Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация Deamox-процесса и молекулярно-биологические исследования формирующихся консорциумов микроорганизмов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация Deamox-процесса и молекулярно-биологические исследования формирующихся консорциумов микроорганизмов"

На правах рукописи

■Ч

ТРУХИНА АНАСТАСИЯ ИГОРЕВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ОЕАМОХ-ПРОЦЕССА И

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОРМИРУЮЩИХСЯ КОНСОРЦИУМОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2011

4843966

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Калюжный Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор биологических наук, профессор Ножевнйкова Алла Николаевна

Защита состоится «I Ч> марта 2011 года в 15°" час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, М1"У, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Ведущая организация:

ОАО "МосводоканалНИИпроект", Москва

Автореферат разослан февраля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Наличие в водных системах азотных загрязнений оказывает токсическое воздействие не только на водные организмы, но и на здоровье людей. Так, присутствие в воде нитратов и нитритов вызывают у человека метгемоглобинемшо, рак желудка, отрицательно влияет на нервную и сердечнососудистую системы, на развитие эмбрионов, а также является причиной возникновения некоторых смертельных заболеваний у младенцев. Существующие в России очистные сооружения технически устарели и не приспособлены для удаления азотных загрязнений из высококонцентрированных сточных вод до установленных значений 1ЩК в сбрасываемых обработанных стоках. Таким образом, развитие и совершенствование современных методов очистки сточных вод от азотных загрязнений является весьма актуальной задачей.

В последние годы процесс анаэробного окисления аммония (анаммокс-процесс) нризнан наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным способом удаления аммония из сточных вод. В этом процессе последний в присутствии анаммокс-бактерий окисляется до молекулярного азота, при этом нитрит используется в качестве акцептора электронов.

КН/ + N0/ Ы2 + 2Н30 (1)

Однако необходимый для протекания процесса окислитель (нитрит), как правило, отсутствует в исходных сточных водах. Для решения проблемы нитрита на кафедре Химической Энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова был разработан новый процесс, получивший название ОЕАМОХ (ОЕпйп^тщ АМтопшш ОХ1ёаЦоп). В этом процессе специально селектированная смешанная микробная ассоциация последовательно осуществляет две реакции -конверсию нитрата, который является типичным компонентом сточных вод, в присутствии донора электронов до нитрита:

N03" + 2е"(донор электронов) +2Н"~> Н02" + Н20 (2)

а затем анаммокс-реакцию (1). Для реакции (2) возможно применение как неорганического донора электронов - сульфида (8-0ЕАМ0Х), так и органического -ацетата (0-1)ЕЛМ0Х).

Цели исследования.

Низкая скорость роста анаммокс-бактсрий, время удвоения которых составляет

11 сут, их относительная труднодоступность в природе и сравнительная

3

малоизученность приводит к тому, что запуск и выведение на стабильный режим работы БЕАМОХ-реакторов занимает длительное время и пока не является стандартной практикой. Поэтому первой целью данной работы являлась разработка методологии получения активной микробной популяции (биогранул) для 2-х модификаций ОЕАМОХ-проиесса с использованием в качестве исходного инокулята биомассы с крайне низкой анаммокс-активностью.

Второй целью работы являлась оптимизация 8- и О- модификаций БЕАМОХ-процесса по отношению к ряду операционных параметров:

• РН;

• температура;

• концентрации ионов бикарбоната;

• нагрузка по соединениям азота (НСА) и способ ее достижения.

Несмотря на то, что ранее была показана возможность реализации БЕАМОХ-

процесса на реальных сточных водах, микробиологический анализ формирующихся сообществ микроорганизмов проведен не был. Таким образом, анализ микробного разнообразия БЕАМОХ-процесса с применением современных молекулярно-биологических методов (168 рРНК и ПБН) являлся третьей целью данной работы. Научная новизна работы. Впервые был проведен молекулярно-биологический анализ микробных сообществ, осуществляющих ОЕАМОХ-процесс. Филогенетический анализ биогранул из в-ОЕАМОХ процесса вьивил наличие микроорганизмов, ответственных за автотрофную денитритацию (ТИаиега, ПгюЬасШш и ВеЫ/иготопая йр.) и анаэробное окисление аммония (ПапШтусег $р). П8Н-анализ в- и О-ОЕАМОХ биогранул подтвердил значительное присутствие анаммокс бактерий, среди которых были идентифицированы представители родов «Са. ВгосасНа» и «Са. Киепта»

Предложена методология получения активных биогранул для 2-х модификаций БЕАМОХ-процесса с использованием в качестве исходного инокулята биомассы с крайне низкой анаммокс-активностью. Обе модификации ОЕАМОХ процесса оптимизированы по отношению к таким операционным параметрам, как рН, концентрация ионов бикарбоната, температура, нагрузка по соединениям азота и способ ее достижения.

Практическая значимость работы. Разработана методология запуска DEAMOX-процесса. заключающаяся в предварительном культивировании неадаптированной биомассы в анаммокс-условиях с последующим переводом биогранул в соответствующие DEAMOX-условия.

Установлены оптимальные значения pll, концентрации ионов бикарбоната, температуры, при которых наблюдается наивысшая эффективность удаления азотных загрязнений. Показано, что наилучшая эффективность S-DEAMOX процесса при высоких нагрузках по азотным загрязнениям наблюдается при относительно коротких временах удерживания среды в реакторе (0) в отличие от O-DEAMOX процесса.

Определение кинетичеческих характеристик биогранул in situ по отношению к субстратам анаммокс-реакции показало, что максимальная скорость потребления субстратов снижается с увеличением диаметра биогранул.

Апуобаиия работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: XVI Международная Научная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009); Международный Симпозиум «Environmental Science and Technology» (Шанхай, Китай, 2009); Международная Конференция «Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications» (Архангельск, 2009); Выставка инновационных проектов (Москва, 2009); Международная Конференция "Protection and Restoration of the Environment X" (Корфу, Греция, 2010); 2-ая Международная Конференция "Hazardous and Industrial Waste Management" (Крит, Греция, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 183 источников. Общий объем работы 115 страниц, включая 35 рисунков и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение и литературный обзор Традиционное микробиологическое удаление соединений азота из сточных вод основано на использовании процессов нитрификации и денитрификации и в связи с этим сопряжено с большими расходами на аэрацию (нитрификация) и подачу донора электронов (денитрификация).

В последние годы процесс анаэробного окисления аммония (анаммокс-процесс

Ур.1) признан наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным

способом удаления аммония из сточных вод. Так, анаммокс-процесс может быть

эффективно применен для очистки фильтратов полигонов ТБО и возвратных вод

метантенков после сбраживания первичного и вторичного осадков сточных вод,

стоков после анаэробной обработки пищевых или животноводческих сточных вод и

др. Однако для протекания процесса необходим нитрит, который, как правило,

отсутствует в исходных сточных водах. В связи с этим все анаммокс-технологии

включают дополнительную стадию для получения нитрита, токсичного уже при

концентрации 100 мг/л и оказывающего значительный ингибирующий эффект на

анаммокс микроорганизмы.

Впервые анаммокс-процесс (ANAMMOX - ANaerobic AMMonia OXidation) был

отмечен в 1995г в Нидерландах на пилотной установке, обрабатывающей сточные

воды дрожжевого производства. Позже бактерии, осуществляющие анаммокс-

реакцию, были обнаружены в природных экосистемах, и была доказана их важная

роль в цикле азота наряду с изученными процессами нитрификации и

денитрификации. К настоящему моменту все описанные бактерии, проводящие

анаммокс-реакцию, относятся к пяти разным родам группы анаммокс-бактерий:

"Candidatos Brocadia", "Candidatos Kuenenia", "Candidatus Scalindua", "Candidatos

Anammoxoglobus" и "Candidatus Jettenia", входящие в порядок Planctomycetales,

отдел Planctomycetes, домен Bacteria.

На основе анаммокс-процесса был разработан процесс, получивший название

DEAMOX (DEnitrifying AMmonium OXidation). Этот процесс включает в себя две

стадии: денитратацию (образование нитрита из нитрата) и анаммокс-процесс (Ур. 1).

Стадия образования нитрита из нитрата может осуществляться как в присутствии

неорганического донора электронов, например, сульфида, (Ур. 3), так и

органического донора электронов, например, ацетата (Ур. 4). Образующийся нитрит

сразу же вступает в анаммокс реакцию (Ур. 1).

N03"+0.25HS--»N02- + 0.25S042' + 0.25H+ (3)

N03" + 0.25СН3СОО" -> N02" + 0.5НС03" +0.251Г (4)

Однако возможно дальнейшее окисление нитрита до молекулярного азота -

процесс денитритации. В связи с этим, определение оптимальных условий (рН,

концентрация ионов бикарбоната, температура, НСА и способ ее достижения) для

6

эффективного удаления соединений азота при помощи двух модификаций процесса DEAMOX является важной задачей.

Результаты исследования и их обсуждения Филогенетический анализ автотрофного микробного сообщества, осуществляющего DEAMOX процесс

Для выяснения филогенетического разнообразия микробного сообщества, сформировавшегося в течение длительной работы автотрофного DEAMOX-реактора, был проведен молекулярно-биологический анализ генов 16S рРНК.

С использованием универсального праймера 8-27f-519r для домена Bacteria было получено и проанализировано 66 последовательностей бактериальных генов 16S рРНК. Все клоны были сгруппированы в 41 филотип, относящихся к 8 известным отделам: Proteobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes, Chloroflexi, Firmicutes, Verrucomicrobia, Lentisphaerae, Spirochaetales.

Большинство последовательностей 16S рРНК отдела Proteobacteria (18 из 24 клонов) были наиболее близки к классу /?-Proteobacteria, среди которых 1 клон был наиболее близок к аммонийокисляющим бактериям (АОБ) рода Nitrosomonas, для которых в литературе показана возможность анаэробной конверсии аммония. Также были выявлены филотипы, относящиеся к родам Thauera и Thiobacillus класса ¡Í-Proteobacteria и к роду Desulfuromonas класса b-Proteobacteria, способные осуществлять окисление сульфида как в аэробных, так и в анаэробных условиях (в процессе денитрификации).

С использованием универсального бактериального праймера было обнаружено всего 3 последовательности гена 16S рРНК, относящиеся к отделу Planctomycetes. Последующие исследования со специфичными праймерами выявили значительное разнообразие представителей этого отдела в исследуемом сообществе (22 филотипа), среди которых был обнаружен клон, близкий к анаммокс-бактериям.

