(N

0 5>

£ 43

Й 5

5 Б

1 &

о О--.

I

Вечная Весна

равномерность окраски плода, увеличение размера плода, усиление окраски мякоти и кожицы плода, уве.шчение

нет

_ Ё

S 5

Я. >>

О п СЧ

4 нет

Я 5

U Я JÍ

я g 8

о b <а

о rt с

(N О. S

увеличение полости в 'центре плода

нет

s ^ г

° і Я s

= 1 О ; ег о 1

6 N I

нет

!_ _ количества розеток I _

Говоровская увеличение ■ •••——

Русь

Карнавал

силы увеличение роста растения, силы роста увеличение зоны растения ^без семянок

усиление окраски Некото-рое кожицы и мякоти усиление

нет уменьшение | нет I нет ' интенсивност

и окраски и глянцевитост ] I

_и листа _ _

нет нет нет | нет

.плода

окраски

' Богема

_ _ _ мякоти плода

усиление окраски нет

мякоти плода _ _

уменьшение нет

гребнистости поверхности плода ,

нет нет

_ I-

нет нет

I I_ I

, нет нет

нет нет

1 2 3 4 5 6 7

Гибрид 96 усиление окраски, слабый отрыв нет увеличение нет нет

кожицы и мякоти и чашечки, различий в

глянцевитости усиление форме между

плода и листа, окраски первыми и

, увеличение размера мякоти плода вторыми

плода, слабый ягодами,

отрыв чашечки уменьшение

зоны без

семянок и

плотности

ягоды

углубление

семянок,

Гибрид 270 нет нет нет нет нет нет

Таким образом, проведенные исследования позволили достоверно судить о поведении регенерантов, степени стабильности или изменчивости новых ценных сортов и гибридов земляники при использовании размножения in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Степень приживаемости меристем, количество получаемых побегов, их длина и сила роста корневой системы регенерантов земляники зависят от генотипа, срока введения в культуру и состава питательной среды.

2. На рост микропобегов более сильное влияние оказывает 6-БАП по сравнению с кинетином. Выявлены разные последействия на рост и развитие корневой системы in vitro фитогормонов 6-БАП и кинетина, введенных в питательные среды в период побегообразования.

3. Установлена прямая корреляция силы роста растений-регенерантов in vitro и in vivo, ЧТО позволяет более успешно проводить отбор лучших регенератов на раннем этапе размножения и оптимизировать этот процесс.

4. Максимальная изменчивость растений-регенерантов в поле наблюдается в первый год их выращивания и ноет преимущественно модификационный характер.

5. Число генеративных органов и процент завязи у мериклонов превышает этот показатель, у исходных генотипов. Масса ягоды у мериклонов соответствует исходным генотипам.

6. Микроразмножение существенно не повлияло на вкус, аромат, размер, плотность, лежкость, содержание Сахаров и кислот в плоде у исследованных

генотипов земляники

7 Установлено, что по целому ряду важных агробиологических признаков и свойств (зимостойкость, весеннее состояние растения, устойчивость к вертициллезному увяданию, мучнистой росе, трем видам грибной пятнистости, серой гнили) изучаемые сорта близки к идеальному сорту, и сохраняют свои достоинства посте размножения m vitro

8 Мериклоны сортов с высокой усообразовательной способностью показали больший диапазон варьирования, чем - с низкой Усообразоватсльная способность растений-регенерантов выше, чем у исходных форм Число розеток на I побег, процент выхода стандартной рассады сильно зависит от генотипа и возраста куста Культура ткани позволяет резко увеличить получение посадочного материала

9 Установлено, что при использовании предлагаемой технологии размножения in vitro большинство мериклонов изученных генотипов земляники достоверно не отличаются по 41 морфо-физиологическому и 9 хозяйственно ценным признакам от исходных форм, что позволяет рекомендовать ее для ускоренного размножения in vitro

10 Установлено, что сорта Богема, Карнавал, Мамочка, Вечная Весна, Говоровская и гибрид 270 достоверно сохраняют генотип при размножении in vitro Гибриды 39, 520 и 521 в этих условиях ведут себя нестабильно

11 Совершенствование элементов технологии (сроки введения в культуру тканей, питательные среды, предварительная оценка стабильности генотипов при размножении m vitro и др) обеспечивают оптимизацию микроклонального размножения новых ценных сортов и гибридов земляники

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

I Рекомендовать модифицированную нами технологию ускоренного массово! о размножения земляники in vitro и схему оценки стабильности генотипов при микроклональном размножении с обязательной проверкой идентичности каждой партии растений-регенерантов исходному генотипу в период их плодоношения

1 Рекомендовать ускоренное размножение ценных устойчивых к болезням генотипов земляники Богема, Карнавал, Русь, Мамочка, Вечная Весна, Говоровская, Снежана методом ш vitro, для внедрения их в сельскохозяйственное производство до появления новых вирулентных рас и более агрессивных штаммов патогенов

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ИССЕРТАЦИИ

1. Мозафари А. А. Сравнительный-морфологический анализ меристематического потомства земляники ананасной // Материалы юбилейной научной конференции молодых ученых и специалистов. - М.,

2003. -С. 452-457.

2. Говорова Г. Ф., Мозафари А. А. Результаты сравнительного изучения в полевых условиях исходных генотипов земляники и их мериклонов // Международная научно-практическая конференция «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур». - М., 2004. - С. 64-69.

3. Говорова Г. Ф., Говоров В. Н., Костин А. К., Зубкова М. И., Мозафари А. А. Продуктивность новых сортов земляники в различных регионов России // Международная научно-практическая конференция, посвященная 100-летию со дня рождения Анатолия Григорьевича Волузнева «Ягодоводство на современном этапе». - Минск, 2004,- Т. 15.-С. 126-129.

4. Мозафари А. А., Говорова Г. Ф. Поведение в полевых условиях мериклонов земляники садовой в сравнении с исходными генотипами // Доклады ТСХА. Вып. 276. - М.: МСХА, 2004. - С. 478-482.

5. Мозафари А. А., Костин А. К. Усообразовательная способность новых перспективных сортов и гибридов земляники и их мериклонов // Материалы научной конференции молодых ученых и специалистов. - М.,

2004.-С. 31-34.

6. Mozafari А. А. Изучение варьирования сомаклонов новых сортов земляники в Московском регионе // 4th international, Iran and Russia Conference "Agriculture and Natural Resources" shahrekord, Iran - 2004. - P. 267-271.

7. Mozafari А. А. Варьирование морфо-физиологических признаков генотипов земляники в условиях in vitro и in vivo// 12th Iranian Researchers Conference in Europe (IRCE) - Manchester - 2004 - P. 334.

Объем 1,25 ц і

Зак 322

Тир 100 экз

Издательство МСХА 127550, Москва, ул Тимирязевская 44

/

\