Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ"



На правах рукописи ДАНИЛОВА Татьяна Викторовна

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДОВ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) В КУЛЬТУРЕ ПЫЛЬНИКОВ IN VITRO И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ

Специальность 06.01.05 — селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Диссертационная работа выполнена на кафедре селекции и семеноводства полевых культур Московской сельокохозяй стве-шой академии им К А Тимирязева и в лаборатории «Новые технолог! I размножения растений» Главного ботанического сада им Н В Цицнна, РАН

Научные руководители доктор сельскохозяйственных наук, профессор Ю. Б. Коновалов; кандидат сельскохозяйственных наук О. И. Молканова.

Официальные оппоненты дсктор биологических наук В. В. Мазин; кандидат биологических чаук О. Г. Семенов.

Ведущее учреждение—Научно исследовательский институт сельского хозяйства центральных районов нечерноземной золы

Защита диссертации состоится 2000 г

в /V ч на заседании диссертационного совета Д 120 35 04 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, ул Тимирязевская, 49 Ученый совет МСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ МСХА

Автореферат разослан о^уье^л 2000 1

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат сельскохозяйственны

наук

■1

/ Р. Р. Усманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации. Методы биотехнологии позволяют , существенно повысить эффективность селекции. Можно утверждать, что в ближайшее время первое место по перспективе широкого использования будет принадлежать гаплоидии. Распространенным методом получения гаплоидов пшеницы является культура пыльников in vitro. Андроклинные дигаплоидные линии гомозиготны, т.е. обладают стабильными рекомбинантными генотипами. Однородные популяции гомозиготных дигаплоидов легче оценить по хозяйственно-ценным признакам, тогда как на свойства растений в сложных популяциях ранних гибридных поколений (из которых обычно производят отборы), оказывают влияние внутрипопуляционные взаимодействия и гетерозисный эффект. Поскольку расщепление в популяции удвоенных гаплоидов аналогично расщеплению гамет, объем популяции, из которой производят отборы, а, следовательно, и площадь посева могут быть значительно уменьшены. Применение гаплоидных растений позволяет сократить сроки выведения сорта самоопылителей на 3-4 года. Использование метода гаплоидии в селекции сдерживается чрезмерно низким выходом гаплоидных растений, получаемых in vitro. Поэтому в представленной работе осуществлен поиск оптимальных условий культивирования, которые позволили бы получать стабильно высокий процент гаплоидных регенерантов. При использовании метода гаплоидии в практической селекции неизбежно возникают следующие вопросы: соответствует ли спектр рекомбинантных генотипов, наблюдаемый в популяции удвоенных гаплоидов, спектру популяций юлученных традиционными методами, вызывают ли применяемые методики изменение наследственности растений.. Поэтому в работе были изучены агрономические свойства линий удвоенных гаплоидов и проведен сравнительный анализ расщепления по маркерному признаку в популяциях удвоенных гаплоидов и в F2. полученным обычным путем.

Цель н задачи исследований. Не существует единого мнения об оптимальном составе питательной среды для культивирования in vitro пыльников Triticum aestivum L., (а именно, ее консистенции и типе источника углерода) который обеспечивал бы надежное получение гаплоидных растений разных генотипов, а свойства линий удвоенных гаплоидов не всегда соответствуют ожидаемым от данной комбинации скрещивания. Исходя из этого, были поставлены следующие цели:

• изучить влияние консистенции и Сахаров питательной среды на выход гаплоидных растений Triticum aestivum в культуре пыльников in vitro;

• изучить характер наследования и, в частности, наследования по материнской линии способности к андрогенезу in vitro;

ЦЕНТРАЛЬНАЯ В НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА !

МОСК. С- . 1Д0МИИ |

ИМ. К ~ .^ЬулЗД^, дД

Инв.

• изучить возможность гаметоклональной изменчивости и гаметного отбора а процессе получения андрокчинных гаплоидов

Для достижения поставленных целей предстояло, используя набор гибридных комбинации яровой пшеницы, решить следующие задачи.

• изучить влияние агара и Сахаров (сахарозы, глюкозы и мальтозы) питательной среды на выход эмбриоидов, регенерантных растений и долю альбиносных регенерантов в культуре пыльников m vitro,

• провести сравнитечьный анализ способности к андрогенезу in vitro реципрокных гибридов,

• провести сравнительный анализ расщепления по маркерному признаку в популяциях удвоенных гаплоидов и популяциях гибридов второго поколения,

• изучить агрономические свойства линий удвоенных гаплоидов в сравнении с родите и.скимк линиями и стандартным сортом

Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований показшо наличие '»ффекта материнского растения и комплементарный характер наследования способности к андрогенезу in vitro мягкой пшеницы Изучены агрономические свойства линий удвоенных гаплоидов в сравнении с родитечьскими сортами и стандартом, что продемонстрировало высокую эффективность применения андроклинных гаплоидов в селекции мягкой пшеницы Даны рекомендации по использованию для культивирования пыльников жидких цитатетьных сред, содержащих в качестве источника уперода глюкозу или мальтозу

Практическая значимость работы Результаты работы станут основой для дальнейшего усовершенствования методики культуры пыльников in vitro и будут использованы для широкомасштабного получения гаплоидов пшеницы в целях практической сепекции Порученные в процессе работы линии удвоенных гаплоидов яровой пшеницы будут включены в селекционный процесс лаборатории селекции и семеноводства почевых культур МСХА

Апробация результатов . диссертации Основные положения диссертационной работы были представлены и доложены на заседании кафедры селекции и семеноводства полевых культур (1999 г), на научных конференциях молодых ученых и специалистов ТСХА 1998 и 1999 г.