С использованием праймера для домена Archaea была получена 51 последовательность генов 16S рРНК, которые были сгруппированы в 13 филотипов, принадлежащих к отделу Euryarchaeota. Большинство филотипов распределилось между порядками Methanomicrobiales, Methanosarcinales и Methanobacteriales, а также были выявлены две предположительно новых группы Euryarchaeota. По

литературным данным, присутствие различных метаногенов объясняется их важной ролью в формировании гранул анаэробной биомассы.

Таким образом, проведенные молекулярно-биологические исследования выявили сложную структуру микробного сообщества автотрофного БЕАМОХ реактора. Выявленные гены 16Б рРНК микроорганизмов, способных осуществлять основные реакции цикла азота и серы в БЕАМОХ процессе, позволили составить общее представление о микробной трофической цепи в реакторе.

Получение анаммокс-активных биогранул

Поскольку задачей данной части работы являлось получение биогранул для запуска БЕАМОХ-процесса и чтобы смоделировать типичную ситуацию, встречающуюся на практике, то преднамеренно использовали образцы (всего 2) стартовой биомассы с низкой анаммокс-активностью и относительно высокими значениями денитрифицирующей и денитритирующей активностей (Табл. 1).

Таблица 1. Основные характеристики биогранул до и после обогащения.

Активность (донор электронов) Биогранулы №1 Биогранулы №2

0 сут 73 сут 0 сут 126 сут

СВ, г/л 22,3+4,4 13,1±0,9 19,4+2,0 18,1±1,7

БВБ, г/л 14,1+2,6 8,0±0,6 10,3±1,5 9,5+0,5

Денитрифицирущая (ацетат), мг N-N03"/ гБВБ/сут 648±49 552+28 нет данных 98,7±4,5

Денитритирующая (ацетат), мг N-N02"/гБВБ/сут 131,8+2,6 28,5+0,7 нет данных 85,3±5,4

Денитрифицирующая (сульфид), мг N-N03"/ гБВБ/сут 79,4±26,5 88,9+10,2 61,9+8,2 22,2+3,2

Денитритирующая (сульфид), мг N-N02'/ гБВБ/сут 67,3+1,1 58,1+8,1 52,7±2,1 50,4+2,5

Анаммокс, м^^Н4+/гБВБ/сут 4,4+0,7 20,1 ±0,6 1,4±0,3 6,1+0,6

Учитывая то, что ЦЕАМОХ процесс состоит из 2-х последовательных стадий (денитратации и анаммокс), необходимо было сбалансировать скорости этих стадий,

т.е. увеличить анаммокс-активность образцов стартовой биомассы. Для этого использовали реакторы непрерывного действия, функционирующие в оптимальных для роста анаммокс-бактсрий условиях - рН ~ 7,8 и Т = 35 °С. Минеральная среда содержала только необходимые субстраты для анаммокс-реакции - аммоний и нитрит. Процесс обогащения проводили в несколько этапов, начиная с низких нагрузок по соединениям азота (1ICA). На каждом из этапов IICA поднимали ступенчато, снижая время пребывания среды в реакторе (0), во избежание накопления ингибирующей концентрации нитрита в среде последнего (Рис. 1 и 2).

Так, для получения анаммокс-активных биогранул №1 (Рис.1) НСА поэтапно повышали от 250 до 1050 мг N/л/сут. При достигнутой максимальной НСА эффективности удаления аммония и нитрита составили 85 и 84 %, соответственно. При этом скорость удаления азота достигла 808 мг N/л/сут.

При получении анаммок-активных биогранул №2 (Рис.2) НСА поэтапно повышали с 340 до 1250 мг N/л/сут. На последнем режиме эффективности удаления аммония и нитрита составили 81 и 85 %, соответственно, а скорость удаления азота достигла 924 мг N/л/сут.

Об эффективности обогащения анаммокс-бакгериями биогранул также свидетельствует измеренная анаммокс-активность, которая увеличилась примерно в 4,5 раза для обоих стартовых образцов биомассы (Табл. 1). Однако процесс получения анаммокс-активных биогранул №2, по сравнению с биогранулами Js'sl (73 сут), происходил медленнее (126 сут) из-за более низкой начальной анаммокс-акгивности. Уменьшение масса биогранул №1 и 2 в реакторе связано с прошедшей сукцессией микроорганизмов в анаммокс-условиях. Денитрифицирующие бактерии (не имеющие донора электронов) частично вымывались из биогранул, о чем свидетельствуют незначительные изменения денитрифицирующей и денитритирующей активностей на различных донорах электронов (сульфид и ацетат).

Нагрузка по соединениям азота, MrN/л/сут 250 300 430 830 396 686 1054 *

Нагрузка по соединениям азота, MrN/л/сут 250 300 430 830 396 686 1054

II этап

Удаление N-NH4+,% Удаление N-N02-, % Удаление N %

□ Скорость удаления N-NH4+, MrN/л/сут 0 Скорость удаления N, MrN/л/су

• 8001

I этап

-1-1-1-1-1-!-—

0,95 0,76 0,52 0,28 0,66 0,4 0,26

Время пребывания среды в реакторе,сут

50 &

40 о

0,95 0,760,52 0Д8 0,66 0,4 0,26 а

Время пребывания среды в реакторе,сут

Рис. 1. Получение анаммокс-активных биогранул № 1: (а) эффективности и (б) скорости удаления различных форм азота.

Нагрузка по соединениям азота, мг№л/сут 340 535 642 807 890 1254

Нагрузка по соединениям азота, MrN/л/сут 340 535 642 807 890 ¡254

i этап

11 этап

Удаление N-NH4+,% Удаление N-N02-,% Удаление N,%

90 80 - 70 60 50 40

-1-г

0,74 0,5 0,4 03 0,33 0,25

Время пребывания среды в реакторе,сут

О Скорость удаления N-NH4+, мг N/л/сут Скорость удаления N, мг N/ji'cy: I этап II этал

1

I20ÖZ

1000 s.

800 |

- 600 1

400 |

200 | о.

0 S

0,74 0,5 0,4 03 0,33 0,25 Время пребывания среды в реакторе.сут

Рис. 2. Получение анаммокс-активных биогранул №2: (а) эффективности и (б) скорости удаления различных форм азота.

Запуск 2-х модификаций ВЕЛМОХ процесса

Запуск S-DEAMOX процесса

В связи с тем, что применяемый в S-ÜEAMOX процессе донор электронов

сульфид) при концентрации выше 30 мг S/л оказывает ингибируюшее влияние на

анаммокс-бактерии, а также во избежание накопления нитрита в реакторе, для

запуска S-модификации использовали более анаммокс-активные биогранулы №1.

Запуск процесса (Рис. 3) начинали с низких НСА - 260 мг N/л/сут (9 = 1,13 сут) и

дальнейшее повышение НСА осуществляли, снижая 0, при этом входящие

концентрации субстратов (аммоний и нитрат) и донора электронов не изменялись.

10

Запуск в-ОЕАМОХ процесса завершили при НСА 390 мг Ы/л/сут (0 = 0, 76 сут), при этом эффективности удаления аммония и окисленных форм азота составили 69 и 84%, соответственно (Рис. За). Скорости удаления аммония и общего азота составляли 100 и 300 мг К/л/сут, соответственно (Рис. 36). Общее время запуска составило 93 суток.

Нагрузка по соединениям азота, мг№л/сут

Нагрузка по соединениям азота, мгИ/л/сут

260

335

390

□ Скорость удаления N-N^[4+, мгТЧ/л/сут а Скорость удаления N. м г №л/су

- Удаление №ЫН4+,%

- Удаление Ы-ЫОх-, %

- Удаление

■50 £

1,13

0,92

0,76

400 ;

- 300 200

- 100 0

Время пребывания среды в реакгоре.сут

0,92

Время пребывания среды в реакторе,сут

Рис. 3. Запуск 8-ОЕАМОХ процесса: (а) эффективности и (б) скорости удаления различных форм азота.

Запуск О-РЕАМОХ процесса

В связи с тем, что ацетат в концентрации до 1500 мг ХПК/л не оказывает ингибирующего влияния на анаммокс-процесс, для запуска О-ОЕАМОХ процесса использовали биогранулы №2 с более низкой анаммокс-активностью. Увеличение НСА с 290 до 420 мг Жл/сут осуществляли с помощью повышения входящих концентраций соединений азота и, соответственно, донора электронов (ацетата) при постоянном 9 = 1 сут. При максимальной НСА 420 мг М/л/сут эффективности удаления аммония и окисленных форм составили 80 и 92%, соответственно, а скорости удаления аммония и общего азота - 140 и 370 мг М/л/сут, соответственно (Рис. 4). Общее время запуска О-ОЕАМОХ составило 156 сут.

Нагрузка по соединениям азота, мгМ/л/сут Нагрузка по соединениям азота, мг№л/сут

290 330 420 290 330 420 £

Время пребывания среды в реакторе,суг ВР6"* пребывания среды в реакторе,сут

Рис. 4. Запуск О-ОЕАМОХ процесса: (а) эффективности и (б) скорости удаления различных форм азота.

Оптимизация условий для 8- и О-ВЕАМОХ процессов

Влияние рН

При проведении экспериментов по изучению влияния рН на эффективность 8- и О-ЭЕАМОХ процессов, его значения контролировали как на вкоде при подаче субстратов, так и на выходе из реакторов.

Из Рис. 5 видно, что изменение значений рН оказало значительное влияние на эффективность удаления аммония и, как следствие, на удаление общего азота в реакторе. Повышение значений рН в среде обоих реакторов было связано с тем, что в результате анаммокс-реакции (с учетом анаболизма) происходит потребление протонов.

КН4+ + 1,32Н02- + 0,066НС03' + 0,1 зн+

1,(Ш2 + 0,2бЫ03- + 0,066СН200,5М0>И + 2,03н20 (5) Следует отметить более значительное повышение значений рН в среде О-ОЕАМОХ-реактора, что связано с образованием более слабой угольной кислоты яз более сильной уксусной (Ур.4).

