Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение локализации флуоресцентных зондов в липидных объектах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Определение локализации флуоресцентных зондов в липидных объектах"

НОСКОВСКМ ГОСТ ДАРСТВЕННЫЙ ШВЕРСШТ ВН. И.В. ЛОМОНОСОВ! ®пзняесша факультет

Еж прютут руштд

Югрех Наколг! Хонстангяновп

Ш: 577.352.333:535.082.56

0ПР2Ш2НШЕ ЛОКШЗШШ ШОРВСПЕНТННХ зондов В ШИШ ОБЪЕКТАХ

Оющс&гивкть: 03.00.02 - eaofacsan

ABÏCPSfflEPAT ;

.дассардааетз sa соиснаняа ушжзв стяшш sffiUXUUüTS фаааюо-штвиуицчасяжж паук ,

80CSM - 1992 Г.

Работа выполнена в лаборатория биофизических ветодов даагао-стихи НИИ фвзико-хшгче ежой медицины ИЗ РФ.

Научные руководитель: доктор фазнко-иатематжчеенш. наук, профессор

Геннадий Евгеньевич Добредав.

Офщиальше оппоненты: доктор Снзико-иатеыатжческнх наук, профессор

Александр Коастантинович Кукушат

доктор фвзшео-катематячеашх наугс, профессор Валери! Леснддовяч Црмодеев

Ведущая организация: Институт химическая $взикг в Черноголовке РАН.

Защита диссертации состоится " * гЯ^^а^У 1992 г. в часов на заседании спедаавизироаанного советй ЖЗ ОФТТ (К 053.CS.77) в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу 119699, Москва, ГСП. Ленинсюге горы, МГУ, физический факультет, аудитория ОФЛ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке фвзтесхого факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " С3* с-с^^кГ^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета «3 ОФГТ (К 053.05.77) в МГУ

ОБЩАЯ ХАРДКТШГША РАБОТЫ '

Актузгьяосгь тегаг. В настояпзв врекя в жссдедованщ Сиологп-зшх иемЗрая з лнопротезнов гарака яспользузтся мзтод фдуорес-ггннх зоядоз. Е1етод основан из возтоазоста получения гнфэряцпз о эуктурэ я свойствах пссхедуемого биологического объекта из пара-гроз флуорасцзЕша ногкяуляршх зсацсз - органических грасатздэЁ, зеосниз. некоьашэнтао связываться с белетЕО-ляшшаа кошхвксагш. íjotc-ees объеиа такого рода вз|ормащш во шгагях случаях трс-бует 1СГ9ННЯ молекул крзсстеля в йюлггачесяом объекте.

Одел пз вояхохов s езяснвшеэ яокадгшвзг флуорзсцонтЕна гон-з яз2я&?ся гспшЕьзэваягз багладучатвяьного переноса энвргяз аоек-тлззго возбусдейпя кзгсгу сгль Дахо в теза, что 2ф£еггпшЕость тагоса знэргпа заазстг о? вазегагого раахогсгэшш зоядов-доноров а щ^в-гздссторса. В адсшсстз, в такзх «кагогзчесиих объектах ках ¡.йранз sis етгопрзтзйЕН пзрэеос анерггз .»szny зозаака долгая за-езгь о? хахалпзвдп зоягез в зтах объектах, Зная елютеекгз свой-за донорез з гкцапгореэ 2 пФ^зтззеость серэпоса евэряа гаяду •a, tarso Емытатьсч озеегглггь за яотастгшгэ в кзгйргга (лото-отвнЕЗ). a заодно - п ояенегь рзз*зра и форму сакго дзппдного

I8KT3.