Публикации. Материалы исстедований опубчикованы в четырех печатных работах.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материал и методику исследований, две главы экспериментальной части, выводы Работа содержит 30 таблиц, 12 рисунков Список литературы включает 142 источника, из которых 107 на иностранном языке

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Получение дигаплоидных растений. Для решения поставленных задач были подобраны сорта яровой пшеницы (Triticum aestivum L.), различающиеся по маркерным признакам (остистые - безостые, высокорослые - карликовые, с опушенными колосковыми чешуями - без опушения, устойчивые к определенной расе бурой ржавчины - поражаемые), и агрономическим показателям (сроки колошения, урожайность). В таблице I приведено описание гибридов, сортов и линий, использованных в разные годы в качестве доноров пыльников для культуры in vitro.

Таблица 1. Генотипы донорных растений

№ Гибридная комбинация Комбинации свойств с указанием кодирующих генов

У с?

1 Яровой аналог Мироновской 808(8) Tonf Pouce. Rht3 Яровой аналог Мироновской 808 Короткостебельный (КЫЗ) х высокорослый

2 Aurore . Альбидум1125-79л Красные колосковые чешуи х белые

3 Agatha Саратовская 29 Короткостебельный, устойчивый к бурой ржавчине (№11, Ьг9) х высокорослый, неустойчивый

4 Новосибирская 67 АНК-12 Высокорослый х короткостебельный (Ши2)

5 Саратовская 29 Пысар 29 Неустойчивый к бурой ржавчине х устойчивый (Ьг19)

б Яровой аналог Мироновской 808 Яровой аналог Мироновской 808(8) Siete Cerros 66, Rhtl Высокорослый х короткостебельный (1Ш1)

7 Calanda Иволга Остистый х безостый

& Линия 294h-4 Линия 431h-10a-15r Низкорослый, скороспелый х высокорослый, позднеспелый

9 Новосибирская 67 АНК-2 Неустойчивый к бурой ржавчине х устойчивый (ЪгТг)

10 Новосибирская 67 Эгисар 29 Неустойчивый к бурой ржавчине х устойчивый (Ьг9)

11 Calanda

12 Иволга

13 АНК-12

14 Линия 431h-10a-15r

15 Линия 294h-4

16 Иволга Calanda Безостый х остистый

17 Линия 43 lh-10a-15r Линия.294Ь-4 Высокорослый, позднеспелый х низкорослый, скороспелый

18 Иволга Линия 35/5 Безостая х остистая

19 Линия 35/5 Иволга Остистый х безостый

2Ü АНК12 Линия 35/5 Безостый, короткостебельный (1Ш2) ж остистый, высокорослый

21 Линия 35/5 АНК12 Остистый, высокорослый х безостый, короткостебельный (ЯЬ12)

22 Линия 35/5 Линия 294h-4 Остистый, позднеспелый х безостый, раннеспелый

23 Линия 294h-4 Линия 35/5 Безостый, раннеспелый х остистый, позднеспелый •

Продолжение таблицы 1

24 Линия 35/5 Линия 431h-10a-15r |Остистын х оезостыи

Линия 431h-10a-15r Линия 35f5 Безостый х остистыи

26 Линия 431 h-10а-15г Веиогинум 693 Нет опушения х опушенные колосковые чешуи

Ï) Линия 35/5

Растения - доноры пыльников - гибриды Fi, сорта и линии выращивали в поле или в теплице Побеги срезали в фазу выхода в трубку. Срезанные побеги 6-8 дней содержали в темноте при температуре 5±1°С Стадию развития микроспор оценивали микроскопированием непосредственно перед началом культивирования пыльников Колосья стерилизовали в 0,1% растворе диацида 7 минут. Для культивирования пыльников использовали среду MN6 [Chu С С et al 1990] с добавлением сахарозы, пюкозы или мальтозы в концентрации 0,25 моль/л Растворы витаминов, гормонов и Сахаров стерилизовали фильтрованием Пыльники культивировали при температуре 28-30°С в темноте, по 30 пыльников в 5 мл среды Каждый вариант опыта включал в среднем 220 культивируемых пыльников Сформировавшиеся эмбриоиды переносили на среду «190-2» [Zuang, Jia, 1983] и культивировали при температуре +10°С и фотопериоде 16 ч-день, 8 ч-ночь Хорошо развитые регенерантные растения (высота 10-15 см, 5-6 листьев, 3-5 корешков) обрабатывали колхицином (0,1% раствор с добавлением 2% DMSO) в течение 5 часов при комнатной температуре, в раствор погружали точку роста, затем растения промывали в проточной воде в течение часа и высаживали в почву