рНэФФ

7,83 8,26

- Удаление N-№4+,%

- Удаление 1Ч-ЫОх-,%

- Удаление

I—

6,77

—I—

7,01

100 80 60 - 40 20 0

7,26 7,57

РНинф

рНэ®Ф 8,35 8,46

^—А—

- Удаление N-№4+,%

- Удаление Ы-МОх-,%

- Удаление

- 80 60 40 20

6,65

7,09

737 7,62

РНинф

■е-•в*

о

Рис. 5. Влияние рН на эффективности удаления различных форм азота: (а) Б-ВЕАМОХ и (б) О-ОЕАМОХ процесс.

В результате проведенных исследований наивысшие эффективности удаления аммония и общего азота для 5-ОЕАМОХ процесса наблюдались при значениях рГГЭФф в реакторе 7,58+0,05 и составили 69 и 79 %, соответственно (Рис. 5а). При этом значении рН наблюдалось примерно одинаковое распределение донора электронов - сульфида между процессами Г)ЕАМОХ и нежелательной денитритацией.

Значение рНЭф<ь в реакторе для О-ОЕЛМОХ, при котором наблюдались наивысшие эффективности удаления аммония - 73% и общего азота - 87% (Рис. 56), составило 8,07+0,08.

Влияние концентрации ионов бикарбоната

Из литературы известно, что ионы бикарбоната оказывает ингибирующее влияние на аиаммокс-процесс. Для выяснения влияния ионов бикарбоната па эффективность ПЕАМОХ-процессов были проведены соответствующие эксперименты прн варьировании концентрации ионов бикарбоната от 12 до 30 мМ. Во время экспериментов значения рН в реакторах поддерживалось в диапазоне оптимальных значений, установленных ранее: ~ 7,5 для в- и 8,1 для О-ОЕАМОХ процессов.

Как видно из представленных данных (Рис. 6), при концентрации ионов бикарбоната более 24 мМ наблюдаюсь снижение эффективности удаления аммония с 70 до 45% в обоих случаях. При этом более 70% донора электронов уходило на нежелательную реакцию денигритации.

- Удаление М-КН4+,%

- Удаление К-КОх-,%

- Удален» М,% --—г-1-

12 !8 24 30 Концентрация ионов бикарбоната,мМ

юо §

—А— Удаление N-N44+,% Г -в— Удаление Ы-КОх-.0/« . 20 -в— Удаление -1-1—---г—-1- 0

12 ¡ 8 24 30

Концентрация ионов бикарбоната,мМ

Рис, 6. Влияние концентрации ионов бикарбоната на эффективности удаления различных форм азота: (а) 8-ОЕЛМОХ и (б) О-ОЕАМОХ процесс.

Влитие температуры

При проведении данных экспериментов условия в реакторе поддерживались в диапазоне оптимальных значений, исследованных выше: рН - 7,5 и 8,1 для Б- и О-ОЕАМОХ. соответственно, входящая концентрация иона бикарбоната 24 мМ для обеих модификаций. Температуру поднимали поэтапно с 20 до 40 °С с шагом в 5°С.

Из представленных данных (Рис.7а) видно, что для в-БЕАМОХ процесса наивысшие эффективности удаления аммония и общего азота наблюдались при 35°С и составили 70 и 83 %, соответственно. Зависимость деамокс активности от температуры имеет вид колоколообразной кривой с максимумом при 35°С, а конкурирующая денитритирующая активность при этой температуре имела минимальное значение (Рис. 76). Отклонение от 35°С сопровождалось ростом денитритирующей активности, что, как следствие, приводило к уменьшению деамокс активности.

Для О-ВЕ А МОХ процесса (Рис. 8а) максимальная эффективность удаления аммония (более 73%) и общего азота (более 87%) наблюдались в диапазоне температур 35 - 25 °С. Однако максимальное значение деамокс-активности наблюдалось при 30 °С (Рис. 86), при этом конкурирующая денитритирующая активность принимала минимальное значение.

- Удаление N-N114+,%

- Удаление Ы-Юх-,%

□ Деамокс 3 Денигригирующая (N02-;

20 25 30 35 Температура провеса, С

20 25 30 35 Температура процесса. °С

Рис. 7. Влияние температуры на Й-БЕАМОХ процесс: (а) эффективности удаления различных форм азота и (б) основные активности.

- Удаление N-№4+,%

- Удаление М-Ж)х-,%

- Удаление

100 80 60 40 20 0

20

25

30

35

40

Температура процесса, С

□ Деамокс

ЕЗ Денигригирующая (>102-)/10

о ш 5 со

и 4 -

ё ё < Ь 2

20

25

Температура процесса, С

Рис. 8. Влияние температуры на О-БЕАМОХ процесс: (а) эффективности удаления различных форм азота и (б) основные активности.

Влияние НСЛ

Как следует из Ур. 6 НСА прямо пропорционально зависит от концентрации всех входящих соединений азота и обратно пропорционально времени пребывания среды в реакторе (0):

3 ИНФ

(6)

N-NHÍ инф, мг №л 60 80 100 120 140 160 _l_i_i_i , i_

- Удаление N-NH4+,%

- Удаление N-NOx-,%

- Удаление N,%_

1003

-60 л

S

40 g i

+ 20 U

U

о S

206 260 315 380 453 505

Нагрузка по соединениям азота, мг N/л/сут

Время пребывания среды в реакторе,сут 0,73 0,62 0Л

100 g

я

•60 .. S

■Но «

- Удаление N-NH4+,% -Удаление N-NOx-,% 4-20 £

- Удаление N,% п-1-0 £

380 453 545

Нагрузка по соединениям азота, мг N/л/сут

N-NH4 инф, мг N/л 140 160 180

Удаление N-NH4+,% Удаление N-NOx-,% Удаление N,% i i-г

100g к ü

4-8о| -60

■■40 £

545

645

725

820

20 % О

Нагрузка по соединениям азота, мгЩт/сут

Рис. 9. Эффективности удаления различных форм азота в З-БЕАМОХ процессе при изменении НСА с помощью (а) и (в) входящих концентраций субстратов; (б) 9.

Таким образом, повышение НСА возможно различными способами: (1) повышением входящих концентраций субстратов при фиксированном Э или (2) снижения 9 при постоянных входящих концентрациях субстратов.

Для S-DEAMOX процесса при поэтапном повышении НСА с 206 до 380 мг N/л/сут с помощью увеличения входящих концентраций субстратов при фиксированном значении 0 = 0,73 сут, наблюдалось увеличение эффективности удаления аммония с 50 до 67%, при этом удаление общего азота осталось на прежнем уровне 80% (Рис. 9а). Дальнейшее повышение НСА до 505 мг N/л/сут привело к резкому спаду эффективностей удаления аммония и общего азота до 28 и 63%, соответственно, что, вероятно, было связано с накоплением ингпбирующих концентраций сульфида в реакторе (> 20 мг S-II2SAi).

Другой способ изменения IICA с 380 до 545 мг N/л/сут с помощью снижения 0 с 0,73 до 0,51 сут при входящих концентрациях аммония 120 мг N/л и нитрита 160 мг N/л показал улучшение в работе S-DEAMOX реактора. Так, при НСА 545 мг N/л/сут, эффективность удаления аммония увеличилась по сравнению с первым этапом с 28 до 79%, а

а эффективность удаления общего азота с 63 до 91% (Рис. 96).

Дальнейшее увеличение НСА до 725 мг К/л/'сут при фиксированном 8 = 0,51 сут (Рис. 9в) привело улучшению удаления аммония до 84 %. Однако при повышении НСА до 820 мг М/л/сут оказало значительное снижение зффективностсй удаления аммония и окисленных форм азота до 55 и 86 %, соответственно. При этом общее удаление азота снизилось с 93 до 73 %.

Таким образом, наилучшая эффективность В-БЕАМОХ процесса наблюдалась при относительно коротких 0 среды в реакторе. При увеличении НСА с помощью повышения входящих концентраций субстратов необходимо строго контролировать содержание в реакторе донора электронов (сульфида) ниже 20 мг Э-НгБ/л.

Как и в предыдущем эксперименте, для О-ВЕАМОХ процесса на первом этапе (Рис. 10а) НСА увеличивали с помощью повышения концентраций входящих субстратов при фиксированном 0 = 0,73 сут. Как видно из Рис. 10а наивысшие эффективности удаленна аммония (75%) и общего азота (88%) наблюдались при низких значениях НСА 267 мг К/л/сут. Дальнейшее повышение НСА до 1010 мг М/л/сут привело к снижению эффективностей удаления аммония и общего азота до 44 и 73%, соответственно. Однако до НСА 830 мг N/л'c^т наблюдался рост скорости удаления аммония с 70 до 214 мг М/п/сут.

На втором этапе повышение НСА осуществляли с помощью поэтапного снижения 9 с 0,73 до 0,44 сут, начиная с НСА 890 мг М/л/сут, при которой на первом этапе наблюдалось снижение скорости удаление аммония. Как видно из Рис 106 изменения 0 не оказало значительного влияния на эффективность удаления аммония и общего азота, так они оставались в диапазоне значений 44 - 54 и 75 - 80 %, соответственно. При этом скорость удаления аммония увеличилась до 310 мг М/л/сут при наивысшей НСА 1500 мг Ы/л/сут. Однако повышение скорости потока при снижении в сопровождалось высоким газообразованием, что приводило к всплытию биогранул и последующему их вымыванию из реактора.

N-NIb ииф, мг№л 80 140 200 260 300 320 -i-jl-*-

Удаленис N-NH4+,% Удаление N-NOx-,% f 20 Удаление N,% —i-1-1—

-i-1-1-1-1-1—

210 267 463 644 829 946 1011

Нагрузка го соединениям азота, MrN/л/сут

Время пребывания среды в реакторе,сут 0,73 0,62 0,53 0,44

a á A di- 100

■■ 80 ■•60 ■-40

-Удаление N-NH4+,%

- Удаление N-NOx-,% "" 20

- Удаление N,% -1-1- О

-вО

:88 1032 1255 1502 Нагрузка го соединениям азота, мг N/л/сут

Рис. 10. Эффективности удаления различных форм азота в O-DEAMOX процессе при увеличении НСА с помощью (а) входящих концентраций субстратов (0 = 0,73 сут); (б) О (N-NHi+ инф - 280 мг N/л).

Чтобы иметь более полное представление о каталитической активности биогранул в реакторных условиях были определены их кинетические параметры in situ по отношению к аммонию и нитриту в анаммокс-условиях.

