Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro"

На правах рукописи

Самарина Лидия Сергеевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИЕМОВ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ЛИМОНА IN VITRO

Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 СЕН 2013

005532775

Москва-2013

005532775

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте цветоводства и субтропических культур Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Сочи)

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук

Коломиец Татьяна Михайловна

Официальные оппоненты:

Калашникова Елена Анатольевна

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева», профессор на кафедре генетики и биотехнологии

Молканова Ольга Ивановна

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, ФГБУН Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук, заведующая лабораторией биотехнологии растений

Ведущая организация: ФГБУН Институт физиологии растений

им. К. А. Тимирязева Российской академии наук

Защита диссертации состоится 25 сентября 2013 года в 16-00 на заседании диссертационного совета Д 220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел/факс: (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан 23 августа 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета .^с^«-1-''/Л.С. Большакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Цитрусовые культуры занимают третье место в мире по распространению среди плодовых культур (FAO, 2009). Основными цит-русо-производящими странами являются США, Япония, Испания, Италия и другие, с теплым влажным климатом.

Среди субтропических районов земного шара особое место принадлежит субтропикам Краснодарского края, которые по своему географическому положению (43—44° с. ш.) являются самыми северными в субтропическом земледелии. В результате многолетних исследований по возделыванию и селекции цитрусовых на базе ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии создана коллекция, в которой собраны все виды рода Citrus, имеющие важнейшее экономическое значение - всего более 120 таксонов (Зорин, Лаврийчук, 1964; Фогель, 2008; Кулян, 2012). Лимон (Citrus limon (L.) Burm.) - один из наиболее ценных видов рода Citrus, пользующийся большим потребительским спросом на рынке. Наряду с известными лечебными и диетическими свойствами лимон обладает высокими декоративными качествами. При благоприятных условиях растения лимона могут цвести круглый год и с успехом использоваться для внутреннего озеленения.

Вместе с тем, Черноморское побережье России является зоной рискованного цитрусоводства, так как повторяющиеся периодические холодные зимы представляют собой угрозу для промышленных посадок. К тому же, в последние годы в результате развития г. Сочи как горно-климатического курорта и столицы XXII зимних Олимпийских игр сельскохозяйственные площади сокращаются, в том числе и под цитрусовыми культурами.

Привлечение в исследования современных методов биотехнологии моет помочь решить стоящие проблемы. Культивирование растений in vitro в состоянии замедленного роста имеет свои преимущества: высокая степень надежности сохранения ценных генотипов, экономия площади, трудовых ресурсов, возможность безопасного обмена гермоплазмой с другими коллекциями (Citrus genetics..., 2008).

Известно, что разработка большинства зарубежных протоколов микроразмножения и сохранения цитрусовых in vitro проведена на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982; Marin, Duran Villa, 1999; Chaturvedi et al., 2002; Avenido et al., 2004; Jajoo, 2009; Benabdesselam, 2011; Chen, 2012 и др.). При этом способе сохранения сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5-10 и более лет. В этой связи актуальным является вопрос разработки и оптимизации надежных приемов сохранения взрослых (неювенильных) тканей, а также изучение органогенного потенциала различных типов эксплантов в условиях in vi-

tro на примере С. limon для сохранения геноресурсов и использования их в селекционных целях.

Объекты исследований: Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий; Citrus х meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИ-ЦиСК Россельхозакадемии.

Дель исследований: оптимизировать приемы микроразмножения и сохранения лимона in vitro для создания депонированной коллекции и дальнейшего использования ее в селекционной работе.

Задачи исследований:

1. Определить эффективный способ стерилизации побегов. Выявить возможные пути прямого морфогенеза эксплантов лимона in vitro.

2. Оптимизировать минеральную основу и гормональный состав питательной среды для микроразмножения лимона.

3. Установить оптимальный режим хранения микропобегов лимона in vitro.

4. Оценить эффективность ISSR-праймеров для определения генетической стабильности сортов в процессе хранения лимона in vitro.

5. Разработать протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.

Новизна исследований. Впервые установлена возможность использования микропрививки лимона для повышения продуктивности микроразмножения. Выявлены сортовые особенности микроразмножения лимона. Модифицирована минеральная основа среды для размножения. Определены оптимальные сроки и условия среднесрочной консервации микропобегов. Для определения жизнеспособности растений при хранении лимона in vitro впервые использован метод медленной индукции флуоресценции хлорофилла. В процессе хранения in vitro изучена жизнеспособность лимона, в зависимости от типа экспланта. Впервые с помощью ISSR праймеров проведена оценка полиморфизма изученных сортов лимона.

Практическая значимость. Оптимизация приемов клонального микроразмножения цитрусовых позволит создать и поддерживать резервную коллекцию, сохранить на небольших производственных площадях накопленный генофонд для дальнейшего использования в селекционных и практических целях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микропрививка - как способ омоложения эксплантов от взрослых растений лимона;

2. Условия культивирования и составы питательных сред на всех этапах от введения in vitro до адаптации ex vitro;

3. Оптимизированы приемы клонального микроразмножения и среднесрочного хранения микропобегов лимона in vitro.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетных сессиях ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии, Сочи, 2009 - 2012 гг., на конференции «Научное обеспечение АПК», Краснодар, 2011 г., на летней школе молодых ученых «AgroBioTech», Москва, 2012, на Всероссийской выставке «Золотая Осень», Москва, 2011 г., на конкурсе научно-исследовательских проектов молодых ученых «AllTech Young Scientist», 2012 г., конкурсе инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.», Краснодар, 2011 г. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них четыре - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах печатного текста, состоит из введения, 6 глав, рекомендаций для практического применения, выводов и 6 приложений. Работа содержит 18 таблиц, 35 рисунков. Список литературы .включает 218 источников, в том числе 185 на иностранных языках.

Личный вклад автора. Автором обосновано направление научно-практических исследований, проведены исследования по оптимизации условий микроразмножения и сохранения лимона in vitro, определены возможные пути прямого органогенеза различных типов эксплантов, обобщены и проанализированы результаты исследований, разработаны рекомендации для практического применения результатов исследования.

Глава 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

В главе рассматриваются вопросы основных биологических особенностей цитрусовых культур и актуальные вопросы культуры тканей как инструмента биотехнологии цитрусовых культур, а именно: проблема получения стерильной культуры, микроразмножение цитрусовых из различных типов эксплантов, вопросы сохранения гермоплазмы.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий, Citrus х meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии. Работа проводилась на базе ГНУ ВНИИЦ и CK Россельхозакадемии с 2009 по 2012 гг.

Методы исследований.

Получение стерильной культуры микропобегов. Источник эксплантов - донорные растения открытого грунта возрастом 6-10 лет. Экспланты для введения в культуру: 1. Вегетативные почки с сегментом побега длиной 0,5 -0,7 см, 2. Меристемы молодых побегов, 3. Семена зрелых плодов (для получения подвоев).