Обработку данных проводили, используя ф-преобразование Фишера для долей (выход эмбриондов или регенерантов на 100 культивируемых пыльников) с введением поправки Иейтса [Лакин, 1990] Существенность влияния факторов на результаты опыта опредеаяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа небольшой группы данных без повторностей [Зайцев, 1991]. Для оценки существенности отличия опытных вариантов от стандарта (агаризированная среда, содержащая сахарозу), вычисляли критерий Стьюдента Для оценки существенности различий между вариантами вычисляли доверительный интервал для доли [Лакин, 1990] Для асгх статистических оценок использовали 5% уровень значимости

2 Полевой опыт. Агрономические свойства линий удвоенных гаплоидов Посев производили в 1999 году на участке с выровненным фоном лаборатории селекции и семеноводства полевых культур МСХА Метеорологические условия 1999 года сильно отличались от среднемноголетних- начало аегетации (май) - пониженная температура, июнь, июль - недостаточное количество ссадхсв, среднесуточная температура выше среднемноголетней В опытг изучали линии удвоенных гаплоидов, полученные от трех хомбинаций скрещивания1 1, 7 и 8 (таблица 1) - 2, 16 и 18 линий соответственно

Повторность трехкратная.' Варианты опыта были организованы в блоки, каждый включал набор линий удвоенных гаплоидов, полученных от данной комбинации скрещивания, 2 родительские линии, стандартный сорт (Энита) и Fz, полученные обычным путем. Рядки длиной 1м располагали поперек полос, расстояние между рядками 30см, 10 растений в рядке. Семена высевали вручную. Такой способ посева обеспечивал равномерное заглубление семян, дружные всходы, одинаковую площадь питания и сводил к минимуму взаимное влияние растений. Линии удвоенных гаплоидов высевали на двухрядковые делянки, линии родителей и стандарт - по 6 рядков, F2 — 12 рядков. Крайние растения рядков и четыре рядка в начале и в конце блока служили защиткой. Расположение делянок в повторении было систематическим. Обработку опытных данных проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ [Доспехов, 1985]. Для оценки существенности отличий между вариантами вычисляли доверительные интервалы. Для анализа расщепления по маркерным признакам в популяциях удвоенных гаплоидов и F2 применяли критерий х2. Все оценки различий между вариантами проводили на 5% уровне значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Выход гаплоидных эмбрноидов и регенерантов пшеницы в зависимости от состава питательной среды, генотипа и условий выращивания донорных растений. В этой части работы проводилось сравнение эффективности использования трех углеводов — глюкозы, сахарозы и мальтозы в жидких . и агаризированных питательных средах при культивирстнии пыльников яровой пшеницы. Согласно .результатам дисперсионного анализа, оба фактора (генотип и состав питательной среды) существенно влияли на выход эмбриоидов. Хотя генотипы сильно различались по способности к андрогенезу in vitro, более чем для половины из них более эффективными оказались . жидкие среды (без агара). Так, для трех из тринадцати генотипов, включенных в опыт 1997 г. (растения - доноры выращивали в теплице), на агаризированной среде с сахарозой эмбриоиды либо не были получены вообще, либо их количество не превышало 1 на 100 пыльников (гибриды №2, 10 и линия №13), тогда как на жидкой среде с глюкозой выход эмбриоидов для этих генотипов составил 6.5, 33.3 и 66.7 соответственно, а для гибридов № 1, 7 и 8 на жидких средах он был больше в 25 раз. Исключением оказался гибрид № 9, для которого стандартная среда — агаризированная, включающая сахарозу, была оптимальной. Для гибридов № 1, 2, 7 и 8 выход регенерантов был пропорционален выходу эмбриоидов. Для гибрида № 3 были получены эмбриоиды на всех вариантах сред, но способными к регенерации оказались только эмбриоиды с агаризированной среды, содержащей глюкозу. Способность к регенерации в условиях данного

опыта си1ыю варьировала в зависимости от генотипа и в лучшем случае составляла 64,3 "'«, включая альбиносы, и 50 %, если брать в расчет только зеленые растения Для наиболее отзывчивых генотипов на жидкой среде с глюкозой было получено более 100 эмбриоидов (гибрид № 8) и 20 зеленых регеиерантов (гибриды № 7, 8) в пересчете на 100 культивируемых пыльников Соотношение зеленых и альбиносных регенератов зависело от генотипа и состава питательной среды и изменялось от 25 7 до О 5, хотя в отдельных случаях получали либо только зеленые растения, либо только альбиносы

Описанные тенденции сохранялись в следующем опыте 1947 года, когда донорные растения выращивали в поле Для половины генотипов (гибриды 3, 7, 8, 9, линии 11, 14) более эффективными оказались жидкие среды За исключением линии 14 (агаризированная среда с мальтозой), для перечисленных генотипов выход эмбриоидов на жидких средах был в 2-10 раз выше, чем на агаризированных средах с теми же сахарами Процент регенерации »мбрноидов изменя-ся в зависимости от генотипа и питательной среды от 250% (в случае лолиэмбриоидов - сложных структур, состоящих из нескольких )мбриоидов, полученных на средах с мальтозой) до 0%