Как видно из данных Табл. 2, кажущаяся константа сродства к аммонию для S-DEAMOX биогранул оказалась в 2,5 раза ниже, чем для O-DEAMOX гранул. В то время как кажущиеся константы сродства к нитриту для различных биогранул были близки по значениям. Различия между биогранулами прослеживались также и в морфологических характеристиках. Так, O-DEAMOX гранулы имели, в основном, диаметр 3-5 мм, в то время как S-DEAMOX гранулы - 1-2 мм (Рис. 11). В связи с тем, что анаммокс бактерии обычно располагаются в центральной части гранулы, субстратам необходимо преодолеть более длинный диффузионный путь в более крупных агрегатах, что и объясняет различия в кажущихся константах сродства к субстратам. Таким образом, скорость потребления субстратов анаммокс-процесса (аммония и нитрита) была выше в том случае, когда размер агрегатов был меньше.

Полученные данные (Табл. 2) позволили рассчитать удельные активности биогранул, показывающие максимально возможное количество субстрата, которое может минерализовать 1 г БВБ в сутки. Из Табл. 2 видно, что активность по отношению к аммонию и нитриту S-DEAMOX биогранул была выше в 2,7 и 3,6 раз, соответственно, чем O-DEAMOX биогранул. Параллельно также проводили

измерения удельных активностей биомассы в периодических тестах (Табл. 3). Следует отметить, что результаты анаммокс-активности биогранул, полученных с помощью различных методов, имеют достаточно хорошую сходимость.

Таблица 2. Кинетические характеристики биогранул-биокатализаторов.

Субстрат Ут, мг №л/сут К5, мг N/л Активность, мг К/г БВБ/сут

в-ВЕАМОХ (диаметр агрегатов 1-2 мм,У|;,аь.тора = 1,06 л, общий вес БВБ = 6,7 г)

ШМНГ 272±6 2,1±0,3 43+3

N-N02- 486+3 3,2+0,5 77+11

О-ВЕАМОХ (диаметр агрегатов 3-5 мм, \'р(,а11-тора = 0,97 л, общий вес БВБ = 10,8 г)

176+5 5,4±0,8 16±4

234±2 3,7+0,3 21+1

Рис. 11. Фотографии (а) 8-ОЕАМОХ и (б) О-ОЕАМОХ биогранул.

Как видно из Табл. 3 за время оптимизации работы 8-ОЕАМОХ процесса анаммокс-активность биогранул увеличилась с 20,1 до 42,7 мг Шг БВБ/сут, то есть более чем в два раза. При этом денитрифицирующая активность также увеличилась почти в 2 раза, а денитритирующая осталась на прежнем уровне. Масса биогранул увеличилась примерно на 30%.

За это же время анаммокс-активность О-ОЕАМОХ биогранул процесса (Табл. 3) увеличилась в 2,7 раза с 6,1 до 16,6 мг М/г БВБ/сут. Денитрифицирующая активность

увеличилась почти в 2 раза, в то время как дешггритирующая снизилась в 1,5 раза. Масса биогранул увеличилась на 64%. Более высокий рост биомассы для О-БЕЛМОХ процесса, чем для Б-БЕАМОХ, связан с тем, что коэффициент прироста органотрофной биомассы существенно выше, чем автотрофной биомассы, кроме того, также нельзя исключить ингибирующее влияние сульфида на рост анаммокс-бактерии.

Таблица 3. Основные характеристики биогранул до и после оптимизации процессов.

Активность (донор электронов) S-DEAM0X O-DEAMOX

73 сут 890 сут 126 сут 860 сут

СВ, г/л 13,1±0,9 16,8+1,0 18,1+1,7 25,1±1,6

БВБ, г/л 8,0±0,6 10,3+0,5 9,5+0,5 15,6+0,6

Денитрифицирущая (ацетат), мг КГ-Ж)з"'/ гБВБ/сут 552+28 нет данных 98,7±4,5 215±5

Дснитритирующая (ацетат), мг N-N02'/гБВБ/сут 28,5±0,7 нет данных 85,3±5,4 56,9±4,1

Денитрифицирующая (сульфид), мг N-N03'/гБВБ/сут 88,9±10,2 189±11 22,2±3,2 нет данных

Дешггритирующая (сульфид), мг N-N02'/гБВБ/сут 58,1±8,1 54,7±4,8 50,4±2,5 нет данных

Анаммокс, мгК-КН4+/гБВБ/сут 20,1±0,6 42,7±2,2 6,1+0,6 16,6+2,1

Деамокс, мгШЯН4+/гБВБ/сут ниже определяемог о уровня 9,3±0,1 ниже определяемого уровня 6,1±0,1

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) анализ биогранул Для подтверждения присутствия анаммокс-бактерий в S- и O-DEAMOX микробных сообществах был проведен FISH-анализ соответствующих биогранул со специфическими праймерами.

На Рис.12 видно, что анаммокс-бактерий (зеленый цвет) являлись доминирующими в сформировавшихся микробных сообществах. Следует отметить,

что применяемый праймер для домена Bacteria EUB 338 (синий цвет) не образует продукта гибридизации с 16S рРНК анаммокс-бактерий.

б

i

Рис. 12. Результаты FISH-анализа со специфическими праймерами на представителей домена Bacteria (синий цвет), группу анаммокс-бактерий (зеленый цвет) и отдел /?-Proteobacteria (красный цвет): (a) S-DEAMOX (б) O-DEAMOX биогранул.

Рис. 13. Результаты РКН-анализа со специфическими праймерами на представителей домена Агскеа (красный), анаммокс-бактерии (зеленый) родов «Са.ВгосасНа» и «Са.Киепма» и отдел у-Рго1еоЬас1ег1а (синий): (а) Б-ОЕАМОХ (б) О-ЭЕАМОХ биогранул.

Дальнейшие исследования с праймером АМХ820 выявили присутствие анаммокс-бактерий родов «Са.ВгосасНа» и «Са.Киетта» (Рис. 13 зеленый цвет), которые

являются типичными представителями микробных сообществ реакторов для обработки сточных вод.

Также были проведены исследования по определению АОБ отдела /?-РшеоЬааепа (Рис 12 красный цвет), так как относящиеся к этому отделу бактерии рода Шгояотопаз способны осуществлять анаэробное окисление аммония и, возможно, они также могли принимать участие в процессе. Однако их было обнаружено незначительное количество, как и представителей другого отдела АОБ -у-Рго1еоЬас1епа (Рис. 13 синий цвет). Присутствие архей в микробных Б- и О-БЕАМОХ сообществах (Рис 13 красный цвет) объясняется важной ролью метаногенов в формировании гранул анаэробной биомассы.

ВЫВОДЫ

1. Проведенный филогенетический анализ микробного сообщества, осуществляющего автотрофный БЕАМОХ процесс, подтвердил наличие бактерий, способных осуществлять основные реакции циклов азота и серы в ОЕАМОХ процессе. Среди клонов отдела Р1апс1отусе1ея были обнаружены нуклеотидные последовательности 16Б рРНК, близкие к анаммокс-бактериям, а среди клонов отдела Рго(еоЬас(епа - близкие к ХИпъотопаз. Установленные бактерии родов ТИюЬасШия, Ткаиега и Ое5и1/иготопа$ способны в анаэробных условиях проводить окисление серы.

2. Разработан метод получения активной микробной популяции (биогранул) для 2-х

модификаций ОЕАМОХ-ироцесса из исходной биомассы с низкой анаммокс-активностью. Метод заключается в предварительном культивировании посевной биомассы в анаммокс-условиях до достижения скорости удаления соединений азота более 800 мг Ы/л/сут с последующим переводом системы на соответствующие ОЕАМОХ-условия. В результате время полного запуска Б-БЕАМОХ и О-ОЕАМОХ процессов составило 93 и 156 сут, соответственно.

3. Исследовано влияние различных операционных параметров - рН, концентрации

ионов бикарбоната, температуры, нагрузки по соединениям азота и способов ее

достижения на эффективность обеих модификаций БЕАМОХ-процесса.

Установлено, что оптимальные значения рН для в- БЕАМОХ и О-ОЕАМОХ

процессов равны 7,58+0,05 и 8,07+0,08, соответственно. Показано, что

оптимальная концентрация ионов бикарбоната для обеих модификаций не

22

превышает 24 мМ. Оптимум температуры для Б- БЕАМОХ процесса составил 35°С и отклонение от этого значения оказывало значительное влияние на эффективность процесса. Для О-БЕАМОХ процесса диапазон оптимальных температур составил 25 - 35 °С. В отличие от О-БЕАМОХ процесса наилучшая эффективность Э-ВЕАМОХ процесса наблюдалась при относительно коротких временах удерживания среды в реакторе.

4. Были определены кинетические характеристики биогранул по отношению к субстратам анаммокс-реакции. Было установлено, что максимальная скорость потребления субстратов анаммокс-процесса (аммония и нитрита) зависит от диаметра биогранул. Так, для Б-БЕАМОХ гранул с диаметром 1-2 мм скорость потребления субстратов была примерно в два раза выше, чем для О-БЕАМОХ гранул с диаметром 3-5 мм.

5. Установлено, что за время оптимизации работы Б-БЕАМОХ и О-БЕАМОХ процессов анаммокс-акгивность соответствующих биограяул увеличилась в 2 и 3 раза, денитрифицирующая активность в обоих случаях увеличилась в 2 раза. При этом денитритирующая Б-БЕАМОХ биогранул осталась на прежнем уровне, в то время как О-БЕАМОХ биогранул снизилась в 2,3 раза.

6. Проведенный Р15Н-анализ Э-ВЕАМОХ и О-БЕАМОХ биогранул выявил, что доминирующими микроорганизмами в сформировавшихся сообществах являются анаммокс-бактерии родов «Са.ВгосасНа» и «.Са.Киетта». АОБ, также способные в определенных условиях к анаэробному окислению аммония, были обнаружены в незначительных количествах. Присутствие микроорганизмов домека АгсИеа объясняется участием метаногенов в формировании матрицы анаммокс-биогранул.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.В. Калюжный, Н. М. Шестакова, Т. П. Турова, А. Б. Полтараус, М. А Гладченко, А.И. Трухина. Т. Н. Назина. Филогенетический анализ микробного сообщества, осуществляющего анаэробное окисление аммонийного азота. Микробиология, 2010.1.19, №2, стр. 260-269.

