Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro"
На правахрукописи
НАМ Ирина Ян-Гуковна
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА И РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ В БИОТЕХНОЛОГИЯХ IN VITRO
Специальность 03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2004
Диссертационная работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева
Научный консультант-доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН B.C. Шевелуха.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.В. Поляков, доктор биологических наук, профессор Н.Е. Павловская, доктор сельскохозяйственных наук С.Д. Айтжанова.
Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии.
Защита диссертации состоится декабря 2004 года сов на
заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет МСХА. С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА.
Автореферат разослан ноября 2004 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Изучение влияния регуляторов роста и развития растений на их морфогенез, устойчивость и продуктивность является важнейшим направлением современной биотехнологии, имеющим теоретическое и практическое значение для создания новых сортов, гибридов и разработки высоких технологий.
Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ. Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н., 1973; Муромцев Г.С. и др., 1987; Кефели В.И. и др., 1989), направленно воздействующие на процессы, протекающие в растениях. Это позволяет использовать их в биотехнологиях in vitro (Шевелуха B.C., 1992), в частности, для клонального микроразмножения и регенерации, разработанных для многих видов культурных растений (Бутенко Р.Г., 1964, 1999). Однако для трудно размножаемых культур, в том числе для ремонтантной малины, актуальным является поиск эффективных регуляторов роста для разработки технологий размножения и регенерации растений в культуре in vitro.
Фундаментальной основой для разработки методов применения существующих и поиска новых физиологически активных веществ является изучение механизмов их действия на растения в онтогенезе. Большое значение в этом отношении имеют модельные системы in vitro на основе изолированных органов, тканей и клеток. Оптимизация таких систем включает характеристику их специфичности, чувствительности по отношению к регуляторам роста, физиологической значимости эффектов и т.д. Особый интерес представляют модельные системы, позволяющие изучать молекулярные механизмы действия фиторегуляторов на уровне транскрипции и регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ.
Разработанные нами модельные системы на основе семядолей прорастающих и зародышей созревающих семян люпина желтого были использованы для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов, гормональной регуляции биосинтеза РНК и белков, активности РНК-полимераз и экспрессии генетических программ.
Воздействие фитогормонов на рост и развитие различных видов растений изучалось многими исследователями (Кефели В.И., 1984; Никелл Л.Дж., 1984; Шевелуха B.C. и др., 1998), однако синтетические регуляторы роста изучены недостаточно. Для ряда фиторегуляторов показано главным образом их влияние на продуктивность отдельных сельскохозяйственных культур, а для
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ | КМВЛИОТБКА {
COtWfijfr/^oi
з
некоторых экономически важных культур не получено и этих данных, например, на огурце при его возделывании в защищенном грунте. К эффективным, но малоизученным фиторегуляторам, созданным в последние десятилетия, относятся препараты эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1 и кавказ (Ненько Н.И., 1999; Ковалев В.М., 2003). Наряду с исследованием их влияния на продуктивность и устойчивость растений огурца, важно было изучить морфофизиологические показатели эффективности этих веществ, регуляцию ими разных этапов онтогенеза.
Такие исследования проводились нами в период с 1978 по 2004 гг. на ремонтантной малине, огурце в защищенном грунте и люпине желтом -культурах разных ботанических семейств.
Целью настоящей работы является оптимизация применения регуляторов роста: а) при создании высокоэффективной системы клонального микроразмножения, регенерации и генетической трансформации in vitro растений ремонтантных форм малины; б) при разработке модельных систем для изучения молекулярных механизмов действия фитогормонов на разных этапах онтогенеза люпина; в) при разработке методов использования новых регуляторов роста и развития для увеличения продуктивности растений огурца.
При этом решались следующие задачи:
- разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины: введение материала в культуру in vitro, оптимизация условий побега- и корнеобразования, разработка способов длительного хранения пробирочных растений;
- разработка системы регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков, а также метода молекулярно-генетического анализа на основе ISSR-PCR для изучения генетической стабильности регенерантов;
- разработка метода трансформации растений ремонтантной малины с использованием A. tumefaciens, доказательство его эффективности с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности;
- разработка модельных систем для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов в онтогенезе на растениях люпина желтого с использованием прорастающих и созревающих семян;
- изучение эффективности новых синтетических регуляторов роста растений эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1, кавказ на разных этапах онтогенеза огурца и оптимизация их применения в условиях защищенного грунта для повышения продуктивности и устойчивости.
Научная новизна работы.
Впервые разработан метод клонального микроразмножения
ремонтантной малины, при этом оптимизированы этапы введения материала в культуру in vitro, размножения и укоренения пробирочных растений и длительного сохранения клонов в пробирочных условиях.
Впервые показана способность регуляторов цитокининового действия структурного ряда дифенилмочевины - тидиазурона (TDZ) и ^(4-пиридил)^-фенилмочевины (4-PU), индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек, что позволило вводить в культуру in vitro новые формы ремонтантной малины в течение всего года.
Разработан метод регенерации растений из листовых дисков ремонтантной малины с применением 4-PU и TDZ, универсальный для различных генотипов. Стеблевой морфогенез наблюдается у всех исследованных форм - на уровне 3.3 - 96.0% в зависимости от генотипа.
Впервые разработан молекулярно-генетический метод анализа растений малины на основе ISSR-PCR. Показана генетическая однородность полученных регенерантов ремонтантной малины и их идентичность исходному образцу. Эффективность метода подтверждена путем проведения генетической паспортизации и построения дендрограмм генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.
Разработана система генетической трансформации ремонтантной малины методом кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Эффективность метода доказана с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности.
Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих семян и незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro, для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян и экспрессии генов.
Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирования. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II и показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.
Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых препаратов кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта, показано их стимулирующее действие на рост, развитие и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном фунте на 9 -17%.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод клонального микроразмножения in vitro ремонтантной малины с применением цитокининов TDZ и 4-PU для оптимизации этапов введения эксплантов в культуру in vitro и размножения пробирочных растений, обеспечивающий размножение образцов практически независимо от генотипа.
2. Системы регенерации ремонтантной малины из листовых дисков и ее трансформации методом кокультивирования с A. turn.
3. Метод молекулярно-генетического анализа малины для оценки генетической стабильности и однородности растений - регенерантов, а также для характеристики размножаемых ремонтантных форм.
4. Модельные системы с использованием изолированных семядолей проростков и незрелых зародышей люпина желтого для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов и регуляции экспрессии генов.
5. Способы применения регуляторов роста Краснодар-1, Кавказ и эмистим в условиях интенсивной технологии выращивания огурца в защищенном грунте для повышения продуктивности растений и ее стабилизации.
Практическая значимость работы. Применение предложенных методов и технологий размножения in vitro ремонтантной малины обеспечило сокращение на 4 - 5 лет сроков селекции от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания, что особенно важно для ремонтантных генотипов, которые отличаются низким коэффициентом вегетативного размножения. В период с 1993 г. по 2004 г. размножено и передано селекционерам более 130 образцов и на этой основе ими создано 8 новых сортов ремонтантной малины.
Применение экологически чистых препаратов эмистим, Краснодар-1 и кавказ повышает продуктивность растений огурца в условиях интенсивного производства в защищенном грунте на 9 -17%.
Обоснованность и достоверность научных положений и выводов обеспечивается обширным экспериментальным материалом, полученным в течение более 25 лет исследовательской работы, использованием современных существующих и разработанных нами методик и статистической обработкой результатов исследований с оценкой их точности и достоверности.
Личный вклад автора. Автор принимал личное участие в постановке проблем, целей и задач исследований, разработке программ и новых методов исследований, руководстве аспирантами. Лично автором и руководимыми им
аспирантами выполнена основная часть экспериментальной работы, а также обработка, анализ и обобщение полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы, выводы и предложения по диссертации докладывались на следующих, конференциях и симпозиумах: на конференции по молекулярным механизмам регуляции метаболических процессов (Минск, 1987), II Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений (Киев, 1988), международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988), 5th and 8th International Lupin conference (Poznan, 1988; Pacific Grove, California, USA, 1996), Всесоюзной конференции "Физиология семян" (Душанбе, 1988), международном симпозиуме "Эмбриология и семенное размножение" (Ленинград, 1990), II и IV съездах Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990; Москва, 1999), II Всероссийском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993), 4 и 5 международных конференциях "Регуляторы роста и 'развития растений" (Москва, 1997, 1999), 3 ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), международной научно-практической конференции «Биотехнология -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке» (С.-Петербург, 2001), Perm State Plant Physiology Symposium «Plant Reproduction 2002» (Penncilvania, 2002), Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003), международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003) и др.
Публикации. Основные результаты исследований по диссертации опубликованы в 59 печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора научной литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Материалы диссертации изложены на 312 страницах машинописного текста, содержат 51 таблицу и 48 рисунков. Библиография включает 380 источников, в том числе 145 из зарубежной литературы.
Объекты исследования.
Настоящая работа была выполнена на малине обычных и ремонтантных форм, гибридов и сортов сложного межвидового происхождения (род Rubus); на сортах люпина желтого (Lupinus luteus (L.) Академический, Нарочанский; на длинноплодных гибридах огурца (Cucumis sativus L.), используемых для выращивания в защищенном грунте: НИИОХ-412, Королек, Аэлита и Московский юбилейный.
Методы исследования.
Культивирование in vitro малины проводили на среде Мурасиге-Скуга с увеличенной в три раза концентрацией хелата железа. Приготовление питательных сред, стерилизация материала, выделение эксплантов осуществлялось с помощью стандартных методов и приемов (Бутенко Р.Г., 1964).
Экспланты для клонального микроразмножения (апексы и зачатки цветков размером 0.2 - 0.7 мм) выделяли из почек побегов замещения. Стерилизацию проводили с помощью 0.1% раствора сулемы.
На разных этапах клонального микроразмножения ремонтантной малины применяли среды, содержащие цитокинины 6-БАП (1-4 мг/л), TDZ (0.025-0.2 мг/л), 4-PU (0.1 - 0.4 мг/л) и ауксины ИУК или ИМК (0.5-1.5 мг/л). При кратковременной обработке побегов для ризогенеза использовали ИМК, 1 г/л.
При регенерации растений в качестве источника эксплантов использовали листья и черешки, изолированные от укорененных in vitro растений малины. Отсутствие генетических изменений в полученных регенерантах доказывали с помощью метода ISSR-PCR по модифицированной методике Prevost G.& Wilkinson J.A. (1999). Все праймеры для метода ISSR- PCR были синтезированы ЗАО «Синтол» (Москва).
Для генетической трансформации растений использовали штаммы А. tumefaciens, любезно предоставленные лабораторией генетической инженерии растений Института общей генетики: E35S-L-licB, E35S-licB, E-nptII. Использованные векторы содержали ген устойчивости к канамицину под опиновым nos-промотором и ген репортерного белка лихеназы под промотором 35S. Эта репортерная система основана на высокой термостабильности бактериального фермента лихеназы Clostridium thermocellum (Мусийчук К.А., 2001). Наличие лихеназной активности в растениях - регенерантах определяли с помощью чашечного теста (Голденкова И.В., 2002).
В опытах использовали также штамм A. tumefaciens GANE 7, содержащий ген Ь6, любезно предоставленный Институтом клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины. Ген участвует в тонкой регуляции действия цитокининов в растениях и способен вызвать повышение регенерационной способности у табака (Кучук Н.В., 1997).
Анализ ФГ в зародышах и семядолях люпина желтого проводили методом ГЖХ и ИФА (Заякин В.В., 1997).
Электрофорез запасных белков люпина и иммуноэлектрофорез по Грабар-Уильямс проводили по стандартным методикам (Остерман Л.А., 1983).
Этиолированные семядоли изолировали у проростков люпина желтого разного возраста (до 8 суток) и культивировали в темноте на воде или растворах ФГ, далее из них выделяли ядра, хроматин или РНК-полимеразы. Транскрипцию хроматина в системе in vitro и определение протеинкиназной активности проводили по методу, описанному Заякиным В.В. (1990). Содержание хлорофилла в семядолях определяли по методике Авериной Т.С., Шлыка А.А. (1972).
В опытах по влиянию регуляторов роста на прорастание семян и развитие проростков огурца использовали гибриды НИИОХ-412 и Королек. Огурцы выращивали в защищенном грунте согласно стандартной технологии. Семена проходили предпосевную обработку методом замачивания в растворах исследуемых препаратов в течение 24 часов. Производственные опыты были проведены на гибридах НИИОХ-412, Королек, Аэлита и Московский юбилейный.
Опыты проводили в 3-4 - кратной повторности. Полученные данные после статистической обработки представили в виде М + т, где М -математическое ожидание, am- стандартная ошибка среднего (Доспехов Б.А., 1974).
Результаты исследований и их обсуждение.
Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений при клональном микроразмножении и регенерации растений ремонтантной малины in vitro.
В работе на ремонтантной малине мы опирались на результаты отечественных и зарубежных исследователей, ранее разработавших методы клонального микроразмножения и регенерации in vitro для ряда плодово-ягодных культур, и в частности, на работы по культивированию in vitro малины и ежевики (Высоцкий ВА, 1984, 1998; Fiola J.A. et al., 1990; Graham J. et al., 1997). Для размножения in vitro большинства культур на этапах индукции из эксплантов первичного побега и размножения растений различными авторами применялись цитокинины 6-БАП, кинетин и зеатин, и для ризогенеза - ауксины ИУК, ИМК или НУК. При разработке метода клонального микроразмножения ремонтантной малины нами также изучалось действие разных цитокининов и ауксинов.
Разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины. В настоящей работе были использованы ремонтантные формы малины селекции чл.-корр. РАСХН Казакова И.В., полученные им при межвидовой гибридизации малины красной, замечательной, черной, боярышниколистной, душистой и поленики. В гибридном питомнике селекционерами было оценено более 120 тысяч гибридов, при этом отобрано более 250 образцов, превосходящих районированный ремонтантный сорт Бабье лето.
Ремонтантные формы растений малины имеют ряд особенностей в своем развитии. Главная из них - плодоношение на побегах первого года, в связи с чем вегетативные почки на отрастающих побегах рано дифференцируются по цветочному типу. Распределение питательных веществ также подчинено раннему плодоношению, и ассимиляты преимущественно потребляются растущими побегами и плодоэлементами. Это вызывает существенное уменьшение образования корневых отпрысков, замедление вегетативного размножения и, как следствие, удлинение селекционного процесса в целом. В связи с этим была поставлена задача разработать биотехнологические приемы для ускоренного размножения элитных селекционных образцов.
При разработке метода введения ремонтантной малины в культуру in vitro основные сложности также были связаны с биологическими особенностями этих форм. Вегетативные почки на отрастающих побегах рано дифференцируются по генеративному типу, а экспланты из цветочных почек на средах, содержащих 6-БАП, полностью погибают. При этом период возможного введения вегетативных почек в культуру in vitro составляет всего 2-3 недели в самом начале вегетации, что существенно ограничивает сроки проведения этого этапа работы.
Кроме того, из-за малого количества корневых отпрысков было ограничено количество исходного материала - всего по 6 -15 эксплантов на образец, что объективно не позволяло проводить опыты по оптимизации питательных сред на этапе введения материала в культуру in vitro. Поскольку метод предполагалось использовать для размножения большого количества ремонтантных образцов, необходимо было разрабатывать достаточно универсальные методики для эффективного введения материала в культуру in vitro, размножения, укоренения и высадки размноженных растений в субстрат.
Важнейшим свойством при размножении новых видов растений является способность эксплантов к развитию в условиях in vitro. Традиционно используемый 6-БАП в наших опытах недостаточно стимулировал развитие вегетативных эксплантов ремонтантных форм - более половины их погибало или плохо развивалось в культуре (рис. 1). Так, в 1996 -1997 годах на средах с
6-БАП из 47 генотипов лишь 14 показали хорошую, а 6 - среднюю адаптацию к условиям in vitro.
6-БАП, 6-БАП, 4-PU, 1994г. 1997г. 1997г.
О Трудно адаптировавшиеся генотипы, % В Легко адаптировавшиеся генотипы, % В Погибшие генотипы, %
Рис.1. Влияние 6-БАП H4-PU на развитие in vitro эксплантов ремонтантной малины.
Для образцов малины, погибавших in vitro, необходимо было найти регуляторы роста, более эффективные на этапе их введения в культуру. Нами был применен цитокинин ряда дифенилмочевины К-(4-пиридил)-К-фенилмо-чевина (4-PU), который ранее использовался на плодовых культурах для регенерации растений из листовых дисков. На средах, содержащих 4-PU, была достигнута высокая приживаемость вегетативных эксплантов генотипов, ранее полностью погибавших на 6-БАП (табл. 1). В 1997 году на среде с 4-PU не погиб ни один из 30 образцов, которые необходимо было размножить (рис.1).
Таблица 1
Влияние различных цитокининов на развитие в культуре in vitro эксплантов из вегетативных почек ремонтантной малины
Концентрация цитокинина (мг/л) Количество эксплантов
6-БАП 4-PU
исходных выживших (%) исходных выживших (%)
22-15-1
0.2 16 0 17 65
0.5 16 0 12 83
1.0 15 0 17 86
6-х-ж
0.2 15 0 16 69
0.5 17 0 16 94
1.0 16 0 17 100
Таким образом, использование нового препарата цитокининового действия 4-PU позволило провести оптимизацию введения в культуру in vitro эксплантов из вегетативных почек ремонтантных образцов малины.
В связи с тем, что вегетативные почки ремонтантной малины доступны всего лишь 2-3 недели в мае, до наступления их дифференциации по генеративному типу, актуальной является проблема культивирования эксплантов из цветочных почек. Нами впервые показано, что 4-PU индуцирует стеблевой морфогенез из цветочных зачатков. Другой регулятор ряда дифенилмочевины, тидиазурон, также показал высокую эффективность при культивировании генеративных почек in vitro. Сравнение способности цитокининов 6-БАП, TDZ и 4-PU индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных зачатков показано на рис. 2 на примере ремонтантного образца 44302-1.
Рис. 2. Влияние 6-БАП, TDZ и 4-PU на стеблевой морфогенез цветочных зачатков ремонтантного образца малины 44-302-1
Разработка метода регенерации из цветочных почек позволила использовать для работы побеги, срезанные осенью после селекционной оценки образцов. В 2001 - 2002 гг. на средах с TDZ из 28 образцов успешно были введены в культуру 27, при этом у 17 форм получена регенерация побегов свыше 80%.
Таким образом, нами показана способность TDZ и 4-PU не только стимулировать побегообразование из вегетативных почек, но и индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек. Использование этих регуляторов роста позволяет культивировать in vitro практически 100% образцов
ремонтантной малины, независимо от регенерационного потенциала изучаемого генотипа и типа дифференциации почек. Выделение эксплантов можно проводить в течение всего года, используя как вегетативные, так и цветочные почки молодых побегов возобновления и старых побегов после снятия с них плодов. В настоящее время разработанный метод успешно применен для введения в культуру in vitro 145 генотипов ремонтантной малины.
Регуляция образования адвентивных побегов у ремонтантной малины. В опытах на ремонтантной малине было показано, что для большинства образцов удовлетворительное побегообразование наблюдается на средах с 6-БАП в концентрации 2 мг/л. При этом коэффициент размножения на разных образцах варьирует в пределах 3-8 (табл. 2). Добавление в среды ПС, ИУК или ИМК неэффективно, что показано на сортах Геракл, Бабье лето-2 и образце 47-Х-4.