Побеги стерилизовали с использованием различных веществ: гипохлори-та Са (7 %), сулемы, диацида, велтолена, новодеза (0,2-0,5 %), доместоса (10 %) в сочетании с тетрациклином (0,1-0,2 %).

Микропрививку осуществляли по методике L. Navarro (Navarro, 2008) модифицированной. В качестве подвоя выступали сеянцы лимона Мейера, выращенные in vitro. Основа питательной среды - DKW с добавлением регуляторов роста БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л.

Микроразмножение. На данном этапе изучали: 1. Влияние минеральной основы: МС (Murasige et al., 1962), WPM (Lloyd et al., 1980) DKW (Driver et al., 1984) и комбинированной минеральной основы (КМО - МС с пониженным содержанием нитрата аммония (250 мг/л) без нитрата калия, но с добавлением сульфата аммония 1500 мг/л); 2. Влияние регуляторов роста (БАП, кинетин, ГК, тидиазурон, НУК - в различных комбинациях) на размножение микропобегов; З.Возможность повышения коэффициента размножения путем повторяющихся микропрививок. Измеряли коэффициент размножения и прирост микропобегов через 1,5 месяца культивирования.

Сохранение in vitro. В качестве модельного сорта использовали лимон Новоафонский. Минеральная основа питательной среды для культивирования МС (или Уг МС) с добавлением БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахарозы 25,0 г/л, агара 7,0 г/л. Хранение растущих образцов проводили в двух режимах: 1. В стандартных условиях при температуре + 22 ± 2 °С и освещении 5 000 люкс (5 клк); 2. В условиях климатической камеры при температуре + 10 ± 2 °С, освещении 1 000 люкс (1 клк). Пробирки закрывали фольгой и герметично заматывали пленкой (Высоцкая, 1994).

Изучение фотосинтетической активности проводили методом медленной индукции флуоресценции хлорофилла (на приборе LPT-3C) и методом А.А. Шлыка (1972). В процессе хранения измеряли прирост (разница между конечной и начальной высотой микропобегов) и индекс жизнеспособности Fm/F_t, где Fm - максимум флуоресценции, F_t - стационарный уровень флуоресценции.

Оценка эффективности ISSR праймеров. Анализ проводили на базе лаборатории мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов ВНИИ растениеводства имени Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург). Кроме сортов ли-

мона в анализ был включен каламондин (Citrus * microcarpa Bunge) с целью определить степень различий между лимонной группой и этим видом с точки зрения оценки эффективности ISSR-праймеров. ДНК выделяли из листьев двухмесячных, адаптированных к нестерильным условиям растений и из листьев 10-летних донорных растений - источников эксплантов. Степень сходства/различия ISSR-фрагментов у образцов оценивали с помощью коэффициента попарного сходства по Dice (Dice, 1945) и визуализировали методом UPGMA с помощью программного обеспечения DARwin5.9 (Perrier et al., 2006). Укоренение микропобегов проводили на питательной среде Vi MC с использованием ауксинов НУК и ИМК.

Все эксперименты проводили в трех-четырех повторностях, по 15-20 образцов в каждой. Статистический анализ полученных данных проводили по методике Б.А. Доспехова (1985) и с помощью программы MS Excel 2007.

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРИЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ И ПРЯМОЙ

ОРГАНОГЕНЕЗ ЭКСПЛАНТОВ ЛИМОНА 3.1. Получение стерильной культуры. Вегетативные почки - наиболее надежный тип эксплантов с точки зрения генетической стабильности сортов. Однако получение стерильной культуры из этих эксплантов проблематично из-за высокого уровня эндофитной контаминации. В связи с этим изучали различные варианты стерилизации побегов. Наиболее высокий процент стерильных почек получен в вариантах IV6 (0,3 % велтолен 25 минут), Vila и VII6 (тетрациклин 0,1-0,2 % 10 мин + Доместос 10 % 15 мин) (табл. 1). Различия между этими тремя вариантами несущественны, и выход стерильных эксплантов составил 27,7 - 33,0 %.

Таблица 1.

Выход жизнеспособных эксплантов в результате стерилизации побегов лимона (средний по сортам)

Вариант Стерилизующие вещества Выход стерильных эксплантов, %

I Гипохлорит Са 7% 20 мин 9,4 ±1,4

II Сулема 0,2% 10 мин 15,9 ±3,9

III Диацид 0,2 % 15 мин 13,2 ±3,0

IVa Велтолен 0,2% 25 мин 12,0 ±2,1

IV6 Велтолен 0,3% 25 мин 27,7 ±4,0

IVb Велтолен 0,5% 25 мин 1,4 ±0,9

Va Новодез 0,2% 25 мин 9,9 ± 1,1

V6 Новодез 0,3% 25 мин 15,7 ±2,0

Vb Новодез 0,5% 25 мин 4,8 ± 1,0

VI Доместос 10% 15 мин 12,8 ±1,5

Vila Тетрациклин 0,1 % 10 +ДомесТос 10 % 15мин 28,4 ±3,0

VII6 Тетрациклин 0,2 % Юмин+Доместос 10 % 15мин 33,0 ±4,6

Для повышения выхода стерильных эксплантов в питательную среду добавляли тетрациклин. Добавление 400 мг/л тетрациклина позволило повысить процент стерильных эксплантов до 65,4 % по сравнению с контролем, а органогенез стерильных почек составил 48,5 %. Таким образом, добавление тетрациклина в питательную среду повысило выход стерильных жизнеспособных эксплантов на 20,8 % (табл. 2).

Таблица 2.

Эффективность получения стерильной культуры и органогенез почек лимона сорта Ново_афонский (стерилизация 0,3 % Велтолен 25 мин)_

Антибиотик в питательной среде, мг/л Выход стерильных эксплантов, % Органогенез, %

Без антибиотика 27,7 27,7

Тетрациклин 200 33,2 31,6

Тетрациклин 400 65,4 48,5

Тетрациклин 900 77,6 24,3

3.2. Особенности органогенеза эксплантов лимона.

Органогенез из пазушных почек. Пазушные почки от 6-летних растений лимона характеризовались более активным побегообразованием, по сравнению с 10-летними. Срок наступления массового роста (СНМР) 10-летних почек был на 7-9 дней больше, чем у почек 6-летних донорных растений, а частота побегообразования была на 2-19 % ниже, в зависимости от сорта (табл. 3). В дальнейшем побеги росли неактивно.

Таблица 3.

Влияние генотипа и возраста донорных растений на частоту и продолжительность побегооб-

разования из почек лимона

Сорт Возраст дерева, лет СНМР, дней Побегообразование, %

Бесколючий 6 : 15,5 ±0,4 84,5

10 22,4±0,4 76,8

Ударник ■ ''",','6' ' 17Д±0,6 61,1

10 2б,5±0,6 59,2

Новоафонский .. 6 20,4±0,4 . 83,5

10 29,2±0,4 64,8

Мейер 6 12,6±0,3 87,7

10 19,0±0,8 85,0

Для повышения ростовой активности использовали альтернативный способ прямого органогенеза - микропрививку.

