Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация санитарно-паразитологических методов исследования объектов среды обитания человека

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация санитарно-паразитологических методов исследования объектов среды обитания человека"

На правах рукописи

Новожилов Константин Андреевич

Оптимизация санитарно-паразитологических методов исследования объектов среды обитания человека

03.02.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

005559069

о ¿015

Москва 2015

005559069

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения российской Федерации России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Черникова Евгения Анатольевна

Официальные оппоненты:

Степанова Татьяна Федоровна, доктор медицинских наук, ФБУН «Тюменский научно-исследовательский институт краевой инфекционной патологии» Роспотребнадзора, директор

Довгалёв Анатолий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России, заведующий кафедрой тропических и паразитарных болезней

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится МирК 2015 года в часов

на заседании диссертационного совета Д 208.040.12 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49) и на сайте www.mma.ru

Автореферат разослан « "2. Я » М^рТЪ_ 2015 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Паразитарные болезни по-прежнему занимают одно из ведущих мест в структуре инфекционной и паразитарной заболеваемости. В России ежегодно регистрируется около 1 млн. больных паразитарными болезнями, несмотря на сокращение обследования населения на паразитозы и снижение показателей заболеваемости (Онищенко, 2011, 2012, 2013). В мире по данным ВОЗ около 4,3 млрд. человек поражены паразитами. Геогельминтозы относятся к числу наиболее распространённых во всем мире инвазий. По оценкам ВОЗ более одного миллиарда жителей нашей планеты поражено геогельминтозами, наиболее распространенными среди которых являются аскаридоз, трихоцефалез и анкилостомидозы. На Исполкоме Всемирной организации здравоохранения, заседаниях Европейского Регионального Бюро ВОЗ (1999 — 2013 гг.) вопросы борьбы с гельминтозами рассматривались в качестве одной из важнейших современных проблем здравоохранения (ВОЗ, 2013).

Наиболее распространенным геогельминтозом в Российской Федерации является аскаридоз, который для большинства субъектов является эндемичным паразитозом. Важной проблемой здравоохранения, особенно в крупных городах, является заболеваемость населения токсокарозом.

Несмотря на то, что по данным официальной статистики заболеваемость геогельминтозами с каждым годом снижается (Онищенко, 2013), существует необходимость проведения постоянного эпидемиологического мониторинга заболеваемости населения и контаминации объектов окружающей среды.

Постоянная урбанизация населения, повышение антропогенной нагрузки, а также изменения климата, природные катастрофы (недавние наводнения в Краснодарском, Алтайском краях и Амурской области) приводят к созданию благоприятных условий для развития и длительного

выживания в почве яиц и личинок геогельминтов (аскарид, токсокар, власоглавов и др.) и их распространению.

В связи с этим основной задачей санитарной паразитологии на современном этапе является установление закономерностей распространения и распределения возбудителей паразитозов в окружающей среде, определение роли последней в эпидемиологии данной группы возбудителей.

Среди подходов по профилактике гельминтозов, следует выделить мероприятия в области санитарной гельминтологии. При охране окружающей среды обитания человека от загрязнения инвазионным материалом важную роль играют методы определения пропагативных стадий гельминтов.

Мониторинг за очагами геогельминтозов, факторами риска распространения инвазий и другие мероприятия необходимы для выработки стратегии профилактики и борьбы с геогельминтозами, а также возможности ликвидации данных гельминтозов на определенной территории.

Существующие на сегодняшний день методы санитарно-гельминтологического исследования почвы очень громоздки, трудоемки и достаточно дороги; проведение таких исследований возможно только в специализированных лабораториях (Аляутдина, 2011; Новожилов, 2014).

Поэтому наиболее приоритетным направлением в разработке программ по борьбе с геогельминтозами в современных, быстроизменяющихся условиях, является совершенствование и разработка новых методов, позволяющих повысить эффективность и снизить трудозатратность санитарно-гельминтологических исследований почвы.

Целью диссертационной работы является оптимизация санитарно-паразитологических методов исследования почвы.

Задачи исследований 1. Проведение ретроспективного анализа динамики заболеваемости геогельминтозами населения в Российской Федерации.

2. Оценка эффективности современных зарубежных и отечественных методов санитарно-паразитологического исследования почвы.