Таблица 2
Влияние различных цитокининов на коэффициент размножения ремонтантных форм малины
Вариант Коэффициент размножения
М ± т % М±т %
8-242-1 образец 47-Х-4
6-БАП, 1 мг/л 2.45 ± 0.41 43.1 1.33 ±0.37 36.6
6-БАП, 2 мг/л 5.68 ±1.09 100.0 3.63 ±0.84 100.0
6-БАП, 4 мг/л 4.43 ± 0.57 78.0 1.33 ±0.40 36.6
TDZ, 0.1 мг/л 8.00 ± 0.68 140.8 8.25 ±2.55 227.2
TDZ, 0.2 мг/л 13.50 ±1.20 237.7 11.8О±1.31 325.1
4-PU, 0.2 мг/л 8.09 ± 0.79 142.4 3.29 ±0.68 90.6
Бабье лето-2 Геракл
6-БАП, 2 мг/л 4.11 ±0.90 100.0 8.36 ±1.58 100.0
TDZ, 0,025 мг/л 3.20 ± 0.40 77.9
TDZ, 0.05 мг/л 11.33 ±1.17 275.7
TDZ, 0.1 мг/л 16.40 ±1.18 399.0
4-PU, 0.1 мг/л 4.78 ± 0.62 116.3
4-PUA2 мг/л 7.86 ±1.56 191.2 14.20 ±1.44 169.5
4-PU,0.4 мг/л 14.00 ±2.32 340.0
Однако для ряда образцов 6-БАП (2 мг/л) недостаточно эффективен, у них наблюдается коэффициент размножения 1.5-1.7 и ниже. Дня этих образцов были разработаны среды с 4-PU и TDZ, которые существенно увеличивали образование адвентивных побегов. Как видно из табл. 2, TDZ в концентрации 0.1 - 0.2 мг/л и 4-PU в концентрации 0.2 - 0.4 мг/л увеличивают коэффициент
размножения в 2.5 - 4 раза по сравнению с 6-БАП. Высокий коэффициент побегообразования позволяет быстро размножить селекционный материал, но часто при этом образуются тонкие, нитевидные побеги, с которыми сложно работать в дальнейшем, так как они плохо растут и развиваются. Поэтому предпочтительнее иметь коэффициент размножения 3-6 при образовании крупных, хорошо развитых побегов, быстро укореняющихся на средах с ауксинами. Кроме того, при длительном культивировании на средах с TDZ часто образуются витрифицированные побеги, которые имеют нарушения в развитии и часто погибают даже после их переноса на другие среды. Поэтому при использовании TDZ лучше снизить его концентрацию, чтобы уменьшить образование витрифицированных растений.
У некоторых форм ремонтантной малины с плохим размножением на 6-БАП перенесение на среды с 4-PU и TDZ не увеличивало побегообразование. Например, для образца 5-185-2 количество адвентивных побегов на среде с 6-БАП было равно 1, а на 4-PU и TDZ стало 1.16 ± 0.14 и 1.21 ± 0.18 соответственно. Таких генотипов очень мало, но они есть, и их размножение in vitro малоэффективно.
В целом можно сделать вывод, что для размножения in vitro большинства образцов ремонтантной малины подходит 6-БАП в концентрации 2 мг/л. Для генотипов с низким регенерационным потенциалом необходимо использовать 4-PU и TDZ. При массовом размножении отдельных селекционных образцов для них необходимо подбирать тип и концентрацию цитокинина для сочетания высокого коэффициента размножения и жизнеспособности растений.
Индукция ризогенеза у пробирочных растений ремонтантной малины. Регенерация корней у пробирочных растений - следующий этап метода кло-нального микроразмножения. Традиционно для индукции ризогенеза используются ауксины ИУК, ИМК и реже НУК. Как показано в опытах по укоренению ремонтантных форм малины, при использовании для корнеобразования ИУК оптимальной является концентрация 0.5 мг/л, при этом у образца 11-220-2 (рис.3) и ряда других форм корни индуцировались примерно у 80% растений. Однако некоторые образцы на средах с ИУК дают укоренение лишь в 30-40% случаев, и для них более эффективна ИМК, вызывающая укоренение 100% растений сорта Геракл (при концентрации ИМК 1.0-1.5 мг/л). Но при уровне ИМК 0.5 мг/л корни появлялись раньше, и количество корешков было существенно больше, поэтому для ризогенеза выбрана концентрация ИМК 0.5 мг/л.
Для растений некоторых плохо укореняемых генотипов был предложен метод укоренения без инкубации на средах с ауксинами. После обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов (1 мг/мл) растения
переносятся на безгормональную среду MS/2, что приводит к высокому уровню индукции ризогенеза - до 100%.
О
. 90 g 80
Рис.3. Влияние ИУК на корнеобразование образца
11-220-2.
0.2 0.5 0.75 1.0 1.5 Концентрация ИУК, мг/л
Ежегодно в лаборатории размножается несколько тысяч растений 10-15 генотипов ремонтантной малины. Для облегчения этой трудоемкой работы нами была разработана методика, по которой после обмакивания растения в раствор ИМК (1 г/л) его высаживали в стерильный песок. На растениях 7 генотипов показана очень высокая эффективность укоренения - от 71 % до 95%.
Таким образом, для регенерации корней у ремонтантной малины можно использовать как ИУК (0.5 - 0.75 мг/л), так и ИМК (0.5 мг/л). Разработаны разные способы укоренения побегов. Выбор метода укоренения зависит от особенностей генотипа. Для некоторых образцов необходимо применять технику обмакивания основания стебля в концентрированный раствор ауксинов при дальнейшем культивировании их на безгормональной среде MS/2. После обмакивания возможно также выращивание растений в стерильном песке.
Высадка растений в субстрат и их адаптация к нему при пониженной влажности воздуха являются сложным этапом. В этих условиях наблюдалась полная гибель некоторых образцов. Согласно разработанному нами методу, при постепенном привыкании растений к пониженной влажности воздуха и рН субстрата около 6 приживаемость растений существенно повышается, нередко до 100%.
Для селекционных образцов необходимо сохранение их в культуре in vitro до получения результатов селекционной оценки, в связи с чем нами были разработаны условия поддержания коллекции при длительном беспересадочном культивировании: лучше всего растения сохранялись на холоду при +4°С. При комнатной температуре растения оставались зелеными и жизнеспособными в течение 9 месяцев на среде с 3% маннита и 3% сахарозы.
Таким образом, нами разработан метод клонального микроразмножения ремонтантной малины, оптимизированы все его этапы. С 1993 по 2004 гг. было размножено более 130 генотипов и передано селекционерам более 15 тысяч растений. На этой основе ими было создано 8 новых сортов ремонтантной малины. Сроки селекции ремонтантных сортов от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания при этом удалось сократить на 4 - 5 лет.
При сравнении растений ремонтантной малины сортов Бабье лето-2 и Геракл, размноженных биотехнологическим и традиционным способами (табл. 3), показано, что у растений, размноженных in vitro, резко увеличилось образование корневой поросли, имеется тенденция к увеличению количества побегов замещения, возросла продуктивность.
Таблица 3
Побегообразовательная способность растений ремонтантной малины, полученных in vitro и традиционным способом
Сорт Растения, размноженные традиционным способом Растения, размноженные in vitro
Побеги замещен., шт. Корневая поросль Потенц. продукт., г Побеги замещен шт. Корневая поросль Потенц. продукт, г
2001 год
Бабье лето-2 4.0±0.4 100% 1.0±0.2 100% - 4.5±0.4 113% 3.2±1.3 320% -
Геракл 3.7±0.2 100% 0.6±0.3 100% - 4.2±0.5 114% 1.9+0.7 320% -
2002 год
Бабье лето-2 4.1 ±0.5 100% 0.7±0.3 100% 1568 г 100% 4.6±0.3 112% 1.5±0.3 214% 2142 г 137%
Геракл 4.4±0.3 100% 0.7±0.2 100% 1260 г 100% 6.4±0.8 145% 2.9±0.3 414% 2066 г 164%
Эти результаты можно объяснить тем, что при длительном культивировании образцов происходит отбор более интенсивно размножающихся клонов, обладающих большей энергией роста и развития, а также последействием экзогенных цитокининов, накопленных в тканях, что и проявляется в полевых условиях повышением вегетативного роста и продуктивности.
Разработка метода регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков. Частным способом ускоренного размножения растений может быть их регенерация in vitro из листовых дисков. Метод регенерации растений необходим для создания трансгенных форм в работах по генетической инженерии, что широко используется в современной селекции.
При разработке метода регенерации ремонтантной малины нами изучены следующие факторы, влияющие на индукцию стеблевого морфогенеза: 1. гормональный состав среды; 2. генотипические особенности изучаемых форм; 3. тип экспланта - листовые диски, черешки листа; 4. возраст экспланта; 5. влияние освещенности и температуры.
Исследования показали, что традиционно используемое сочетание 6-БАП и ИУК при регенерации ремонтантной малины малоэффективно. Например, частота регенерации растений на листовых дисках сорта Бабье лето-2 не превышает 6.7%. Применение 4-PU и TDZ позволило резко увеличить стеблевой морфогенез (рис. 4), который на сортах Бабье лето-2 и Геракл в отдельных опытах достигает 95%.
Рис. 4. Динамика регенерации на листовых дисках у сорта Бабье лето-2 в зависимости от концентрации ТБ2.
Регенерация растений на средах с ТБ2 существенно зависит от генотипа (табл. 4). Для большинства образцов оптимальной является концентрация ТБ2 0.1 мг/л, для Геракла это - 0.2 мг/л. При этом более трети изученных форм показали регенерацию на уровне 50% и более. Регенеранты были получены у всех изученных образцов. Молодые листья имеют более высокий потенциал регенерации, на старых листьях морфогенез практически отсутствует. При использовании черешков верхних листьев регенеранты наблюдались у 62% эксплантов, у черешков нижних листьев регенерация отсутствовала.
Таблица 4
Влияние концентрации TDZ на частоту регенерации некоторых генотипов ремонтантной малины
№ Частота регенерации, %
п.п. Генотип TDZ, TDZ, TDZ, TDZ,
0,05 мг/л 0,1 мг/л 0,2 мг/л 0,5 мг/л
1 Бабье лето-2 8,3±3,4 81,0±1,0 46,7 21
2 Геракл 13,0±3,3 47,0±4,3 63,0±5,2 -
3 21-232-2 - 68,5 ± 8,8 46,7 ±8,3 -
4 14-205-27 25,0±3,2 47,0±7,5 32,0±4,2 -
5 19-99-1 13,3 ±4,1 16,7 ±4,1 0 0
6 17-60-1 13,3 ± 0,2 6,7 ±4,1 0 0
7 8-79-2 - 72,5±5,1 - -
8 9-35-10 - 25,9 ± 9,2 - -
9 5-253-1 - 9,3±1,4 - -
10 1-98-10 - 6,7 ±4,1 - -
11 18-65-10 - 3,3±4,1 - -
12 2-85-1 3,3 6,7 0 -
13 24 16,7 3,3 0 0
14 2-205-1а 0 4,5 8,3 -
15 4-43-2 0 3,3 0 0
Для регенерации необходимо строгое соблюдение температурного режима- оптимум наблюдается при 20°С, при повышении температуры до 25°С и выше побегообразование снижается.
Анализ срезов морфогенных структур, образовавшихся на листовых дисках (рис.5), свидетельствует о наличии двух путей регенерации. Возможно образование каллусной ткани, из которой развиваются отчетливо видимые обособившиеся эмбриоидоподобные структуры. В других случаях регенеранты могут развиваться. непосредственно из субэпидермальных тканей без образования видимого слоя каллусных клеток, что более желательно для получения генетически однородного материала, тождественного исходным генотипам. Регенерацию увеличивает темновая прединкубация листовых дисков: после 10-дневной инкубации каллусообразование снизилось с 50% до 31.3%, в то время как органогенез возрос более чем в 3 раза.
Таким образом, нами разработана эффективная система регенерации растений из листовых дисков и черешков ремонтантной малины.
Рис. 5. Прямая регенерация из листовых дисков сорта Бабье лето-2 (слева)
и регенерация через каллусогенез (справа). 1 - зачаток стеблевой почки на листовом экспланте, 2 - эпидермис листового диска, 3 - субэпидермальные слои клеток, 4 - сосудистые пучки регенерантов, 5 - масса каллусных клеток, 6 - обособившиеся эмбриоподобные структуры
Доказательство генетической стабильности полученных регенерантов проведено с помощью метода ISSR-PCR, впервые разработанного нами для малины. Для анализа ДНК подобрано 8 праймеров, дающих наибольший полиморфизм (табл. 5). Сравнение продуктов ISSR-PCR исходных образцов и регенерантов показало отсутствие генетических изменений у регенерантов
Разработка метода генетической трансформации растений малины является следующим необходимым этапом при создании трансгенных растений.
Из 4 испытанных нами способов трансформации методом кокультивирования листовых дисков с агробактерией A. tumefaciens наиболее эффективными оказались культивирование эксплантов на питательной среде под каплей ночной бактериальной культуры и на газоне ночной бактериальной культуры. Полученная при этом частота регенерации (табл. 6) является вполне достаточной для успешной работы по трансгенозу.
Регенерационная способность эксплантов снижается при культивировании с агробактерией, однако при этом также проявляются особенности генотипа (табл. 7): в то время как некоторые формы, например, сорт Геракл, сохраняют высокую способность к регенерации, у других генотипов в этих условиях она существенно падает.
Для селекции на канамицине в целях получения максимального выхода трансформантов нами разработана двухэтапная схема: на этапе регенерации
Таблица 5.
Полиморфизм межмикросателитных последовательностей видов и сортов малины.
Таблица 6
Влияние способа трансформации листовых дисков сорта Бабье лето-2 штаммом A. turn. E35S-L-lic b на частоту регенерации
Способ инокуляции листовых дисков агробактерией. Кол-во зеленых эксплантов через 14 суток, % Частота регенерации через 30 сут., %
Инкубация в жидкой ночной бактериальной культуре, 4 часа 31.8 ±4.2 0
Культивирование под каплей ночной бактериальной культуры 96.0 ±1.5 66.5 ±3.1
Культивирование на газоне ночной бактериальной культуры 97.9 ±1.2 75.1 ±2.3
Вакуумная инфильтрация эксплантов жидкой культурой 93.8 ±1.9 0
предлагается использовать минимальную концентрацию канамицина 3 мг/л, практически полностью подавляющую регенерацию из нетрансформированных клеток, но обеспечивающую длительную жизнеспособность эксплантов. Для селекции образовавшихся побегов эффективна концентрация 15 мг/л.
Таблица 7
Влияние кокультивирования с A.tum. E35S-L-lic b на регенерацию разных генотипов ремонтантной малины
Образец Регенерационная способность листовых эксплантов
Без кокультивации с агробактерией После кокультивации с агробактерией
Бабье лето-2 95.6 ±5.3 54.0 ±5.4
Геракл 95.0 ± 7.0 81.0 ±1.2
14-205-27 87.0 ± 7.5 56.3 ± 6.5
8-79-2 72.6 ± 5.2 57.0 ± 7.2
5-253-1 9.3 ±1.5 3.9 ±1.3
2-200-20 8.0 ±1.2 0
2-205-1а 0 0
В полученных регенерантах с помощью ГЩР доказано присутствие гена пр1 II; чашечный тест показал наличие в растениях - регенерантах активности бактериальной термостабильной лихеназы. То есть, разработанный метод трансформации является эффективным для ремонтантной малины.
Таким образом, предложенные нами методы регенерации и генетической трансформации растений малины позволяют перейти на качественно новый уровень в селекции ремонтантной малины и создавать трансгенные формы с новыми, уникальными свойствами.
Молекулярно-генетический анализ и паспортизация образцов малины проводились на основе метода ISSR-PCR с помощью праймеров, при использовании которых проявляется высокий полиморфизм амплифици-рованных фрагментов (табл. 5). На основании результатов ISSR-PCR построены дендрограммы генетического родства, отражающие взаимосвязь 15 ремонтантных сортов, 12 сортов с обычным типом плодоношения и 5 видов малины: Rubus idaeus L. («Новость Кузьмина»), Rubus crataegifolius Bunge, Rubus odoratus L., Rubus occidentalis L. и Rubus arcticus sfellarcticus G. Larsson ("Sofia" из коллекции ВИРа). Эти дендрограммы могут быть использованы в селекционном процессе.
По дендрограммам, построенным при применении праймеров
выявляется присутствие фрагментов ДНК диких видов в геномах сортов современной селекции, что отражает их участие в создании этих сортов. При использовании праймера (AC)gYA получено четкое разделение исследованных образцов на 2 группы: ремонтантных сортов и гибридов и сортов с обычным типом плодоношения.
Наиболее информативным ампликонам с частотой встречаемости 0,4 - 0,6 были присвоены буквенные обозначения, и на их основе составлены генетические «формулы» сортов малины. Они оказались уникальными для всех изученных сортов малины. Такие «паспорта» полезны для идентификации сортов и контроля сортовой чистоты
Разработка модельных систем для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов на разных этапах онтогенеза растений люпина желтого. Модельные системы на основе изолированных органов растений позволяют подробно охарактеризовать отдельные физиологические процессы и вычленить воздействие на них различных факторов. Среди них особенно важно изучение регуляторного действия фитогормонов, в том числе на молекулярном уровне, вплоть до регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ.
Нами были разработаны модельные системы для исследования гормональной регуляции процессов, происходящих на этапах созревания и прорастания семян люпина желтого. Модельная система на основе культивируемых in vitro изолированных зародышей незрелых семян использована для изучения основных физиологических процессов, происходящих при созревании, и их гормональной регуляции. Система на основе изолированных семядолей проростков позволила исследовать
молекулярные механизмы действия цитокининов и абсцизовой кислоты на этапе прорастания и формирования фотосинтетического аппарата.
Разработка модельной системы на основе незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro. Модельная система для изучения механизма действия фитогормонов, их влияния на рост и развитие зародышей разного возраста, экспрессию отдельных генов и генетических программ была разработана нами на основе незрелых зародышей люпина культивируемых in vitro.
Для разработки этой модельной системы нами были исследованы основные процессы, происходящие в созревающих семенах люпина - рост зародышей и накопление в них запасных белков. При этом изучены динамика роста, биосинтеза запасных белков и содержания фитогормонов - абсцизовой кислоты, ИУК, цитокининов. Показано, что масса зародыша резко возрастает после наступления сердцевидной фазы развития. С помощью методов иммуноэлектрофореза по Грабар-Уильяме и электрофореза в диссоциирующих условиях выявлено, что биосинтез запасных белков в нижних мутовках начинается при размере зародыша 5 - 5.5 мм, причем сначала появляется вицилин, а позже легумин (рис. 6).
Рис. 6. Динамика накопления запасных белков в созревающих зародышах люпина желтого
1 2 3456789
1 - вицилин; 2 - 3.-3.5 мм; 3 - 4.-4.5 мм;
4 - 5-6 мм; 5 - 6-7 мм; 6 - 7-8 мм;
7-9-12 мм; 8 - сухие семена; 9 - легумин
В период активного накопления запасных белков содержание ауксина и абсцизовой кислоты резко возрастает, что может свидетельствовать об их участии в регуляции этого процесса. В то же время содержание цитокининов плавно уменьшается, что может быть связано с уменьшением активности деления клеток зародыша.
При культивировании in vitro на низкоосмотической безгормональной среде развитие изолированных незрелых зародышей зависит от их размера: при
исходном размере 2.0 - 3.5 мм и более 8-9 мм они прорастают в течение 5 дней. При размере 4-7 мм в этих условиях зародыши не прорастают (рис. 7).
Рис. 7. Прорастание in vitro зародышей разного размера
Полученные нами данные позволили выбрать в качестве физиологической модели для изучения гормональной регуляции процессов созревания и прорастания зародыши с исходным размером 4-4.5 мм и массой 11-13 мг. В них еще не начался биосинтез запасных белков, они не способны к прорастанию на безгормональной среде в течение 5 дней, уровень эндогенной АБК в них составляет 1.0 мкг/г сырой массы.
Гормональная регуляция процессов, происходящих при созревании семян люпина желтого При изучении влияния фитогормонов разных классов на рост зародышей в культуре in vitro и накопление в них запасных белков выявлено, что АБК на этом этапе онтогенеза имеет стимулирующую функцию, активируя оба процесса. Действие этого гормона описывается типичной для физиологически активных веществ концентрационной кривой с наличием оптимума и области супероптимальных ингибирующих концентраций (рис. 8).
Рис. 8. Влияние АБК на биосинтез запасных белков в созревающих зародышах
1 - контроль; 2 - АБК, 0.1 мг/л; 3 -0.4 мг/л; 4- 1.0 мг/л; 5-2.5 мг/л; 6-10 0 мг/л.
ИУК, 6-БАП и ГК увеличивают массу зародыша, но не стимулируют биосинтез запасных белков в отсутствие АБК. Более того, композиция гормонов-стимуляторов ингибирует биосинтез запасных белков по сравнению с контролем. Совместное действие АБК с этими гормонами вызывает резкое увеличение накопления запасных белков, особенно в варианте АБК + ИУК, в котором моделируется гормональный фон, на котором происходит биосинтез запасных белков in vivo.