2. Трухина А. И.. Гладченко М.А., Калюжный С.В. Реактивация биокатализаторов после длительного хранение и запуск DEAMOX процесса. Биотехнология. 2010. №5. Стр. 68-75

3. Trukhina A.. Gladchenko М., Kalyuzhnyi S., Arnold Mulder, Bram Versprille. Start-up and optimization of the DEAMOX process after a long storage of sludge. In Progress in Environmental Science and Technology. Proceedings of the International Symposium ISEST. Shanghai, China. 2009. V.2. P. 1195-1203.

4. Трухина А. И.. Гладченко M.A. Запуск и оптимизация процесса DEAMOX. Материалы докладов XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009», секция Химия - Наука о живом. Москва. Стр. 42.

5. Trukhina A.. Gladchenko М., Kalyuzhnyi S. Optimization of new anaerobic process of biological nitrogen removal. In Abstract book of the International Conference Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications. Arkhangelsk, Russia. 2009. P. 36.

6. Трухина А. И.. Гладченко M.A. DEAMOX - новый процесс удаления азотных загрязнений. Выставка инновационных проектов. МГУ Химический факультет. Москва. 2009.

7. Trukhina A.. Gladchenko М., Kalyuzhnyi S. The comparison of DEAMOX processes driven by inorganic (sulphide) or organic (VFA) donors with regard to sludge kinetic characteristics and ammonia removal rate. In Abstract book of the International Conference Protection and Restoration of the Environment X. Corfu, Greece. 2010. P. 74.

8. Trukhina A.. Gladchenko M., Kalyuzhnyi S. Influence of Nitrogen Loading Rate on impact of DEAMOX reaction for Sulphide and Organics DEAMOX processes. In Abstract book of the 2nd International Conference Hazardous and Industrial Waste Management. Crete, Greece. 2010. P. 79.

Подписано в печать:

09.02.2011

Заказ № 4962 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Трухина, Анастасия Игоревна

1. Введение.

2.0бзор литературы.

2.1. Микробиологическое окисление аммония.

2.1.1. Аэробное окисление аммония.

2.1.2. Анаэробное окисление аммония.

2.1.2.1. Аммонийокисляющие бактерии (АОБ).

2.1.2.2. Анаммох-бактерии.

2.2. Микробиологические и биохимические характеристики анаммокс-бактерий.

2.2.1. Физиологические аспекты.

2.2.2. Структура клетки.

2.2.3. Основные биохимические процессы.

2.3. Идентификация анаммокс-бактерий и АОБ.

2.4. Удаление азотсодержащих загрязнений из сточных вод.

2.4.1. Нитрификация и денитрификация.

2.4.2. Анаммокс-процесс и его модификации.

2.4.2.1. SHARON-ANAMMOX.

2.4.2.2. CANON.

2.4.2.3. DEAMOX.

3. Материалы и методы.

3.1. Минеральная среда.

3.2. Биомасса.

3.3. Лабораторная установка.

3.3.1. Рабочие параметры реакторов.

3.4. Аналитические методы.

3.4.1. Анализ последовательностей генов 16S рРНК.

3.4.1.1. Выделение ДНК и амплификация генов 16S рРНК.

3.4.1.2. Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов.

3.4.1.3. Филогенетический анализ.

3.4.2. FISH-анализ.

3.4.3. Определение концентраций низкомолекулярных веществ в реакторных исследованиях.

3.4.3.1 Определение концентрации аммония методом Фосетта и Скотта.

3.4.3.2 Определение концентрации нитрат-ионов.

3.4.3.3 Определение концентрации нитрит-ионов.

3.4.3.4 Определение концентрации сульфид-ионов.

3.4.3.5 Определение показателя общего химического потребления кислорода (ХПК).

3.5. Определение количества беззольного вещества биомассы (БВБ).

3.6. Определение удельных активностей биогранул.

3.7. Определение кинетических характеристик биогранул in situ.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Филогенетический анализ автотрофного микробного сообщества, осуществляющего DEAMOX процесс.

4.1.1. Гены 16S рРНК домена Bacteria.

4.1.2. Гены 16S рРНК отдела Planctomycetes.

4.1.3. Гены 16S рРНК домена Archaea.

4.2. Получение анаммокс-активных биогранул.

4.2.1. Биогранулы №1.

4.2.2. Биогранулы № 2.

4.3. Запуск 2-х модификаций DEAMOX процесса.

4.3.1. Запуск S-DEAMOX процесса.

4.3.2. Запуск O-DEAMOX процесса.

4.4. Оптимизация условий для S- и O-DEAMOX процессов.

4.4.1. Влияние рН.

4.4.2. Влияние концентрации ионов бикарбоната.

4.4.3. Влияние температуры.

4.4.4. Влияние НСА.

4.4.5. Кинетические и каталитические характеристики биогранул.

4.5. FISH-анализ.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация Deamox-процесса и молекулярно-биологические исследования формирующихся консорциумов микроорганизмов"

Вода является основой жизни на Земле. Однако интенсивное воздействие человека на природу (быстрые темпы развития промышленности и строительства, индустриализация и химизация сельского хозяйства) привели к такому загрязнению водных ресурсов, что историческая «Конференция ООН по окружающей среде и развитию» (Рио-де-Жанейро 1992г.) назвала эту проблему глобальной и требующей безотлагательного решения на пути «устойчивого развития» мирового сообщества. Повышение эффективности мер по охране водных ресурсов связано с широким внедрением ресурсосберегающих, малоотходных и безотходных технологических процессов.

Различные соединения азота появляются в воде в результате сброса промышленных сточных вод, разложения азотосодержащих веществ человеческого и животного происхождения, а также в результате чрезмерного использования азотных удобрений в сельском хозяйстве. Смываемые с почвы и поступающие в водоемы и подземные воды азотные загрязнения нарушают природное равновесие существующих экосистем и стимулируют бурный рост микроорганизмов, водорослей и растений, что вызывает зарастание каналов, рек, озер и водохранилищ. В результате в водном объекте ухудшаются физико-химические свойства воды: уменьшается ее прозрачность, вода приобретает зеленый или желто-бурый цвет, появляется неприятный вкус и запах, повышаются значения рН, наблюдается дефицит кислорода, возникают заморные явления для рыбы и других животных. Наличие в водных системах азотных загрязнений оказывает токсическое воздействие не только на водные организмы, но и на здоровье людей. Так, присутствие в воде нитратов и нитритов вызывают у человека метгемоглобинемию, рак желудка, отрицательно влияет на нервную и сердечно-сосудистую системы, па развитие эмбрионов, а также является причиной возникновения некоторых смертельных заболеваний у младенцев [1]. Согласно санитарным правилам и нормам СанПиН 2.1.4.1074-01 «питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения» и СанПиН 2.1.4.1175-02 "Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников" предельно допустимые концентрации (ПДК) аммонийного, нитратного и нитритного азота в воде хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования составляют 2,0;

3,0 PI 45 MrN/л, соответственно.

В результате вышеперечисленных процессов загрязненные водоемы становятся непригодными для питьевого, а часто и для технического водоснабжения, и нередко теряют рыбохозяйственное значение. Существующие в России очистные сооружения технически устарели и не приспособлены для удаления азотных загрязнений из высококонцентрированных сточных вод до установленных значений ПДК в сбрасываемых обработанных стоках.

Таким образом, защита водных ресурсов от азотных загрязнений является весьма актуальной проблемой, и необходимость развития и совершенствования современных методов очистки сточных вод не вызывает сомнений. Микробиологическая очистка является основным применяемым на практике методом обработки бытовых и производственных сточных вод. В его основе лежит процесс конверсии загрязнений, содержащихся в сточных водах, сообществами микроорганизмов. Разработка новых микробиологических методов является перспективным решением для значительного улучшения качества очистки сточных вод от различных загрязнений, в том числе азотсодержащих.

Ранее удаление азотсодержащих загрязнителей практически полностью базировалось на традиционных микробиологических процессах нитрификации и денитрификации, сопряженных с большими расходами на аэрацию (нитрификация) и подачу донора электронов (денитрификация).

В последние годы процесс анаэробного окисления аммония (анаммокс-процесс) признан наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным способом удаления аммония из сточных вод [2-6]. В этом процессе последний в присутствии анаммокс-бактерий окисляется до молекулярного азота, при этом нитрит используется в качестве акцептора электронов. NH44" + N02* —> N2 + 2Н20 (1.1)

Однако необходимый для протекания процесса нитрит, как правило, отсутствует в исходных сточных водах. В связи с этим большинство анаммокс-технологий (ANAMMOX, SHARON, CANON и др), включают дополнительную и сложно контролируемую стадию микробиологического получения нитрита, токсичного для формирующегося биоценоза уже при концентрации 100 мг/л [7, 8].

Для решения указанной выше проблемы нитрита на кафедре Химической Энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова был разработан новый процесс, получивший название DEAMOX (DEnitrifying AMmonium OXidation) [9-13]. В этом процессе специально селектированная смешанная микробная ассоциация последовательно осуществляет две реакции - конверсию нитрата (типичный компонент сточных вод) в присутствии донора электронов до нитрита: N03" + 2е"(донор электронов) +2Н+-> N02" + Н20 (1.2) а затем анаммокс-реакцию (1.1). Преимуществом DEAMOX-процесса по сравнению с другими анаммокс-технологиями является простота конструкции (весь процесс осуществляется в одном реакторе) и отсутствие специального контроля концентрации нитрита, так как его содержание в системе значительно ниже ингибирующего уровня [9-13].

Авторами [9-13] предложены две модификации DEAMOX-процесса, различающиеся природой донора электронов для реакции (1.2) - Sulphide-DEAMOX (S-DEAMOX) и Organics-DEAMOX (O-DEAMOX). Несмотря на то, что была показана возможность реализации DEAMOX процесса на реальных сточных водах, микробиологический анализ формирующихся сообществ микроорганизмов проведен не был. Таким образом, анализ микробного разнообразия DEAMOX-процесса с применением современных молекулярно-биологических методов (16S рРНК анализ и FISH) являлся одной из целей данной работы.

Несмотря на указанные преимущества DEAMOX-процесса, низкая скорость роста анаммокс-бактерий (время удвоения - 11 сут), их относительная труднодоступность в природе и сравнительная малоизученность приводит к тому, что запуск и выведение на стабильный режим работы DEAMOX-реакторов занимает длительное время и пока не является стандартной практикой.