3. Усовершенствование экспериментальной модели, воспроизводящей контаминацию объектов окружающей среды (песка/почвы) яйцами гельминтов.

4. Разработка нового метода исследования образцов почвы на наличие или отсутствие яиц гельминтов, более эффективного и менее трудозатратного.

Научная новизна результатов исследований В результате исследований получены следующие данные, характеризующиеся научной новизной:

1. Впервые разработан метод исследования образцов почвы на наличие или отсутствие яиц гельминтов, который позволяет снизить трудозатраты и время на исследования в 2-3 раза по сравнению с другими санитарно-паразитологическими методами.

2. Усовершенствована экспериментальная модель, воспроизводящая контаминацию объектов окружающей среды (песка/почвы) яйцами гельминтов для модификации и разработки новых санитарно-паразитологических методов исследования.

Практическое значение результатов исследования

Разработанный новый метод обнаружения яиц гельминтов в почве позволяет: снизить трудозатраты и время на проведение пробоподготовки и анализа; избежать потерь материала при исследовании; обеспечить безопасность труда персоналу санитарно-паразитологических лабораторий путем применения нетоксичных реагентов. Применение данного метода дает возможность проведения качественного анализа почвы без дорогостоящего оборудования.

Внедрение материалов исследований в практику

Материалы исследований используются:

1) в учебном процессе (лекциях, семинарских и практических занятий) кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России при обучении специалистов-паразитологов в рамках дополнительного профессионального образования по специальности 03.02.11 - «паразитология»;

2) в научных исследованиях по оптимизации санитарно-паразитологических методов отдела медицинской гельминтологии в НИИ МПиТМ им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ

Положения, выносимые на защиту

1. Актуальность проведения постоянного мониторинга за очагами геогельминтозов подтверждена ретроспективным анализом динамики заболеваемости геогельминтозами населения Российской Федерации и условий их распространения

2. Разработанный метод обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы позиционируется как часть современных технологий мониторинга и прогнозирования степени рисков заражения объектов среды обитания человека

Апробация результатов исследования

Материалы диссертации были изложены:

на заседании Научного совета Научно-исследовательского института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского 2012, 2013 г.г.;

на заседании пленума научного совета по экологии и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Приоритеты профилактического здравоохранения в устойчивом развитии общества: состояние и пути решения проблем» в ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды», 2013 г.

Личный вклад автора

Лично автором был проведен сбор образцов проб почвы (840 исследованных образцов почвы); санитарно-паразитологические исследования собранных образцов почвы существующими отечественными и зарубежными методами (более 1500 исследований); экспериментальные исследования по усовершенствованию лабораторной модели, воспроизводящей контаминацию образцов почвы пропагативными стадиями паразитов; разработка и экспериментальное подтверждение нового метода санитарно-паразитологического исследования почвы.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 03.02.11 - «паразитология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности 03.02.11 -«паразитология», конкретно пунктам 8, 9.

Публикации

По материалам исследований опубликовано 4 работы, из них 3 в рецензируемых научных журналах, включённых в перечень рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 162 источника, из которых 40 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками и фотографиями.

Благодарности

Приношу глубокую благодарность научному руководителю Евгении Анатольевне Черниковой за неоценимую помощь в выполнении научной работы.

Искренне благодарю сотрудников отдела медицинской гельминтологии НИИ МПиТМ им. Е.И. Марциновского Бориса Николаевича Беребнева, Камалю Юнисовну Кузнецову, Любовь Васильевну Медведеву за помощь в экспериментальной работе.

Особая благодарность Плющевой Галине Львовне и Чернышенко Антонине Ивановне за замечания и консультации.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объем исследований

Отбор и исследование объектов окружающей среды (почва/песок) на яйца гельминтов проводились в соответствии с методическими указаниями -«Методы санитарно-паразитологических исследований» 4.2.2661-10 (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011).

Для гельминтологического анализа с каждой пробной площадки отбирали одну объединенную пробу массой 200 г, составленную из десяти точечных проб массой 20 г каждая. Точечные пробы отбирались методом конверта, по диагонали послойно с поверхности и глубины 10-20 см. Пробы отбирались на детских игровых площадках, песочницах дворовых территорий, в парках.