Органогенез лимона путем микропрививки. В результате микропрививки на подвой лимон Мейера через 10-20 дней образовывалась общая сосудистая система и меристемы трогались в рост (рис. 1). Меристемы от in vitro культивируемых почек приживались лучше, чем меристемы из открытого грунта (ш

vivo). Приживаемость составила 65,8-81,6 % и 21,4-35,1 %, соответственно. Различия между сортами несущественны (табл. 4).

Рис 1. Микропрививка лимона Новоафонский на лимон Мейера: А, Б - образование общей проводящей системы (через 10 дней); В - начало роста (через 20 дней).

В результате дисперсионного анализа установлено, что доля влияния сорта на приживаемость меристем составила лишь 5 %, в то время как влияние источника привоя - 92 % (табл. 4). Все полученные данные достоверны F4 > F05. Таким образом, в результате микропрививки были получены высокие показатели приживаемости, что делает этот способ перспективным для дальнейшего культивирования лимона in vitro.

Таблица 4.

Приживаемость микропрививки на подвой лимон Мейера (%, HCPos=8,33).

Сорт привоя Источник привоя

in vivo in vitro

Новоафонский 25,5 IS,2

Бесколючий 21,4 73,3

Ударник 24,8 65,8

Мейер 35,1 81,6

Результаты дисперсионного анализа

Фактор F* Fos Доля влияния фактора, %

Сорт привоя 19,62 2,99 4,8

Источник привоя 1134,74 4,24 92,4

Взаимодействие 3,05 2,99 0,7

Глава 4. KJIОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЛИМОНА IN VITRO 4.1. Микроразмножение побегов из пазушных почек. Для повышения эффективности культивирования in vitro микропобегов из пазушных почек оптимизировали состав питательной среды. Из четырех базовых сред наиболее

эффективными оказались КМО и где коэффициент размножения (1,8 -

2,8) существенно превышал контроль (на среде МС -1,4-1,7) (рис. 2).

ед. і И Новоафонский Ж Бесколючий ШУдарник «Мейер

3,00 ------------------------1------------------т—у-----

МС WPM DKW КМО

Рис. 2. Коэффициент размножения микропобегов в зависимости от минеральной основы питательной среды (БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л).

При изучении влияния регуляторов роста установлено, что наиболее эффективными для размножения вариантами оказались VII и VIII (табл. 5).

Таблица 5.

Коэффициент размножения микропобегов из почек лимона в зависимости от регуляторов __роста в питательной среде (базовая среда КМО)_

Генотип Концентрации регуляторов роста, мг/л

Контроль без регуляторов роста НУК 0,5 БАП+ГК БАП 1

БАП Кинетин ТДЗ

1,0 2,0 3,0 1,0 2,0 1,0+1,0 2,0+2,0 0,01 0,10

/ II III IV V VI VII VIII IX X

Новоафонский 1,0 1,4 1,7 1,2 1,1 1,1 1,9 2,4 1,2 1,5

Бесколючий 0,9 1,2 1,7 1,4 1,0 1,2 1,8 2,4 1,5 1,0

Ударник 1,0 1,2 1,7 0.9 1.1 1,4 1,7 2,1 1,6 1,8

Мейер 1,0 1,2 1,3 1,0 0,9 1,1 1,6 1,9 1,1 1,1

Значения F критерия и НСР при 0,05% уровне значимости

Фактор F факт. F теор. НСР Доля фактора, %

Сорт 25,21 4,40 0,1 6

Регуляторы роста 109,31 8,58 0,1 74

Взаимодействие 5,36 2,18 0,2 11

Наибольший коэффициент размножения микропобегов был получен при добавлении в среду БАП 2 мг/л + ГК 2 мг/л и составил в зависимости от сорта

1,9-2,4 побега на эксплант через 1,5 месяца культивирования. На питательных средах с другими комбинациями регуляторов роста коэффициент размножения принимал меньшие значения, но при этом он был выше, чем в контрольном варианте. Проведенная статистическая обработка результатов опыта достоверно показала, что различия между вариантами существенны и наиболее оптимальной питательной средой для размножения является КМО с добавлением БАЛ 2 мг/л + ГК 2 мг/л.

Следует отметить, что, в целом, микропобеги из пазушных почек взрослых растений лимона характеризовались низкими значениями коэффициента размножения. В связи с этим изучали возможность повышения их продуктивности путем микропрививки.

4.2. Микропрививка как способ размножения лимона

В наших экспериментах способность к омоложению микропобегов проверялась с помощью сравнения роста привоя от 1го, 2го и Зго циклов субкультивирования в микропрививке. Характер роста и размножения микрочеренков, полученных от каждого цикла, сравнивали с микропобегами и сеянцами от 10-летнего лимона Новоафонский in vitro. В целом, микропобеги привоя характеризовались более быстрым ростом, чем побеги, полученные из почек взрослых растений. После третьего цикла микропрививки коэффициент размножения микрочеренков в 2 раза превышал аналогичный показатель микропобегов из пазушных почек растений-доноров и составил 4,6 шт/побег, тем самым приближаясь к сеянцам (рис. 3).

циклы субкультаинроммик Побегов us почек микропривнтык побегов сеянцев

Рис. 3. Коэффициент размножения микропобегов лимона в зависимости от их источника и цикла субкультивирования

Также отмечено, что коэффициент размножения микропобегов из почек взрослых растений после третьего пассажа существенно не повышался. Таким образом, с помощью перепрививок происходила активизация ростовых процессов, связанная с физиологическим омоложением. Следовательно, данный путь морфогенеза открывает большие возможности для массового размножения и оздоровления генотипов лимона.

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ СОХРАНЕНИЯ МИКРОПОБЕГОВ ЛИМОНА IN VITRO 5.1. Оптимизация режимов и условий хранения in vitro.

Высокие показатели роста микропобегов являются главной целью микроразмножения, но для длительного хранения in vitro необходимо определить условия, замедляющие рост побегов без потери их жизнеспособности. В процессе хранения in vitro было установлено, что микропобеги из пазушных почек взрослых растений характеризовались низкой жизнеспособностью. Через 4 месяца на среде '/г МС осталось 83,0-88,1 %, а на среде МС - 76,6-81,8 % жизнеспособных микропобегов лимона Новоафонский (табл. 6). При этом их средний прирост составлял 4,7 и 2,3 мм, соответственно. Спустя 10 месяцев хранения на этих средах при стандартных световом и температурном режимах большая часть микропобегов погибла.

Таблица 6.