Поэтому второй целью данной работы являлась оптимизация технологии получения активной микробной популяции (биогранул) для 2-х модификаций DEAMOX-процесса с использованием в качестве исходного инокулята биомассы с крайне низкой анаммокс-активностью. Третьей целью работы являлась оптимизация обеих модификаций DEAMOX-процесса по отношению к ряду опреационных факторов системы - температуре, pH, концентрации ионов бикарбоната, нагрузке по азоту и способу ее достижения.

2,Обзор литературы

Азот является одним из первостепенных биогенных элементов, необходимых для существования животных и растений. Он входит в состав белков (16—18 % по массе), аминокислот, нуклеиновых кислот, нуклеопротеидов, хлорофилла и др. Круговорот азота в земной биосфере представляет собой ряд взаимосвязанных путей, упрощенно показанных на Рис. 2.1. Вкратце, ключевую роль в фиксации атмосферного азота на Земле играют растения и микроорганизмы, обеспечивая биосферу соответствующим набором азотсодержащих органических веществ, биоминерализация которых, как правило, приводит к образованию аммония. Последний с помощью микробиологических процессов нитрификации, денитрификации и анаммокс превращается в молекулярный азот, который возвращается в атмосферу. Так как центральное место в процессах удаления азотных загрязнений из гидросферы занимает аммоний, то на путях его микробиологического окисления остановимся более подробно.

Растительный ^ бэлок

Аммоний

Рис. 2.1. Круговорот азота в природе.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Трухина, Анастасия Игоревна

5. Выводы

1. Проведенный филогенетический анализ микробного сообщества, осуществляющего автотрофный БЕАМОХ процесс, подтвердил наличие бактерий, способных осуществлять основные реакции циклов азота и серы в БЕАМОХ процессе. Среди клонов отдела Р1апс[отусе1ез были обнаружены нуклеотидные последовательности 168 рРНК, близкие к анаммокс-бактериям, а среди клонов отдела Рго1еоЪас1ег1а - близкие к ШМяоглопав. Установленные бактерии родов ТЫоЬасШш, Ткаиега и ВеБЫ/иготопая способны в анаэробных условиях проводить окисление серы.

2. Разработан метод получения активной микробной популяции (биогранул) для 2-х модификаций БЕАМОХ-процесса из исходной биомассы с низкой анаммокс-активностью. Он заключается в предварительном культивировании посевной биомассы в анаммокс-условиях до достижения скорости удаления соединений азота более 800 мг М/л/сут с последующим переводом системы на соответствующие БЕАМОХ-условия. В результате время полного запуска 8-БЕАМОХ и О-БЕАМОХ процессов составило 93 и 176 сут, соответственно.

3. Исследовано влияние различных операционных факторов системы - рН, концентрации ионов бикарбоната, температуры, нагрузки по азоту и способов ее достижения на эффективность обеих модификаций БЕАМОХ-процесса. Установлено, что оптимальные значения рН для 8- БЕАМОХ и О-БЕАМОХ процессов равны 7,58±0,1 и 8,07±0,08, соответственно. Показано, что оптимальная концентрация ионов бикарбоната для обеих модификаций не превышает 24мМ. Оптимум температуры для 8- БЕАМОХ процесса составляет 35°С и отклонение от этого значения оказывает значительное влияние на эффективность процесса. Для О-БЕАМОХ процесса диапазон оптимальных температур составил 30 - 35 °С. В отличие от О-БЕАМОХ процесса наилучшая эффективность 8-БЕАМОХ процесса наблюдалась при относительно коротких временах удерживания среды в реакторе.

4. Были определены кинетические характеристики биогранул по отношению к субстратам анаммокс-реакции. Было установлено, что максимальная скорость потребления субстратов анаммокс-процесса (аммония и нитрита) зависит от диаметра биогранул. Так, для 8-БЕАМОХ гранул с диаметром 1-2 мм скорость потребления субстратов была примерно в два раза выше, чем для О-БЕАМОХ гранул с диаметром 3-6 мм.

5. Установлено, что за время оптимизации работы в-БЕАМОХ и О-ОЕАМОХ процессов анаммокс-активность соответствующих биогранул увеличилась в 2 и 3 раза, денитрифицирующая активность в обоих случаях увеличилась в 2 раза. При этом денитритирующая активность 8-ОЕАМОХ биогранул осталась на прежнем уровне, в то время как О-ЭЕАМОХ биогранул снизилась в 2,3 раза.

6. Проведенный РГБН-анализ Б- и О-БЕАМОХ биогранул выявил, что доминирующими микроорганизмами в сформировавшихся сообществах являются анаммокс-бактерии родов Са. ВгосасНа и Са. Киешша. АОБ, также способные в определенных условиях к анаэробному окислению аммония, были обнаружены в незначительных количествах. Присутствие микроорганизмов домена АгсИеа объясняется участием метаногенов в формировании матрицы анаммокс-биогранул.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Трухина, Анастасия Игоревна, Москва

1. Perxas L. A study on the phylogeny and the ecology of the ammonia-oxidizing bacteria using a new molecular marker based on the gene AMOB. PhD thesis 2005. P.31.

2. Schmidt, I., Sliekers O., Schmid M., Bock E., Fuerst J., Kuenen J. G., Jetten M.S.M, Strous M. New concepts of microbial treatment for the nitrogen removal in wasterwater. FEMS Microbiol. Rew. 2003. V. 27. P. 481-492.

3. Egli K., Langer C., Siegrist H., Zehnder A.J.B., Wagner M., van der Meer J.R. Community analysis of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of nitritation reactors. Appl Env Microbiol. 2003. V. 69 (6). P. 3213-3222.

4. Zhang L., P. Zheng, C. Tang, R. Jin. Anaerobic ammonium oxidation for treatment of ammonium-rich wasterwaters. J. Zhejiang Univ Sci B. 2008. V. 9(5). P. 416-426.

5. Kartal B, Kuenen J.G., van Loosdrecht M.C.M. Sewage treatment with Anammox. Science. 2010. V. 328. P. 702-704.

6. Strous M., Kuenen J.G., Fuerst J.A., Wagner M., Jetten M.S.M. The anammox case a new manifesto for microbiological eco-physiology. Antonie van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 693-702.

7. Strous M., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation. Appl. and Env. Microbiol. 1999. V. 6. P. 3248-3250.

8. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Mulder A., Versprille B. "DEAMOX new biologicalnitrogen removal process based on anaerobic ammonia oxidation coupled to sulphide driven conversion of nitrate into nitrite" Water Res. 2006. V. 40. P. 3637-3645.

9. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Mulder A., Versprille B. New anaerobic process ofnitrogen removal. Wat. Sci. Technol. 2006. V. 54 (8). P. 163-170.

10. Kalyuzhnyi S., Gladchenko M., Mulder A., Versprille B. Comparison of quasi steady state performance of the DEAMOX process under intermittent and continuous feeding and different nitrogen loading rates. Biotechnol. J. 2007. V.2. P. 894-900.

11. Kalyuzhnyi S.V., M. Gladchenko, Ho Kang, A. Mulder, B. Versprille. Development and optimisation of VFA driven DEAMOX process for treatment of strong nitrogeneous anaerobic effluents. Wat. Sci. Technol. 2008. V.57 (3). P. 323-328

12. Kalyuzhnyi S., M. Gladchenko. DEAMOX new microbiological process of nitrogen removal from strong nitrogenous wastewater. Desalination. 2009. V. 248. P. 783-793.

13. Rotthauwe, J.H, K.P. Witzel, W. Liesack. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63(12). P. 4704-4712.

14. Bano N, JT Hollibaugh. Diversity and distribution of DNA sequences with affinity to ammonia-oxidizing bacteria of the beta subdivision of the class Proteobacteria in the Arctic Ocean. Appl Environ Microbiol. 2000. V. 66(5). P.1960-1969.

15. Holibaugh, J.T., N. Bano, H.W. Ducklow. Widespread distribution in polar oceans of a 16S rRNA gene sequences with affinity to Nitrosospira-like ammonia-oxidizing bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 1478-1484.

16. O'Mullan, G.D., B.B. Ward. Relationships of temporal and spatial variabilities of ammonia-oxidizing bacteria to nitrifications rates in Monteray Bay, California. Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 697-705.

17. Nold S.C., Zhou J., Devol A.H., Tiedje J.M. Pacific Northwest marine sediments contain ammonia-oxidizing bacteria in the beta subdivision of the Proteobacteria. Appl Environ Microbiol. 2000 V. 66(10). P. 4532-4535.

18. McCaig A.E., Embley T.M., Prosser J.I. Molecular analysis of enrichment cultures of marine ammonia oxidizers. FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 120. P. 363-367.

19. Voytek M.A., Ward B.B. Detection of ammonia-oxidizing bacteria of the beta-sublass of the class Proteobacteria in aquatic samples with PCR. Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61. P. 1444-1450.

20. Ward BB, Voytek MA, Witzel KP. Phylogenetic diversity of natural populations of ammonia oxidizers investigated by specific PCR amplification. Microb Ecol. 1997. 33:87-96.

21. Kim, O.S., P. Junier, J.F. Imhoff, K.P. Witzel. Comparative analysis of ammonia monooxygenase (amoA) genes in the water column and sediment-water interface of two lakes and the Baltic Sea. FEMS Microbiol. Ecol. 2008. V. 66. P. 367-378.

22. Molina, V., Ulloa O., Farias L., Urrutia H., Ramirez S., Junier P., Witzel K-P. Ammonia-oxidizing p-proteobacteria from the oxygen minimum zone off northern Chilie. Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 3547-3555.

23. Stephen J., McCaig A., Smith Z., Prosser J., Embley T. Molecular diversity of soil and marine 16S rRNA gene sequences related to beta-subgroup ammonia-oxidizing bacteria. Appl. Environ Microbiol. 1996. V. 62. P. 4147-4154.

24. Head, I.M., W.D. Hiorns, T.M. Embley, A.j.McCCarthy, J.R. Saunders. The phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as determined by analyses of 16S ribosomal RNA gene seguences. J. Gen. Microbiol. 1993. V.139. P. 2258-1153.

25. Teske, A., E. Aim, S. Toze, B.E. Rittmann, D.A. Sthahl. Evolutionary relationships among ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria. J. Bacterid. 1994. V. 176. P. 66236630.

26. Dua, R.D., B. Bhandari, D.J.D. Nicholas. Stable isotope studies in the oxidation of ammonia to hydroxylamine by Nitrosomonas europaea. FEBS Lett. 1979. V. 106. P. 401-404.