Доставленные в лабораторию пробы почвы и песка оставляли высушиваться в течение недели. Для экспериментов с известным количеством пропагативных стадий из общей пробы делали навески 5г для песка и 25 г для почвы. В каждую из них вносили пропагативные стадии (чистую культуру яиц Diphyllobothrium latum) в количестве 100 шт. Для экспериментов с неизвестным количеством паразитарных агентов и почву, и песок помещали в стаканы ёмкостью 500г и добавляли к ним несколько тысяч яиц D. latum. Содержимое стаканов тщательно перемешивалось, чтобы гарантировать равномерное распределение яиц гельминтов по почве и песку соответственно. Стаканы с материалом, зараженным пропагативными стадиями, оставляли до дальнейшего использования.

Таблица 1. Объем выполненных исследований

Проведенные мероприятия Объём работы / количество исследованных проб

Сбор проб:

Почва с детских площадок 30

Песок из песочниц на детских площадках 30

Почва с мест выгула собак 30

Почва с дачных участков 20

Почва с придомовых площадок 20

Исследование образцов:

Методом Романенко 50

Методом Долбина 30

Методом Романенко в модификации Аляутдиной 20

Методом Васильковой-Гефтер 30

Иностранными методами 700

Поиск альтернативных конфигураций для метода Романенко 140

Определение концентрации для нового метода 20

Определение сравнительной эффективности метода Романенко и разработанного метода 200

Проверка эффективности нового метода в «слепых» исследованиях 200

Общее количество исследованных проб 1540

Методы исследований

Пробоподготовку образцов выполняли известными методами: методом Романенко; методом Романенко, модифицированным Аляутдиной; методом Васильковой-Гефтер; методом Долбина и Хамзиной.

Метод Васильковой-Гефтер (1955) При пробоподготовке по Васильковой-Гефтер из объединенной пробы берут навеску 50 г почвы, помещают в центрифужную пробирку емкостью 250 мл. Одновременно ведется обработка почвы из 4-х проб. Отобранные навески заливают 3%-ным раствором щелочи (NaOH, КОН) или 1%-ным раствором стирального порошка "Лотос" (или другим CMC) в соотношении 1:2 на 60 мин. для размягчения почвы. Содержимое пробирок тщательно перемешивают стеклянными палочками или электромешалкой в течение 5

мин., а затем центрифугируют 5 мин. при 800 - 1000 об./мин., надосадочную жидкость сливают (при обработке черноземной, торфяной почвы или илового осадка обработку щелочью повторяют и промывают от 1 до 5 раз в зависимости от типа почвы до получения прозрачной надосадочной жидкости). К осадку добавляют насыщенный раствор азотнокислого натрия (удельный вес 1,38 - 1,40) в соотношении 1:2, тщательно перемешивают стеклянной палочкой 5 мин., уравновешивают и центрифугируют 5 мин. при 800 - 1000 об./мин.

Эта процедура повторяется 3 раза. После каждого центрифугирования раствор над уплотненным осадком сливают в отдельную емкость для дальнейшего фильтрования.

Раствор фильтруют через мембранные фильтры "Владипор" типа МФАС-СПА диаметром 35 мм фильтровальной установкой ПВФ-35/2. С фильтра делают соскоб осадка покровным стеклом в каплю 50%-ного раствора глицерина и микроскопируют.

Метод Романенко (1996) и его модификация Аляутдиной (2011)

Из объединенной пробы брали на исследование 4 порции по 25 г почвы, помещали их в центрифужные пробирки объемом 250 мл и заливали 3%-ным раствором натриевой щелочи (в соотношении 1:1) / 3% раствор поверхностно-активного вещества (ПАВ), входящего в состав моющих средств, в частности, моющего средства «Прогресс». После этого содержимое пробирок тщательно размешивали, отстаивали в течение 20 - 30 мин. и центрифугировали 5 мин. при 800 об./мин. Надосадочную жидкость сливали, а почву промывали водой до 8 раз для получения прозрачной надосадочной жидкости. После добавления очередной порции промывочной воды осадок на дне центирифужной пробирки тщательно перемешивали при каждом промывании. После промывки к почве добавляли 150 мл насыщенного (плотность 1,38) раствора нитрата натрия. Почву тщательно размешивали, полученную смесь вновь центрифугировали 5 мин. при 800 об./мин.. Пробирки устанавливали в штатив, доливали тем же насыщенным