Для тринадцати из восемнадцати генотипов испытываемых в 1948 г (доноры пыльников выращены в поле) существенно больший выход эмбриоидов по сравнению с агаризированнои средой, содержащей сахарозу, был получен на жидких средхх Пять оставшихся генотипов оказались слабо отзывчивыми или вообще не дхли эмбриоидов ни на одной из испытываемых сред Для грех генотипов - гибридов 25, 26 и линии 14 выход эмбриоидов на жидкой среде, содержащей мальтозу, был существенно выше, чем на пяти других вариантах сред Та же гипенция прослеживается и для гибрида 17. Нужно отметить, что материном и формой гибридов 17, 25 и 26 является линия 14, которая проявила высокую способность к андрогенезу in vitro на жидкой среде с мальтозой (79,6 эмбриоидов на 100 культивируемых пыльников) Все гибридные комбинации, включающие эту линию (8, 17, 24, 25, 26), показали неплохие результаты Гибриды 7 и 8 показали наилучшие результаты на жидкой среде с сахарозой, 7 и 17 — на жидкой среде с глюкозой Результаты использования жидких питательных сред, содержащих различные сахара, приведены в таблице 2

Таблица 2. Процент генотипов, превосходящих контроль (агаризированная среда с

сахарозой) по выходу эмбриоидов и регеиерантов

Опыт Количество | Сахароза Глюкоза | Мальтоза

испытываемых ')чбр генотипов Рег-ты Эмбр Рег-ты | Эмбр Рег-гы

1Ч97(тетнца) 13 i 30 8 23 0 46 2 23 0 1 - 1 -

1Ч97(поле» 12 ¡41.7 41.7 41.7 25 0 1 41.7 I 33 5

1Ч98(поле) 16 | 62 5 18.8 56 3 31 3 1 62 5 ¡«0 0

Для оценки влияния материнского "растения на способность яровой пшеницы к андрогенезу in vitro были проведены реципрокные скрещивания, и пыльники полученных гибридов Fi введены в культуру. В таблице 3 приведены значения критерия Стьюдента, рассчитанные для выхода эмбриоидов пар реципрокных гибридов. Четыре пары' гибридов из шести рассматриваемых показали существенные отличия по выходу эмбриоидов на разных вариантах сред. Генотипы 20 и 21 оказались слабо отзывчивыми; для них и для пары 22 - 23 существенных различий не выявлено.

Таблица 3. Критерии Стьюдента рф) для выхода эмбриоидов реципрокных гибридов.

X» п/п Пары реципрокных гибридов (комбинация прямого скрещивания) сж ст пж гт мж мт

1 7-16 (Каланда х Иволга) •2,33 0,99 2,47/ 1,59 0,36 0,34

2 8-17 (Линия 294И-4 х Линия 431Ь-10а-15г) >12,47 1,78 .3,15 * ■ - 2,03 • 0,20 1,92

3 18- 19 (ИволгахЛиния35/5) 4,89 0,21 0,97 0,20 №29 k 0,12

4 23-22 ( Линия 294И-4 х Линия 35/5) 0,09 0,06 1,93 0 1.33 0,06

5 24-25 ( Линия 35/5 х Линия 431Ь-10а-15г) шИ 0,85 1,21 5.41 »Xa'V'I 0,71'

6 20-21 (АНК12х Линия 35/5) 0,02 0,01 0,16 0,09 0,50 0,65

Обозначения:

-отличие / 7 - существенно, стандарт - агаршированная среда с

сахарозой; с - среда с сахарозой, г - с глюкозой, м - с мальтозой,'

ж - жидкая, т - твердая (агаризированная), t st=l,96 В опыт были включены как гибриды, так и родительские формы. Интересно отметить, что родителями реципрокных гибридов 7 и 16, образующих эмбриоиды в культуре пыльников, являются чистолинейные сорта Иволга и Каланда, не давшие эмбриоидов ни на одной из испытываемых сред. Можно предположить, что в данном случае гены, отвечающие за способность к андрогенезу in vitro, действуют как комплементарные.

При подборе компонентов для скрещивания важно учитывать, что на результаты работы может существенно повлиять выбор материнского растения.

Из пятнадцати генотипов, использованных в опытах 1997 года, десять были включены в оба опыта, что позволило оценить влияние на выход эмбриоидов генотипа (10 вариантов), питательной среды (4 варианта) и условий выращивания донорных растений (2 варианта). Была проведена статистическая обработка данных, полученных в ходе опытов 1997 года с применением

преимущественно в верхнем слое (0-10 см) почвы. Наименьшая общая засоренность почвы семенами сорных растений в 2000 г. в слое 0-20 см была на поверхностно — отвальной (Сочетание 2) обработке. Применение соломы совместно с полным минеральным удобрением в среднем по всем системам обработки и гербицидов способствовало существенному увеличению потенциальной засоренности семенами сорных растений в сравнении с количеством семян по фону без удобрений. Последействие гербицидов в среднем по всем системам обработки и удобрений проявилось не существенно.