27. Anderson, K.K., A.B. Hooper. O2 and H20 are each the source in one O in N02" produced from NH3 by Nitrosomonas; 15N-NMR evidence. FEBS Lett. 1983. V. 164. P. 236-240.

28. Hyman M.R., P.M. Wood. Suicidal inactivation and labeling of ammonia monooxygenase by acetelene. Biochem J. 1985. V. 227. P. 719-725.

29. Hyman M.R., C.Y. Kim, D.J. Arp. Inhibition of ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea by carbon disulphide. Biochem J. 1990. V. 172. P. 4775-4782.

30. Schmidt, I., E. Bock, M.S.M. Jetten. Ammonia oxidation by Nitrosomonas eutropha with N02 as oxidant is not inhibited by acetylene. Microbiol. 2001. V. 147. P. 22472253.

31. Schmidt, I., Bock E. Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen dioxide by Nitrosomonas eutropha. Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 106-111.

32. Ensign SA, Hyman MR, Arp DJ (1993) In vitro activation of ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea by copper. J Bacteriol 175:1971-1980

33. McTavish H., LaQuier F., Arciero D., Logan M., Mundfrom G., Fuchs J.A., Hooper A.B. Multiple copies of genes coding for electron transport proteins in the bacterium Nitrosomonas europaea. J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 2445-2447

34. Zahn JA, Arciero DM, Hooper AM, DiSpirito AA. Evidence for an iron center in the ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea. FEBS Lett 1996. V. 397. P. 35-38

35. Arp, D.J., L.A. Sayavedra-Soto N.G. Hommes. Molecular biology and biochemistry of ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea. Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 250255.

36. Hooper A.B., Terry K.R. Hydroxylamine oxidoreductase of Nitrosomonas production of nitric oxide from hydroxylamine. Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 571. P. 12-20.

37. Bock, E., I. Schmidt, R. Stuven, D.Zart. Nitrogen loss caused by denitrifying Nitrosomonas calls using ammoniumor hydrogen as electron doors and nitrite as electron acceptor. Arch. Microbiol. 1995. V. 163. P. 16-20.

38. Schmidt, I., Bock E. Anaerobic ammonia oxidation by cell-free extracts of Nitrosomonas eutropha. Antonie Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 271-278.

39. Zart, D., E. Bock. High rate of aerobic nitrification and denitrification by Nitrosomonas eutropha grown in a fermentor with complete biomass retention in the presence of gaseous N02 or NO. Arch. Microbiol. 1998. V. 169. P. 282-286.

40. Zart, D., I. Schmidt, E. Bock. Significance of gaseous NO for ammonia oxidation by Nitrosomonas eutropha. J. Antonie van Leeuwenhoek. 2000. V. 7. N. 1 P. 49-55.

41. Mulder A., A.A. Van de Graaf, L.A. Robertson, J.G. Kuenen. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor. FEMS Microbiol. Ecol. 1995. V. 16. P. 177-184.

42. Strous M., J.A. Fuerst, E.H.M. Kramer, S. Logemann, G. Muyzer, K.T. van de Pas-Schoonen, R. Webb, J.G. Kuenen, M.S.M. Jetten. Missing lithotroph identified as new plactomecete. Nature. 1999. V. 400. № 29. P. 446-449.

43. Pynaert K., Smets B.F., Wyffels S., Beheydt D., Siciliano S.D., Verstraete W. Characterization of an autotrophic nitrogen-removing biofilm from a highly loaded lab-scale rotating biological contactor. Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69 (6). P. 36263635.

44. Fujii T., Sugino H., Rouse J.D., Furukawa K. Characterization of the microbial community in an anaerobic ammonium-oxidizing biofilm cultured on a nonwoven biomass carrier. J Biosci Bioeng. 2002. V. 94 (5). P. 412-418.

45. Toh S.K., NJ Ashbolt. Adaptation of anaerobic ammonium-oxidising consortium to synthetic coke-ovens wasterwater. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59. P. 344352.

46. Egli K., Fanger U., Alvarez P.J.J., Siegrist H., van der Meer J.R., Zenhder A.J.B. Enrichment and characterization of an anammox bacterium from rotating biological contactor trating ammonium-rich leachate. Arch. Microbiol. 2001. V. 175. P. 198-207.

47. Kuypers M.M.M., Sliekers A.O., Lavik G., Schmid M., Jorgensen B.B., Kuenen J.G., Damste J.S., Strous M., Jetten M.S.M. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea. Nature. 2003. V. 422. P. 608-611.

48. Kartal B, L.A. van Niftrik, J. Rattray, J. van de Vossenberg, M.C. Schmid, J. S. Damste, M.S.M. Jetten, M. Strous. Candidatus "Brocadia fulgida": an autofluorescent anaerobic ammonium oxidizing bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 2008. V. 63. P. 46-55.

49. Quan Z., S. Rhee, J. Zuo, Y. Yang, J. Bae, J.R. Park, S. Lee, Y. Park. Diversity of ammonium-oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria. Env. Microbiol. 2008. V. 10(11). P. 3130-3139.

50. Fuerst J.A. Planctomycetes a phylum of emerging interest for microbial evolution and ecology. WFCC newsletter. 2004. V. 38. P. 1-11.

51. Brochier C., H. Phillippe. A non-hyperthermophilic ancestor for Bacteria. Nature. 2002. V. 400. P. 446-449.

52. Strous M., Jetten M.S.M. Anaerobix oxidation of methane and ammonium. Annu. Rev. Microbiol. 2004. V. 58. P. 99-117.

53. Cervantes F.J., De la Rosa D.A. Gomez J. Nitrogen removal from wasterwate at low C/N ratios with ammonium and acetate as electron donors. Biores. Tech. 2001. V. 79. P. 165-170.

54. Kartal B, M.M.M. Kuypers, G. Lavik, J. Schalk, H.J.M. Op den Camp, M.S.M. Jetten, M. Strous. Anammox bacteria disguised as denitrifiers: nitrate reduction to denitrogen gas via nitrite and ammonium. Env. Microbiol. 2007. V. 9(3). P. 635-642.

55. Strous M, Van Gerven E, Kuenen JG, Jetten MSM. Effects of aerobic and microaerobic conditions on anaerobic ammonium-oxidizing (Anammox) sludge. Appl Environ Microbiol. 1997. V. 63. P. 2446-2448.

56. Kuypers M.M.M., Lavik G., Woebken D., Schmid M,. Fuchs B.M., Amann R., Jorgensen B.B., Jetten M.S.M. Massive nitrogen loss from the Benguela upwelling system through anaerobic ammonium oxidation. PNAS. 2005. V. 102.№ 18. P. 64786483.

57. Jetten, M.S.M., Wagner M., Fuerst J., van Loosdrecht M., Kuenen G., Strous M. Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation (anammox) process. Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 283-288.

58. Dalsgaard T., Thumdrup B. Factors controlling anaerobic ammonium oxidation with nitrite in marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. № 8. P. 3802-3808.

59. Cema G., J. Wiszniówski, S. Zablochka-Godlewska, A. Raszka, J. Surmacz-Garska. Biological nitrogen removal from landfill leachate by deammonification in a rotating biological contactor (RBC). Water. Sci. Tech. 2007. V. 55 (8/9). P. 35-42.

60. Isaka K., T. Sumino, S. Tsunedo. High nitrogen removal perfomance at moderately lo temperature utilizing anaerobic ammonium oxidation. J. Biosci. Bioeng. 2007. V. 103 (5). P. 486-489.

61. Dosta J., I. Fernandez, J.R. Vazquez-Padin, A. Mosquera-Corral, J.L. Campos, Ok> Malta-Alvarez, Kio Mendez. Short- and long-term affects of temperature on the Anammox process. J. Haz. Mat. 2008. V. 154. P. 688-693.

62. Rysgaard S., Glud R.N., Risgaard-Petersen N., Dalsgaard T. Denitrification and anammox activity in Arctic marine sediments. Limnol. Oceanogr. 2004. V. 49. № 5. P. 1493-1502.

63. Lindsay M.R., Webb R.I., Strous M., Jetten M.S.M., Butler M.K., Forde R.J., Fuerst J. A. Cell compartmentalization in planctomycetes: novel type of structural organization for the bacterial cell. Arch. Microbiol. 2001. V. 175. P. 413-429.

64. Sinninghe Damste J.S., M. Strous, W.I.C. Rijpstra, E.C. Hopmans, J.A.J. Geenevasen, A.C.T. Van Duin. L.A. Van Niftrik. Linearly concatenated cyclobutane lipids form a dense bacterial membrane. Nature. 2002. V 419. P. 708-712.

65. Trimmer M., J.C. Nicholls, B. Deflander. Anaerobic ammonium oxidation measured in sediments along the Thames estuary, United Kingdom. Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 11. P. 6447-6454.

66. Shalk J., de Vries S., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. Involvement of a Novel Hydroxylamine Oxidoreductase in Anaerobic Ammonium Oxidation. Biochemistry. 2000. V. 39. P. 5405.

67. Hastings RC, Ceccherini MT, Miclaus N, Saunders JR, Bazzicalupo M, McCarthy AJ. Direct molecular biological analysis of ammonia oxidizing bacteria populations in cultivated soil plots treated with swine manure. FEMS Microbiol Ecol. 1997.23:45-54

68. Mobarry B.K., Wagner M., Urbain V., Rittmann B.E., Stahl D.A. Phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 2156-2162.

69. Pommerening-Roeser A., Rath G., Koops H-P. Phylogenetic diversity within the genus Nitrosomonas. Syst. Appl. Microbiol. 1996. V. 19. P. 344-351.

70. Utaker JB, Nes IF. A qualitative evaluation of the published oligonucleotides specific for the 16S rRNA gene sequences of the ammonia-oxidizing bacteria. Syst Appl Microbiol. 1998. 21:72-88

71. Wagner M., Rath G., Amman R., Koops H-P., Schleifer K.H. In situ identification of ammonia-oxidizing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 251-264.

72. Kirkpatrick J., Oakley B., Fuchsman C., Srinivasan S.T., Staley J.T., Murray J.W. Diversity and distribution of Planctomycetes and related bacteria in the suboxic zone of the Black Sea. Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 3079-3083.

73. Amann R.I., Binder B.J., Olsen R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 1919-1925.

74. Daims H., Brühl A., Amann R., Schleifer K.-H., Wagner M. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: Development and evaluation of a more comprehensive probe set. Syst. Appl. Microbiol. 1999. V. 22. P. 434-444.