Полученные результаты свидетельствуют о синергическом взаимодействии фитогормонов в регуляции процесса синтеза запасных белков при созревании семян. При этом АБК играет роль индуктора экспрессии генов запасных белков, а остальные гормоны способствуют этому процессу, стимулируя, но не вызывая биосинтез запасных белков. То есть абсцизовая кислота, являющаяся ингибитором роста и развития растений, при созревании семян имеет стимулирующую функцию, индуцируя биосинтез запасных белков и способствуя увеличению биомассы зародышей.
Однако ингибиторная функция АБК также продемонстрирована на модели изолированных зародышей in vitro - гормон препятствует их прорастанию (рис. 9). При культивировании зародышей исходного размера 3 5-4 0 мм показано, что ГК и ИУК вызывают рост зародышевой оси, а АБК ингибирует прорастание, и ее действие тем выше, чем выше концентрация гормона.
Таким образом, на модели изолированных зародышей люпина в культуре in vitro показана особая роль АБК при созревании: именно этот гормон индуцирует экспрессию генов запасных белков и блокирует преждевременное прорастание незрелых зародышей, то есть АБК является триггером программ прорастания и созревания семян. Гормоны стимулирующего действия являются антагонистами АБК при прорастании и синергистами - в процессах накопления запасных белков и увеличения биомассы зародыша.
Контроль
ГК, 1.0мг/л ИУК, 1.0 мг/л
АБК, 0.1 мг/л
1.0 мг/л 2.5 мг/л 10 мг/л
Рис. 9. Влияние фитогормонов на рост и прорастание зародышей размером 3.5 - 4 0 мм
Модельная система на основе изолированных семядолей проростков люпина желтого. Для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов прорастания семян была разработана модельная система на основе изолированных семядолей проростков люпина. Для характеристики основных процессов, происходящих в семядолях при прорастании - роста семядолей и формирования фотосинтетического аппарата, изучена их регуляция цитокинином 6-БАП и абсцизовой кислотой.
Показано, что изолированные семядоли очень чувствительны к цитоки-нинам, которые стимулируют их позеленение и рост. Компетентность семядолей к восприятию гормонов и оптимальная действующая концентрация 6-БАП зависят от возраста проростков. Установлено, что максимальная отзывчивость семядолей на 6-БАП по накоплению хлорофилла наблюдается у проростков 5-дневного возраста. На этих семядолях была снята концентрационная кривая действия 6-БАП и для проведения опытов выбрана концентрация 5х10-5 М.
АБК подавляет рост семядолей и накопления в них хлорофилла (рис. 10). Наибольшую чувствительность к АБК проявляют проростки в начале прорастания.
а с; с х
•в-
I-
5 э
т
| I
а
I
О
100,00 90,00
80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
Ж.
Контроль -»-6-БАП АБК
8 24 30 4в
Время освещения, час
Рис. 10. Влияние 6-БАП и АБК на позеленение семядолей люпина 5-дневного возраста.
На этапе прорастания водный дефицит вызывает резкое накопление АБК в тканях, особенно в семядолях 5-дневных проростков (табл. 8). Физиологическое значение быстрого накопления абсцизовой кислоты при водном стрессе заключается в том, что высокая концентрация АБК замедляет метаболитические процессы в семядолях, предохраняя проростки от повреждений. Особенно высока чувствительность тканей к АБК в первые дни прорастания, позже она снижается. Поэтому для замедления метаболитических процессов при воздействии стрессорного фактора (водного дефицита) в первые сутки прорастания требуется сравнительно низкий уровень гормона. Для
ингибирования метаболитических процессов в проростках большего возраста требуется гораздо более высокое содержание АБК.
Таблица 8
Влияние водного дефицита на накопление АБК в семядолях люпина разного возраста
Возраст Содержание АБК (нг/г сырой массы)
семядолей Контроль Водный дефицит
(сутки) З часа 24 часа
1 17.2 ±4.9 12.8 ±5.5 54.0 ± 5.9
3 34.6 ± 9.5 107.4 ±15.8 511.4± 125.5
5 21.6 ±8.4 92.4 ± 58.9 862.4 ±212.0
Таким образом, на физиологической модели этиолированных изолированных семядолей люпина разного возраста, культивированных in vitro, показано действие фитогормонов - антагонистов 6-БАП и АБК на процессы накопления биомассы и позеленения семядолей, изучены концентрационные кривые их действия, выяснен возраст семядолей, в котором их компетентность к восприятию гормонов является максимальной. Показано также быстрое накопление АБК при водном дефиците, которое зависит от возраста семядолей.
Возможность применения разработанных модельных систем для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов, протекающих при созревании и прорастании семян, показана в следующих опытах.
Инкубация семядолей 5-дневного возраста в темноте на растворах 6-БАП и АБК с последующим выделением из семядолей ядер и хроматина позволила показать влияние фитогормонов на транскрипционные процессы - оба фитогор-мона воздействуют на РНК-полимеразную активность хроматина (табл. 9).
Из семядолей люпина были выделены и с помощью методов осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации, аффинной и ионообменной хроматографии частично очищены индивидуальные РНК-полимеразы I и И, были определены солевые условия, при которых проявляется максимальная активность ферментов, а также проведен ингибиторный анализ с помощью альфа-аманитина, показавший достаточно хорошее разделение двух ферментов.
При этом на люпине впервые было показано, что оба фермента ассоциированы с автокиназной активностью, которая стимулируется цитокинином 6-БАП в широком диапазоне ее концентраций.
При инкубации семядолей на растворах фитогормонов 6-БАП и АБК наблюдается не только воздействие гормонов на транскрипционную активность РНК-полимераз in vitro, но и изменение степени фосфорилирования ферментов.
Таблица 9
Влияние фитогормонов на активность РНК-полимеразы хроматина in vitro при добавлении гормона в среду гомогенизации
Вариант Концентрация ФГ (М) Включение 14С-АМФвРНК
Имп./10мкгДНК %
Контроль 0 631 ±21 100
6-БАП 1.34 x10-7 732 ± 30 116
6-БАП 4.47x10-7 1033 ±63 164
6-БАП 1.34 х10-6 1016 ±61 162
АБК 1.14 х 10-7 834 ±12 132
АБК 7.60x10-7 647 ±29 102
Наблюдается прямая зависимость между этими параметрами (табл. 10): 6-БАП увеличивает как степень фосфорилирования, так и активность РНК-полимераз, а АБК снижает их.
Таблица 10
Влияние фитогормонов на активность транскрипции in vitro и степень фосфорилирования РНК-полимераз, выделенных из семядолей люпина
Вариант Удельная активность Степень фосфорилир.
Имп/мин на 1 мг белка % Имп/мин на 1 мг белка %
Контроль 7490 ±1160 100 94400± 150 100
6-БАП,9х10-5М 11720 ±1280 140 142000 ±420 153
АБК,9х10-5М 6800 ±950 91 78000 ±310 83
Таким образом, модельная система на основе изолированных семядолей люпина может применяться для изучения участия 6-БАП и АБК в регуляции начальных этапов прорастания - роста семядолей и формирования фотосинтетического аппарата, а также для исследования влияния стрессорных факторов внешней среды. При этом действие гормонов может исследоваться на уровне регуляции активности отдельных ферментов, а также транскрипции in vitro.
В целом можно сделать вывод, что разработанные модельные системы на основе изолированных зародышей созревающих и семядолей прорастающих семян люпина позволяют исследовать гормональную регуляция процессов созревания и прорастания, при этом изучение действия фитогормонов может проводиться на уровне регуляции экспрессии генетических программ.
Разработка методов применения регуляторов роста для повышения продуктивности растений огурца в защищенном грунте. .
Применение регуляторов роста и развития растений является одним из наиболее перспективных направлений для высокорентабельных производств с высокой урожайностью возделываемых культур. При выращивании огурца в защищенном грунте в современных тепличных комплексах используются интенсивные высокоэффективные технологии (Нурметов Р.Д., 2001). Для дальнейшего повышения урожайности этой культуры требуется внедрение новых наукоемких подходов (Жученко А.А., 2002), в связи с чем перспективна разработка применения регуляторов роста и развития растений. Согласно литературным данным, применение фитогормонов стимулирующего действия для предпосевной обработки семян огурца не дает стабильной прибавки урожая. Поэтому для активизации роста и развития растений в целом полезными могут оказаться препараты негормональной природы общестимулирующего характера с широким спектром действия. К таким веществам относятся созданные в 90-х годах экологически чистые препараты эмистим, экост-ГФ, Кавказ и Краснодар-1 и ивин. Это синтетические регуляторы роста различной химической природы. Эмистим получен из экстракта эндофитных микоризообразующих грибков, развивающихся в межклетниках корней женьшеня, Кавказ и Краснодар являются производными фурфурола. Однако для этих регуляторов роста недостаточно изучены физиологические механизмы действия на развитие растений разных культур и формирование их продуктивности. Для сравнения в опыты был включен синтетический препарат ивин (производное N-окиси лутидина), применяющийся на огурце в защищенном грунте.
При разработке метода применения фиторегуляторов на огурце нами изучено их влияние на разные этапы онтогенеза: прорастание семян, формирование и рост проростка, цветение и плодоношение, накопление нитратов в плодах, а также на устойчивость к стрессам.
Исследования проводили в лабораторных условиях и в защищенном
грунте.
Влияние РРР на прорастание семян огурца в лабораторных условиях. В лабораторных опытах на гибридах НИИОХ-412 и Королек изучено влияние регуляторов на динамику прорастания семян, развития корневой системы, рост гипокотиля, был определен диапазон действующих концентраций. Показано, что все изученные препараты стимулируют прорастание семян огурца НИИОХ-412 (табл. 11), для них получены концентрационные кривые действия на этот процесс. При этом установлено, что оптимумы концентраций препаратов,
ускоряющие появление корешка, замедляют появление семядолей; в то же время супероптимальные концентрации регуляторов, производя меньший эффект на развитие корешка, ускоряют появление семядолей и рост гипокотилей.
Таблица 11
Влияние регуляторов роста растений на прорастание семян огурца НИИОХ-412 (через 55 часов) и появление семядолей (через 96 часов)
№ Вариант Проросшие Появление
семена (55 час.) семядолей (96 час.)
наклюнув, Кол-во, Кол-во, % %к
семян, % % контр.
1 Контроль 40.0± 2.0 100 42.016.0 100
2 Эмистим, 5 мкл/л 79.0±3.0 198 43.016.7 102
3 Ивин, 1 мг/л 80.0±3.8 200 34.013.0 81
4 Ивин, 3 мг/л 87.0±2.2 218 41.012.9 98
5 Ивин, 6 мг/л 55.0+2.9 138 43.014.9 102
6 Эмистим + ивин 1 мг/л 89.0±2.2 223 35.013.5 83
7 Эмистим + ивин 3 мг/л 83.0±2.2 208 32.014.2 76
8 Эмистим + ивин 6 мг/л 45.014.5 113 49.015.8 117
9 Краснодар-1,25 мг/л 76.015.0 190 37.016.0 88
10 Краснодар-1, 75 мг/л 83.012.2 208 41.014.8 98
11 Краснодар-1,125 мг/л 84.015.1 210 27.013.9 64
12 Краснодар-1,500 мг/л 59.013.5 148 66.014.0 157
13 Кавказ, 10 мкл/л 84.013.8 210 58.019.5 114
14 Кавказ, 25 мкл/л 91.012.2 228 43.015.1 102
15 Кавказ, 50 мкл/л 70.013.0 175 42.012.0 100
16 Кавказ, 75 мкл/л 69.013.5 173 54.016.7 129
17 Кавказ, 100 мкл/л 70.013.0 175 63.0+2.2 150
Все испытанные регуляторы роста стимулируют рост корней, вызывая более раннее образование корневых волосков и формирование боковых корней. Особенно выделялись краснодар и кавказ, стимулировавшие рост боковых корней более чем в 2 раза по сравнению с контролем.
Все регуляторы роста, кроме эмистима, изменяли морфофизиологические характеристики проростков, стимулируя более активное развитие корневой системы по сравнению с гипокотилем. Опыты, проведенные на гибриде Королек, показали аналогичные результаты. Результаты проведенных лабораторных исследований позволили выбрать наиболее эффективные
концентрации препаратов, стимулирующие прорастание семян и развитие проростков огурца: для ивина - 3 мг/л, Кавказа - 25 мкл/л, для Краснодара-1 -125 мг/л.
Влияние РРР на рост, развитие и продуктивность огурца в защищенном грунте. Для разработки метода применения РРР на огурце в защищенном грунте в опытах на гибриде НИИОХ-412 было изучено действие регуляторов роста на динамику появления всходов и развития проростков огурца, формирование листового аппарата - раскрытие и размер семядольных и появление настоящих листьев, рост растений, цветение, образование завязей, а также продуктивность растений и содержание нитратов в плодах.
Показано, что изученные препараты влияют на появление всходов и развитие проростков по-разному: эмистим, ивин и их композиции существенно ускоряют появление всходов и раскрытие семядольных листьев, а также рост семядольных и настоящих листьев по сравнению с контролем. В то же время препараты Краснодар-1 и кавказ явно замедляют появление всходов и раскрытие семядолей по сравнению с контролем.
Можно предположить, что в защищенном грунте эмистим и ивин активизируют развитие проростка в целом, как корневой части, так и гипокотиля, что наблюдается и в лабораторных опытах. В то же время Краснодар-1 и кавказ вызывают формирование более мощной корневой системы, вызывая более активный рост и развитие боковых корней. При этом рост гипокотиля и появление семядолей на поверхности замедляется, что согласуется с результатами, полученными в лабораторных опытах.
Все использованные в опытах регуляторы роста и развития стимулируют цветение огурца (табл.12). Дифференциальный учет бутонов, цветков и завязей показал, что регуляторы способны ускорять начало плодоношения и увеличивать общее количество плодоэлементов.
Согласно многолетним данным (табл.13), использованные в работе препараты увеличивали как выход ранней продукции, так и общую урожайность: ивин повысил раннюю продуктивность в среднем за 3 года на 10 %, а общую отдачу зеленцов на 9%, но действие его нестабильно по годам. Краснодар-1 и кавказ увеличили урожай ранней продукции в среднем на 1516%, общий эффект от обработки семян краснодаром-1 был 13%, а Кавказом -16%, действие по годам было стабильным. Эмистим в среднем за 3 года увеличил раннюю и общую продуктивность на 7% и 9% соответственно.
Содержание нитратов в зеленцах находится в допустимых пределах.
Поскольку работа проводилась в производственных условиях, в ряде случаев растения подвергались воздействию стрессорных факторов.
Влияние регуляторов роста на цветение растений огурца НИИОХ-412 (опыт 1996-1997 гг.)
Таблица 12
№ Вариант Количество на растении
бутонов цветков Молодых завязей Всего
штук % штук % штук % Штук %
1 Контроль 7.8+1.8 100 19.8+3.3 100 24.3+6.4 100 51.9 +7.5 100
2 Эмистим, 5 мкл/л 13.8+3.1 177 23.5+2.4 119 25.0+1.1 103 72.3 + 5.5 139
3 Ивин, 1 мг/л 11.8+0.9 151 15.0+1.3 76 23.8+2.6 98 50.6 + 4.8 98
4 Ивин, 3 мг/л 14.0+3.4 190 17.0+1.6 86 15.8+4.1 65 46.8 +9.1 90
5 Ивин, 6 мг/л 11.8+1.9 151 18.5+2.2 93 31.5+4.1 130 61.8 +8.2 119
6 Эмистим + ивин, 1 мг/л 13.0+1.5 167 20.8+2.0 105 26.3+2.9 108 60.1 +5.9 116
7 Эмистим + ивин, 3 мг/л 14.3+2.0 183 20.5+1.0 104 20.8+2.2 86 55.6 +5.2 107
8 Краснодар-1, 125 мг/л 14.5+1.8 186 21.8+1.0 110 20.5+2.5 84 56.8 + 5.3 109
9 Краснодар-1,250 мг/л 15.0+1.5 192 24.3+1.9 123 29.5+2.0 121 68.8 + 5.4 133
10 Кавказ, 25 мкл./л 14.8+1.5 190 19.3+0.7 97 21.0+3.0 86 55.1 +5.2 105
Таблица 13
Влияние регуляторов роста на выход продукции огурца НИИОХ-412 в защищенном грунте
Выход продукции (кг/кв.м)
Вариант 1996-1997 гг. 1998-1999 гг. 1998-1999 гг. Среднее
блок№1 блок №3 за 3 года
ранняя всего ранняя всего ранняя всего ранняя всего
Контроль 10.9 22.4 13.5 21.3 12.0 21.8 12.1 21.8
100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%
Эмистим, 12.3 24.6 13.6 22.3 13,2 24.4 13.0 23.8
5 мкл/л 113% 110% 101% 105% 110% 112% 107% 109%
Ивин, 1 мг/л 12.6 25.2 14.3 22.9 13,0 23.4 13.3 23.8
116% 113% 106% 108% 108% 107% 110% 109%
Ивин, 3 мг/л 13.0 25.8 12.3 20.3 11,5 22.1 12.3 22.7
119% 115% 92% 95% 96% 101% 102% 104%
Эмистим + 13.4 26.2 13.5 21.6 12,4 22.9 13.1 23.6
ивин,1 мг/л 123% 117% 101% 102% 103% 105% 108% 108%
Краснодар-1, 13.1 20.8 11,8 22.3 12.5 21.6
75 г/л 97% 98% 98% 102% 98% 100%
Краснодар-1, 13.1 26.0 14.8 23.2 13,7 24.7 13.9 24.6
125 мг/л 120% 116% 110% 109% 114% 113% 115% 113%
Кавказ, 13.3 26.1 15.3 23.9 13,4 25.7 14.0 25.2
25 мкл/л 122% 117% 114% 112% 112% 118% 116% 116%
Кавказ, 14.6 23.4 13,1 23.6 13.9 23.5
50 мкл/л 108% 110% 109% 108% 109% 109%
Сделанные при этом наблюдения позволили предположить наличие у изучаемых препаратов защитных свойств, противодействующих стрессу и стабилизирующих продуктивность растений огурца.
Так, при воздействии на рассаду низкой положительной температуры из-за сбоев в отоплении теплицы ее развитие и начало плодоношения резко замедлились. Однако к середине вегетации растения, полученные из семян, обработанных эмистимом, сравнялись по отдаче урожая с контролем, а в целом их продуктивность была даже выше.
В другом случае, вследствие -задержки посева семян, обработанных регуляторами роста, в течение суток проростки испытывали кислородное голодание. Опытные растения по развитию сначала существенно отставали от контроля, но к фазе цветения выровнялись с ним
урожая они были выше контроля на 16-17%, что может свидетельствовать об антистрессовом действии препаратов.
Важно также отметить, что при применении регуляторов роста наблюдалась тенденция к снижению поражения растений болезнями.
Нами также испытывалась схема двукратного применения препаратов -обработка семян и опрыскивание вегетирующих растений перед началом цветения. Обработка растений во время вегетации была малоэффективной и почти не дала прибавки урожая.
Полученные результаты позволяют предложить для предпосевной обработки семян огурца препараты кавказ (25 мкл/л), краснодар-1 (125 мг/л) и эмистим (5 мкл/л). Производственные опыты, проведенные на гибридах огурца НИИОХ-412, Аэлита, Королек и Московский юбилейный, показали эффективность предпосевной обработки семян препаратами эмистим и кавказ, в них наблюдалась прибавка урожая до 22.2%.
Таким образом, нами разработан метод применения регуляторов роста при возделывании огурца в защищенном грунте и показано, что эмистим, кавказ и краснодар-1 обладают стимулирующим действием на рост, развитие и плодоношение растений этой культуры, обеспечивая существенную прибавку урожая и увеличение рентабельности производства более чем на 10%.
Выводы.
1. Разработана технология клонального микроразмножения и регенерации растений ремонтантной малины in vitro, применение которой обеспечивает ускорение создания высокопродуктивных и устойчивых сортов этой культуры. Технология оптимизирована для ремонтантных гибридов малины сложного межвидового происхождения на этапах введения эксплантов в культуру in vitro, размножения, укоренения и длительного сохранения пробирочных растений. Ее высокая эффективность основана на применении цитокининов ряда дифенилмочевины - тидиазурона и К-(4-пиридил)-К-фенилмочевины; подборе эксплантов различного происхождения; возможности круглогодичного введения эксплантов в культуру in vitro; дифференцированной оптимизации условий размножения элитных сортообразцов малины.