раствором соли до уровня на 2 - 3 мм ниже краев пробирок и накрывали предметными стеклами. Затем между краем пробирки и предметным стеклом оставляли пространство шириной не более 10 мм, куда с помощью пипетки вносили насыщенный раствор соли до его соприкосновения с нижней стороной стекла, которое осторожно передвигали до полного покрытия центрифужной пробирки. Через 20 - 25 мин. отстаивания стекла снимали, переворачивая нижней поверхностью вверх, а на их место ставили другие, а через еще 20-25 минут и третьи. На предметные стекла с поверхностной пленкой наносили 1-2 капли 30%-ного раствора глицерина, накрывали их покровными стеклами, а затем микроскопировали. Для обнаружения яиц гельминтов препарат просматривали при увеличении х 80.

Метод Долбина и Хамзиной (патент №2466388)

Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы заключается в том, что пробу почвы весом 25 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды, смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин и центрифугируют в течение 3 мин при 800-1000 об/мин, воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл трехкомпонентной флотационной системы, состоящей из насыщенных растворов цинка хлорида (2 кг ZnCU на 1 л), натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л) и глицерина, взятых в соотношении 1:1:1, в пробирку доливают тот же раствор до образования выпуклого мениска, пробирку накрывают обезжиренным предметным стеклом так, чтобы оно касалось слоя жидкости, через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют, снятие препарата рекомендуется повторить 2-3 раза.

После пробоподготовки различными способами проводили исследования поверхностных стекол с нанесенными на них контаминированными образцами проб почвы или песка с использованием отечественных комплексов аппаратно - программного автоматизированного определения фотометрических параметров «МЕКОС-Ц1» и «МЕКОС-Ц»,

оборудованных микроскопом OLYMPUS, а также обычный световой микроскоп NIKON. Учитывали все обнаруженные яйца гельминтов в пробах.

Статистическая обработка результатов Цифровой материал диссертации обработан методами вариационной статистики: критерий Стьюдента (t) для оценки достоверности, метод корреляционного анализа с расчетом коэффициента корреляции Пирсона для параметрических данных (г). Достоверность коэффициента корреляции принимали при Р<0,05.

Для графического отображения материала и статистической части использовано стандартное программное обеспечение Paint, Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований На основании данных статистических и аналитических материалов Роспотребнадзора нами проведен ретроспективный анализ динамики заболеваемости аскаридозом за 53 года и трихоцефалезов за 23 года.

Анализ показателя заболеваемости (по данным официальной статистики) показывает снижение с 7,3 (на 100 тыс. населения) до 0,24, т.е. в более чем 30 раз. Из приведенных данных четко наблюдается общее снижение заболеваемости населения, как аскаридозом, так и трихоцефалезом.

По экспертным оценкам рассчитанное число больных гельминтозами в 10 раз превышает число официально регистрируемых в стране больных паразитарными болезнями. Отсутствие достоверной информации сказывается на оценке, и поэтому данные, представляемые разными экспертами, значительно различаются (Лебедева, 2010).

Российская Федерация занимает территорию в 17 098246 км2 и разделена на 9 административных округов. Неодинаковый уровень заболеваемости геогельминтозами в разных регионах обусловлен ее зависимостью от ряда климатических, экологических, социальных и экономических факторов. Например, по данным Управления Роспотребнадзора по Приморскому краю заболеваемость аскаридозом в

Приморье за 1995 - 2011 гг. был выше общероссийского примерно в 3 раза, а в одном из районов края - Ольгинском - в 9 раз (Ермоленко, 2011).

В этой ситуации на первое место выходят методы определения яиц гельминтов в окружающей среде. По данным Роспотребнадзора за 2013 год в России было исследовано 432198 проб почвы, из них 1630 с положительным результатом, в которых - 43,4% яйца аскариды, 3,3% яйца власоглава и 53,3 % яиц токсокар.

Существующие на сегодняшний день методы санитарно-гельминтологического исследования почвы очень громоздки, трудоемки и достаточно дороги; проведение таких исследований возможно только в специализированных лабораториях.

Для того чтобы верно и точно определять в почве пропагативные стадии паразитарных агентов, необходимо иметь результативные и действенные методы выявляемое™ яиц геогельминтов, создание которых, в свою очередь, невозможно без экспериментального подтверждения их эффективности.