75. Schmid M., Schmitz-Esser S., Jetten M., Wagner M. 16S-23S rDNA intergenic spacer and 23S rDNA of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria: implications for phylogeny and in situ detection. Envir. Microbiol. 2001. V. 3(7). P. 450-459.

76. Risgaard-Petersen N., R.L. Meyer, M. Schmid, M.S.M. Jetten, A. Enrich-Prast, S. Rysgaard, N.P. Revsbech. Anaerobic ammonium oxidation in an estuarine sediments. 2004. V. 36. P. 293-304.

77. Dalsgaard T., Canfield D.E., Petersen B., Thamdrup B., Acuna-Gonzales J. Anammox is a significant pathway of N2 production in the anoxic water column of Golfo Dulce, Costa Rica. Nature. 2003. V. 422. P. 606-608.

78. Thamdrup B., Dalsgaard T. Production of N2 through anaerobic ammonium oxidation coupled to nitrate reduction in marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 1312-1318.

79. Jetten M.S.M., M. Smid, K. van de Pas-Schoonen, J. Sinninghe Damste, M. Strous. Anammox organisms: enrichment, utivation and environmental analysis. Meth. Enz. 2005. Y. 397. P. 34-57.

80. Sinninghe Damste J.S., Rijpstra, E.C., Schouten S., Fuerst J.A., Jetten M.S.M., Strous M. The occurrence of hapanoids in planctomycetes: implications for the sedimentary biomarker record. Org. Geochem. 2004. V. 35. P. 561-566.

81. Norton J.M., Alzerreca J.J., Suwa Y., Klotz M.G. Diversity of ammonia monooxygenase operon in autotrophic ammonia-oxidizing bacteria. Arch Microbiol. 2002 V. 177(2). P. 139-149.

82. Rotthauwe J.H., Witzel K.P., Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Appl Environ Microbiol. 1997 V. 63(12). P.4704-4712

83. Hoshino Т., Noda N.? Tsuneda S., Hirata A., Inamori Y. Direct detection by in situ PCR of the amoA gene in biofilm resulting from a nitrogen removal process. Appl Environ Microbiol. 2001 V. 67(11). P. 5261-5266.

84. Nicolaisen M.H., Ramsing N.B. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) approaches to study the diversity of ammonia-oxidizing bacteria. J Microbiol Methods. 2002 V. 50(2). P. 189-203.

85. Junier P., Kim O.S., Junier Т., Ahn T.S., Imhoff J.F., Witzel K.P. Community analysis of betaproteobacterial ammonia-oxidizing bacteria using the amoCAB operon Appl Microbiol Biotechnol. 2009 V. 83(1) P. 175-188

86. Lam P., Lavik G., Jensen M.M. Revising the nitrogen cycle in the Peruvian oxygen minimum zone. ProcNatl Acad Sci USA. 2009. V. 106. P. 4752-4757

87. Академика ЖКХ РФ В.К. Гордеева-Гаврикова. Ростов-на-Дону: Изд-во Юг. 2005. Стр. 84-99.

88. Хенце М., П. Армоэс, Й. Ля-Кур-Янсен, Э. Арван. Очистка сточных вод. М.: Мир.2004. Стр. 246-331.

89. Hellinga С., A.AJ.C. Schellen, J.W. Mulder, М.С.М. Loosdrecht, J.J. Heijen. The Sharon process: an innovative method for nitrogen removal from ammonium-rich waste water. Water Sci. Tech. 1998. V. 37 (9). P. 135-142.

90. Kelly P.D. Thermodynamic aspects of energy conservation by chemolithotrophic sulfur bacteria in relation to the sulfur oxidation pathways. Arch Microbiol. 1999. V. 171. P. 219-229

91. Sierra-Alvarez R, Guerrero F, Rowlette P, Freeman S, Field JA. Comparison of chemo, hetero- and mixotrophic denitrification in laboratory- scale UASBs. Water Sci Technol2005. V. 52. P. 337-342

92. Sanchez I., Fernandez N., Amils R., Sanz J.L. Assessment of the addition of Thiobacillus denitrificans and Thiomicrospira denitrificans to chemolithoautotrophic denitrifying bioreactors. Int. Microbiol. 2008. V. 11. P. 179-184

93. Fux C., Boehler M., Huber P., Bmnner I., Siegrist H. Biological treatment of ammonium-rich wastewater by partial nitritation and subsequent anaerobic ammonium oxidation (anammox) in a pilot plant. J. Biotechnol. 2002. V. 99(3). P. 295-306.

94. Fux C., J. Dosta, M.C.M. Loosdrecht, J. Mata-Alvarez. Two ways to achieve an anammox influent from real reject water treatment at lab-scale: partial SBR nitrification and SHARON process. Proc. Biochem. 2007. V. 42(4). P. 715-720.

95. Ahn Y.H. H.C. Kim. Nutrient removal and microbial granulation in an anaerobic process treating inorganic and organic nitrogenous wastewater. Water Sci. Technol. 2004. V. 50(6) P. 207-215.

96. Ahn, Y.H., Hwang, I.S., Min, K.S. ANAMMOX and partial denitritation in anaerobic nitrogen removal from piggery waste. Water Sci. Technol 2004. V. 49 (5-6). P. 145153.

97. Hwang, I.S., Min, K.S., Choi, E., Yun, Z. Nitrogen removal from piggery waste using the combined SHARON and ANAMMOX process. Water Sci. Technol. 2005. V. 52 (10-11). P. 487-494.

98. Dong, X., Tollner, E.W. Evaluation of Anammox and denitrification during anaerobic digestion of poultry manure. Bioresour. Technol. 2003. V. 86 (2). P. 139-145.

99. Waki M., T. Tokutomi, H. Yokoyama, Y. Tanaka. Nitrogen removal from animal waste treatment water by anammox enrichment. Biores. Technol. 2007. V. 98. P. 2775-2780

100. Ciudad G., O. Rubilar, P. Munoz, G. Ruiz, R. Chamy, C. Vergara, D. Jeison. Partial nitrification of high ammonia concentration wastewater as a part of a shortcut biological nitrogen removal process. Proc. Biochem. 2005. V. 40(5). P. 1715-1719.

101. Ruiz G., D. Jeison, O. Rubilar, G. Ciudad, R. Chamy. Nitrification-denitrification via nitrite accumulation for nitrogen removal from wastewaters. Biores. Tech. 2006. V. 97(2). P. 330-335.

102. Abma W.R., W Driessen, R Haarhuis, MC van Loosdrecht. Upgrading of sewage treatment plant by sustainable and cost-effective separate treatment of industrial wastewater. Water Sci Technol. 2010. V 61(7). P. 1715-1722.

103. Sliekers A.O., N. Dewort, J.L.C. Gomez, M. Strous, J.G. Kuenen, M.S.M. Jetten. Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite in one single reactor. Water Res.2002. V. 36(10). P. 2475-2482.

104. Sliekers A.O., K.A. Third, W. Abma, J.G. Kuenen, M.S.M. Jetten. CANON and anammox in a gas-lift reactor. FEMS Microbiol. Lett. 2003. V. 218(2). P. 339-344.

105. Third K.A., J. Paxman, M. Schmid, M. Strous, M.S.M. Jetten. Enrichment of anammox from activated sludge and its application in the CANON process. Microb. Ecol. 2005. V. 49 (2). P. 236-244.

106. Jetten M.S.M., Strous M., van de Pas-Schoonen K.T., Schalk J., van Dongen U.G.J.M., van de Graaf A.A., Longemann S., Muyser G., van Loosdrecht M.C.M., Kuenen J.G. The anaerobic oxidation of ammonium. FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 22. P. 421437.

107. Weisburg W., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 697-703.

108. Kirkpatrick J., Oakley В., Fuchsman С., Srinivasan S.T., Staley J.T., Murray J.W. Diversity and distribution of Planctomycetes and related bacteria in the suboxic zone of the Black Sea. Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 3079-3083.

109. Колганова T.B., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей./ Микробиология. 2002. Т. 71. С. 283-285.

110. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4 P. 406-425.

111. Van de Peer Y., De Wächter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

112. Pemthaler, J., F. O. Glöckner, W. Schönhuber, R. Arnann. Fluorescence in situ hybridization. In J. Paul (ed.), Methods in Microbiology: Marine Microbiology. V. 30. Academic Press Ltd, London. P. 1-31

113. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M. and Schleifer K.-H. (1992). Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions. Syst. Appl. Microbiol. V. 15. P.593 600

114. Stahl, D. A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England. 1991. P. 205-248.

115. Лурье Ю. Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984.-448 с.

116. Truper H.G. & Schlegel H.G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antonie van Leeuwenhoek, S. Microbiol. Ser. 30 (1964), p. 225-238.

117. Hooijmans С. M., Veenstra S., Lubberding H. J. Laboratory course process parameters and microbiology // Int. course in anaerobic waste water treatment / Ed. G. Lettinga. -Delft.: Agricultural University, Wageningen (Holland), 1990. 44c.

118. Rebac S., Gerbens S., Lens P., van Lier J.B., Stams A.J.M., Keesman K.J. and Lettinga G., Kinetics of fatty acid degradation by psychrophilically grown anaerobic granular sludge. Biores. Technol. 1999. V. 69. P. 241-248.

119. Березин И. В.,. Клёсов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики, Изд-во Московского университета, 1976, 320 с.

120. O.Hoshino Т, Terahara Т, Tsuneda S, Hirata А & Inamori Y (2005) Molecular analysis of microbial population transition associated with the start of denitrification in a wastewater treatment process. J. Appl. Microbiol. 99: 1165-1175.

121. Delbes C, Moletta R & Godon JJ (2000) Monitoring of activity dynamics of an anaerobic digester bacterial community using 16S rRNA polymerase chain reaction— single-strand conformation polymorphism analysis J Environ Microbiol 2: 506-515.

122. Grotenhuis JTC, Smit M, Plugge CM, Yuansheng XU, van Lammeren AAM, Stams AJM & Zehnder AJB (1991) Bacteriological composition and structure of granular sludge adapted to different substrates. Appl Environ Microbiol 57: 1942-1949.

123. Sekiguchi Y, Kamagata Y, Syutsubo K, Ohashi A, Harada H & Nakamura К (1998) Phylogenetic diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology 144: 2655-2665.