2. Применение разработанной технологии позволяет сократить на 4 - 5 лет сроки создания сортов и гибридных образцов ремонтантной малины. За период с 1993 по 2004 годы получено, размножено и передано селекционерам более 15 тысяч растений 130 гибридных образцов. На их основе создано 8 новых сортов этой культуры.
3. Использование тидиазурона и К-(4-пиридил)-К-фенплмочевины обеспечило введение в культуру in vitro более 145 новых форм ремонтантной малины, а также индукцию стеблевого морфогенеза из цветковых почек,- что позволило вводить материал в культуру in vitro в течение всего года.
4. На этапе собственно микроразмножения in vitro для большинства ремонтантных образцов наиболее эффективным оказался препарат 6-БАП в концентрации 2 мг/л, а для трудно размножаемых форм - препараты 4-PU и TDZ в концентрациях 0.4 мг/л и 0.1 мг/л, соответственно. Лучшему укоренению побегов способствуют ауксины ИУК и ИМК в концентрации 0.5 - 0.75 мг/л, а для слабо укореняемых генотипов преимущество имеет обработка побегов раствором ИМК, 1 г/л с дальнейшим перенесением на безгормональную питательную среду или в песок.
5. Полученные in vitro растения при выращивании их в полевых условиях имеют более высокий коэффициент вегетативного размножения и обладают повышенной продуктивностью. Указанный эффект постепенно снижается в течение 4-5 лет.
6. При регенерации растений из листьев, листовых дисков и листовых черешков различных генотипов in vitro стеблевой морфогенез индуцируется у всех исследованных форм в широком диапазоне - от 3.3 до 96.0%. Показано, что регенерационная способность ремонтантной малины зависит от генотипа, происхождения эксплантов, концентрации используемых регуляторов роста, условий культивирования.
7. Впервые для ремонтантной малины применен метод молекулярно-генетического анализа с использованием ISSR-PCR. С его помощью показана генетическая однородность растений - регенерантов малины и их идентичность исходному образцу, а также проведена генетическая паспортизация и построены дендрограммы генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.
8. Для ремонтантной малины разработан метод генетической трансформации с помощью кокультивирования листовых дисков с А. tumefaciens, получены трансформированные растения с генами nptH и термостабильной бактериальной лихеназы, что доказано методом PCR и тестом на наличие лихеназной активности.
9. Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого, культивируемых in vitro. Эти системы могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян этой культуры.
10. Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирования. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и П. Показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.
11. Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых регуляторов роста: кавказ, краснодар-1, эмистим и экост-ГФ,- на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта. Препараты стимулируют прорастание семян, рост, цветение и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9-17%. Наибольшую прибавку продукции, в среднем на 16% за три года, обеспечил препарат Кавказ в концентрации 25 мкл/л, рентабельность в производственных опытах возросла при этом на 5.5% -11.9%.
Практические рекомендации.
1. Разработанная технология клонального микроразмножения ремонтантных форм малины может быть применена для ускорения селекции и для производства посадочного материала новых сортов этой культуры.
2. Метод ISSR-PCR рекомендуется использовать для молекулярно-генетического анализа малины при селекции, в частности для поиска молекулярных маркеров на хозяйственно-ценные признаки, при уточнении схем селекции и для установления родства различных образцов.
3. Генетическая паспортизация с помощью ISSR-PCR позволяет различать между собой сорта малины и может быть рекомендована для оценки сортовой чистоты при производстве и внедрении новых сортов.
4. Разработанные методы регенерации и трансформации in vitro ремонтантной малины могут быть использованы в работах по созданию трансгенных форм этой культуры.
5. Модельные системы на основе семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого рекомендуются для изучения механизмов действия фитогормонов и регуляторов роста.
6. Для повышения эффективности производства огурца в защищенном грунте перспективным является использование препаратов кавказ в концентрации 25 мкл/л и Краснодар-1 в концентрации 125 мг/л.
7. Полученные результаты рекомендуется использовать в учебных курсах по физиологии и биохимии растений при обучении студентов в вузах.
Список опубликованных работ
1. Нам И.Я., Заякин В.В., Кулаева О.Н. Изучение роли абсцизовой кислоты в процессе формирования генеративных органов люпина. // Тез. II Всесоюзн. конф. по регуляторам роста и развития растений. Киев, 1988. С. 267.
2. Заякин В.В., Нам И.Я., Кулаева О.Н. Изучение молекулярного механизма действия цитокинина на модели изолированных семядолей люпина: стимуляция цитокинином протеинкиназной активности, ассоциированной с РНК-полимеразой. // Тез. II Всесоюзн. конф. по регуляторам роста и развития растений. Киев, 1988. С. 222.
3. Нам ИЛ., Заякин В.В. Влияние абсцизовой кислоты на развитие зародышей желтого люпина в культуре in vitro. // Тез. Междунар. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Новосибирск, 1988, С.237.
4. Нам И.Я., Заякин В.В., Кулаева О.Н. Динамика содержания абсцизовой кислоты в созревающих семенах желтого люпина. // Физиол. раст., 1989, Т. 36, N.6., С.1133 -1139.
5. Заякин В.В., Нам И.Я., Кулаева О.Н. Регуляция автокиназной активности, связанной с РНК-полимеразой люпина, - возможный механизм действия фитогормонов. // Тезисы V междунар. конф. по люпину. Познань, 1988, С. В36 (на англ. языке).
6. Заякин В.В., Нам И.Я., Кулаева О.Н. Влияние цитокинина на протеинкиназную активность, ассоциированную с РНК-полимеразой в семядолях люпина. // Физиол. 'раст., 1989, Т.36, N1, С. 11-17.
7. Нам И.Я., Заякин В.В., Шутов Г.К., Кулаева О.Н. Роль абсцизовой кислоты при созревании и прорастании семян люпина желтого. // Тез. Всесоюзн. конф. "Физиология семян". Душанбе, 1988, С. 214 - 217.
8. Заякин В.В., Нам И.Я. Возможное участие протеинкиназной реакции в реализации действия цитокинина на изолированные семядоли люпина желтого. // II съезд Всесоюзн. общ. физиол. раст. Минск, 24-29 сент. 1990, Тез. докл.,ч.2., 1992, С.78.
9. Нам ИЛ., Заякин В.В. Роль абсцизовой кислоты в эмбриогенезе люпина. // Тез. XI Междунар. симп. "Эмбриология и семенное размножение". Ленинград, 1990, С.108.
10. Нам ИЛ., Заякин В.В., Шутов Г.К., Кулаева О.Н. Содержание абсцизовой кислоты и накопление запасного белка в созревающих семенах желтого люпина. // Физиол. и биохимия культ, растений, 1990, Т. 22, N. 4, С.349 - 354.
11. Заякин В.В., Нам И.Я. РНК полимеразы I и II и цитозольный фактор регуляции транскрипции в семядолях люпина желтого. // Физиол. раст., 1992, Т. 39, N1, С. 48-54.
12. Заякин В.В., Нам И.Я., Кулаева О.Н. Возрастные различия в компетентности изолированных семядолей люпина к абсцизовой кислоте. // Физиол. и биох. культ, раст., 1992, Т. 24, N. 5, С. 461 - 467.
13. Нам И.Я., Заякин В.В., Кулаева О.Н. Влияние абсцизовой кислоты на рост зародышей незрелых семян люпина желтого. // Физиол. и биох. культ, раст., 1992., Т.24, N.5, С.467-472.
14. Нам И.Я., Заякин В.В. Гормональная регуляция экспрессии генов запасных белков в зародышах люпина (Lupinus luteus (L). // Тез. II Всеросс. симп. "Новые методы биотехнологии растений". Пущино, 1993, С.86.
15. Нам И.Я., Заякин В.В. Абсцизовая кислота как стимулятор развития и накопления запасных белков в семенах люпина желтого. // Тез. Междунар. симп. "Физиология абсцизовой кислоты". Пущино, 1993, С. 41.
16. Нам И.Я., Заякин В.В., Казаков И.В. Совершенствование метода микроклонального размножения ремонтантной малины. // Матер, межвузовской научно-практ. конф. «Достижения науки и передовой опыт в производство и учебно-воспитательный процесс». Брянск, 1995, С. 93.
17. Нам И.Я., Заякин B.C., Шевелуха B.C. Гормональная регуляция развития семян люпина желтого (Lupinus luteus (L.). // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 100 (на англ. языке).
18. Нам И.Я., Заякин В.В. Использование метода эмбриокультуры для получения гибридов от скрещивания видов люпина с разным числом хромосом. // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 101 (на англ. языке).
19. Заякин В.В., Нам И.Я. Экспрессия генетической программы прорастания у созревающих семян люпина желтого (Lupinus luteus (L.). // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 177 (на англ. языке).
20. Заякин В.В., Нам И.Я, Шевелуха B.C. Фитогормональная регуляция опадения генеративных органов люпина. // Тезисы VIII Междунар. конф. по люпину. Калифорния, США, 1996, С. 178 (на англ. языке).
21. Миненко А.И., Нам И.Я. Применение экологически чистого биопрепарата эмистим в условиях закрытого грунта на огурце. // Матер. Научно-метод. конф."Внедрение достижений науки и передового опыта в с/х производство и учебный процесс". Ярославль, 1996, С. 73.
22. Заякин В.В., Нам И.Я., Шевелуха B.C. Гормональная регуляция
поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу на модельной системе люпина желтого (Lupinus luteus L.). // Матер. 4 Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений". Москва, 1997, С. 124.
23. Миненко А.И., Заякин В.В., Нам И.Я. Применение новых регуляторов роста для увеличения урожайности огурцов и томатов в закрытом грунте. // Матер. 4 Междунар. конф. "Регуляторы роста и развития растений". Москва, 1997, С. 251.
24. Заякин В.В., Нам И.Я. Фитогормоны - прямое звено в механизме регуляции опадения генеративных органов люпина желтого. // Мат. межвузовской научно - практ. конф. Брянск, 1997, С. 46.
25.Нам И.Я., Заякин В.В. Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке систем трансформации. // Мат. межвузовской научно - практ. конф. Брянск, 1997, С. 47.
26. Заякин В.В., Нам И.Я. Экспрессия гена синтетазы 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты в цветках люпина перед цветением.// Тезисы 3 ежегодного симпозиума "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология". Москва, 1997, С. 127.
27. Вовк В.В., Нам И.Я., Казаков И.В., Заякин В.В. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции ремонтантных форм малины. // Мичуринское чтение. Мичуринск,. 1997, С. 78.
28. Вовк В.В., Заякин В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке систем трансформации. // Матер, научно-практической конференции агрофака БГСХА, 1997, С. 145.
29. Миненко А.И., Нам ИЛ. Применение экологически чистого биопрепарата эмистим в условиях закрытого грунта на огурце. // Матер, научно-практической конференции агрофака БГСХА, 1997, С. 114.
30. В.В.Заякин, И.Я.Нам. Стимуляция абсцизовой кислотой поступления ассимилятов из оболочки семени к развивающемуся зародышу люпина (Lupinus luteus (L.). // Физиол. раст., 1998, Т.45, N.I, С. 100 -107.
31. Нам И.Я., Заякин В.В. Установление первичной структуры фрагментов одного из генов АЦК-синтазы желтого люпина, кодируемой олигогенным семейством. // Сборник трудов агрон.фак. БГСХА, 1998, С. 73.
32. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В., ИЛ, Казаков И.В. Оптимизация метода клонального микроразмножения для ускоренной селекции межвидовых ремонтантных форм малины. // С/х биология, 1998, № 3, С. 51-56.
33. Нам И.Я., Заякин В.В., Заякина О.В., Шевелуха B.C. Изучение
гормональной регуляции опадения плодоэлементов на модельных системах на основе соцветия люпина желтого. // конф."Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". Брянск, 1999, С. 343-347.
34. Нам И.Я., Заякин В.В., Шевелуха B.C. Трансгенные растения - путь к экологически чистым технологиям XXI века. Подходы к созданию высокопродуктивных трансгенных форм люпина желтого (Lupinus luteus (L). конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 340-343.
35. Заякин В.В., Вовк В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. Повышение эффективности клонального микроразмножения ремонтантной малины при использовании цитокининов ряда дифенилмочевины. // конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 304-308.
36. Миненко А.И., Ковалев В.М., В.В. Заякин, Нам И.Я. Влияние новых экологически чистых регуляторов роста на рост, развитие и продуктивность растений огурца в условиях закрытого грунта. // конф. "Актуальные проблемы экологии на пороге третьего тысячелетия". БГСХА, 1999, С. 336 - 340.
37. Нам И.Я., Заякин В.В., Заякина О.В., Шевелуха B.C. Применение упрощенных модельных систем на основе мутовчатого соцветия желтого люпина для изучения роли отдельных фитогормонов в регуляции опадения плодоэлементов. // 5 Междунар. конф. по регуляторам роста и разв. растений. Москва, 1999, С. 55.
38. Нам И.Я., Заякина О.В., Заякин В.В., Шевелуха B.C. Использование в модельных опытах глифосата как ингибитора биосинтеза ауксина в растениях. // Матер. IV съезда ВОФР. Москва, 1999, С. 649.
39. Нам И.Я., Заякин В.В., Шевелуха B.C.. Гормональная регуляция опадения генеративных органов люпина. // Матер. IV съезда ВОФР. 1999, С. 648.
40. Миненко А.И., Заякин В.В., Нам ИЛ., Ковалев В.М. Повышение урожайности огурца в защищенном грунте с помощью новых регуляторов роста растений. // 5 междунар. конф. по РРР. Москва, 1999, С. 217-218.
41. Нам И.Я., Вовк В.В., Казаков И.В., Заякин В.В. Использование цитокининов ряда дифенилмочевины при микроклональном размножении ремонтантной малины. // С/х биология, 1999, №5, С.52-56.
42. Нам И.Я., Заякин В.В., Вовк В.В., Казаков И.В. Применение методов биотехнологии для ускорения селекции ремонтантной малины. // Сельскохоз. биотехнология. Избранные работы под ред. Шевелухи B.C. Т. 1, Москва, 2000, С.79-88
43. Заякин В.В., Нам И.Я. Опадение органов плодоношения люпина
желтого как проявление интегральной системы регуляции развития растения. // Всерос. конф. «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 2000, С. 11-15.
44. Нам И.Я., Заякин В.В. Специфическая индукция экспрессии генов АЦК-синтаз у разных видов растений. // Всерос. конф. «Молодые ученые -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 2000, С. 15 -19.
45. Кравченко Д.В., Антошкин А.А., Миненко А.И., Нам И.Я. Влияние регуляторов роста растений на развитие проростков томата и огурца. // Всерос. конф. «Молодые ученые - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». Брянск, 2000, С. 47-50.
46. Сковородников Д.Н., Бъядовский И.А., Заякин В.В., Нам И.Я. Изучение влияния TDZ и темноты на регенерацию растений из листовых эксплантов межвидового ремонтантного сорта малины Бабье лето -2.1 Матер, мждунар. научно-практ. конф. «Биотехнология - возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». С-Петербург, 2001, С. 68 - 71.
47. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Подходы к разработке метода трансформации ремонтантных форм малины через листовые экспланты. // Матер, междунар. научно-практ. конф. «Биотехнология -возрождению сельского хозяйства России в XXI веке». С.-Петербург, 2001, С. 72 - 74.
48. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Молекулярное маркирование видов, сортов и гибридов малины с помощью микросателлитных повторов. // Матер, междунар. научно-практ. конф. «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». Брянск, 2002, С.57-58.
49. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Разработка метода создания трансгенных растений ремонтантной малины. // Матер, междунар. научно-практ. конфер. «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». Брянск, 2002, С. 56-57.
50. Сковородников Д.Н., Соболева А.Г., Нам И.Я. Использование биотехнологических подходов в селекции ремонтантных форм малины. // Матер, междунар. научно-практ. конфер. «Использование достижений современной биологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии». Брянск, 2002, С. 55-56.
51. Нам И.Я., Миненко А.И. Применение новых экологически чистых регуляторов роста в технологии производства огурца в защищенном грунте. // Тез конф. «Физиол. раст. и экология на рубеже веков». Ярославль, 2003, С. 114.
52. Соболева А. Г., Соболев В. В., Заякин В.В., Нам И. Я. Влияние разных факторов на регенерацию ремонтантной малины из листовых эксплантов // Тез. конф. «Физиол. раст. и экология на рубеже веков». Ярославль, 2003, С. 51.
53. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Разработка метода трансформации малины ремонтантных форм через листовые экспланты. // Материалы II международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений». Харьков, 2003, С. 89-90.
54. Соболева А.Г., Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Регенерация и трансформация ремонтантной малины. // Материалы V съезда общества физиологов растений России «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 524.
55. Сковородников Д.Н., Заякин В.В., Нам И.Я. Клональное микроразмножение и длительное хранение in vitro ремонтантной малины. // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 525.
56. Соболев В.В., Заякин В.В., Нам И.Я. Характеристика полиморфизма межвидовых ремонтантных гибридных форм малины по физиологическим признакам и ISSR-PCR молекулярным маркерам. // Материалы V съезда общества физиологов растений России. «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 526.
57. Миненко А.И., Мищенко В.О., Нам И.Я. Влияние новых экологически чистых регуляторов роста на развитие огурца. // Материалы V съезда общества физиологов растений России «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003, С. 314.
58. Нам И.Я., Заякин В.В. Влияние цитокининов ряда дифенилмочевины на дедифференциацию цветковых почек ремонтантной малины. // Материалы Междунар. симпозиума по физиологии растений "Размножение растений -2002". Пенсильвания, США, 2002, С. 26 (на англ. языке)
59. Сковородников Д.Н., Заякин В.В., Нам И.Я., Казаков И.В. Особенности начального этапа клонального микроразмножения ремонтантных форм малины in vitro. // Сельскохоз. биол., 2004, Т. 3, С. 109-114.
Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту акад. РАСХН, профессору, доктору биологических наук Шевелухе Виктору Степановичу за помощь, поддержку и внимание, оказанные в ходе выполнения работы. Автор выражает глубокую благодарность профессору, д.б.н Заякину Владимиру Васильевичу за многолетнее творческое содружество, понимание и всестороннюю помощь в работе, чл.-корр. РАСХН, профессору, д.с.-х.н. Казакову Ивану Васильевичу за интерес к работе и участие в обсуждении полученных результатов, д.б.н. Голденковой Ирине Васильевне, д.с.-х.н. Высоцкому Валерию Александровичу и к.б.н. Ралдугиной Галине Николаевне за консультации и методическую помощь в работе, сотрудникам кафедры сельскохозяйственной биотехнологии МСХА им. К. А. Тимирязева за поддержку и неизменно дружеское отношение. Автор благодарит сотрудников и аспирантов лаборатории биотехнологии Брянской ГСХА за интерес и добросовестное отношение к работе.
Объем 2,75 п. л.
Зак. 262
Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44
Тир. 100 экз.
»25070
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Нам, Ирина Ян-Гуковна
Список сокращений
Введение
1. Литературный обзор
1.1. Применение регуляторов роста и развития растений в современной биотехнологии
1.1.1. Применение регуляторов роста и развития растений при клональном микроразмножении
1.1.2. Гормональная регуляция регенерации растений плодово-ягодных культур in vitro
1.1.3. Генетическая трансформация плодово-ягодных культур
1.1.4. Использование метода эмбриокультуры in vitro в селекционном процессе
1.2.1. Молекулярно-генетическое маркирование растений методом ISSR-PCR
1.3. Применение модельных систем на основе изолированных органов in vitro для исследования действия регуляторов роста и развития растений при созревании и прорастании семян
1.3.1. Гормональная регуляция созревания семян in vivo
1.3.2. Влияние фитогормонов на рост и развитие зародышей в культуре in vitro
1.3.3. Гормональная регуляция прорастания семян
1.3.4. Изолированные семядоли как модельная система для изучения действия фитогормонов
1.3.4. Изучение молекулярных механизмов действия фитогормонов на модельных системах на основе изолированных органов растений
1.4.1. Регуляция роста и развития растений с помощью фитогормонов и синтетических регуляторов роста
1.4.2. Применение фитогормонов и синтетических регуляторов роста на огурце
1.4.2.1. Применение фитогормонов на огурце в открытом и закрытом грунте
1.4.2.2. Применение на огурце регуляторов роста растений негормональной природы
1.4.3. Применение препаратов из эндофитных симбионтных грибов
1.4.4. Применение регуляторов роста, синтезированных на основе фурфурола
2. Объекты и методы исследований 91 2.1. Характеристика объектов исследования
2.1.1. Биологическая характеристика огурца
2.1.2. Биологическая характеристика малины
2.1.3. Биологическая характеристика люпина
§> 2.2. Методы исследования
2.2.1. Культивирование малины in vitro
2.2.2. Регенерация и генетическая трансформация растений малины
2.2.3. Молекулярно-генетический анализ методом ISSR
2.2.4. Отбор растительного материала люпина желтого
2.2.5. Анализ фитогормонов в тканях люпина желтого
2.2.6. Культивирование зародышей незрелых семян люпина in vitro 107 '* 2.2.7. Технология выращивания огурца в защищенном грунте
3. Результаты и их обсуждение 112 3.1. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений при культивировании in vitro малины 112 3.1.1. Разработка методов клонального микроразмножения ремонтантной малины
3.1.1.1. Применение регуляторов роста на этапе введения ремонтантной малины в культуру in vitro
3.1.1.2. Этап размножения пробирочных растений ремонтантных форм малины.