Осковаая трудность р?г;.а:™л такого рога "обратая" задач состо-3 ~:сл, ЧТО OZVXVTZTZrn ПЗр-SEDC ЭЕЗрГПЛ ITS34 СООТЕЭТСТВОЗаТЬ S3-одысл Езрзаггем ¿одалгазегз эегдоз. И длз того» чтобн вабрать га Езсжиыга вариантов, вэобхоя»»:

- Г>*9ГЬ ОЧЕНЬ ЕНСОЗУП ТО'ШОС'ГЬ 3Ka¡2JE2i3HTS.SbEíX ДЯЕНЦХ;

- воаучзть "í:% гжгя» Cornil сбг-su шфорггатга о пэреяоео энзр-

- ггзть хлрозу» ^гззтаскуа ьядзль, оялсывагауэ дареное энэргаи реальных бпасаггчэсххх octeerrax с езсгкз гксскоЭ точностью

Рэггвиз зтаг. трех пройдем составляло етдгетво давнсЗ ргботи.

Даль 'а задача работа. Ооюааал цель ргяЗстн зг&шэт&яэсь а раз-пш подхода» основанного аа пепшпьзоваяаз безаглучатзльвзго пере-сз грергаз, к йсслздовзнгз .тазадпзгяда флуорзецеятннх зсадов э астппеекпх зкмбразах н дшлротсхяах.

Для взстшэеея мой сага сияя шетазлзш следусзез задача:

- в petasx теордз шхауктявао-резскансяЕюго переноса гнергиа Ч.

Ферстера н Ы.Д. Гааашна осукзствсть ш возлкшосях болзе гочз решент праяа задач ш расчету зффектвностЕ шреЕоса в части сферической фосаа ороЕзвалъшго радиуса для различных взриан1 сферически стагетрачного расположения хрогго&зров в пределах каа; часгшш;

- исследовать спектральные н флуоресцентные свойства есполь: ешх флуоресцентных зондов, оСеспечЕз теи сашы возгзогность при нзнеш результатов теории в ресешЕ пряшх ¡в обратннх задач для ю крата донорзо-агщепторнах пар н лшедных объектов;

- провзста экспериментальное исследованЕЗ переноса заергна ; нз скольких дотрЕО-акцет-арннх пар при сганЕонарноа и гыцульеши в пучкэ СЕЗфОТрОЯВОГО кзлучешя - возбуюйнеи в иодельши. оОъ; ?ах: smacxzsax, шдглгррхнх фосфсшшндвыЕ бяслой, и лишдвнх ч< ТЕЦях, иоделарушнх лэдопротеиш, а такгг в жшшротеянах оч! еез;соЗ плотности;

- разработать кэтода аааялза, позволяэдяе увеличить обгеи ] влекаемой ЕЕфорцащш из полученных экспериментальных данных , возшжно более точного ресенгя обратных задач по определена» лоз лязацзи флуоресцентных зондов в лжгшшх оОьеетах;

- использовать разработаявиз катода для пэлучешш количеств« ных данных о локализаций флуоресцентных зондов в исследуешх объе тах.

Научная новизна работа. В результате проделанной работы прас рел новые возгс02Е0ста н стал существенно более количественным а : фзктивнш подход к исследованию пространственной организация био. гических мэцбран и липопротешов, основанный на исследовании лоз дизайна флуоресцентных зондов с помощью безизлучательного перенс энергии.

Это удалось сделать, вс-первих, благодаря Еяервые осукествлс ному обобщению теоряи Ендуктивно-резонансного переноса энергии случай частиц сферической формы произвольного радиуса. С поыо; развитой б этоы направлении теорш был ресен целый ряд прямых : дач. В частноста, было рассчитано влияние на эффективность перенс энергии крквкзш поверхности и глубины погружения в лжвдные чзс^ ца шлекул донора к акцептора. •

Во-вторых. Сшш получены новые данные о спектральных а фж ресцентши свойствах используемых красителей а липидных объектах

некоторых растворителях. Это дало возможность применить результаты теоретических расчетов для решения прямых и обратных задач в случае конкретных донорно-акцепторных пар в лшгосоыах, лнпндннх частицах, моделирующих лшгопротеины, я липопротеинах очень низкой плотности.