Влияние сроков хранения мизсропобегов in vitro на рост и жизнеспособность лимона сорта

Новоафонский

Среда Продолжительность Прирост, мм Выжило

консервации, мес. микропобегов, %

2 б,4±0,6 93,9-98,3

ЙМС • 4 4,7±0,7 83,0-88,1

- -6 , '■ 1,9±0,6 - 60,0-65,8

8 , 0,3±0,2 34,0-40,8

■10 , ' . 0 13,6-15,6

2 5,0±0,4 81,3-88,9

МС 4 2,3±0,4 76,6-81,8

6 0,5±0,2 48,0-54.0

8 0 20,4-25,0

10 0 5,0-7,0

*± ошибка выборочной средней

С целью повышения продолжительности хранения без пересадок на свежую среду определяли наиболее оптимальный тип эксплантов: микропобегов от микропрививки, сеянцев и микропобегов от взрослых растений-доноров лимона Новоафонский. Через 4 месяца хранения наибольший прирост был отмечен у сеянцев (14,8 мм) и у микропривитых растений (12,0 мм) на среде У2 МС при стандартных условиях освещения и температуры (табл. 7). У микропобегов

из почек отмечен наименьший прирост (4,7 мм). В условиях пониженного светового и температурного режима (1 клк и I +10 ± 2°С) прирост снижался: от 0,0 (побеги из почек) до 4,3 (сеянцы) мм.

Таблица 7.

Прирост и индекс жизнеспособности у микропобегов лимона Новоафонский через 4

месяца хранения

Тип экспланта 5 клк, +22±2 °С 1 клк, +10±2 °С

Прирост (мм) Индекс жизнеспособности Прирост (мм) Индекс жизнеспособности

Почки взрослых растений 4,7 ± 0,7 1,33 ±0,09 0,0 ± 0,0 1,73 ± 0,07

Сеянцы 14,8 ±2,5 1,81 ±0,08 4,3 ± 1,0 2,46 ±0,44

Микропривитые растения 12,0 ±1,4 1,61 ±0,17 3,8 ±0,5 1,99 ±0,11

*± ошибка выборочной средней

Таким образом, хранение в условиях пониженных температуры и освещения более оптимально для замедления роста микропобегов, чем культивирование при стандартных условиях. Этот вывод подтверждается индексами жизнеспособности. При интенсивности освещения 1 клк и t +10 ± 2°С этот показатель был выше, чем при 5 клк и t +22 ± 2°С. Наибольший индекс жизнеспособности отмечен у сеянцев и составил 1,81-2,46. У микропривитых растений отмечены меньшие его значения - 1,61-1,99. И наименьшим индексом жизнеспособности характеризовались микропобеги из почек - 1,33-1,63.

В зависимости от типа эксплантов определяли оптимальную продолжительность хранения in vitro без пассирования. Наибольшее количество жизнеспособных микропобегов (95 %) через 12 месяцев хранения наблюдалось у сеянцев (рис. 4).

— Мнкропобепі из почек —■—Сеянцы — *--Мнкропривитые побеги 100

-• 90

й 80

| 70

| 60

І 50

0

1 40 1 30

I 20

О

g ю

Рис. 4. Выход жизнеспособных микропобегов лимона Новоафонский на среде 'Л МС при 1 клк и +10 ± 2°С (п=120)

4 6 8

Продолжительность хранения, мес.

10

12

Оптимальный срок хранения микропривитых растений составил 10 месяцев. К 12 месяцу хранения количество их снизилось до 85 %. У микропобегов из почек резкое снижение жизнеспособности происходило после 4 месяцев хранения in vitro и к 12 месяцу осталось лишь 40 % жизнеспособных побегов. Таким образом, наибольшей продолжительностью хранения in vitro без пассирования характеризовались сеянцы и микропривитые побеги.

Важным показателем, отражающим особенности физиологической адаптации растений к различным факторам среды, является пигментный состав листьев. При изучении содержания хлорофилла a (Ch а) и каротиноидов в листьях сеянцев лимона отмечено постепенное снижение этих пигментов в процессе хранения in vitro. Однако, было обнаружено, что в условиях пониженных температуры и освещенности это снижение происходило медленнее, чем при хранении в обычных условиях (рис. 5).

В условиях пониженной температуры и освещения содержание хлорофилла а снижалось с 1,81 до 1,56 мг/г, то есть на 0,25 мг/г сырой массы листьев через 6 месяцев культивирования. В стандартных условиях хранения за аналогичный период количество хлорофилла а снижалось с 1,59 до 1,18 мг/г - в среднем на 0,41 мг/г. На 12-й месяц хранения при стандартных условиях содержание этого пигмента составляло 1,14 мг/г, то есть снизилось на 0,45 мг.

мг/г —1КЛК, tlO"C -в-5клк, +22*С

а Каротиноиды

Рис. 5. Динамика содержания хлорофилла а и каротиноидов (мг/г сырого вещества) в процессе хранения сеянцев лимона сорта Новоафонский in vitro (на среде '/2 МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л)

Концентрация каротиноидов с 1-го по 3-й месяц хранения при пониженных температуре и освещении практически не изменялась, ее снижение на 0,11 мг происходило с 3-го на 6-й месяцы культивирования. В стандартных условиях хранения происходил постепенный спад каротиноидов с 1,14 до 0,82 мг/г, то есть их концентрация снизилась на 0,32 мг за 12 месяцев хранения.

Анализ изменения содержания пигментов показал, что условия пониженной температуры (+10 °С) и интенсивности освещения (1000 люкс) более оптимальны для сохранения фотосинтетического аппарата и пластических веществ в листьях микропобегов лимона, и, как следствие, более высокого уровня жизнеспособности микропобегов. Такие условия позволяют сохранять их 10-12 месяцев без пассирования.

4.3. Анализ внутрисортового полиморфизма. В процессе хранения коллекций in vitro важным является вопрос генетической стабильности сортов. Для идентификации сортов лимона и степени их стабильности при хранении in vitro изучали эффективность девяти ISSR праймеров. В результате анализа трех сортов лимона - Новоафонский, Бесколючий и Ударник в сравнении с формой ка-ламондина Citrus х microcarpa Bunge, с помощью девяти ISSR праймеров в сумме получили 92 четких фрагмента высокой интенсивности (табл. 8). Количество таких фрагментов варьировало от 7 (праймер Мб) до 17 (праймер МЗ) при арифметическом среднем 10,2. Число полиморфных фрагментов варьировало от 0 (праймер М13С) до 13 (М 3) и в среднем составляло 4,8, то есть 47 %.

Таблица 8.

Уровень полиморфизма девяти IS SR праймеров у Citrus limon (L.) Burm и Citrus mitis Blan.

Праймер Количество фрагментов Полиморфизм, %

Всего Полиморфных

Ml (AC)gCG 12 9 75

МЗ (GA)g(C/T)C 17 13 76

Мб (CAC)s 7 1 14

М7 (CAG)5 8 1 13

М8 (GTG)s 9 4 44

М9 (GACAC)4 9 8 89

М10 (CA)6(A/G)G 10 4 40

М13С (AGC)4C 9 0 0

М13Т (AGC)„T 11 3 27

Среднее 10,2 4,8 47

Всего 92 43 -

На электрофореграмме праймера М1 видны различия между каламонди-ном (дорожка 1) и лимонной группой (дорожки 2 - 9), а также различия между сортами Бесколючий, Ударник и Новоафонский (рис. 6).