3.1.1.3. Укоренение пробирочных растений ремонтантной малины
3.1.1.4. Адаптация укорененных пробирочных растений к внешним условиям
3.1.1.5. Общая характеристика генетического разнообразия образцов ремонтантной малины при их размножении в культуре in vitro
3.1.1.6. Описание сортов ремонтантной малины, полученных с помощью биотехнологических подходов
3.1.1.7. Хранение образцов ремонтантной малины in vitro
3.1.2. Регенерация растений ремонтантной малины in vitro
3.1.3. Разработка метода генетической трансформации ремонтантных форм малины
3.1.4. Разработка метода молекулярно-генетического анализа малины методом ISSR-PCR
3.2. Исследование гормональной регуляции процессов, протекающих на разных этапах онтогенеза растений люпина
3.2.1. Создание модельной системы на основе зародышей из созревающих семян люпина желтого
3.2.2. Создание модельной системы на основе семядолей проростков люпина желтого
3.2.3. Изучение механизма действия фитогормонов на модельных системах изолированных органов люпина
3.3.1. Разработка метода применения РРР для повышения продуктивности огурца при возделывании в защищенном грунте
3.3.1.1. Определение диапазона оптимальных концентраций РРР при их воздействии на прорастание семян ф 3.3.1.2. Влияние регуляторов роста растений на появление и развитие всходов огурца в опытах в защищенном грунте 248 3.3.1.3. Влияние регуляторов роста и развития растений на цветение растений огурца в условиях защищенного грунта
3.3.1.5. Влияние регуляторов роста и развития растений на продуктивность растений огурца
3.3.1.6. Влияние препарата кавказ на урожайность огурца в производственных опытах в защищенном грунте
Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro"
Исследование влияния регуляторов роста и развития на жизнедеятельность растений является важнейшим направлением современной биотехнологии. Интерес к нему связан как с теоретической значимостью проблемы, так и с возможностью практического использования результатов в селекции и технологии.
Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ, оказывающих воздействие на все этапы онтогенеза растений (Муромцев Г.С. и др., 1987). Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н., 1973, 1982; Кефели В.И., 1974, 1989), направленно регулирующие процессы, протекающие в растениях, что позволяет использовать их в биотехнологиях in vitro (Муромцев Г.С. и др., 1987; Шевелуха B.C., 1992).
Важное значение среди биотехнологических подходов имеют кло-нальное микроразмножение и регенерация in vitro, которые разработаны для многих видов культурных растений (Бутенко Р.Г., 2001). Однако для сложно размножаемых культур актуальным остается поиск эффективных регуляторов роста для разработки технологий их размножения и регенерации in vitro.
Фундаментальной основой для поиска новых физиологически активных веществ и разработки методов их применения является изучение механизмов действия регуляторов роста на различных уровнях. Большие возможности в этом отношении дают модельные системы in vitro, включая изолированные органы, ткани, а также бесклеточные системы (Третьяков Н.Н. и др., 1998; Глазко В.И., Глазко В.Г., 2003). Разработка модельных систем включает изучение физиологических процессов, характерных для данного органа, исследование специфичности их гормональной регуляции и чувствительности по отношению к различным гормонам, взаимодействие разных типов фитогормонов и т.д. Особый интерес представляют системы, позволяющие изучать действие регуляторов роста на молекулярном уровне, в том числе на уровне транскрипции и регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ. Разработка таких модельных систем на разных культурах способствует расширению наших представлений о молекулярном механизме действия фитогормонов на процессы, протекающие на разных этапах онтогенеза, и в конечном счете, дальнейшему развитию теории гормональной регуляции жизнедеятельности растений.
Создание теории гормональной регуляции у растений стало возможным благодаря накоплению большого количества данных о воздействии фитогормонов на рост и развитие различных видов растений, в то же время для многих представителей обширной группы синтетических регуляторов роста изучено лишь их влияние на продуктивность отдельных сельскохозяйственных культур (Муромцев Г.С. и др., 1979; 1984; Никелл Л.Дж., 1984; Шевелуха B.C. и др., 1998). Поэтому их применение на других видах растений с целью повышения продуктивности растений и ее стабилизации, например, на огурце при возделывании в защищенном грунте, требует дальнейшего изучения.
Исследования, результаты которых представлены в данной работе, были проведены в период с 1978 по 2004 гг. на ремонтантной малине, огурце в защищенном грунте и люпине желтом - культурах разных семейств, сильно различающихся в физиологическом отношении, а также по степени изученности и проблемам, которые решались с применением регуляторов роста.
В настоящей работе были использованы ремонтантные формы малины селекции чл.-корр. РАСХН И.В. Казакова, полученные при межвидовой гибридизации малины красной, замечательной, черной, боярышниколист-ной, душистой и поленики. На Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.) собрана многочисленная коллекция ремонтантных сортов и форм, здесь создан самый крупный в стране гибридный фонд. В гибридном питомнике было оценено около 120 тысяч гибридов, при этом отобрано более 250 образцов, превосходящих районированный ремонтантный сорт Бабье лето. Однако ремонтантные формы имеют существенные особенности в развитии (Казаков И.В., 1994), резко замедляющие их вегетативное размножение. Главной отличием этих генотипов является плодоношение на побегах первого года, в связи с чем вегетативные почки рано дифференцируются по цветковому типу. Распределение питательных веществ также подчинено раннему плодоношению, поэтому ассимиляты преимущественно потребляются растущими побегами и плодоэлементами. Это вызывает существенное уменьшение образования корневых отпрысков, замедление вегетативного размножения и, следовательно, селекционного процесса в целом. Для ускорения создания новых ремонтантных сортов малины актуальной была разработка биотехнологических приемов размножения элитных ремонтантных форм, в частности методов их кло-нального микроразмножения и регенерации растений in vitro.
В работе мы использовали результаты отечественных и зарубежных исследователей, ранее разработавших методы клонального микроразмножения in vitro для растений рода Rubus: малины красной, черной, ежевики (Коротаева М.С. и др., 1975; Высоцкий В.А., 1984, 1998; Туровская Н.И., 1990; Fiola J.A. et al., 1990; Graham J. et al., 1997). Так, при микроразмножении этих видов растений на этапах введения эксплантов in vitro и собственно размножения пробирочных растений применяются цитокинины пу-ринового ряда - 6-БАП, реже кинетин и зеатин, а на этапе индукции ризо-генеза - ауксины ИУК, ИМК или НУК. Для регенерации in vitro растений разных видов из эксплантов различного типа - листовых пластинок, дисков и черешков, семядолей, зародышей и других органов, используются сочетания различных цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее эффективным для индукции регенерации является 6-БАП, а в качестве ауксинов чаще всего упоминаются ИУК, ИМК, реже 2,4-D. В ряде работ по регенерации растений плодовых культур авторы индуцируют стеблевой морфогенез на семядолях и листовых дисках с помощью тидиазурона - ци-токинина ряда дифенилмочевины.
В начальный период нашей работы литературных данных о размножении и регенерации in vitro ремонтантной малины не было. Разработку методов клонального микроразмножения и регенерации in vitro ремонтантных форм малины мы начали с изучения эффективности применения при их культивировании традиционно используемых фитогормонов 6-БАП и ауксинов ИУК и ИМК.
Основные сложности при разработке метода клонального микроразмножения наблюдались на этапе введения образцов ремонтантной малины в культуру in vitro, что было связано с биологическими особенностями этих форм — с ранним плодоношением растений, формированием ягод на побегах текущего года. В связи с этим были ограничены как сроки вычленения апексов для культивирования in vitro, так и количество исходного материала - всего по 6 -15 эксплантов на образец. Малое количество исходного материала объективно не позволяло проводить опыты по оптимизации питательных сред, особенно на этапе введения материала в культуру in vitro. Кроме того, оптимизировать гормональный состав питательных сред на других этапах микроразмножения также было сложно из-за большого генетического разнообразия размножаемых форм - с 1993 по 2004 гг. нами было введено в культуру более 145 гибридных образцов, размножено и передано селекционерам более 15 тысяч растений 130 генотипов. То есть, необходимо было разработать универсальные среды, эффективные для большинства образцов, но, возможно, не оптимальные для отдельных генотипов. При недостаточной активности традиционно используемых фитогормонов на разных этапах этой работы важно было исследовать возможность применения новых регуляторов роста, ранее не использованных для ремонтантной малины.
В современной селекции широко используются методы генетической инженерии, позволяющей направленно создавать сорта, несущие новые, уникальные свойства. Однако для трансгеноза растений необходимо предварительно разработать высокоэффективный метод регенерации растений изучаемой культуры in vitro, а также выбрать способ трансформации растительных тканей и подобрать условия ее проведения. В литературных источниках в начале 90-х годов были данные о получении трансгенных растений малины и ежевики, однако с ремонтантными формами работа не проводилась, что явилось основанием для разработки методов регенерации и трансформации ремонтантных генотипов.
В современной биотехнологии в последние годы четко проявилась тенденция использования методов, подходов и достижений этой науки для проведения исследований в смежных областях биологии. Так, например, успехи генетической инженерии позволили разрабатывать модельные системы типа растение - агробактерия A. tumefaciens, которые применяются для изучения физиологических (гормональных) и молекулярных механизмов генетической трансформации, а также генетических систем, отвечающих за их взаимодействие (Лутова JI.A. и др., 2002).
Методы культивирования изолированных органов и тканей растений также широко используются в физиологии и молекулярной биологии растений. Так, при изучении регуляторов роста и развития растений особое внимание ученых привлекает их воздействие на растения на молекулярном уровне, например, влияние фитогормонов на экспрессию генов и генетических программ на уровне регуляции их транскрипции и трансляции (Ку-лаева О.Н., 1987, 1999; Холл A.M., 2002). Для этого требуется разработка модельных систем, отвечающих определенным требованиям. Создание модельных систем на основе культивируемых in vitro органов растений позволяет упростить регуляторные взаимодействия, вычленить и охарактеризовать отдельные процессы, и изучить влияние на них внешних факторов, в том числе фитогормонов.
Исследования гормональной регуляции процессов, протекающих на разных этапах онтогенеза люпина желтого, были начаты нами в 1978 году.
На модельной системе цветочной кисти люпина изучена гормональная регуляция процесса опадения плодоэлементов и на этой основе был предложен препарат ингибиторного действия 2-аминоизомасляная кислота. Она является конкурентным ингибитором АЦК-синтазы - ключевого фермента биосинтеза этилена, и существенно подавляет опадение плодоэлементов, повышая тем самым продуктивность растений.
Изолированные семядоли проростков и незрелые зародыши люпина, культивируемые in vitro, также могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения действия гормонов на этапах формирования и прорастания семян, в том числе на молекулярном уровне. Ранее на люпине желтом подобные исследования не проводились, и этой проблеме посвящена часть настоящей диссертации.
Регуляторы роста широко используются при возделывании многих сельскохозяйственных культур, при этом они стимулируют рост и развитие растений, увеличивают их продуктивность и устойчивость. Для повышения урожайности огурца в защищенном грунте мы изучали действие ряда регуляторов негормональной природы из числа стимуляторов роста общего действия, которые в целом ускоряют рост, развитие и плодоношение растений. В настоящее время таких препаратов известно довольно много. Многие из них не являются аналогами фитогормонов или имеют весьма отдаленное сходство с ними. Механизмы и особенности их действия на растения изучены в недостаточной степени. Поэтому возникает задача исследования физиологических особенностей действия таких веществ на растения.
К эффективным, но малоизученным фиторегуляторам, созданным в последние десятилетия, относятся препараты эмистим, экост-ГФ, красно-дар-1 и кавказ (Ненько Н.И., 1999; Ковалев В.М, 2003). Наряду с исследованием их действия на продуктивность и устойчивость растений огурца, важно изучить морфофизиологические показатели эффективности этих веществ, влияние на разные этапы онтогенеза.
Целью настоящей работы является оптимизация применения регуляторов роста: а) при создании высокоэффективной системы клонального микроразмножения, регенерации и генетической трансформации in vitro растений ремонтантных форм малины; б) при разработке модельных систем для изучения молекулярных механизмов действия фитогормонов на разных этапах онтогенеза люпина; в) при разработке методов использования новых регуляторов роста и развития для увеличения продуктивности растений огурца.
При этом решались следующие задачи:
- разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины: введение материала в культуру in vitro, оптимизация условий по-бего- и корнеобразования, разработка способов длительного хранения пробирочных растений;
- разработка системы регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков, а также метода молекулярно-генетического анализа на основе ISSR-PCR для изучения генетической стабильности регенерантов;
- разработка метода трансформации растений ремонтантной малины с использованием A. tumefaciens, доказательство его эффективности с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности;
- разработка модельных систем для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов в онтогенезе на растениях люпина желтого с использованием прорастающих и созревающих семян;
- изучение эффективности новых синтетических регуляторов роста растений эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1, кавказ на разных этапах онтогенеза огурца и оптимизация их применения в условиях защищенного фунта для повышения продуктивности и устойчивости.
Научная новизна работы.
Впервые разработан метод клонального микроразмножения ремонтантной малины, при этом оптимизированы этапы введения материала в культуру in vitro, размножения и укоренения пробирочных растений и длительного сохранения клонов в пробирочных условиях.
Впервые показана способность регуляторов цитокининового действия структурного ряда дифенилмочевины - тидиазурона (TDZ) и N-(4-пиридил)-М-фенилмочевины (4-PU), индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек, что позволило вводить в культуру in vitro новые формы ремонтантной малины в течение всего года.
Разработан метод регенерации растений из листовых дисков ремонтантной малины с применением 4-PU и TDZ, универсальный для различных генотипов. Стеблевой морфогенез наблюдается у всех исследованных форм - на уровне 3.3 - 96.0% в зависимости от генотипа.
Впервые разработан молекулярно-генетический метод анализа растений малины на основе ISSR-PCR. Показана генетическая однородность полученных регенерантов ремонтантной малины и их идентичность исходному образцу. Эффективность метода подтверждена путем проведения генетической паспортизации и построения дендрограмм генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.
Разработана система генетической трансформации ремонтантной малины методом кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Эффективность метода доказана с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности.
Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих семян и незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro, для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян и экспрессии генов.
Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирова-ния. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II и показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.
Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых препаратов кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта, показано их стимулирующее действие на рост, развитие и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9 - 17%.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод клонального микроразмножения in vitro ремонтантной малины с применением цитокининов TDZ и 4-PU для оптимизации этапов введения эксплантов в культуру in vitro и размножения пробирочных растений, обеспечивающий размножение образцов практически независимо от генотипа.
2. Системы регенерации ремонтантной малины из листовых дисков и ее трансформации методом кокультивирования с A. turn.
3. Метод молекулярно-генетического анализа малины для оценки генетической стабильности и однородности растений - регенерантов, а также для характеристики размножаемых ремонтантных форм.
4. Модельные системы с использованием изолированных семядолей проростков и незрелых зародышей люпина желтого для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов и регуляции экспрессии генов.
5. Способы применения регуляторов роста Краснодар-1, кавказ и эмистим в условиях интенсивной технологии выращивания огурца в защищенном грунте для повышения продуктивности растений и ее стабилизации.
Практическая значимость работы. Применение предложенных методов и технологий размножения in vitro ремонтантной малины обеспечило сокращение на 4 - 5 лет сроков селекции от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания, что особенно важно для ремонтантных генотипов, которые отличаются низким коэффициентом вегетативного размножения. В период с 1993 г. по 2004 г. размножено и передано селекционерам более 130 образцов и на этой основе ими создано 8 новых высокоурожайных, устойчивых к болезням и вредителям сортов ремонтантной малины. Клональное микроразмножение необходимо также для организации массового производства посадочного материала новых перспективных сортов этой культуры.
Применение экологически чистых препаратов эмистим, Краснодар-1 и кавказ повышает продуктивность растений огурца в условиях интенсивного производства в защищенном грунте на 9 - 17%.
Таким образом, настоящая работа затрагивает различные аспекты применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологии:
1. Применение ранее не использовавшихся для ремонтантной малины регуляторов роста ряда дифенилмочевины привело к разработке технологии клонального микроразмножения и регенерации растений этой культуры in vitro, что позволило резко ускорить создание новых сортов. Разработка методов генетической инженерии на основе эффективной регенерации растений in vitro открывает новые перспективы в селекции этой культуры.
2. Решение технологических проблем при возделывании огурца в защищенном грунте оказалось возможным при использовании экологически чистых препаратов эмистим, кавказ и Краснодар-1, повышающих продуктивность растений на 9-17%.
3. Для исследования механизма действия фитогормонов и регуляторов роста перспективно применение модельных систем, созданных на основе культивируемых in vitro изолированных зародышей и семядолей люпина желтого, что важно для развития гормональной теории регуляции жизнедеятельности растений.
1. Литературный обзор.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нам, Ирина Ян-Гуковна
Выводы.
1. Разработана технология клонального микроразмножения и регенерации растений ремонтантной малины in vitro, применение которой обеспечивает ускорение создания высокопродуктивных и устойчивых сортов этой культуры. Технология оптимизирована для ремонтантных гибридов малины сложного межвидового происхождения на этапах введения эксплантов в культуру in* vitro, размножения, укоренения и длительного сохранения пробирочных растений. Ее высокая эффективность основана на применении цитокининов ряда дифенилмочевины - тидиазурона и Н-(4-пиридил)-Н-фенилмочевины; подборе эксплантов различного происхождения; возможности круглогодичного введения эксплантов в культуру in vitro; дифференцированной оптимизации условий размножения элитных сортообразцов малины.
2. Применение разработанной технологии позволяет сократить на 4 - 5 лет сроки создания сортов и гибридных образцов ремонтантной малины. За период с 1993 по 2004 годы получено, размножено и передано селекционерам более 15 тысяч растений 130 гибридных образцов. На их основе создано 8 новых сортов этой культуры.
3. Использование тидиазурона и Н-(4-пиридил)-Ы-фенилмочевины обеспечило введение в культуру in vitro более 145 новых форм ремонтантной малины, а также индукцию стеблевого морфогенеза из цветковых почек, что позволило вводить материал в культуру in vitro в течение всего года.
4. На этапе собственно микроразмножения in vitro для большинства ремонтантных образцов наиболее эффективным оказался препарат 6-БАП в концентрации 2 мг/л, а для трудно размножаемых форм - препараты 4-PU и TDZ в концентрациях 0.4 мг/л и 0.1 мг/л, соответственно. Лучшему укоренению побегов способствуют ауксины ИУК и ИМК в концентрации
0.5 — 0.75 мг/л, а для слабо укореняемых генотипов преимущество имеет обработка побегов раствором ИМК, 1 г/л с дальнейшим перенесением на безгормональную питательную среду или в песок.
5. Полученные in vitro растения при выращивании их в полевых условиях имеют более высокий коэффициент вегетативного размножения и обладают повышенной продуктивностью. Указанный эффект постепенно снижается в течение 4-5 лет.
6. При регенерации растений из листьев, листовых дисков и листовых черешков различных генотипов in vitro стеблевой морфогенез индуцируется у всех исследованных форм в широком диапазоне - от 3.3 до 96.0%. Показано, что регенерационная способность ремонтантной малины зависит от генотипа, происхождения эксплантов, концентрации используемых регуляторов роста, условий культивирования.