Потенциальная засоренность почвы вегетативными органами размножения в среднем в год закладки опыта (1995) в слое 0-20 см составила 2927 см/м2, в том числе в слое 0-10 см длина органов размножения достигала 2389 см/м2, а в слое 10-20 см - 537 см/м2; сухая масса органов размножения в слое 0-10 см составляла 71,7 г/м2, а в слое 10-20 см - 21,5 г/м2, при общей биомассе в слое 0-20 см - 93,18 г/м2. После проведения обработки почвы в ■течение 6 лет длина корней размножения заметно уменьшилась (табл. 3).

Таблица 3

Роль факторов в изменении длины органов вегетативного размножения многолетних _сорных растений (см/м2, второй этап опыта, 2001)_

Вариант Слой почвы, см

0-10 10-20 0-20

А. Обработка почвы, «О» !

Отвальная, «0|» 277,7 132,5 410,2 !

Сочетание 1, «02» 309,0 129,3 438,3

Сочетание 2, «03» 222,2 208,9 431,1

Поверхностная, «04» 521,2* 173,9 695,1*

В. Удобрение, «У»

Без удобрений, «У |» 413,0 175,2 588.2

Солома, «У3» 411,2 162,3 573,5

Солома + Х'РК, «У5» 309,5 131,0 440,5

С. Гербицид, «Г»

Без гербицидов, «Г[» 350,9 191,6 542,5

С гербицидами, «Гз» 314,0 130,9 444,9

Наименьшее снижение длины по сравнению с исходными величинами отмечалось при ежегодной поверхностной обработке. Существенных различий по этому показателю между отвальной и системами с сочетанием обработок не наблюдалось. Однако наименьший уровень засоренности почвы вегетативными зачатками в слое 0-10 см был по системе поверхностно-отвальной обработки (Сочетание 2). Это можно объяснить применением вспашки через 4 года (1999) и своевременными поверхностными обработками. В среднем по фонам удобрений и гербицидов основная масса корней размножения по всем системам обработки почвы формировалась в верхней части, пахотного горизонта. Наметилась тенденция к снижению длины органов вегетативного размножения при внесении одной соломы и особенно соломы с минеральными удобрениями

дигаплоидов преобладали низкорослые, скороспелые и малопродуктивные При использовании в качестве донорных растений гибридов, родителями которых были остистые и безостые формы, в популяциях удвоенных гаплоидов преобладали остистые растения

В опытах 1997 - 1998 г наибольшее количество линий удвоенных гаплоидов было получено для комбинаций скрещивания № 7 и № 8 (16 и 18 соответственно) Эти линии, а также 2 линии удвоенных гаплоидов от скрещивания № 1 (таблица 5) были изучены в опыте Анализ линий проводили по следующим показателям продуктивность (масса зерна с растения, масса 1000 зерен, число зерен с растения, продуктивная кустистость), высота, срок колошения

Таблица 5. Средняя масса 1000 зерен, г, число зерен и средняя масса зерна с одного

растения г (комбинация скрещивания № 7)

X» Генотип Масса 1000черен Число черен Масса черна с растения

Значение Откл от ст Значение Откл от ст Значение Откл отст

1 ')иита 28 83 — 164 48 — 4 71 —

1 И йот га 26 78 -2 05 151.14 -13 34 4 04 -0 67

3 Каланаа 27 41 -1.43 149 36 -15 12 4 10 -0 61

4 ДГ7 1 24 96 Р1 1.13 143 35 -21.13 4.29 -0 41

5 ДГ7 2 32 41 Р! Р2 3,5£ 155 52 -8 96 4.99 р1 0 28

6 ДГ7 3 25 77 -3 06 147 40 -17 08 3.80 -0.91

1 ДГ7 4 30 1 р| 1 27 128.82 -35 66 3 87 -0 84

8 ДГ 7 5 :чч) 1 09 124 42 -40 06 3,74 -0.97

9 ДГ7 6 34.14 р1 р2 531 134.04 -30 44 4 58 -0 13

10 ДГ 7 7 28 04 -0 20 1 127.20 -37 28 3 65 -1.06

11 ДГ 7 8 30 И Р! 1 27 "118 97 р| р2 -45 51 3.56 -1.14

12 ДГ 7 Ч 29 60 0 77 130,10 -34 38 3.8<* -0 85

13 ДГ7 10 26 75 -2 08 154 49 -9 99 4.14 -0 57

14 ДГ7 11 29 34 051 143 10 -21.38 4.18 -0 52

15 ДГ7 12 26 95 -1 88 171.26 6.78 461 -0 10

16 ДГ7 13 29 03 0,20 1ь7.94 3.46 4 85 0.14

17 ДГ 7 14 28.08 -0 75 172 52 8 04 4.84 0.14

18 ДГ7 15 27,81 -1,03 158 63 -5,85 4,42 -0.29

19 ДГ7 16 27.81 -1 02 130,43 -34.05 3,62 -1.091

НСР05 3.155 26,935 0,905

Р Фишера факт 3.358 3,144 2.089

Обозначения ¡Г ] - отклонение от стандарта существенно

р1 р2 - отклонение от 1-ой, 2-ой родительской линии существенно

Согласно данным таблиц 5 и б, фактор (генотип), существенно влиял на изменчивость признаков (масса 1000 зерен, число зерен и масса зерна с растения) линий удвоенных гаплоидов, полученных от скрещиваний №7 и№8.