В результате проведенного кластерного анализа методом UPGMA все сорта разделяются на отдельные кластеры. Выявлено, что микропобеги после хранения in vitro 6 месяцев (обозначены in vitro 1) и 12 месяцев (in vitro2) идентичны исходным маточным растениям (Мат.1) (рис. 7).

Similarity

Р Я о в о о о в

ё ё & 2 "й S § "8

-1-1-\-1_I_1_I_I

Бескшпочмй in vftro2

Бшюлючиб _in vitrol

(Бесколючий

____Мат.

i

Ударник |Мат.

(Ударник

-----In vitro

Ковоафон. Мат.1

Новоафвн. --Irt vJiroi

Иоиафмь •n vitioZ

—- Калалм>н-

дим Мат.

Рис. 7. UPGMA дендрограмма лимона и каламондина на основе коэффициентов попарного сходства по Dice, 1945.

Рис. 6. MP - маркер размера; 1 - Каламондин, 2 - Бесколючий Мат., 3 -Бесколючий in vitrol, 4 - Бесколючий in vitro2, 5 - Ударник Мат., 6 - Ударник in vitrol, 7 - Новоафонский Мат., 8 - Новоафонский in vitrol, 9 - Новоафонский in vitro2,

У сортов Бесколючий и Новоафонский после 12 месяцев хранения in vitro, и у сорта Ударник после 6 месяцев хранения не было выявлено генетических отклонений от исходных маточных растений. Таким образом ISSR прай-меры позволяют оценить генетическую стабильность изученных сортов.

Глава 6. УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ ПОБЕГОВ К НЕСТЕРИЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ

Изучение влияния ИМК и НУК в питательной среде на длину корневой системы микропобегов из пазушных почек показало, что при добавлении только НУК длина корней была больше, чем когда использовали сочетание двух ауксинов (рис. 8). Максимальные показатели длины корней у всех сортов наблюдали в варианте с 3,0 мг/л НУК, при этом длина составляла 4,2 - 5,2 см. В этом варианте между сортами различия несущественны. _____

7.00 .....-.•---------—--

Рис. 8. Длина корневой системы (см) микропобегов лимона на среде МС через 30 дней культивирования.

Количество корней, образованных у микропобегов зависело от наличия/отсутствия ИМК в питательной среде. Оно было больше в вариантах, где присутствовали два ауксина. Там же, где был только НУК, количество корней на микропобег было значительно меньше (рис. 9). Максимальным этот показатель оказался в вариантах с НУК 1,0 - 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л и в среднем по сортам составил 3,1 - 3,8 корней на микропобег.

МУК 1.0 НУК 3,0 НУК 1,0 + НУК 2,0 + ИМК1.0 ИМК1.0 концентрация ауксина, мг/л

Рис. 9. Количество корней на микропобег (пгг) у лимона на среде [А МС через 30 дней культивирования.

Таким образом, наиболее оптимальным сочетанием регуляторов роста в питательной среде У2 МС является НУК 1,0 - 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л. Такая комбинация позволяет получить 83,7 - 95,1 % укорененных микропобегов с длинной корневой системы 4,2 - 5,2 см и количеством корней на побег 3,1 - 3,8 штук. В результате наших исследований были получены укорененные, адаптированные к нестерильным условиям растения, готовые к высадке в теплицу или для выращивания в комнатной культуре.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

С целью получения полноценных растений лимона, микроразмножения и сохранения их в культуре тканей предлагается следующая последовательность операций (рис. 10):

1. Для введения в культуру тканей:

а) Молодые побеги весеннего (апрель - май) прироста освободить от листьев, промыть с хозяйственным мылом и в проточной воде в течение 30 минут. Затем в условиях стерильного помещения обработать побеги 0,3 % растворе Велтолен 25 мин, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Сегменты побегов длиной 0,7 см с почкой помещаются вертикально на питательную среду - МС + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л. Культивирование при световом режиме 16/8 - 5 клк, 1 +22±2 °С до получения микропобегов.

б) Для получения сеянцев - семена стерилизуют 0,3 % раствором велтолен 30 мин. Стерильными инструментами снимают обе семенные оболочки, и

помещают семядоли на питательную среду МС + БАЛ 1,0 мг/л + НУК 0,1 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С.

в) Для получения побегов путем микропрививки отдельно готовят подвой и привой. Подвой - сеянцы лимона четырех недель культивирования in vitro, привой - микропобеги из пазушных почек in vitro. Сеянцы декапитируют, оставляя 1,0 - 1,5 см эпикотиль, на месте среза которого делают L-образный разрез коры длиной 1 - 2 мм. В этот разрез помещают привой - меристему с 2-3 примордиями. Микропривитые побеги помещают на среду DKW + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, и культивируют при световой режиме 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С.

2. Для омоложения микропобегов проводят цикл из не менее трех микропрививок, продолжительностью 2-3 месяца каждый. В каждой последующей прививке используют почки предыдущего привоя. После третьей перепрививки микрочеренки привоя высаживают на среду для размножения.

3. Для микроразмножения микропобеги культивируют на среде DKW (или КМО) + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л световой режим 16/8 - 5 клк, t + 22 ± 2 °С.

4. Для депонирования in vitro используют следующие условия - среда /4 МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8-1 клк, t + 10 ± 2 °С.

5. Для укоренения микропобеги помещают на среду Vi МС + НУК 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л + сахароза 20,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С.

6. Адаптацию следует проводить в 2 этапа: 1. Высадка укорененных растеньиц в адаптационные камеры с вермикулитом, закрытые полиэтиленовой пленкой; 2. Высадка на стеллажи или в горшки в тепличные или комнатные условия.

выводы

1. Установлен эффективный режим стерилизации побегов взрослых растений лимона - обработка 0,3% раствором Велтолен 25 мин и добавление антибиотика тетрациклина 400 мг/л в питательную среду.

2. Оптимизирован минеральный и гормональный состав питательной среды для микроразмножения лимона - КМО + БАЛ 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л.

3. Установлено, что после трех циклов микропрививки в почках происходит активизация ростовых процессов, и коэффициент размножения лимона повышается в 2 раза, что является критерием физиологического омоложения. Микропрививка является наиболее перспективным способом микроразмножения и сохранения лимона in vitro.

4. Выявлены оптимальные условия, позволяющие сохранять микропобеги лимона in vitro 10-12 месяцев на среде Vi МС + БАЛ 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, при температуре + 10 ± 2 °С, освещении 1 000 люкс, фотопериоде 16/8 часов.