Для этого необходимо иметь опытную модель контаминации почвы яйцами геогельминтов, которую также можно использовать в качестве проверки эффективности дезрастворов.

На основе описанного ранее метода (Василькова и Гефтер, 1955) нами усовершенствована экспериментальная модель контаминированных образцов почвы.

Материалом для «заражения» исследуемого образца почвы послужили яйца Diphyllobothrium latum, полученные из проглоттид широкого лентеца, выделенного от человека, и любезно предоставленные сотрудниками Спец. КДЛ Первого МГМУ им. И. М. Сеченова.

Некоторыми авторами (Василькова и Гефтер, 1955) для разработки методов санитарно-гельминтологических методов исследования почвы использовались в качестве культуры яйца аскариды. Для выделения яиц

аскариды необходимо вскрывать самку аскариды, внутриполостная жидкость, которой является очень сильным аллергеном. Для того, чтобы обезопасить исследователя от воздействия сильнейшего аллергена нами были использованы яйца D. latum. Кроме этого выбор яиц D. latum в качестве чистой культуры сделан из-за близких по значению размеров и формы с яйцами геогельминтов, в частности аскариды и схожей удельной плотности, а значит, и приблизительно одинакового времени для всплытия яиц при проведении санитарно-паразитологических исследований.

Важный аспект отработки модели - определение точного временного интервала, необходимого для адгезии почвы/песка с введенными паразитарными агентами для того, чтобы корректно воспроизвести заражение пропагативными стадиями гельминтов почвы или песка.

В исследуемые образцы почвы или песка (500 г.) вносили 300 яиц D. latum. Тщательно перемешивали и оставляли отстаиваться при температуре 20 - 25°С. Первый опыт провели сразу после заражения, последующие -через каждые следующие 24 часа.

Все полученные таким методом образцы почвы или песка исследовали методом Романенко.

В результате проведенных исследований нами установлено, что для прочной адгезии необходимо отстаивание образцов зараженной почвы минимум пять дней. Лучшие результаты были получены спустя неделю и более отстаивания контаминированного образца. Литературные данные (Живилова, 1941; Василькова, 1948; Василькова и Гефтер, 1955) свидетельствуют, что для яиц геогельминтов (аскариды, токсокары, власоглава) достаточно 2-3 суток для хорошей адгезии с образцом, после которого можно проводить исследования.

У флотационных растворов, используемых при пробоподготовке, имеются многочисленные недостатки, которые не способствуют быстрой и качественной диагностике. Первое - это длительность проведения пробоподготовки. Часть времени уходит на отстаивание образцов, их многочисленное промывание, которое также ведет к потере до 10% материала за каждую из них. Второе - использование таких флотационных растворов, как нитрат натрия, тиосульфат натрия, растворов натриевой селитры и им подобных, которые относятся ко 2ому классу опасности. В-третьих, эти же флотационные растворы обладают способностью к кристаллизации, которая серьезно затрудняет, как и сам процесс пробоподготовки на последнем этапе, так и просмотр предметного стекла. В четвертых: у унифицированных методов, представленных в МУК 4.2.266110, основной флотационный раствор позволяет обнаружить лишь аскарид и власоглавов, чтобы обнаружить яйца токсокар необходимо применять насыщенным раствором сульфата цинка или сульфата магния в смеси с 5%-ным раствором йодата калия. В-пятых, это использование громоздкого оборудования, такого, как центрифуги и, в случае с методом Васильковой-Гефтер, специальной фильтровальной установки ПВФ-35/2 и специальных фильтров «Владипор» типа МФАС-СПА. И хотя в модификации метода Романенко Аляутдина Л.В. и заменила раствор гидроксида натрия на раствор ПАВ, что несколько уменьшило количество времени, затрачиваемого на пробоподготовку и повысило безопасность труда, это не убрало других недостатков, присущих оригинальному методу.