7. Впервые для ремонтантной малины применен метод молекулярно-генетического анализа с использованием ISSR-PCR. С его помощью показана генетическая однородность растений - регенерантов малины и их идентичность исходному образцу, а также проведена генетическая паспортизация и построены дендрограммы генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.
8. Для ремонтантной малины разработан метод генетической трансформации с помощью кокультивирования листовых дисков с А. tumefaciens, получены трансформированные растения с генами nptll и термостабильной бактериальной лихеназы, что доказано методом PCR и тестом на наличие лихеназной активности.
9. Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого, культивируемых in vitro. Эти системы могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян этой культуры.
10. Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирования. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II. Показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.
11. Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых регуляторов роста: кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ,- на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта. Препараты стимулируют прорастание семян, рост, цветение и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9-17%. Наибольшую прибавку продукции, в среднем на 16% за три года, обеспечил препарат кавказ в концентрации 25 мкл/л, рентабельность в производственных опытах возросла при этом на 5.5% -11.9%.
Практические рекомендации.
1. Разработанная технология клонального микроразмножения ремонтантных форм малины может быть применена для ускорения селекции и для производства посадочного материала новых сортов этой культуры.
2. Метод ISSR-PCR рекомендуется использовать для молекулярно-генетического анализа малины при селекции, в частности для поиска молекулярных маркеров на хозяйственно-ценные признаки, при уточнении схем селекции и для установления родства различных образцов.
3. Генетическая паспортизация с помощью ISSR-PCR позволяет различать между собой сорта малины и может быть рекомендована для оценки сортовой чистоты при производстве и внедрении новых сортов.
4. Разработанные методы регенерации и трансформации in vitro ремонтантной малины могут быть использованы в работах по созданию трансгенных форм этой культуры.
5. Модельные системы на основе семядолей прорастающих и незрелых зародышей созревающих семян люпина желтого рекомендуются для изучения механизмов действия фитогормонов и регуляторов роста.
6. Для повышения эффективности производства огурца в защищенном грунте перспективным является использование препаратов кавказ в концентрации 25 мкл/л и Краснодар-1 в концентрации 125 мг/л.
7. Полученные результаты рекомендуется использовать в учебных курсах по физиологии и биохимии растений при обучении студентов в вузах.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Нам, Ирина Ян-Гуковна, Москва
1. Аветисова Л.В., Марьяхина И.Я. Ультраструктура клеток каллуса капусты при различном характере морфогенеза in vitro. // Культура клеток растений и биотехнология. / М.: Наука, 1986, с. 124 127.
2. Авакян А.Г., Арзуманян А.Т. Влияние физиологически активных веществ на рост, развитие и продуктивность огурцов. // Наука — овощеводству, Ереван, 1990а, с. 96-101.
3. Авакян А.Г., Арзуманян А.Т. Капельное орошение огурца в условиях защищенного грунта. // Наука овощевод. Ереван, 1990,6, С. 75-79.
4. Алексеенко JI.B. Особенности размножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники in vitro. // Автореф. дисс. канд. с/х наук. М., 1998, 20 с.
5. Андреева Е.А., Ходжайова JI.T. Изучение роли цитокининов в развитии признака устойчивости к болезням в модельной системе карфтофель фитофтора. // 2-й съезд генетиков и селекц., С-Пб., 2000, Т.1, С. 275.
6. Армитидж Ф., Уолден Р., Дрейпер Дж. Агробактериальные трансформирующие векторы растений.// Генная инженерия растений. Лабораторное руководство / Под ред. Дрейпера Дж., М.: Мир, 1991, с. 11-86.
7. Бадовская J1.A., Кульневич В.Г., Ненько Н.И. Новый регулятор роста кукурузы — препарат кротонолактон. / Рекоменд. АПК Краснодарск. края, 1986, 5с.
8. Балуева H.J1. Перспективность применения биостимуляторов на яровой пшенице. // Тез. докл. областной научно -практ. конф., Курган, 1999, с. 61-62.
9. Балуева H.J1. Сравнительная эффективность влияния биологическиактивных веществ на начальный рост и продуктивность яровой пшеницы. / Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. с/х наук, Курган, 2000, 19 с.
10. Баскаков Ю.А. Новые гербициды и регуляторы роста растений. // Журн. Всесоюзн. хим. общ-ва им. Менделеева, 1984, т.29, №1, с. 22-39.
11. Баскаков Ю.А. Новый антистрессовый препарат цитокининового типа действия. // Регуляторы роста растений. JI, 1989, С. 42 45.
12. Батыгина Т.Б., Бутенко Р.Г. Морфогенетический потенциал зародыша покрытосеменных растений (на примере представителей рода Рае-onia сем. Paeoniaceae). // Бот. журн., 1981, Т. 66, № 11, с. 1531 1547.
13. Бленда В.Ф., Радилова Л.Д. Клональное микроразмножение подвоев косточковых культур. // Садоводство и виноград., 1991, №3, с. 21 24.
14. Бленда В.Ф. Адаптация подвоев косточковых культур, полученных из изолированных меристем. // Садоводство и виногр., 1996, №3, с. 18—19.
15. Болотских А.С. Выращивание огурцов./ М.:Колос,1975, 114 с.
16. Болотских А.С., Даус Е.Г. Промышленное производство огурцов. / М.: Колос, 1983,203 с.
17. Будыкина Н.П., Шабалина Л.П., Кучко JI.A. Эффективность применения гиберсиба в сочетании с хлорхолинхлоридом на тепличной культуре томата. // Эколого-физиологические основы устойчивости, роста и развития растений, Петрозаводск, 1992, с. 98-103.
18. Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Голодрига П.Я. Быстрое клональное размножение виноградного растения // Сельскохозяйственная биология, 1983, N 5, с. 48-50 .
19. Бурдейная Т.В., Высоцкий В.А., Алексеенко JI.B. Использование тидиазурона в культуре изолированных тканей и органов ягодных растений. // Плодоводство и ягодоводство России, 1998, Т.5, С. 55-59.
20. Брызгалов В.А. Советкина В.Е., Савинова Н.И., Девочкин Л.А., Лебл Д.О., Нестругин Н.А., Попов Г.Ф., Калиненок Н.П. Овощеводство защищенного грунта. / М."Колос", 1995, 352 с.
21. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений./ М.:Наука, 1964.
22. Бутенко Р.Г., Лунева М.З. Применение метода стерильных культур для выращивания отдаленных гибридов Nicotiana. // Физ. раст., 1966, Т. 13, №4, с. 733-736.
23. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений./ М.: Наука, 1975, 121 с.
24. Бутенко Р.Г. Использование культуры тканей растений в сельскохозяйственной науке и практике // Сельскохозяйственная биология, 1979, Т.14,№3, с. 306-315.
25. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе // Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии / Мат. Всесоюзн. конф., Москва, 1986, с. 29-38.
26. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений и биотехнология на их основе. // Учебное пособие, М.: ФБК-Пресс, 1999, 160 с.
27. Вакуленко В.В., Гашников Э.Г., Янина М.М. Результаты испытаний Эмистима на капусте белокочанной, картофеле, яблоне зимних сортов, рисе и сахарной свекле.//Аграрная Россия, 1999, т.1-2, с. 27-35.
28. Васильева В.Е., Батыгина Т.Б. Культура in vitro зародышей и семядолей лотоса, изолированных на разных стадиях развития. // Физиол. раст., 1981, т. 28, №2, с. 319-327.
29. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция. // Мол. биол., 1991, т.25, №4, с. 926-936.
30. Ващенко С.Ф., Чекунова З.И., Савинова Н.И. и др., Овощеводство защищенного грунта. / М.: Колос, 1984, 272 с.
31. Винклер Г.Н., Бутенко Р.Г. Применение черенкования при выращивании безвирусных растений картофеля методом культуры меристемы //
32. Физиол. раст.,. 1970, т.17, N 4, с.851-853.
33. Вовк В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение ремонтантных форм малины методом in vitro. / Автореф. на соиск. канд. с.-х. н., Брянск, 2000, 20 с.
34. Волохов М.М. Совершенствование родительских форм малины ремонтантного типа на основе межвидовой гибридизации. / Автореф. на соиск. . канд. с.-х. н., Брянск, 2003, 23 с.
35. Высоцкий В.А., Попов Ю.Г., Трушечкин В.Г. Регенерация изолированных меристематических верхушек древесных растений. // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы / Сб. научных трудов НИ-ЗИСНП, 1976, т. 9, с. 89 100.
36. Высоцкий В.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные меристематические верхушки черной смородины. // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы / Сб. научных трудов НИЗИСНП, 1979, т. 9, с. 101-107.
37. Высоцкий В.А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение. // Сельскохозяйственная биология, 1983, №7, с. 42 47.
38. Высоцкий В.А. Усовершенствование способов получения растений малины из изолированных меристематических верхушек. // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы / Сб. научных трудов НИЗИСНП, 1984, с. 3-8.
39. Высоцкий В.А. Морфогенез и клональное микроразмножение растений. // Культура клеток раст. и биотехнол. / М.: Наука, 1986, с. 91 102.
40. Высоцкий В.А. Использование методов культуры изолированных тканей для оздоровления и ускоренного размн.плодовых и ягодных культур. // Селекц. Плод, и ягодн. культур, Новосибирск, 1989, с. 132 — 138.
41. Высоцкий В.А., Хамукова Ф.М. Возможности регенерации растений земляники и малины из каллусов различного происхождения. // Ягодоводство в Нечерноземье, 1993, с. 19 — 24.
42. Высоцкий В.А. О генетической стабильности при клональном мик-роразмнож. плодовых и ягодных культур // С/х. биол., 1995, N 5, с. 57-63.
43. Высоцкий В.А. Особенности клонального микроразмножения некоторых форм ремонтантной малины. // Плодоводство и ягодоводство России / Сб. научных трудов ВСТИСП, 1996, т.З, с. 90-95.
44. Высоцкий В.А., Бурдейная Т.В. Влияние селективных агентов на регенерационные процессы в культуре листовых дисков малины красной. // Садоводство и ягодоводство России, 1998, Т.5, С. 72 77.
45. Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных культур // Дисс. на соиск. уч. степ. докт. с.-х. наук, М., 1998, 321 с.
46. Высоцкий В.А., Карпова О.В., Янина М.М. Использование препаратов Эмистим и Экост 1/3 в технологиях микроклонального размножения ежевики // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2. с. 44 46.
47. Высоцкий В.А., Алексеенко JT.B. Чувствительность изолированных органов плодовых растений к Agrobacterium rhizogenes в культуре in vitro. // Плодоводство и ягодоводство России, 2001, Т.8, С. 154 157.
48. Гамбург К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений. Новосибирск, 1976,272 с.
49. Гельцер Ф.Ю. Приемы обработки желудей микоризным грибком и источники его получения. // Советская агрономия, 1951, № 11. с. 54 — 62.
50. Гельцер Ф.Ю. Эффективный стимулятор роста растений // Сельское хозяйство СССР, 1973, № 12, с. 46-51.
51. Ф.Ю.Гельцер. Симбиоз с микроорганизмами основа жизни растений. / М.: изд.МСХА, 1990, с. 135.
52. Глазко В.И., Глазко Г.В. Толковый словарь./Киев:КВИЦ, 2001, 580.
53. Глазко В.И., Глазко Г.В. Введение в генетику./ Киев: КВИЦ, 2003,640 с.
54. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений / Киев :Наукова думка, 1984, 160 с.
55. Говорова Г.Ф. Биотехнология в селекции земляники на устойчи вость к болезням. // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии / Тез. докл. конф., М., 1996, с. 16.
56. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Абдеев P.M., Кобец Н.С., Пиру-зян Э.С. и др. Новый репортерный ген для растений. // Тез. докл. IV съезда ВОФР, Москва, 1999, С. 760.
57. Головин С.Е. Корневые гнили малины в питомниках, причины возникновения и борьба с ними // Плодоводство и ягодоводство России. / Сб. трудов ВСТИСП. / М., 1986, т.2. с. 30 38.
58. Горьковцева Е.А., Юлдашев О.Х. Микроклональное размножение ценных сортов винограда. // Садоводство и виноград., 1991, N 11, с. 17-20.
59. Гринько Н.Н., Вялых А.К., Соколова JI.M., Ерошин В.К. Защитное и стимулирующее действие иммунофита на культуры томата и огурца в защищенном грунте. // Мир теплиц, 1998, №8, с. 62-63.
60. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений./ М.: Мир, 1986, с. 203-267.
61. Деменко В.И., Трушечкин В.Г. Размножение вишни методом in vitro // Сельскохоз. биол., 1983, N 7, с. 51-53.
62. Дерфлинг К. Гормоны растений. / М.: Мир, 1985, 303 с.
63. Джигадло М.И. Использование биотехнолгических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур. / Автореф. на соиск. канд. с.-х. н., Орел, 2003, 27 с.
64. Джонс О.П. Размножение хозяйственно важных древесных растений in vitro. // В кн.: Биотехнол. с/х растений, М., 1987, с. 134-152.
65. Долежел Й., Новак Ф.Й. Кариологические изменения в ходе дедиф-ференцировки клеток чеснока (Allium sativum)./ Культура клеток растений и биотехнология, М.: Наука, 1986, с. 20 24.
66. Дорошенко Н.И. Микроклональное размножение столового винограда сорта Агат Донской. // Садоводство и виноград., 1989, №3, с. 24 — 25.
67. Дорошенко Н.П., Кострикин И.А. Клональное микроразмножение столового винограда сорта Агат донской // Садоводство и виноградарство, 1989, №3, с. 37-40.
68. Дорошенко Н.П. Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда / Автореф. на соиск.докт. с.-х.н., 1999, 59 е.
69. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта./ М.: Колос, 1974, 416 с.
70. Дрейпер Дж., Скотт Ф., Армитидж Ф. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство / Под ред. Дж. Дрейпера, М.: Мир, 1991. 408 с.
71. Ежов М.Н., Прусакова Л.Д., Сальников А.И. Повышение продуктивности и повышение качества зерна гречихи под действием эмистима и эпибрассинлида.//Агрохимия, 1999, №5, с. 88-90.
72. Ежов М.Н., Прусакова Л.Д., Сальников А.И. Использование эмистима для улучшения плодообразования гречихи. // Регуляторы роста и развития растений. / Сб. тр. 5 междунар. конф., 1999, с. 180-181.
73. Ежов М.Н. Регуляция плодообразования гречихи эмистимом и эпи-брассинолидом для повышения продуктивности./ Москва, 1999,21 с.
74. Жукова П.С. Гербициды и стимуляторы роста в овощеводстве. / Минск, 1976, 47 с.
75. Жуков П.С. и Аниховская Т.Б. Использование регуляторов роста при выращивании огурцов // Хим. сельского хозяйства, 1991, N.5, с.28-31.
76. Жученко А.А. К проблемам научного овощеводства // Картофель и овощи, 2002, №2, с. 2-5.
77. Заулкова Н.П., Микроразмножение алычи // Проблемы интенсификации современного садоводства / Тез. конф., Мичур.,1990, с. 165-166.
78. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура незрелых зародышей миндаля от межвидовой гибридизации и свободного опыления. // Бюлл. Гл. бот. сада, 1980, т. 115, с. 85 90.
79. Здруйковская-Рихтер А.И. Культура in vitro зародышей хурмы от межвидовой гибридизации. // Бюлл. Гл. бот. сада, 1981, т. 121, с. 84 — 86.
80. Здруйковская-Рихтер А.И. Рост и дифференцировка изолированных зародышей бобовых растений in vitro. // Бот. журн., 1983, т. 70, №10, с. 1355- 1362.
81. Игнатьев Н.Н., Дозорцева Н.В. Оценка биологической активности стимуляторов роста растений по интенсивности поглощения кислорода системой почва растение. // Изв. ТСХА, 981, т. 1, с. 72-78.
82. Казаков И.В. Селекция малины в средней полосе РСФСР ./Тула: Приокск. кн. изд., 1989, 217 с.
83. Казаков И.В. Малина и ежевика / М., 1994. 114 с.
84. Казаков И.В., Рожнов Н.И., Евдокименко С.Н. Совершенствование исходных форм малины ремонтантного типа. // Генетика и наследование важнейших хозяйственных признаков плодовых растений, Мичуринск, 1994, с. 64-69.
85. Калашников Д.В. О некоторых результатах применения препарата Эмистим во Вьетнаме // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2, с. 47.
86. Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ.докт. биол. наук, М., МСХА, 2003.
87. Калашникова Е.А. Влияние факторов гормональной и негормональной природы на морфогенетический потенциал интактных растений пшеницы и в культуре in vitro.// Сельскохозяйственная биотехнология. Под ред. Шевелухи B.C., М.: Евразия+, 2001, т.2, с. 71-80.
88. Калашников Д.В. О некоторых результатах применения препарата Эмистим во Вьетнаме // Аграрная Россия. 1999. — 1-2.- С. 47.
89. Калинин Ф.Л. Биологически активные вещества в растениеводстве // Киев, «Наукова думка», 1984. 320 с.
90. Кан А.А. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. / М.: Колос, 1982, с. 495.
91. Катаева Н.В., Аветисова В.А. Клональное микроразмножение растений в культуре ткани. // Культура клеток растений, М.: 1981, с. 137 149.
92. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Принципы микроклонального размножения растений на примере герберы. // Изв. АН СССР, сер. Биология, 1982, №1, с. 126- 129.
93. Катаева Н.В. Особенности клонального микроразмножения трудно-укореняемых сортов яблони. // Сельхоз. биология, 1984, №4, с. 18 — 22.
94. Кефели В.И. Рост растений. / М.: Наука, 1984, 175 с.
95. Кефели В.И., Прусакова Л.Д. Химические регуляторы растений . Сер. Биология, М.,1985, 64 с.
96. Кефели В.И., Коф Э.М., Власов П.В., Кислин Е.Н. Природный ингибитор роста абсцизовая кислота. / М.: Наука, 1989, 184 с.
97. Кефели В.И., Власов П.В., Прусакова Л.Д. Природные и синтетические регуляторы онтогенеза растений // Итоги науки и техники, т.7 / М., ВИНИТИ, 1990, с.26-111.
98. Князева Т.П. Огурцы защищенного фунта. / М., Армада-пресс, 2001, 31 с.
99. Ковалев В.М., Шилова Е.В. Роль физиологически активных веществ в повышении адаптивной способности растений // Вестник с/х науки, 1987, №1, с. 74-78.
100. Ковалев В.М. Теоретические основы оптимизации формирования урожая. / М.: изд. МСХА, 1997, 284 с.
101. Ковалев В.М., Сей Хуей Гуан, Лей Юнь Бо. Применение фиторегу-ляторов при выращивании культуры огурца в Китае .// Аграрная наука, 1998, В.4, с. 45-46.
102. Ковалев В.М., Янина М.М. Методологические принципы и способы применения рострегулирующих препаратов нового поколения в растениеводстве. // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2, с. 9-12.
103. Ковалев В.М. Теория урожая. / М.гизд. МСХА, 2003, 332 с.
104. Козлова Л.Н., Гашников Э.Г., Богомаз В.И. Испытания биопрепаратов Эмистим и Экост 1/3 на хлопчатнике в условиях Таджикистана. // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2, с. 17-22.
105. Кордюм Е.Л., Недуха Е.М., Сидоренко П.Г. Структурно-функциональная характеристика растительной клетки в процессах диффе-ренцировки и дедифференцировки // Культура клеток растений и биотехнология. Киев: Наукова думка, 1980. - 112 с.
106. Коротаева М.С., Попов Ю.Г., Трушечкин В.Г., Ярославцев Е.И. О регенерации стеблевых верхушек малины. // Биологические науки, 1975, N 10, с. 133-136.
107. Корховой В.И., Радчук В.В., Бартиш И.В., Долгов С.В. Генетическая трансформация клона яблони сорта Флорина с помощью Agrobacte-rium tumefaciens.// Матер, междунар. конф. «Садоводство и виноградарство 21 века». Краснодар, 1999, ч.З, С. 138 141.
108. Кособрюхов А.А. Физиологические аспекты оптимизации выращивания огурца в защищенном грунте / Автореф. дисс. . канд. к.б.н., ЛГУ им. Жданова, Л., 1986, 16 с.