5. Определена эффективность ISSR праймеров для оценки генетической стабильности сортов лимона в процессе хранения in vitro. У сортов Новоафонский, Бесколючий и Ударник не было выявлено генетических отклонений после 6-12 месяцев хранения in vitro.

6. Разработан и рекомендован для практического применения протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.

Рис. 10. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА микроразмножения и сохранения Citrus limon (L.) Burm. в условиях in vitro

Микроразмножение - DKW + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 'ХЗ.

Молодые побеги весеннего прироста -стерилизация - 0,3 % Вслтолен 20 мин, трижды промывка стерильной дистводой.

Анализ генетической стабильности сортов, депонированных в коллекции in vitro, с помощью ISSR маркеров.

Укоренение - '/а MC + НУК 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л + сахароза 20,0 г/л + aiap 7,0 г/л, световой режим 16/8 -5 клк, t + 22 ± 2 *ЧГ.

Регенерация побегов - МС + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 т/я. Культивирование при световом режиме 16/8-5 клк, I + 22±2"С

Введение в культуру пазушных почек

Хранение - Vi MC БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8 -1 клк, t + 10±2°С.

Подвой - сеянцы лимона 4-х недель культ-я /л \Нгоу привой - 2-х недельные регенераты пазушных почек. Среда ОК\У + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 - 5 клк, I + 22 ± 2 °С.

Введение в культуру семян

стерилизация 0,3 % велтолен 25 минут

Ювенильные подвои in vitro

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Samarina, L. S. Regeneration and micropropagation of lemon cultivars in vitro from nodal explants / L. S. Samarina [et al.] // Russian Agricultural Science -2010.-36(6).-P. 417-420.

2. Самарина Л. С. Биотехнология цитрусовых культур: достижения и перспективы (обзор) / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, В. М. Горшков // Садоводство и виноградарство. - 2011 г. - № 6. - С. 27-30.

3. Самарина, Л. С. Оценка регенерационной способности эксплантов цитрусовых in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, В. М. Горшков // Садоводство и виноградарство. - 2011. - Вып. 24, № 6. - С. 23-26.

4. Самарина Л. С. Идентификация размноженных in vitro сортов лимона и регенерантов семядолей с помощью ISSR маркеров / Л. С. Самарина, Е. К. По-токина // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2013. -№ 1.-С. 39-41.

5. Самарина, Л. С. Особенности микроразмножения С. limon в условиях in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Материалы IX молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - ВНИИ СБ, Москва - 2009. - С. 25-26.

6. Горшков В. М. Экологические и биологические особенности основных видов рода Citrus для промышленного возделывания / В. М. Горшков, Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Субтропическое и южное садоводство России -2009.-Т. 2.-С. 250-255.

7. Самарина, Л. С. Регенерация лимона in vitro из стеблевых почек и ну-целлярных зародышей / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Сб. тез. IV науч,-практ. конф. молодых ученых «Научное обеспечение АПК». - Краснодар 2010 г. - С. 220-222.

8. Горшков, В. М. Последствия погодных стрессов для цитрусовых культур на примере Citrus unshiu Marc, в прибрежно-черноморской зоне субтропиков / В. М. Горшков, Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Сб. тез. Всероссийский симпозиум «Растение и стресс», Москва, 2010. - С. 115-116.

9. Самарина, Л. С. Медленнорастущие коллекции in vitro как способ сохранения цитрусовых культур в российских субтропиках / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец // Сб. тез. Всероссийский симпозиум «Растение и стресс» Москва, 2010.-С. 311-312.

10. Самарина, Л. С. Микроклональное размножение цитрусовых культур и их подвоев / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, Н. С. Налбантова // Сб. тез. VI науч.-практ. конф. молодых ученых «Научное обеспечение АПК». - Краснодар, 2012г.-С. 51-53.

11. Самарина, Л. С. Разработка приемов культивирования цитрусовых in vitro / Л. С. Самарина, Т. М. Коломиец, Н. С. Налбантова // Сб. трудов ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии. - 2012. - Вып. 46. - С. 175-179.

12. Samarina, L.S. In vitro conservation of Citrus limon (L.) Burm. / L.S. Sa-marina, [et al.] // Biological Agriculture & Horticulture, UK (in press).

Благодарности. Автор выражает особую благодарность своему научному руководителю кандидату с.-х. наук Коломиец Татьяне Михайловне, за неоценимую помощь в написании диссертации и в достижении результатов. Также отдельная благодарность за оказанные содействие и консультативную помощь в выполнении данной работы д.с-х.н. Горшкову В.М., к.б.н. Карпун H.H., к.б.н. Гутиевой Н.М., д.б.н. Малюковой Л.С., д.с.-х.н. Бесединой Т.Д., к.б.н. Маля-ровской В.И., к.б.н. Слепченко H.A., д.с.-х.н, чл.-корр. Россельхозакадемии Рындину A.B., и другим сотрудникам ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии. Отдельная благодарность сотрудникам ФГБУН Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева к.б.н. Бургутину А.Б., к.б.н. Моисеевой H.A. за детальное изучение работы, ценные замечания и оказанную консультативную помощь, а также сотрудникам РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева к.б.н. Чередниченко М.Ю., д.б.н. Соловьеву A.A., д.б.н. Карлову Г.И. Автор выражает отдельную благодарность оппонентам д.б.н. Калашниковой Е.А. и к.б.н. Молка-новой О.И. за детальное изучение работы и ценные замечания.

Отдельное спасибо автор адресует' к.б.н. Потокиной Е.К. и сотрудникам лаборатории мониторинга генетической эрозии растительных ресурсов ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова за помощь в проведении ISSR анализа.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 21.08.2013 г. Формат 60х84,Л6. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 403.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12,977-26-90, 977-40-64

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самарина, Лидия Сергеевна, Сочи

Государственное научное учреждение Всероссийский научно исследовательский институт цветоводства и субтропических культур Российской академии сельскохозяйственных наук

04201360887 „

На правах рукописи

Самарина Лидия Сергеевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРИЕМОВ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ

ЛИМОНА IN VITRO

Специальность: 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к. с.-х. н. Коломиец Т.М.