Родительские сорта Иволга и Каланда (комбинация скрещивания №7) не имели существенных отличий по этим признакам и не отличались от стандарта. Линии удвоенных гаплоидов ДГ-7.2 и ДГ-7.6 существенно превосходили стандарт и оба родительских сорта по массе 1000 зерен. Около половины (7 из 16) линий удвоенных гаплоидов имели существенно меньше зерен на одно растение по сравнению со стандартом. У остальных линий удвоенных гаплоидов число зерен было промежуточным между родительскими линиями и не отличалось существенно от стандарта. Масса зерна с одного растения была существенно ниже по сравнению со стандартом у 5 линий удвоенных гаплоидов, тогда как различия между стандартом и родительскими линиями были несущественными. У остальных линий масса зерна с растения была на уровне стандарта; у большинства удвоенных гаплоидов этот показатель колебался между значениями родительских линий. . '

На рис. 1,2, 3 отображены результаты измерения продуктивной кустистости, сроков колошения и высоты удвоенных гаплоидов. Согласно результатам однофакторного дисперсионного анализа влияние фактора (генотипа) на указанные параметры было существенным.

Й

I

Рис. 1 Сроки колошения (комбинация скрещивания №7)

&

5 4 3 2 1

С

Рис. 2 Продуктивная кустистость (комбинация скрещивания №7)

Сопасно рис 2, Каланда, а также две линии удвоенных гаплоидов (ДГ-7 12 и ДГ-7 13) существенно превосходили стандарт по продуктивной кустистости, но все линии удвоенных гаптоидов и мети промежуточное значение этого показателя по сравнению с родительскими линиями

Сроки колошения линий удвоенных гаплоидов (рис 1) в большинстве случаев были промежуточными между таковыми у родителей Только одна линия -ДГ-7 2 выколашивалась существенно раньше более скороспелого ролителя - Квивл^ь,. Высота половины линий удвоенных гаплоидов была существенно меньше стандарта (рис 3) Один из родителей (Иволга) был также существенно ниже стандарта Две линии (ДГ-7 3 и ДГ-7 4) были существенно ниже низкорослого родится, а одна линия (ДГ-7 2) существенно превосходила более высокорослого родителя - Каланду Высота большинства линий удвоенных гаплоидов была промежуточной между родительскими линиями

Таблица 6. Средняя масса 1000 зерен, г, число зерен и средняя масса зерна с одного растения, г (комбинация скрещивания 8)

X» Генотип Масса 1000 зерен Чис'о зерен Масса зерна с растения

Значение 1 Откл от ст Значение Откл от ст Значение Отхл от ст

I Ошгта 25,98 | 137,30 — 3,56 —

2 линия 43111-10а-15г 35.30 9,33 124,48 -12.82 4,37 0 81

3 линия 2Ч4И-4 25.04 -0,93 117.89 -19,41 2.94 -0 62

4 ДГ 8 1 | 27,77 Р1 Р2 1,79 155 84 р2 18,54 4,32 р2 0,76

5 ДГ 8 2 28.87 Р1 Р2 2.90 107,48 -29,82 3,08 Р1 -0,48

6 ДГ 8 3 31,63Р1 р2 5,66 115,83 -21,47 3 60 0 04

7 ДГ 8 4 31.79 Р1 Р2 5,81 192.0 р1р2 54,70 6,10 Р1 р2 2.54

8 1ДГ85 27,40 р| 1,43 137,74 0,44 3.79 0 23

Ч 1ДГ86 28,70 р! р2 2,72 148,95 11,64 4.24 Р2 0 68

10 | ДГ 8 7 | 26 62 р1 0,65 112,37 -24,94 3.00 Р1 -0.56

Я) 4) 2)1 3) К>|

А

Дя

я « £3 сч т чЛ> -ОГ— ооф. о—-ГМСЧТГ'Л-О о <3 г ^ » [ г-» г- г- Г4» г- Г4 г*»

Рис 3 Высота растений, см (комбинация скрещивания №7)

Продолжение таблицы 6

и ДГ 8.8 27,15 Р1 1,17 142,61 5,30 3,92 • 0,36

12 ДГ 8.9 ¿1,92 р1р2 5,94 119,11 -18,19 3,81 0,25

13 ДГ 8.10 37,23 1,2 11,26 129,81 -7,49 1,25;

14 ДГ8.И 27,06 Р1 1,08 146,73 9,43 3,96 0,40

15 ДГ 8.12 27,24 Р1 1,26 143,05 5,75 3,89 0,33

16 ДГ 8.13 31,58 р1 р2 5,60 106,53 -30,78 3,39 -0,17

17 ДГ 8.14 29,71 Р1 р2 , 3,73 115,78 -21,52 3,45 -0,11

18 ДГ 8.15 32,40 Р1 р2 6,42 109,79 -27,51 3,57 0,01

19 ДГ 8.16 31,59 Р1 р2 . й: 5,61 142,74 5,43 4,53 Р2 0,97

20 ДГ 8.17 27,43 Р1 1,46 1,23

21 ДГ 8.18 <&3,30р2 -• - 7,32 137,54 0,23 4,57 Р2 1,01

НСР 05 2,920 31,439 1,017

Р Фишера факт. (Р05=1,870) 11,900 4,040 ' 4,284

Обозначения: отклонение от стандарта существенно

р 1, р2 — отклонение от 1-ой, 2-ой родительской линии существенно.