109. Кудрявцев Н.А., Янина М.М., Озерецковская O.JL, Богомаз В.И. Эффективность и безопасность применения препарата Экост в льноводстве. // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2, с. 22 27.
110. Кукина И.М., Микулович Т.П., Кулаева О.Н. Изменение синтеза хлоропластных белков и структуры хлоропластов семядолей тыквы под влиянием АБК. // Физиол. раст., 1995, Т. 42, №. 5, С. 686 695.
111. Кулаева О.Н. Цитокинины и их физиологическое действие. // Успехи совр. биол., 1967, Т. 63, №1, С. 28-53.
112. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции / М.: Наука, 1973,263 с.
113. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка. // XLI Тимиряз. Чтение., М, Наука, 1982, 83 с.
114. Кульневич В.Г., Калашникова В.Г., Ненько Н.И. и др. Новый стимулятор роста сладкого перца -препарат «Краснодар-1» / Рекомендации АПК Краснодарск. края, 1986, 5с.
115. Кульневич В.Г., Бадовская JI.A., Ненько Н.И. Новые перспективные регуляторы роста растений, полученные на основе фурфурола. // Регуляторы роста и развития растений: Сб. тез. докл. на всесоюзн. рабочем совещании. / 1991, с. 55.
116. Кучук Н.В., Каневский И.Ф. Методы генетической трансформации растений. // Биотехнология, 1987, т.З, с. 365 369.
117. Кучук Н.В. Выделение и культивирование протопластов 5 видов бобовых // Физиол. раст., 1989, Т.36, С. 821 824.
118. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений. / Киев.: Наукова думка, 1997, 152 с.
119. Латашко В.М., Бадовская JI.A., Ненько Н.И. Эффективность применения препарата Кавказ на яровой пшенице // Регуляторы роста и развития растений: Сб. тез. докл. на IV междунар. конф., 1997, с.194.
120. Лебедев В.Г, Долгов С.В. Влияние селективного агента и растительного интрона на эффективность трансформации и экспрессию гетеро-логичных генов в растениях груши (Pyrus commynis). // Генетика, 2000, Т 6, №6, С. 792-798.
121. Лутова Л.А., Бондаренко Л.В., Бузовкина И.С., Левашина Е.А., Ти-ходеев О.Н., Ходжайова Л.Т., Шарова Н.В., Шишкова С.О. Влияние генотипа на регенерационные процессы // Генетика. 1994. - Т. 30, №8. - С. 1065-1074.
122. Лутова Л.А., Проворов Н.А., Шишкова С.О. Генетика развития цветка. / Генетика развития растений // СПб.: Наука, 2000, с. 201-255.
123. Лутова Л.А. Взаимодействие растений с агробактериями: концепция генетической колонизации. // Генетика развития растений // СПб.: Наука, 2000, с. 388-438.
124. Лычкин В.В. Совхоз-комбинат «Московский»: опыт индустриального выращивания овощей в теплицах // М.:Моск. рабочий, 1986, 112 с.
125. Майсурян Н.А., Атабекова А.И. Люпин. / М.: Колос, 1974, 463 с.
126. Макеев А.В., Кузнецов В.В., Оельмюллер Р., Кренделева Т.Е., Мок-роносов А.Т., Кулаева О.Н. Лимитирующая стадия формирования фотосинтетического аппарата в процессе зеленения изолированных семядолей люпина. // Физиол. раст., 1994, Т. 41, №.5, С. 668 674.
127. Марышев Н.В„ Сучкова Л.В., Калимулина Э.Ш. Влияние регуляторов роста на урожайность огурца и томата в весеннем пленочных теплицах // Проблемы аграрного сектора Южного Урала и пути их решения, Челябинск, 1999, вып. 1, с. 47 -51.
128. Матвеева Т.В., Лутова Л.А., Нестор Ю. Опухолеобразование у растений. // Генетика, 2001, т 37, №9, с. 1188 1197.
129. Машкина О.С., Буторина А.К. Генетическая инженерия лесных древесных растений. // Генетика, 2003, т. 39, №3, с. 309 -317.
130. Мельников Н.Н., Баскаков Ю.А. Химия гербицидов и регуляторов роста растений. /М.:Госхимиздат, 1962, 724 с.
131. Меркулов С.М., Бартиш И.В., Долгов С.В., Пастернак Т.П., Макхь-юген А. Генетическая трансформация груши (Pyrus communis L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens. // Генетика, 1998, т.34, № 3, с. 373 378.
132. Микулович Т.П., Кукина И.М., Кулаева О.Н. Влияние теплового шока и цитокинина на позеленение изолированных семядолей тыквы. // Докл. АН/РАН, 1999, Т. 365, №2, С. 270 272.
133. Мироненко А.В. Биохимия люпина. / Минск: Наука и техника, 1978,310с.
134. Михальчик Л.С. Ускоренное выращивание посадочного материала яблони для интенсивных насаждений Нечерноземной зоны РСФСР // Ав-тореф. дисс. канд. с.-х. наук., М., 1990, 23 с.
135. Морозова Э.В., Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Новикова Г.В., Моисеева Т.В. Изучение влияния картолина на устойчивость пшеницы к засухе и активацию в листьях РНК-полимеразы. // Бюлл. ВИУА, 1990, Т.94, С. 37-41.
136. Муратова С.А., Фирсов Ф.П., Долгов С.В. Разработка методов регенерации и генетической трансформации сливы домашней (Использование в селекции). // Молодые ученые — садоводству России., М., 1995, С. 30-32.
137. Муратова С.А., Долгов С.В., Фирсов Ф.П. Генетическая трансформация сливы домашней с использованием Agrobacterium tumefaciens. // Бюлл. Научн. инф. ВНИИ генетики и селекции плодовых ратсений, 1998, В. 53, С. 3-8.
138. Муромцев Г.С. Регуляторы роста растений./ М.:Колос, 1979, 247 с.
139. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основыхимической регуляции роста и продуктивности растений. / М.: ВО «Агро-промиздат", 1987, 383 с.
140. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйств. биотехнологии. //М.: Агропромиздат, 1990, 430 с.
141. Муромцев Г.С., Данилина Е.Э. Эндогенные химические сигналы растений и животных: сравнительный анализ // Успехи совр. биологии, 1996, т. 116, в. 5, с.533-551.
142. Мусийчук К.А. Бифункциональные репортерные системы для про-и эукариот на основе делеционного варианта термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum. / Автореф. на соиск. . канд б.н., 2001, 20 с.
143. Муштакова В.М., Фомина В.А., Роговин В.В., Богомаз В.И., Янина М.М. Применение метода хемилюминесценции для изучения иммуностимулирующего действия Экоста и Эмистима. // Аграрная Россия, 1999, т.1-2,. с. 13-15.
144. Наумов Н.П. От молекулы до человека./ М.: Просвещение, 1973, с. 362-366.
145. Ненько Н.И., Косулина Т.П., Арустамова И.С., Поспелова Ю.С., Алехина Е.М. Действие 2-(фурил-2)-1,3-диоксалана на семена черешни. // Химия и технология фурановых соединений,-1985, с. 91-87.
146. Ненько Н.И., Поспелова Ю.С. Некоторые аспекты воздействия препарата фуролан на биологические процессы плодовых косточковых культур // Регуляторы роста и развития ратсений / Сб. тез. докл. на II междунар. конференции, 1993, с. 211.
147. Ненько Н.И., Поспелова Ю.С. Влияние препарата фуролан на засухоустойчивость яблони и груши // Регуляторы роста и развития растений / Сб. тез. Докл. на III междунар. конф, 1995, с. 169.
148. Ненько Н.И., Поспелова Ю.С., Косулина Т.П. Эффективность применения экологически чистого регулятора роста фуролан на озимой пшенице // Регуляторы роста и развития растений / Сб. тез. Докл. на III междунар. конф., М., 1995, с. 86-87.
149. Ненько Н.И., Поспелова Ю.С., Котляров В.В. Влияние препарата фуролан на развитие внутренней и внешней инфекции Fusarium graminearum семян озимой пшеницы // Регуляторы роста и развития растений: Сб. тез. докл. на IV междунар. конф. / М., 1997, б, с. 217.
150. Ненько Н.И., Поспелова Ю.С., Котляров В.В., Бурдун A.M. Изучение влияния препарата фуролан на устойчивость пшеницы к поражению фузариозом // Теоретические основы производства экологически чистых продуктов растениеводства / Краснодар, 1997, в, с. 13-21.
151. Ненько Н.И. Действие на растения регуляторов роста, синтезированных на основе фурфурола. / Автореферат на соиск. уч. степ. докт. с/х наук, 1999, Краснодар, 48 с.
152. Никелл Л.Дж. Регуляторы роста растений. Применение в сельском хозяйстве. / М.: Колос, 1984, 192 с.
153. Николаева М.Г. Покой семян и факторы, его контролирующие. -Физиол. и биохимия покоя и прораст. семян. / М.: Колос, 1982, с. 72 98.
154. Норишина М.В., Клочкова И.Н., Суслова Т.А., Хатаева Л.Ю. Новые регуляторы роста на основе фурфурола.// Тезисы Междунар. конф. «Развитие научного наследия акад. Н.И. Вавилова». Саратов, 1997, ч.2, с. 260-262.
155. Нурметов Р.Д., Микелян Г.А., Прянишников Л.Н. Защищенный грунт интенсивная отрасль. // Картофель и овощи, 2001, №5, с. 24-25.
156. Олешко Е.В. Особенности клонального микроразмножения подвоев и сортов вишни. / М., 1985, с. 25-28.
157. Острейко С.А., Дроздовский И.М. О полифункциональности регуляторов роста и разв. растений. // С/х. биол., 1981, т. 7, N. 5, с. 702-711.
158. Оурецки Д.К. Малина и ежевика. // Advances in fruit breeding / Ed. JJanick, J.N.Moore, 1975, p.142-180.
159. Павлова M.K., Банникова В.П. Преодоление перекрестной несовместимости при отдаленной гибридизации методом культуры незрелых гибридных семян. // С/х биол., 1974, т. 9, № 1, с. 23 27.
160. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды агробактерий и генетиче екая инженерия растений. / М.: Наука, 1985, 289 с.
161. Полевой В.В. Фитогормоны. Л., 1982, 288 с.
162. Пондева Р., Загорска Н. Использование методов in vitro для преодоления стерильности межвидового гибрида Capsicum annuum х С. praetermissum // В кн.: Культура клеток растений и биотехнология. / М.: Наука, 1986, с. 171-176.
163. Пономаренко С.П., Боровикова Г.С., Анишин А.А., Деева В.П. Композиции биостимуляторов. // Сахарная свекла, 1996, №5, с. 20-23.
164. Пономаренко С.П. Гашников Э.Г. Определение типа физиологической активности Эмистима с использованием специфических биотестов.// Аграрная Россия, 1999, т.1-2, с.15-16.
165. Попов Г.Д., Трушечкин В.Г. Получение растений земляники методом культуры изолированных верхушек побега. // Плодоводство и ягодо-водство нечерноземной полосы / Сб. научных трудов НИЗИСНП., М., 1972, т.4. — с. 184-193.
166. Попов Ю.Г. Культура in vitro меристематических верхушек стебля как метод оздоровления и размножения растений. // Биологические науки, 1976, №6, с. 13-24.
167. Попов Ю.Г., Высоцкий В.А. Культура стеблевых верхушек in vitro как метод ускоренного размножения плодовых и ягодных растений. // Вестник с.-х. науки, 1978, №4, с. 124 — 127.
168. Попов Ю.Г. Оздоровление и размножение плод, и ягодных раст. методом культуры меристем, верхушек. //Метод, указания, М., 1979.
169. Прусакова Л.Д., Чижова С.И., Третьяков Н.Н., Агеева Л.Ф., Голан-цева Е.Н., Яковлев А.Ф. Антистрессовые функции Экоста и эпибрассино-лида на яровой пшенице в условиях центральной нечерноземной зоны. // Аграрная Россия, 1999, т.1-2., с. 39 41.
170. Пугаев С.В. Снижение содержания нитратов в плодах огурца при обработке растений кинетином. // Агрохимия, 1990, №10, с. 109-112.
171. Пугаев С.В. Фототехнические методы снижения нитратов в продукции растениеводства. // Изв. Тимирязевской с/х академии, 1992, вып. 6, с.174- 179.
172. Пугаев С.В., Пугаев А.В. Динамика содержания нитратов в растущих огурцах и его регуляция. / Приемы повышения продуктивности растениеводства в нечерноземной зоне России.- изд. Мордовс. унив-та, 1992, с. 116-119.
173. Рожнова Н.А., Геращенков Г.А., Янина М.М., Гилязетдинов Ш.Я. Эмистим индуктор устойчивости к вирусным болезням пасленовых. // Аграрная Россия, 1999, т. 1-2, с. 35-38.
174. Розанова М.А. Ягодоведение и ягодоводство / М., 1935, с. 135-148.
175. Рукавцова Е.Б., Золова О.Э., Бурьянова Н.Я., Борисова В.Н., Быков В.А. Бурьянов Я.И. Анализ трансгенных растений табака, содержащих ген пов. антигена вируса гепатита В. // Генетика, 2003, т.39, № 1, с. 51 -56.
176. Русанов В.А., Паршин В.Г. Применение биологически активных веществ для получения дополнительного урожая огурца и повышения его устойчивости к фузариозу. //Всероссийский съезд по защите растений, С.Петербург, 1995, с. 455.
177. Селиванкина С.Ю., Муромцева Д.Г., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. Регуляция фузикокцином протеинкиназ, ассоциированных с хроматином и РНК-полимеразой 1. // Докл. ВАСХНИЛ, 1990, Т.З, С. 2-4.
178. Симола Л.К. Каллусные культуры и размножение березы in vitro. // Культура клеток растений и биотехнология / М.: Наука, 1986, с.102 — 106.
179. Соболев A.M. Запасание белка в семенах растений.// М.: Наука, 1985, 111с.
180. Старых Г.А. Эффективность минеральных удобрений при выращивании огурца в зимних теплицах // ВСХИЗО агропромышленному комплексу, М., 1994, с. 10-12.
181. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных животных: методы изучения и перспективы использования // Успехи совр. генет., 1993, с. 3 — 35.
182. Суриков И.М. Несовместимость и эмбриональная стерильность растений. / М.: ВО Агропромиздат, 1991, 218 с.
183. Стрыгина О.В. Размножение новых сортов малины методом культуры тканей. // Достижения науки — в практику / Тез. докл. конф. (27 29 апреля 1990), М., 1990, с. 123 - 124.
184. Тараканов Г.И., Мухин В.В. Овощеводство. / М.:Колос, 1993, 511 с.
185. Титова И.В. Преодоление постгамной несовместимости в скрещиваниях лука репчатого с дикими видами методом культуры зародышей. // Культура клеток растений и биотехнология / М., Наука, 1986, с. 195 198.
186. Томилин А.А., Упадышев М.Т. М. К вопросу об эффективности оздоровления растений малины красной от вируса мозаики резухи с использованием метода культуры меристем. // Ягодоводство в Нечерноземье, М, 1993, с.25 — 29.
187. Третьяков Н.Н. Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений. /М.:Колос, 2000, 640 с.
188. Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А., Леонтьев-Орлов О.А. Размножение клоновых подвоев яблони методом культуры тканей. // Сельскохоз. биол., 1992, N4, с. 455-457.
189. Туровская Н.И., Стрыгина О.В. Микроклональное размножение малины. // Садоводство и виноградарство, 1990, N 8, с. 26-29.
190. Тюленев В.М., Нафталиев П.М., Осипова П.В., Расторгуев С.Л. Способ укоренения побегов яблони in vitro. // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина., 1990, Вып. 48, с. 34-36.
191. Тюленев В.М., Расторгуев С.Л., Туровский И.И. Получение растений регенерантов из изолированных тканей земляники. // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина, 1991, Вып. 50, с. 21-27.
192. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Размножение ежевики и малины черной методом культуры тканей. // Садоводство и виноградарство, 1991, №6, с. 24 27.
193. Упадышев М.Т. Клональное микроразмножение и особенности растений ежевики и малины черной методом in vitro. // Дисс. .канд.с.-х.наук, 1992, 211 е.
194. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Совершенствование процесса клонального микроразмножения ежевики и малины черной. // Совершенствование технологии выращивания ягодных культур в Нечерноземье, М., 1992,.с. 42-53.
195. Упадышев М.Т Клональное микроразмножение некоторых нетрадиционных культур рода Rubus. // Ягодоводство в Нечерноземье, М., 1993, с. 10-18.
196. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Регенерационная способность эксплантов рода Rubus в зависимости от длительности культивирования in vitro.//Сельскохозяйственная биология, 1995, №1, с. 85-88.
197. Филипеня B.JL, Брель Н.Г., Попович Е.А., Долгов С.В. Влияние ти-диазурона на регенерацию адвентивных побегов из листовых эксплантов клюквы крупноплодной. // Регуляция роста, развития и продуктивности растений. / Минск, 1999, С. 117 118.
198. Фурманова М., Совинска Д., Олендэка Г. Регенерация растений путем эмбриогенеза из каллуса тмина обыкновенного (Carum carvi (L.). // Культура клеток растений и биотехнология / М.: Наука, 1986, с. 127 128.
199. Хапова С.А. Условия культивирования in vitro и последующая продуктивность растений земляники. // Автореф. дисс. канд. с.-х. наук,-М., 1997, 23 с.
200. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельско-хоз. биол., 1997, №5, с. 3-21.
201. Хайдекер У. Стресс и прорастание семян: агрономическая точка зрения. // Физиология и биохимия покоя и прорастания семян. / М.: Колос, 1982, с. 273-319.
202. Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro. // Биотехнология сельскохозяйственных растений, 1987, с. 105 — 133.
203. Холл М.А., Новикова Г.В., Мошков И.Е., Мур Л.А.Дж., Смит А.Р. Протеинкиназы растений в трансдукции абиотических и биотических сигналов. // Физиол. раст., 2002, Т. 49, №1, С. 121 135.
204. Хомчак A.M. Влияние предпосевной обработки семян регуляторами роста на продуктивность растений огурца в теплице. // Пути интенсификации овощеводства, 1987, с. 63-65.
205. Хомчак A.M. Влияние предпосевной обработки семян регуляторами роста ивин и его солями на рост, развитие и продуктивность огурцов в зимних теплицах. // Овощеводство и бахчеводство, 1989, № 34, с.56-58.
206. Хотылева Л.В., Савченко А.П. Генетика люпина./ Минск: Наука и тезника, 1988, с. 183.
207. Читра Поннаммал Манн. Влияние новых регуляторов роста и уровня азотного питания на урожай и качество плодов огурца в закрытом грунте. / Автореф. дисс. . канд. с/х наук, РУДН, 1995, 18 с.
208. Шамина З.Б. Андрогенез и получение гаплоидов в культуре пыльников и микроспор. / Культ, клеток раст., М.: Наука, 1981, с. 124 — 136.
209. Шевелуха B.C., Ковалев В.М., Груздев Л.Г., Блиновский И.К. Регуляторы роста растений в сельском хозяйстве. // Вестник с.-х. науки, 1985, №9, с. 57-65.
210. Шевелуха B.C., Ковалев В.М., Лезжова Т.В. Эффективность действия регуляторов роста картолина на продуктивность ярового ячменя в условиях почвенной засухи. // С.-х. биология, 1987, №9, с. 3 — 6.
211. Шевелуха B.C., Шанбанович Г.Н., Тальчук J1.C. Защитная функция картолина при выращивании ячменя в неблагоприятных условиях. // Регуляторы роста растений, М.: Агропромиздат, 1990, с. 45- 52.
212. Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. / М.: Колос, 1992.
213. Шевелуха B.C., Ковалев В.М., Курапов П.Б. Регуляторы роста и проблемы селекции растений. // Физиол. основы селекции. Теорет. основы селекции, т.2, ч.1., С-Пб.: ВИР, 1995, с. 259-292.
214. Шевелуха B.C. Современные проблемы гормональной регуляции живых систем и организмов. // Регуляторы роста и развития растений / Сб. тез. докл. III конф., М., 1997, с. 3-4.
215. Шевелуха B.C., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В., Кочиева Е.З., Прокофьев М.И., Новиков Н.Н., Ковалев В.М., Калашников Д.В. Сельскохозяйственная биотехнология. // М.: Высшая школа, 1998, 416 с.