В-третьих, была разработаны новые методические подходы к получения большего объет информация из экспериментальных данных по переносу-энергии. В частности, нз совместного рассмотрения стационарного тушения и кинетики затухания флуоресценции донора удалось показать, что кинетические данные содержат дополнительную информацию о переносе гнергаа. Показано таю», что существенно больший объем информации монно извлечь аз совместного рассмотрения переноса в нескольких донорно-шсцеигорных парах.

В результате впервые был количественно реиен целый ряд конкретных обратных задач, связанных с восстановлением расположения молекул донора и акцептора в лилидннх объектах по экспериментальным данным о переносе энергии.

Практическое значение работы. Проделанная работа позволила:

- усовершенствовать методы определения радиуса, площади поверхности и общего схЗьека жпид-содержашгх частиц сферической форды в суспензии;

- получить количественную информацию о локализации используемых флуоресцентных зондов, в тем числе и трех веществ - флуоресцентных аналогов холестерина, - в липоссмах, в липидных частицах, моделирующих лшюпротегна, и лппопротеинах очень низкой плотности;

- количественно оценить плоладь поверхности, приходящуюся на одну молекулу фосфолипида в модельных частицах и лшопротеинах очень низкой плотности, а такге измерить средний радиус последних;

- выяснить влияние гидроксильной группы холестерина на его локализацию в липадных частицах, моделируютх липепротеины.

Апробация работа. Основные результаты диссертации были долоке-ны на Всесоюзных совещаниях по использованию синхротронного излучения СЙ-84, СИ-86, СИ-88, СИ-90 (Новосибирск, 1984, 1986, Г988, 1990 гг.), на Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение" (Рига, 1985 г.), на Всесоюзном совещании по молекулярной лшинесценции (Караганда, 1989 г.), аа научной конференции НИИ физико-химической медицины МЗ РСФСР (Москва, 1989 г.).

- в

ПуАшкашге. По ьагершш ДЕСсерт2ЩШ.;опублшковано 16 печати работ (3 ез ншс sa рубесои).

Структура и саъеи работы. Диссертация содергнт сладущаа ра: делн: введение, обзор литература, ошсаяае материалов и методов а сдздоваша, трз гязеы ваксзаня ж обсуаденля результатов, закдзч< Ese, взвода, библиография, шлючавдая 225 ссылок на источнике лек ратуры. Работа накосэна на 133 страницах шжшпжзого текста, а лзетргрована 19 ТЕблща-ш п 53 ргсункаш.

С0ХЕРШ2ЙЕ ДЕССЕРГАШ ГЛАВА I. ОБЗОР ШЕРАОТЫ

В обзорз рассмотрена сгадуизз вопроса. I. Основа теории ш дукишно-рзгонансшго перекоса енергвд электронного возбухщенпя бесконечной срзде с в срздах,разделанных грашщааа; влияние дай® 322 на &45®31гтаз:оегь пзреноса зпергза. 2. Флуоресцентное зонда кг инструмент да исйгадоваяш! пространственной организацш шмбран лшопротеиаов с шиощьв безнзяучательного переноса энергш.

ГЛАВА 2. НИШАМ И НЕТОЛЫ

Объекты дсслэдревняя.

Иекбраннда вззш:улк - ляшеомы - получали по катоду, предлс 28КЕ0«у Batzri s., 1973, из яичного фосфатвдилхолинв (Харысовскз завод бакт„ препаратов).

Лишвдше частицы, гстделкрущие лихгоиротеинн (ЛЧ), готовили еледушиы образок. I ыл смеси яичного лецптзша в триолеша (serva в весовом отношении 1:2, растворенных в изопропаноле, при темпера туре 55 °С добавляли пра быстрой перекашиваний к 9 мл охлаздениог до 10 °С раствора 10 Ш грис*нс1, 2 i¿i ЭДТА и 0,9% ылС1 согласи skiar l.a., 1931. Образовавшее« в результате этого 14 отделяли о возможной прима си липос-оы ультрацентрифугированиеи при ICfg в тече ние 18 часов. Отбаралз содержимое верхией части цектркфужаоЁ про бирки (1/5 общего объема) и диализовалн против 30-ти кратного объе иа буерного раствора. В полученной такта образом суспензии ЛЧ оп ределяли содерааяаэ фосфолишгда по vaskovsky v.e. , 1975 и общег лнпцда по foich j. , 19s7 с последущш взвешиванием.