Линии удвоенных гаплоидов от скрещивания №8 имели промежуточные, по сравнению с родителями значения массы 1000 зерен главного и боковых колосьев, а также всего растения. Отцовская линия 431Ь-10а-15г существенно превосходила стандарт по рассматриваемому показателю. 10 из 18 линий удвоенных гаплоидов также превосходили стандарт по массе 1000 зерен. По числу зерен с растения большинство линий удвоенных гаплоидов также занимали промежуточное положение по сравнению с родителями. Однако линии ДГ-8.4 и ДГ-8.17 существенно превосходили лучшего родителя по этому показателю. Большинство линий удвоенных гаплоидов имели промежуточную по сравнению с родителями массу зерна с главного, боковых колосьев и с растения в целом. Только одна линия - ДГ-8.4 существенно превосходила более продуктивного родителя по массе зерна с растения за счет большего числа зерен. Однако 3 линии удвоенных гаплоидов существенно превосходили стандарт по массе зерна с растения (табл. 6). Родительские линии 294Ь-4 и 431Ь-10а-15г и стандарт не имели существенных отличий по числу продуктивных колосьев на растение. У линий удвоенных гаплоидов этот показатель имел промежуточные значения по сравнению с родителями. По срокам колошения родительские линии существенно отличались между собой и от стандарта (рис.4). Сроки колошения линий удвоенных гаплоидов не выходили за пределы родительских.

Только две линии ДГ-8 7 и ДГ-8 16 выколашивались позже стандарта Родительская линия 294h-4 являлась более низкорослой, чем 431h-10a-15r, и оба родителя существенно отличались от стандарта Линии удвоенных гаплоидов имели промежуточную высоту и только две из них - ДГ-8 2 и ДГ-8 3 оказались существенно ниже низкорослого родителя Пять линий были существенно выше стандарта, а четыре - существенно ниже

Дня комбинации скрещивания были получены только 2 линии Рис 4 Сроки колошения (комбинация удвоенных гаплоидов Оба родителя скрещивания „Ч»8)

относятся к разновидности lutescens, хотя короткостебельный Яровой аналог Мироновской 808(8) Тот Pouce, Rht3 имел остевидные отростки длиной 1-1,5 см на верхних цветковых чешуях Однако одна из двух полученных для данной комбинации линий удвоенных гаплоидов оказалась остистой Среди растений F2 наблюдали только безостые формы и формы с остевидными отростками Возможно, появление такой формы объясняется явлением гаметоклональной изменчивости Обе линии удвоенных гаплоидов были существенно выше карликового родителя и по высоте не отличались от стандарта

Аналнз расщепления по признаку остистости проводили в популяциях линий удвоенных гаплоидов и Fi, полученных от комбинации скрещивания №7. Были учтены все удвоенные гаплоиды как фертильные, так и стерильные, полученные на всех вариантах питательных сред Как в популяциях линий удвоенных гаплоидов так и F2 расщепление по остистости соответствовало ожидаемому по схеме Менделя - 1 : 1 и 3 ■ 1 соответственно ( х2 опыта меньше X2 st ) (таблица 7)

Таблица 7. Результаты статистического анализа расщепления

Популяция Показатель Повторение Остистые Безостые Всего

F 2 1 29 60 89

2 17 59 76

3 16 69 85

г1 2,53

X'st 3 84

Удв гаплоиды 31 21 52

1.92

t^st 3 84

•V

4»

4« « Г

«I

4

■О

5

s yl

ri.

iif,

"il

"ni

ri «

¡л;

S <3 <

il L U L Li tiil ; e * ^ « * a к s feï a É? И kk

Количество линий удвоенных гаплоидов было недостаточным для поведения статистического анализа соотношения остистых и безостых форм в зависимости от питательных сред, использованных для культивирования пыльников. Однако можно отметить, что при использовании жидкой среды с сахарозой среди полученных дигаплоидов преобладали остистые формы.