Нами проведены сравнительные исследования применения различных санитарно-гельминтологических методов образцов почвы (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение отечественных санитарно-паразитологических методов исследования почвы

Параметры Метод ВасилькоП-Гефтер Метод Романенко Метод Долбина, Хамзиной Метод Романенко в модификации Аляутднной

Используемые реагенты Гидроксид натрия (№ОН), Нитрат натрия (№ЫОз) Гидроксид натрия (№ОН), Нитрат натрия (№Ж)з) Трехкомпонентная флотационная система: насыщенный раствор цинка хлорида (гпСЬ), натрия хлорида (КаС1) и глицерина в соотношении 1:1:1 Раствор ПАВ, Нитрат натрия (Ыа>Юз)

Средний % выявляемости яиц гельминтов 44,6 73 79,5 73

Эффективность метода 34 - 60% 59,6- 83,1% 65 - 90 % 59,6-83,1%

Оборудование, необходимое для проведения исследования Центрифуга, электромешалка, мембранные фильтры "Владипор" типа МФАС-СПА диаметром 35 мм фильтровальной установкой ПВФ-35/2 Центрифуга, электромешалка Центрифуга, электромешалка Центрифуга, электромешалка

Затраченное время на пробоподготовку более 2 часов 1-1,5 часа 1-1,5 часа 1-1,5 часа

НЕДОСТАТКИ

Кристаллизация препарата Есть есть есть есть

Длительность сохранения препарата для просмотра 15мии 15 мин 20 мин 15 мин

Время на пробоподготовку, учитывая подготовку растворов более 4 часов 3 - 3,5 часа. 2 - 2,5 часа 3 часа.

Возможность повторного просмотра препарата Отсутствует Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Наличие промывок Присутствуют Присутствуют Присутствуют Присутствуют

Потеря паразитарных агентов в результате промывок в % До 10% за каждую До 10% за каждую До 10% за каждую До 10% за каждую

Так как схема практически у всех методов, использующих флотационный механизм, одинакова, мы использовали, взяв за основу последовательность исследования из унифицированного метода Романенко, рекомендуемого к использованию при санитарно-паразитологических исследованиях в лабораториях Роспотребнадзора.

Изменяя порядок применения различных компонентов, растворы в ключевых точках нами проведена оценка этапов санитарно-паразитологических исследований проб почвы методом Романенко (табл. 3).

Таблица 3. Оценка этапов санитарно-паразитологического исследования проб почвы методом Романенко (1996 г.)

Название методики Численность поставленных экспериментов Количество яин в пробе Количество яиц, найденных при просмотре надосадочной Процент потери Итоговое количество найденных яиц к

жидкости после начальному

промывки этапу

Оригинальная В

методика 50 100 8-12 среднем 47-54%

Романенко 10%

Методика В среднем 10%

Романенко без этапа промывания 20 100 8-12 10-20%

Методика

Романенко без

этапа 30 100 8-12 8-12% До 20%

перемешива-

ния

Методика В среднем 10%

Романенко без этапа отстаивания 30 100 8-12 10-30%

Методика

Романенко сразу с этапа 20 100 - - До 20%

№Ж>3

Методика

Романенко с В

заменой МаК03 20 100 8-12 среднем 2-4%

на Перекись 10%

водорода (3%)

Методика с

Перекисью водорода + N31403 20 100 - Отсутствует 2-5%

При разработке нового метода мы руководствовались целью создать быстрый и точный метод определения яиц геогельминтов в почве без сложных приборов и конструкций, в перспективе, с возможностью работать прямо на месте забора проб при наличии мобильной лаборатории.

Отечественные паразитологи Исаев Л.М., Василькова З.Г. и Гефтер В.А. предлагали использовать специальные приборы, подающие потоки воздуха под давлением для очистки яиц гельминтов от частиц почвы.

Проанализировав эти данные, а также имеющиеся на сегодняшний день растворы с похожим механизмом действия, мы использовали для разработки новой методики перекись водорода, так как эффект от взаимодействия почвы и данного раствора в какой-то мере схож с воздействием приборов, предложенных Исаевым Л.М., Васильковой З.Г. и Гефтер В.А..

Для определения наиболее эффективной и не затрудняющей просмотр препарата концентрации перекиси водорода были проведены сравнительные исследования последовательных концентраций, отвечающих поставленным требованиям к раствору.