Сочи-2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................3

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ......................................................................................................7

1.1. Основные биологические особенности цитрусовых культур...................7

1.2. Культура тканей, как основной инструмент биотехнологии цитрусовых ..............................................................................................................................10

1.2.1. Проблема контаминации на этапе введения в культуру...................12

1.2.2. Регенерация и микроразмножение эксплантов цитрусовых............16

1.2.3. Процедура сохранения гермоплазмы цитрусовых in vitro...............26

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ.................................35

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРИЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ И ПРЯМОЙ ОРГАНОГЕНЕЗ ПОЧЕК ЛИМОНА.....................................................................45

3.1. Эффективность стерилизации пазушных почек лимона.........................45

3.2. Особенности органогенеза лимона из пазушных почек и путем микропрививки...................................................................................................50

ГЛАВА 4. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЛИМОНА.....................63

4.1. Влияние минеральной основы питательной среды и регуляторов роста на размножение побегов из почек лимона.......................................................63

4.2. Микропрививка как способ физиологического омоложения и размножения лимона..........................................................................................73

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ СОХРАНЕНИЯ МИКРОПОБЕГОВ ЛИМОНА IN VITRO......................................................................................................................78

5.1. Оптимизация режимов и условий хранения in vitro................................78

5.2. ISSR-маркирование для определения генетической стабильности лимона в процессе хранения in vitro.................................................................86

ГЛАВА 6. УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ ПОБЕГОВ К НЕСТЕРИЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ...........................................................................................................91

Заключение..............................................................................................................99

Рекомендации для практического применения................................................100

Выводы..................................................................................................................ЮЗ

Список литературы............................................................................................104

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................И9

ВВЕДЕНИЕ

Цитрусовые культуры занимают третье место в мире по распространению среди плодовых культур, и основными странами-производителями являются США, Япония, Испания, Италия и другие, с теплым влажным климатом (FAO, 2009). Кроме своей высокой пищевой ценности, они получили широкое применение в парфюмерной, косметологической, фармацевтической промышленностях, а также известны как высокодекоративные растения. Цитрусовое дерево является настоящим украшением интерьера: декоративные плоды и ароматные цветы появляются одновременно, круглый год в кроне из вечнозелёных кожистых листьев со специфическим запахом эфирных масел. В России наиболее популярна в озеленении комнатная культура лимона. Известными сортами являются Павловский лимон, Майкопский, Новоафонский и лимон Мейера. Лимон (Citrus limon (L.) Burm.) — один из наиболее ценных видов рода Citrus. О диетических и лечебных свойствах лимонов, было известно в арабских странах уже в 13 веке. Их с успехом применяли при лечении ран, легочных заболеваний, цинге и др. Из лепестков цветков, листьев и кожуры плодов добывают эфирное масло, используемое в кондитерском производстве, парфюмерии и медицине.

В благоприятных условиях растения лимона могут цвести круглый год и, благодаря высокой декоративности, с успехом используются для внутреннего озеленения и как комнатная культура.

Наилучшие места для произрастания цитрусовых - тропические и субтропические территории, расположенные на широте 40 градусов по обе стороны экватора, где температура преимущественно выше 0 °С. Среди субтропических районов земного шара особое место принадлежит субтропикам Краснодарского края, которые по своему географическому положению (43-44° с. ш.) являются самой северной зоной по выращиванию

цитрусовых. Опыт промышленного цитрусоводства первой половины XX века и экспериментальные посадки этих культур в 1980-1990-х годах показывают, что промышленная культура цитрусовых в субтропиках России может быть экономически рентабельной (Трубачев В.В., http://www.Hmon-citron.ru). В благоприятные по климатическим условиям годы местные хозяйства получали высокие урожаи мандаринов - от 200 до 350 ц/га. Сравнительно высокими были и урожаи лимонов.

В результате многолетних исследований по возделыванию и селекции цитрусовых на базе ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии создана коллекция, в которой собраны все виды рода Citrus, имеющие важнейшее экономическое значение - всего более 120 таксонов (Зорин, Лаврийчук, 1964; Фогель, 2008; Кулян, 2012). Следует отметить, что Черноморское побережье России является зоной рискованного цитрусоводства, так как периодически повторяющиеся холодные зимы представляют собой угрозу для промышленных посадок. В связи с этим, главными направлениями цитрусоводства в нашей стране является получение новых сортов, устойчивых к низким температурам и биотическим факторам.

Традиционные методы селекции цитрусовых малоэффективны в связи с биологическими особенностями этих культур: полиэмбриония, длительный ювенильный период, стерильность пыльцы и семяпочек. Современные методы биотехнологии позволяют преодолеть эти проблемы и открывают возможности для получения сортов нового поколения. Для осуществления этих приемов необходимы эффективные протоколы регенерации, микроразмножения и депонирования in vitro (Malaurie, 1998; Marin, Duran Villa, 1999; Negash et al., 2001 и др.).

Абсолютное большинство зарубежных протоколов микроразмножения и сохранения цитрусовых in vitro выполнены на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982; Marin, Duran Villa, 1999; Chaturvedi et al., 2002; Avenido et al., 2004; Jajoo, 2009; Benabdesselam, 2011; Chen, 2012 и др.). При этом способе

сохранения сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5-10 и более лет. В этой связи актуальным является вопрос разработки и оптимизации надежных приемов сохранения взрослых (неювенильных) тканей, а также изучение органогенного потенциала различных типов эксплантов в условиях in vitro на примере С. limon для сохранения геноресурсов и использования их в селекционных целях.

Объекты исследований: Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий; Citrus х meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии.

Цель исследований: оптимизировать приемы микроразмножения и сохранения лимона in vitro для создания депонированной коллекции и дальнейшего использования ее в селекционной работе. Задачи исследований:

1. Определить эффективный способ стерилизации побегов. Выявить возможные пути прямого морфогенеза эксплантов лимона in vitro.

2. Оптимизировать минеральную основу питательной среды и гормональный состав для микроразмножения лимона.

3. Установить оптимальный режим хранения микропобегов лимона in vitro.

4. Оценить эффективность ISSR-праймеров для определения генетической стабильности сортов в процессе хранения лимона in vitro.

5. Разработать протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.

Новизна исследований. Впервые установлена возможность использования техники микропрививки для повышения жизнеспособности и коэффициента размножения микропобегов. Модифицирована минеральная основа питательной среды для размножения. Определены оптимальные сроки и условия среднесрочной консервации микропобегов. Для определения жизнеспособности растений при хранении лимона in vitro впервые использован метод медленной индукции флуоресценции хлорофилла.

Впервые с помощью ISSR праймеров проведена оценка полиморфизма изученных сортов лимона.

Практическая значимость. Оптимизация приемов клонального микроразмножения цитрусовых позволит создать и поддерживать резервную коллекцию, сохранить на небольших производственных площадях накопленный генофонд для дальнейшего использования в селекционных и практических целях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микропрививка - как способ омоложения эксплантов от взрослых растений лимона;

2. Условия культивирования и составы питательных сред на всех этапах — от введения in vitro до адаптации ex vitro;

3. Оптимизированы приемы клонального микроразмножения и среднесрочного хранения микропобегов лимона in vitro.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетных сессиях ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии, Сочи, 2009 - 2012 гг., на конференции «Научное обеспечение АПК», Краснодар, 2011 г., на летней школе молодых ученых «AgroBioTech», Москва, 2012, на Всероссийской выставке «Золотая Осень», Москва, 2011 г., на конкурсе научно-исследовательских проектов молодых ученых «AllTech Young Scientist», 2012 г., конкурсе инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.», Краснодар, 2011 г. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них чытыре - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах печатного текста, состоит из введения, 6 глав, рекомендаций для практического применения, выводов и 6 приложений. Работа содержит 18 таблиц, 35 рисунков. Список литературы включает 218 источников, в том числе 185 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И

ПЕРСПЕКТИВЫ

1.1. Основные биологические особенности цитрусовых культур

Род Citrus L. принадлежит к семейству рутовых (Rutaceae), подсемейству померанцевых (Aurantioidae) и состоит в близком родстве с другими важными родами - Fortunella, Poncirus, Microcitrus, Eremocitrus (всего 140 родов и 1300 видов по всему миру) (Singh, Rajam, 2009). Цитрусовые культуры занимают третье место в мире по распространению среди плодовых культур и их ежегодное производство составляет более 200 миллионов тонн, а площадь под насаждениями более 7,2 млн га (FAO, 2009). Бразилия и США являются мировыми лидерами по производству плодов и обеспечивают 42 % всей мировой потребности. Другие крупнейшие цитрусопроизводящие страны это Испания, Италия, Египет, Мексика, Китай, Индия.