216. Шевелуха B.C. Проблемы, приоритеты и масштабы сельскохозяйственной биотехнологии в XXI веке. / Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. Шевелухи B.C., М.: Евразия +, 2000, с. 3 — 16.
217. Шевелуха B.C. Трансгеноз и биобезопасность. // Сельскохозяйственная биотехнология / Под ред. Шевелухи B.C., М.:Воскресенье, 2000, с
218. Щелкунова С.Е., Попов Ю.Г. Получение свободных от вируса растений малины путем культуры изолированных апексов. // Физиол. раст., 1970, т.17, N 3, с.618-622.
219. Шишов А.Д. Регуляция роста, развития и продуктивности растений основных овощных культур открытого и защищенного грунта (Применение регуляторов роста и развития растений). / Автореф. дисс. докт. с.-х. н., С.Петербург. ГАУ, Пушкин, 1994, 44 с.
220. Шкиперова О.М. Влияние некоторых физических и химических факторов на рост и продуктивность огурца и томата в регулируемых условиях. / Автореф. дисс.канд. с.-х. н., С.-Петерб. ГАУ, Пушкин, 1994, 18 с.
221. Abbot A.J. Propagating temperate woody species in tissue cultures. // Sci.Hort., 1977, N.28, P. 4.
222. Anderson W.C. Tissue culture propagation of red and black raspberry, Rubus idaeus and Rubus occidentalis.// Acta hort., 1980, V.l 12, P. 13-20.
223. Apostol J., Heinstein P.F., Low P.S. Rapid stimulation of oxidative burst during elicitation of cultured plant cells // J.Plant Physiol., 1990, V. 39, P. 109-116.
224. Atkinson R.G., Schroder R., Hallett I.C., Cohen D., Elspeth A.M. Overex-pression of polygalacturonase in transgenic apple trees leads to a range of a novel phenotypes involving changes in cell adhesion. // Plant Physiol., 2002, V. 129, P. 122-133.
225. Baker В., Bhatia S. Factors effecting adventitious shoot regeneration from leaf explants of quince (Cydonia oblonga) // Plant cell, tissue and organ culture, 1993.- V. 35. P. 273 - 277.
226. Bakker J.C. Effects of humidity of on stomatal density and its relation to leaf conductance// J. Hort. Sci SI., 1991, P.205-212.
227. Barcelo M., El-Mansouri I., Mercado J.A., Quesada M.A., Alfaro F.P. Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler // Plant cell, tissue and organ culture. 1998, V. 54. - P. 29-36.
228. Belfanti E., Tartarini S., Patocci A., Zhu J. The HcrV£2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated variety. // PNAS USA, 2004, V.101, N.3, P.886 890.
229. Boxus P.H. The production of strawberry plants by in vitro micropropa-gation // J. Hort. Sci., 1974, V. 49., P. 209 210.
230. Boxus P., Quoirin M., Laine J.M. Large scale propagation of strawberry plant from tissue culture. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Springer-Verlag.- Berlin, Heidelberg, New York, 1977, P. 130-143.
231. Broome O.C., Zimmerman R.N. In vitro propagation of blackberry. // HortScience., 1978, V.13, N.2, P. 151-153.
232. Brown P., Tanksley S.D. Characterization and genetic mapping in simple sequence repeats in the tomato genome. // Mol. Gen. Genet., 1996, V.250, p. 3949.
233. Carbanne F., Martin-Tanquy J. & Martin C. Phenolamines associees a l'induction florale et a l'etat reproducteur.// Physiotogie Vegetale, 1977, V. 15, P. 429-43.
234. Cekis C., Battey N.H., Wilkinson M.J. The potential of ISSR-PCR primer-pair combinations for genetic linkage analysis using the seasonal flowering lokus on fragaria as a model. // Theor Appl Genet, 2001, V. 103, P. 540 — 546.
235. Chandler S.F., Radolsky E., Pua E. Some morphogenetic effects of sodium sulfate in tobacco callus // Plant cell tissue organ cult., 1987, V.l 1, P. 141 150.
236. Chauvin J.E., Hamann H., Cohat J., Le Nard M. Selective agents and marker genes for use in genetic transformation of Gladiolus grandiflorus and Tulip gesneriana // Acta hort., 1997, V. 430, P. 291 297.
237. Chauvin J.E., Marhadour S., Cohat J., Le Nard M. Effect of gelling agents on in vitro regeneration and kanamycin efficiency as a selective agents in plant transformation procedures // Plant cell tissue organ cult., 1999, V.58, P. 213-217.
238. Chevreau E., Skirvin R.M., Abu-Qaoud H.A., Korban S.S., Sullivan J.G. Adventitious shoot regeneration from leaf tissue of three pear (Pyrus sp) culti-vars in vitro // Plant cell reports, 1989, V.7, P.688-691.
239. Dandekar A.M., McGranaham G., Uratsu S., Leslie C., James D.J. et al. Engineering for apple and walnut resistance to codling moth // Pest and diseases, 1992, P. 741-746.
240. Davies F.T., Joiner J.N. Growth regulator effects on adventitious root formation in leaf cuttings of juvenile and mature Ficus pumila // J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1980, V. 105, P. 91 -95.
241. Echt C.S., May-Marquardt P., Hsein M., Zahorchak R. Characterization pf microsatellite markers in eastern white pine. // Genome, 1996, V. 39, P. 1102 -1108.
242. Echt C.S., May-Marquardt P. Survey of microsatellite DNA in pine. // Genome, 1997, V. 40, P. 9 17.
243. Eeuwens C.L., Schwabe W.W. Seed and pod wall development in pisum sativum L. in relation to extracted and applied hormones //J. Exp. Bot. 1975.V.26. N.90. P. 1-14
244. Evans D.A. Somaclonal variation genetic basis and breeding applications // Trends genet., 1989, V. 5, P. 46, 50.
245. Fasolo Z., Zimmerman R.H., Fordham I. Adventitious shoot formation on excised leaves of an in vitro grown apple cultivar // Plant cell tissue organ cult., 1989, V. 16, P. 75-87.
246. Fiola J.A., Swartz H.J. Somatic embryogenesis, organogenesis and proliferation in vitro from Rubus embryos // Acta hortic., 1986, V. 183, P. 91 -96.
247. Fiola J.A., Swartz H.J., Hassan M.A., Bors R.H., Mc Nicol R.J. Effect of thidiazuron, light fluence rates and kanamycin on shoot organogenesis from excised Rubus cotyledons and leaves // Plant cell tissue organ cult., 1990, V. 20, P. 223-228.
248. Gheysen G., Dhase P., VanMontagu M. & Schell J. DNA flux across genetic barriers: the crown gall phenomenon // Plant gene res.:genetic flux in plants. Ed. B. Hohn, E.S. Dennis. New York : Springer - Verlag, 1985, P. 1147.
249. Gortner G., Nenno M., Weising K., Zink D., Nagl W., Kahl G. Chromosomal localization and distribution of simple sequence repeats and the Arabi-dopsis tipe telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L. // Chromo Res, 1998, V.6, P. 97-104.
250. Graham J., McNicol R.J., Greig K., Van de Ven. Identification of red cultivars and an assessment of their relatedness using fingerprints produced by random primers. // J. Hort. Sci, 1994, V. 69, P. 123 130.
251. Graham J., McNicol R.J., Greig K. Towards genetic based insect resistance in strawberry using the cowpea tripsin inhibitor gene // Ann. Appl. Biol., 1995, V. 127, P. 163- 173.
252. Graham J.A., Iasi L., Millam S. Genotype-specific regeneration from a number of Rubus cultuvars // Planr cell org. Cult., 1997, V.48, P. 167-173.
253. Graham J., Gordon S.C., McNicol R.J. The effect of the CpTi gene in strawberry against attack by vine weevil (Otiorhynchus sulcatus F. Coleoptera: Curculionidae) // Ann. Appl. Biol., 1997, V. 131, P. 133 139.
254. Gresshoff P.M., Doy C.H. Development and differentiation of haploid Lycopersicon esculentum (tomato) // Planta, 1972, V. 107, P. 161 -170.
255. Hammerschlag F.A., Bauchan G., Scorza R. Regeneration of peach plants from callus derived from immature embryos // Theor. Appl. Genet., 1985, V. 70, P. 248-251.
256. Hammerschlag F., Liu Q., Zimmerman R. Generation apple transformation free of Agrobacterium tumefaciens by vacuum infiltration with an acidified medium and with antibiotics. // Acte hort. Proc., 2000, V. 530, P. 103 108.
257. Hicks G.S. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination // Bot. Rev., 1980, 46, P. 1 -23.
258. Hilder V.A., Gatehouse A.M., Sheerman S.E., Barker R.F., Boulter D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tabacco // Nature, 1987, V. 330, P. 160-163.
259. Hiratsuka S., Katagari M. Shoot and callus formation in explants from immature seeds of Japanese pear // Sci Hortic,1988, V. 34, P. 193 -199.
260. Hodges Т.К., Kamo K.K., Imbrie C.W., Becwar M.R. Genotype specificity of somatic embryogenesis and regeneration im maize // BioTechnology, 1986, V. 4, P. 219-223.
261. Hood D.W., Deadman M.E., Jennings M.P., Bisercic M., Fleischman R.D., Venter J.C., Moxon E.R. DNA repeats identify novel virulence genes in Haemophyllus influenzae. // Proc Natl Acad Sci USA, 1996, V. 93, P. 1112111125.
262. Horsch R.B., Fry J., Hoffman N. A simple and general method for trans-fering genes into plants // Science, 1985, V. 227, P. 1229-1231.
263. Huetteman C.A., Preece J.E. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture // Plant cell, tissue and organ culture, 1993, V.33, P. 9-17.
264. Hussey G. & Stacey N.J. In vitro propagation of potato (Solanum tuberosum L.). //Annals of Botany, 1981, V.48, P. 787-96.
265. James D. J., Newton B. Auxin: citokinin interactions in the in vitro micropropagation of strawberry plant. // Acta Hort., 1977, V.78, P. 321-331.
266. James D.J. The role of auxins and phloroglucinol in adventitious root formation in Rubus and Fragaria grown in vitro // J. Hort. Sci., 1979, V. 54, P. 273 -277.
267. James D.J. , Knight V.H., Thurbon I.J. Micropropagation of red raspberry and the influence of phloroglucinol //Sci. Hort., 1980, V.12, P.313-319.
268. James D.J., Newton B. Auxin: cytokinin interactions in the in vitro micropropagation of strawberry plants // Acta hort., 1988, V. 78, P. 321-331.
269. James D.J., Passey A.J., Barbara D.J., Bevan M.W. Genetic transformation of apple (Malus pumilla Mill.) using a disarmed Ti-binaiy vector // Plant cell rep., 1989, V.7, P. 658 661.
270. James D.J., Passey A.J., Barbara D.J., Bevan M.W. Genetic transformation of apple (Malus pumila Mill.) using a disarmed Ti-binaiy vector // Plant Cell Reports, 1989, V. 7, P. 658 -661.
271. James D.J., Passey A.J., Barbara D.J. Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry (Fragaria x anannassa Duch.) using disarmed binary vectors // Plant science, 1990, V. 69, P. 79 94.
272. Johnson R., Narvaez J., Ryan C.A. Expression of proteinase inhibitors I and II in transgenic tobacco plants: effects on natural defence against Mandula sexta larvae // PNAS USA., 1989, V. 86, P. 9871 9875.
273. Jones O.P. Effect of phloridzin and phloroglucinol on apple shoots // Nature, 1976, V. 262, P. 392 393.
274. Jones O.P., Waller В .J., Beech M.G. The production of strawberry plants from callus cultures // Plant cell tissue cult., 1988, V. 12, P. 235 241.
275. Kerns H.R., Meyer M.M.Jr. Tissue culture propagation of Acer x Freemanii using thidiazuron to stimulate shoot tip proliferation // Hort Science, 1986, V. 21, P. 1209- 1210.
276. Korban S.S., Skirvin R.M. In vitro shoot regeneration fron an intact and sectioned embryo axis of apple seed // Plant Scie, 1985, V. 39, P. 61 66.
277. Mante S., Scorza R., Cordts J.M. Plant regeneration from cotyledons of Prunus persika, Prunus domestica, Prunus cerasus. // Plant cell tissue org.cult.,1989, V.19, P. 1-11.
278. Matsuta N., Hirabayashi T. Embryogenic cell lines from somatic embri-ous of grape (Vitis vinifera L.). // Plant cell rep., 1989, V.7, P.684 687.
279. McGranaham G.H., Leslie C.A., Uratsu S.L., Dandekar A.M. Improved efficiency of the walnut somatic gene transfer system // Plant Cell Reports,1990, V. 8, P. 512-516.
280. McNicol R.J., Graham J. In vitro regeneration of Rubus from leaf and stem segments // Plant cell tissue organ cult., 1990, V. 21, P. 45 50.
281. Millan-Mendoza В., Graham J. Organogenesis and micropropagation in red raspberry using forchlorfenuron (CPPU) // J. Hort. Sci & Biotech., 1999, V. 74, N. 2, P. 219-223.
282. Morgante M., Oliveri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in rice.//Plant J., 1993; V. 3, P. 175- 182.
283. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant., 1962, V. 15, P. 473 497.
284. Murashige T. Plant propagation through tissue cultures // Ann. Rev. Plant Physiol., 1974, V. 25, P. 135 166.
285. Murashige Т. Plant cell and organ cultures as horticultural practices. // Acta Hort., 1977, V. 78, P. 17-30.
286. Murata M., Haruta M., Murai N., Itoh Y. Transgenic apple (Malus x do-mestica) shoot showing low browning potential. // J. agric. Food chem., 2000, V. 48, N.l 1, P. 5243-5248.
287. Nap J.P., Bijvoet J., Stiekema W.J. Biosafety of kanamycin resistant transgenic plants // Transgenic res., 1992, V. 1, P. 239 - 249.
288. Nehra N.S., Stushnoff C., Kartha K.K. Direct shoot regeneration from strawberry leaf disks// J. Amer. Soc. Hort. Sci.,1989, V. 114, P. 1014 1018.
289. Nehra N.S., Chibbar R.N., Kartha K.K., Datla R.S.S., Crosby W.L., Stushnoff C. Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants // Plant cell rep., 1990, V. 9, P. 10-13.
290. Nehra N.S., Chibbar R.N., Kartha K.K., Datla R.S.S., Crosby W.L., Stushnoff C. Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefa-ciens using a leaf disc regeneration system 1990, V. 9.- P. 293 — 298
291. Nienwkirk K., van Fordham J., Zimmerman R.H. Tidiazuron stimulation of apple shoot proliferation in vitro. // Hort. Sci., 1987, V. 21, P. 516-518.
292. Oosawa K.K., Takayanagi K. High yielding variants in strawberry derived from anther culture // Abstr. 5 Int. congr. Plant tissue cell cult., Tokio, 1982, P. 121.
293. Owens у de Novoa C. Empirical evalution of in vitro media components for cell growth and shoot regeneration from rubus explants II New Zealand Natural Sci. 1992, V. 19. - P. 79 - 86.
294. Parsons B.J., Newbury H.J., Jackson M.T., Ford-Lloyd B.V. Contrasting genetic diversity relationships are revealed in rice using different marker types. // Mol Breed, 1997, V. 3, P. 115 125.
295. Pedersen C., Rasmussen S.K., Linde-Laursen I. Genome and chromosome identification in cultivated barley and related species of the Triticeae by in situ hybridization with the GAA satellite sequence. // Genome, 1996, V. 39, P. 93 - 104.
296. Phillips I.D.J. Apical dominance. Annual Review of Plant Physiology. / 1975, V.26, P. 341-67.
297. Pyott J.R. Converse R.H. In vitro propagation of heat-treated red rasp-beny clones //HortSci.,1981, V. 16, P. 308-309.
298. Powell W., Machray G.C., Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. // Trends plant Sci, 1996, V. 1, P. 215 222.
299. Preece J.E., Huetteman C.A., Puello C.H., Neuman M.C. Influence of thidiazuron on in vitro culture of woody plants // HortScience, 1988, V. 22, P. 1071.
300. Reed B.M. Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage of strawberry germplasm. // Plant cell reports, 1991, V.10, P.431-434.
301. Sarwar M, The effect of different media and culture technicques oh planting efficiency of strawberry mesophyll cells in culture. // Physiol. Plant., 1984, V. 60, P. 57-60.
302. Schmidt Т., Heslop-Harrison J.S. The physical organization of micro-satellites in sugar beet. // Proc Nat Acad Sci USA, 1996, V. 93, P. 8761 8765.
303. Scoog F., Armstrong D.J. Cytokinins // Ann. Rev. Plant physiol., 1970, V. 21, P. 415-444.
304. Scott Т.К. Auxins and roots // Ann. Rev. Plant physiol., 1972, V.23, P. 235-258.
305. Snir I. Red raspberry (Rubus idaeus). In Biotechnology in Agriculture and Foresty 6: Crops II (Ed. Y.P.S. Bajaj), Springer-Verlag, Berlin, P. 124 -141.
306. Sorvari S., Ulvinen S., Hietaranta Т., Hiirsalmi H. Preculture medium promotes direct shoot regeneration from micropropagatied strawberry leaf disks //Hort Science, 1993, V. 28, N.l, P. 55-57.
307. Swartz H.J., Bors R., Mohamed F., Naess S.K. The effect of in vitro pretreatment on subsequent shoot organogenesis from excised Rubus and Malus leaves // Plant cell tissue organ cult., 1990, V. 21, P. 179 184.
308. Tikunov Yu.M., Khrustaleva L.I., Karlov G.I. Application of ISSR in the genus Lycopersicon. // Euphytica, 2003, V. 131, P. 71 80.
309. Tulecke W., McGranaham G. Somatic embryogenesis and plant regeneration from cotyledons of walnut J J Plant Sci., 1985, V. 40. P. 57 - 63.
310. Turk B.A., Swartz H.J., Zimmerman R.H. Adventitious shoot regeneration in vitro cultured leaves of Rubus genotypes // Plant cell tissue cult., 1994, V. 38, P. 11-17.
311. Van der Beek J.G., Verkerk, K., P. Zabel & P. Lindhout, 1991. Mapping strategy for resistant genes in tomato based on RFLPs between cultivars: Cf9 (resistance to Cladosporium fulvum) on chromosome 1. Theor Appl Genet 84: 106-112.
312. Walkey D.G.A. Production of apple plantlets from axillary bud meris-tems // Plant Sci., 1972, V. 52, P. 6.
313. Wang D., Wergin W.P., Zimmerman R.H. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of strawberry // HortScience, 1984, V. 19, P. 71-72.
314. Wang Z., Weber J.L., Zhong G., Tanksley S.D. Survey of plant short tandem repeats. //Theor Appl Genet, 1994, V. 88, P. 1-6.
315. Welander M. In vitro culture of raspberry (Rubus ideaus) for mass propagation // J. Hort. Sci.- 1985, V.60, N.4, P. 493-499.
316. Welander M. Plant regeneration from leaf and stem segments of shoots reised in vitro from mature apple trees // J/ Plant Physiol., 1988, V. 132, P. 738 — 744.зп
317. Wolff К., Zietkiewicz Е., Hofstra Н., Identification of chysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprint patterns. // Theor. Appl. Genet, 1995, V. 91, P. 439-447.
318. Yang S.F., Hoffman N.E. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants.//Annu Rev Plant Physiol., 1984, V.35, P.155-189.
319. Yao J.-L., Cohen D., Atkinson R Regeneration of transgenic plants frpm the commercial apple cultivar Royal Gala // Plant Cell Reports., 1995, V.14, N.7, P. 407-412.
320. Yepes L.M., Aldwincle H.S. Factors that affect leaf regeneration efficiency in apple, and effect of antibiotics in morphogenesis // Plant cell, tissue and organ culture, 1994, V.37, P. 257 269.
-
Нам, Ирина Ян-Гуковна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.23
- Формирование урожая, зимостойкость и качество зерна озимой ржи при использовании мелафена в условиях лесостепи Поволжья
- Морфо-физиологические особенности клонального микроразмножения in vitro различных сортов лилий (Lilium L.) и гладиолусов (Gladiolus L.)
- Обоснование приемов световой биотехнологии при клональном микроразмножении винограда
- Формирование урожайности и пивоваренных свойств ярового ячменя под действием регуляторов роста и микроэлементов
- Депонирование и рекультивирование сахарной свеклы в культуре in vitro