Пробоподготовка образцов почвы/песка проводилась следующим образом: к 25г образца почвы, помещённого в большую центрифужную пробирку, добавляют 25 мл 1,4 - 1,6 % перекиси водорода. Содержимое перемешивают маленькими стеклянными палочками и отстаивают в течение 4-6 минут. Перемешивание повторяют дважды. Пробирку оставляют на 20 -25 минут для взаимодействия исследуемой пробы и раствора. В процессе реагирования почвы и перекиси водорода, почва поднимается выше уровня жидкости и оседает на стенках пробирки. Её смывают небольшим количеством раствора перекиси водорода, также смывают частички почвы с палочки, которую используют для перемешивания образца, с целью недопущения возможных потерь в пробе. В процессе отстаивания на линии соприкосновения перекиси водорода с верхней границей образца почвы формируется зона, отличающаяся по цвету от основной массы исследуемого образца, из которой пипеткой забирается материал для микроскопирования

на предметном стекле. Для обнаружения яиц геогельминтов, которые могут находиться в образце, достаточно микроскопировать не более трёх предметных стёкол. Полученные препараты просматривают под увеличением х 10.

Определив необходимую концентрацию, мы приступили непосредственно к исследованиям проб почвы/песка на моделях, зараженных яйцами D. latum. Было проведено сто экспериментов с почвой и сто с песком. При исследованиях, в 98% случаев было обнаружено хотя бы одно яйцо паразитарного агента при просмотре трех покровных стекол.

Разработанный нами метод был назван как «метод перекисной дисперсии».

Выбрав из представленных методик метод Романенко в качестве контрольного, мы приступили к сравнению его с только что разработанным методом (табл. 4).

Таблица 4 Сравнение метода Романенко и метода перекисной дисперсии

Параметры Метод Романенко Метод перекисной дисперсии

Время пробоподготовки и проведения исследований 180-210 минут 30 - 35 минут

Необходимые реагенты Гидроксид натрия (NaOH), Нитрат натрия (N'aNO^) Перекись водорода (H^OJ

Среднее количество выявляемых яиц (в 100 опытах) 4,4 8,6

Уже первоначальные испытания выявили преимущество разработанной нами методики. Ее применение позволяет за время, необходимое для

пробоподготовки по методу Романенко, провести 2-3 полных исследования, включая и ее пробоподготовку. А учитывая также и время, затраченное на подготовку и производство раствора нитрата натрия для метода Романенко, за это время можно провести 5-6 исследований.

Новый метод также избавил нас от необходимости переливания и промывок, что позволяет не терять ни процента исследуемого образца. Новый метод дает возможность использовать лишь один раствор для выявления пропагативных стадий геогельминтов.

Используемая перекись водорода в концентрации 1,5% относится к 4 классу опасности, что улучшает безопасность труда, заменив высоко опасный 3% раствор натриевой щелочи на умеренноопасные и малоопасные вещества.

При просмотре предметного стекла, даже если препарат высох, что происходит лишь через 30 минут после его приготовления, можно возобновить изучение без усилий, так как не происходит кристаллизация препарата. А препарат, приготовленный по методу Романенко, через 15 минут уже не может быть просмотрен из-за его полной кристаллизации. Использование новой методики обходится без дорогостоящего и громоздкого оборудования, и не требует для проведения исследования наличия центрифуги.

Для подтверждения полученных результатов нами были взяты пробы почвы с неисследованных территорий, а именно: пробы песка из песочницы на детской площадке, пробы почвы с детской площадки, пробы почвы с площадок для выгула домашних питомцев жителями окружающих домов и придомовых площадок. Также пробы почвы были взяты на дачных участках в Московской области (табл. 5).

Таблица 5. Исследования проб почвы новым методом перекисной дисперсии

Места для забора проб Число исследованных проб Число положительных проб Обнаруженные пропагативные стадии геогельминтов (среднее число в пробах)

Почва с детских площадок 30 15 2,2+0,5 яиц Т. сатз

Песок из песочниц на детских площадках 30 11 1,4+0,2 яиц Т. ЫсЫига 2,5+0,9 яиц Т. сатз

Почва с мест выгула собак 30 23 3,1 + 1,1 яиц Т. сат$

Почва с дачных участков 20 0 0

Почва с придомовых площадок 20 12 1,7+0,9 яиц Т. сатз

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на стойкое и очевидное снижение заболеваемости геогельминтозами следует отметить необходимость проведения постоянного эпидемиологического мониторинга за очагами геогельминтозов для выработки стратегии профилактики и борьбы с геогельминтозами, а также возможности ликвидации очагов данных гельминтозов на определенной территории.