Центрами видового разнообразия цитрусовых являются Китай и юго-восточная Азия, где эти плодовые растения культивируются уже более 4000 лет. Цитрусовые культуры произрастают в более ста странах мира и предпочитают тропический и субтропический климат. Жизненная форма -вечнозеленые кустовидные деревья, очень чувствительные к изменению температуры, особенно в моменты активного роста и созревания плодов, критическими температурами являются -8-10 °С. В следующем ряду приведена морозоустойчивость от наименьшей до наибольшей: цитрон, лайм, лимон, грейпфрут, сладкий апельсин, танжерин (и его гибриды), кислый апельсин, кумкват (кинкан), понцирус трехлисточковый (и его гибриды) (Saunt, 1990; Singh, Rajam, 2009).

На Черноморском побережье России главным лимитирующим фактор возделывании цитрусовых являются отрицательные температуры. В связи с этим, основное направление агротехники цитрусовых в этой зоне -разработка систем укрытий и повышение морозостойкости растений.

Многолетние исследования, предпринятые с целью получения новых морозоустойчивых сортов, так и не привели к получению устойчивых генотипов ни у одного из видов цитрусовых (Mauk, Shea, 1994; Singh, Rajam, 2009, Febres et al., 2011).

Традиционная селекция цитрусовых в мире практикуется много десятилетий, и непреодолимыми препятствиями для нее являются высокая гетерозиготность, стерильность пыльцы/семяпочек, долгий ювенильный период (8-15 и более лет), нуцеллярная полиэмбриония и апомиксис (Koltunow, 1995). Далее более подробно рассмотрим эти особенности.

Все виды цитрусовых культур в генетическом отношении очень близки между собой и, как правило, имеют одинаковое (2п =18) число хромосом, что обусловливает легкое переопыление и возникновение межвидовых гибридов. Многовековое переопыление между этими гибридами способствовало появлению большого количества новых генотипов -организмов с определенными унаследованными качествами (http://gryadka.net/).

Высокая степень спонтанной гибридизации между различными таксонами, и, как следствие, высокая гетерозиготность семян цитрусовых создают проблемы для селекционеров. При этом в гибридах чаще всего проявляются отрицательные признаки родителей, которые носят доминантный характер наследования (Febres et al., 2011). Данная биологическая особенность послужила главной причиной того, что до сих пор нет общепринятой всеми неоспоримой таксономической системы цитрусовых, т.к. сложно определить происхождение многих таксонов. Еще одной причиной путаницы в их таксономической системе является высокая подверженность почковым мутациям, образование химер и соматических гибридов. Некоторые авторы предлагают интересное объяснение последнему, утверждая, что в результате прочного симбиоза растения с грибами, мицелий гриба, обитая в сосудистых тканях деревьев цитрусовых,

вырабатывает токсины, которые могут влиять на митотические деления в почках цитрусовых на молекулярном уровне, приводя к возникновению почковых мутаций (Керкадзе, Трапаидзе, 1982).

Другой характерной особенностью многих ценных промышленных видов цитрусовых является стерильность пыльцы и семяпочек. Высокая степень стерильности наряду с партенокарпией необходима для производства бессемянных плодов. Однако для получения гибридов эта особенность является нежелательным признаком и затрудняет селекцию.

Следующая особенность рода Citrus это полиэмбриония. Она подразделяется на 2 типа: гаметофитная и спорофитная. Гаметофитная полиэмбриония включает апогаметы и апоспоры, тогда как спорофитная заключается в образовании зародышей из тканей нуцеллуса, интегумента, делением зиготы или из эндосперма (Cameron, Gaber, 1968; Batygina, Vinogradova, 2007). За исключением последних двух, эти различные формы полиэмбрионии связаны с апомиксисом и определяются как неполовое размножение семенами (Savidan et al., 2003).

Нуцеллярная эмбриония является препятствием в селекции привоя. Когда берется материнское растение с этой чертой, селекционеру приходится затратить много материальных и трудовых ресурсов, чтобы получить популяцию, что связано с продолжительным ювенильным периодом, который может длиться от 5 до 15 лет в зависимости от вида. В то же время, нуцеллярная эмбриония рассматривается как важная характеристика для производства подвоев, поэтому селекционеры при подборе подвоев выбирают родителей, которые дают высокий процент нуцеллярных семян и мало половых зародышей.

Перечисленные здесь биологические особенности цитрусовых культур часто являются препятствиями для селекции. Преодолеть эти проблемы возможно биотехнологическими приемами, в основе которых лежит метод культуры тканей, позволяющий размножать и сохранять ценные генотипы in

vitro. Биотехнологические исследования на цитрусовых культурах ведутся в мире уже более 60 лет и за это время достигнуты высокие результаты: получены новые сорта методами генетической трансформации, соматической гибридизации, расшифрованы геномы некоторых видов, выделены целевые гены. Однако, до настоящего времени имеется масса нерешенных проблем не только в генетической трансформации, но и в области регенерации и культивирования тканей некоторых видов и сортов цитрусовых.

1.2. Культура тканей, как основной инструмент биотехнологии

цитрусовых

Культура растительных тканей включает в себя набор приемов, методов и стратегий in vitro, которые входят в группу технологий под общим названием биотехнология растений. Культура тканей используется для микроразмножения и оздоровления посадочного материала, повышения разнообразия гермоплазмы, являясь инструментом в помощь селекционерам. В настоящее время протоколы культуры тканей разработаны для большинства сельскохозяйственных видов, хотя оптимизация их все еще требуется для многих видов, особенно древесных растений. Методы культивирования тканей в сочетании с молекулярными методами с успехом используются для получения растений с заданными признаками путем переноса целевых генов. Методы культуры протопластов, пыльников, микроспор, семяпочек и зародышей используются для создания новых генетических форм, как правило, путем получения гаплоидов. С помощью культуры клеток также получают сомаклональные и гаметоклональные вариации с высоким селекционным потенциалом. Культивирование единичных клеток и меристем применяют для устранения патог