Анализ показателей продуктивности линий удвоенных гаплоидов двух гибридных комбинаций продемонстрировал, что с помощью метода культуры пыльников можно получать гомозиготные линии, не уступающие, а иногда и превышающие родительские формы по продуктивности. Средние показатели продуктивности линий г удвоенных гаплоидов комбинации №7 превышают родительские. Нужно отметить, что среди них не было отмечено линий, с показателями, существенно меньшими, чем у худшего родителя, зато 2 линии удвоенных гаплоидов существенно превышали обоих родителей по массе 1000 зерен. В среднем масса 1000 зерен дигаплоидов комбинации № 8 меньше среднего родителей, но больше, чем у менее продуктивной формы, а масса зерна с растения больше, чем среднее родительских форм. Эти результаты отличаются от большинства данных, приводимых в литературных источниках: обычно по средним показателям линии дигаплоидов, полученные от одной гибридной комбинации, несколько хуже родителей из-за большой доли низкопродуктивных линий, хотя дигаплоиды с положительной трансгрессией также не редкость. Возможно, объяснение состоит в том, что на протяжении всего опыта условия адаптации гаплоидных регенерантов при высадке в почву были неблагоприятными и на этой стадии растения подверглись жесткому отбору. Так, процент прижившихся растений составлял в среднем 50% и менее. Среди них, как правило, преобладали стерильные растения, оставшиеся гаплоидными. Часть диплоидных растений не дали семян из-за неблагоприятных условий выращивания. Вероятно, этими же причинами объясняется отсутствие дигаплоидов с ярко выраженными аномалиями, хотя среди регенерантов, оказавшихся t в дальнейшем стерильными, наблюдали • карликовые формы.

ВЫВОДЫ

1. Наибольшее влияние на эффективность культуры пыльников in vitro оказывают условия выращивания донорного растения и его генотип.

2. В условиях конкретного опыта состав ».консистенция питательной среды

существенно влияют на выход эмбриоидов, а, следовательно, и гаплоидных

регенерантов в культуре пыльников, причем при культивировании

пыльников на жидких питательных средах, он существенно выше.

Оптимальный источник углерода нужно подбирать с учетом особенностей

генотипа. Замена сахарозы в составе питательной среды мальтозой или

глюкозой может привести к увеличению выхода гаплоидных растений

пшеницы либо за счет усиления индукции андрогенеза, (при использовании

м

пюксмы), либо i.i счет увеличения регенерационной способности гаплоидных »мбриондов (при использовании мальто)ы)

3 Четыре пары реципрокных гибридов из шести рассматриваемых показали существенные отличия по выходу шбриоидов на разных вариантах сред, следовательно, цитоплазма материнского растения влияет на способность гибрида к андрогенезу m vitro

4 Неотзывчивые линии при скрещивании могут давать высоко отзывчивые гибриды Можно предположить, что гены, отвечающие за рассматриваемый признак, действуют как комплементарные

5 Выявлена линия с высокой способностью к андрогенезу in vitro, причем гибриды, полученные с ее участием, также показали хорошие результаты Отзывчивые линии могут быть использованы в селекционном процессе в качестве донора рассматриваемого признака

6 Линии удвоенных гаплоидов имеют промежуточные по сравнению с родителями высоту, сроки колошения и продуктивность Отсутствие малопродуктивных линий удвоенных гаплоидов и линий с ярко выраженными аномалиями можно объяснить воздействием жесткого отбора на этапе адаптации регенерантных гаплоидных растений В целом, метод культуры пыльников in vitro позволяет получать высокопродуктивные гомозиготные линии пшеницы

7 У линий удвоенных гаплоидов не наблюдали отклонений по морфологическим признакам Только одна линия обладала морфологическими свойствами, отличными от родителей Возникновение остистой дигаплоидной линии от скрещивания безостых родителей, возможно, объясняется явлением гаметоклональной изменчивости

8 Условия культивирования пыльников оказывают селективное воздействие на микроспоры пшеницы Среди всех линий, происходящих от скрещивания остистого и безостого сортов, не наблюдали статистически достоверного отклонения от менделевской нормы расщепления, однако отбор гамет был отмечен на питательных средах, различающихся по составу Сахаров Так., среди линий, полученных на среде с сахарозой, преобладали остистые, но для того, чтобы результаты были достоверными, необходимо проанализировать большее количество удвоенных гаплоидов

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для получения гаплоидов пшеницы целесообразно использовать жидкие питательные среды, в качестве источника углерода содержащие глюкозу или мальтозу Применение андроклинных гаплоидов в селекции пшеницы является целесообразным, т к с помощью метода культуры пыльников можно получать гомозиготные линии, не уступающие родительским формам по продуктивности, а иногда и более продуктивные

и

СИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1.Молканова О.И., Данилова Т.В. Выход гаплоидных растений яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) в культуре пыльников in vitro в зависимости от состава Сахаров питательной среды. Известия ТСХА, 1994, вып. 4, с.69-75.

2. Данилова Т.В. Влияние генотипа и Сахаров' питательной среды на выход гаплоидов в культуре пыльников in vitro. Труды научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА 8-10 июня 1999 г.

3. Молканова О.И., Коновалов Ю.Б., Хупацария Т.И., Данилова Т.В. Изучение детерминированности морфогенеза в культуре тканей пшеницы в интересах селекции. Тезисы конференции к 100 - летию Н.В. Цицина, М. 1999 г.

4. Данилова Т.В., Коновалов Ю.Б. Оптимизация условий культивирования in vitro пыльников яровой пшеницы, оценка агрономических свойств линий удвоенных гаплоидов. Тезисы докладов II съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров 1-5 февраля 2000 г., т. 1, с. 101., Санкт-Петербург, 2000.

1б

Обьем 1.0 п л

3-1 чал 191

Тираж ! 1)

Типография Издательства МСХЛ 12755Э. Москва, Тимирязевская уд, д. 44