Осуществление этих мероприятий невозможно без применения санитарно-паразитологических методов исследования объектов окружающей среды, в частности почвы. Это становится очень важным моментом при текущих изменениях климата, участившихся природных катастроф, произошедших за последние несколько лет.

Для точного определения в почве пропагативных стадий паразитарных агентов необходимо иметь результативные и действенные методы выявляемое™ яиц геогельминтов, создание которых невозможно без экспериментального подтверждения их эффективности. Это невозможно без простой и безопасной опытной модели контаминации почвы яйцами

геогельминтов, которую также можно использовать в качестве проверки качества и эффективности дезрастворов.

Методика санитарно-паразитологического исследования почвы очень сложна и трудоёмка, так как связана с неоднократным центрифугированием проб почв и их исследованием. Однако, несмотря на многочисленные попытки исследователей на протяжении 20 века и до наших дней получить простой и эффективный метод для определения яиц гельминтов в почве, до сих пор этого сделать не удалось.

Для решения этой проблемы назрела необходимость разработки совершенно новых или модификация уже имеющихся методов санитарно-гельминтологических исследований почвы, позволяющих снизить трудоемкость, повысить эффективность исследования почвы на наличие яиц гельминтов, что позволит активизировать изыскание новых дезинфицирующих средств, сохраняющих биологическое равновесие урбаноземов.

Разработанный нами новый простой и эффективный метод перекисной дисперсии обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы, который можно использовать и как экспресс-метод, решает эту задачу.

Использование новой методики обходится без дорогостоящего и громоздкого оборудования. В этом случае, при наличии передвижных лабораторий существует возможность проводить исследования прямо на месте забора проб почвы.

ВЫВОДЫ

1. Проведенный ретроспективный анализ динамики заболеваемости геогельминтозами на территории Российской Федерации позволил выявить стойкое снижение заболеваемости населения (по официальным данным Роспотребнадзора), однако на основании экспертных оценок реальное число больных гельминтозами за этот период было гораздо выше.

2. Сравнительные исследования иностранных и отечественных санитарно-паразитологических методов исследования почвы позволили определить ряд не выявленных ранее недостатков - на этапах промывания, переливания и замены растворов теряется до 10% исследуемого материала. Используемые растворы обладают более высокой степенью кристаллизации, чем указывалось ранее.

3. Усовершенствованная экспериментальная модель (контаминации почвы/песка) может быть использована для разработки новых методов санитарно-паразитологических исследований объектов окружающей среды.

4. Разработан новый эффективный метод перекисной дисперсии определения яиц гельминтов в пробах почвы/песка, снижающий трудозатраты, время на исследования и обеспечивающий безопасность труда персоналу лаборатории путем применения безопасных реагентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Применение нового метода обнаружения яиц гельминтов в почве позволит снизить трудозатраты и время на проведение пробоподготовки и анализа; избежать потерь материала при исследовании; а также обеспечить безопасность труда персоналу санитарно-паразитологических лабораторий путем применения нетоксичных реагентов.

Применение данного метода даст возможность проведения качественного анализа почвы без дорогостоящего оборудования, а при наличии мобильных лабораторий и прямо на месте забора проб.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Новожилов К. А., Беребнев Б. Н., Аликов А. В. Проблема геогельминтозов в Москве и Московской области. // Приоритеты профилактического здравоохранения в устойчивом развитии общества: состояние и пути решения проблем». Материалы пленума научного совета по экологии и гигиене окружающей среды Российской Федерации. Под ред. академика РАН Рахманина Ю. А.. М.: 2013. — стр. 272-274.

2. Новожилов К. А., Черникова Е. А. Актуальность и совершенствование санитарно-гельминтологических методов исследования почвы. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни - М.2014.-№1.-С. 58-59.

3. Черникова Е. А., Новожилов К. А., Беребнев Б.Н. Оптимизация модели оценки эффективности используемых методов санитарно-гельминтологических исследований почвы на загрязнение ее паразитарными агентами // Медицинская паразитология и паразитарные болезни - М.2015.-№1.-С. 49-51.

4. Новожилов К. А., Беребнев Б.Н., Черникова Е. А. Новый экспресс метод исследования почвы на обнаружение яиц гельминтов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни - М.2015.- №1,- С. 51 - 52.

Подписано в печать 23.01.2015г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 7444-12-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39