Динотгротекш очень низкой плотности (ЛОШ) выделяли из цельна

йБоротня крова здсравнх догоров, вэдлсй'патодак, ультрацентрЕфуга-овэнпегл прз ICfg в течешзэ Г8 чзсез. Согласна h*,v«ji я. л., i<?s3 яотвость снворотаг при атсм Сила доведена с пахзаью *з?г до Г.СОЗ /мл. После отбора содарт&ого верхней 1/5 частз цзнтрвйтаса прозри проводила дналзз ддя сеепззня коЕцантрашш "kdt к .определяла эдерзаннэ фэсфагщглдэ а сб~5го 'лкшиа тек еэ, ¡шг в случае ЛЧ. йлуор'зсцевтшз зонда.

В работе псгсльзязап зонда: н-терфгнпд (х.ч.); алтргизн злдоа); годеста-5,7,,9(11}-тржз-Зр-сл ада В-хосвстатргзя (В-ХТЕ), ¡М.^то^ско^стсРб^.ЭШ )-тр~зз (Ü-LT2), стсарат хсхгзсга-5,7,9 [I )-трззн-зр-олз (Ст-ГГЕ), <йгпгаззровааг±з Я.В. Иоф$э а Б.В. £jc-шгь, 1985 в Иастзтутэ эксявр&гентальша ездяцзны МЛ СССР; 4-

зметаяаигвтааисш ШЗД;

зЗ СДШ-12): 4-(5-(фзшгахегзадпл-г>-1-гаета.х9Ц^)Е1ргцЕнпй йэр--порат (К-63). сггтеззроваш-аЗ H.H. Тур а Л.Ш. .бфанасназз. Харьков-

Измерения.

Огюктрофотоквтрзчеснва измерения проводзля на стз:ггройотсйотр-г

Bactccum Dii-7 (СШ), а фЗуореСЦЙЕТШЙ ИЗИЗрвЕИЯ ЩШ СТаЦЕОНЗра

возбувдешш - на флуоресцентна спектрофотометрах ж tacw t>s?F-4 Hitacht F-4000 (Япония). Коррекдав спектров вспускання фдуоресце: ши осуществляли с поисщьа калиброванной шш накаливания с вол фразовой Езгьа п известной яркостаой теипвратурой. Эффектнанос переноса энергии определяли по гусеняв флуоресценции доноров ц добавлзнан акцепторов.

Кинетику затуханзя флуоресценции зондов исследовала фазов иодуляционныы изтодоа на спектрсфдусрсжзтрз ал-4£ооз (ODA) н s пуяьснш! ызтодси в пучке сянхротрояюго Езлученпя усзюретвля Ш С-60 на спеизалазнрованной установка (Александров B.Li.. 133 1963). осназзняой системой счета фэтоноз. с поисаь» 2048-нканально: вреш-амшсктудного преобразователя (0,1 зс/канал).

Обработка результатов.

Бее Езгларешш проводит с повторам от 3 до 20 в более раз. ! случайную ШГрвЕНОСТЪ ЕЗЦЗРЗЕШ! взздз пршЕлаш ешбзу ерзднзг Б&льау» часть рзечетов осуществила на ЭВМ еке-6&6/в (Вентрпя) . програамач автора. Наиболее слогане расчеты, связанные с варваров няем нескольких параметров, были осуществлены с помощью спзцяаяьн го пакета программ, составленного СырейдаозоЁ Т.Н.. ФйАН. Подб оптимальных значений варьируешх параметров осуществляла с жепол зованием ^-критерия.

ГЛАЗА 3. ТЕОРИЯ ЙНДУККШН0-РЕ30НАЯСН0Г0 ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ В ЧАСТИЦАХ СФЕРИЧЕСКОЙ ФОРШ

Глава посвящена развитая теорга переноса энергш на случ сред со сфержческиш'граншхеш при объемней и (или) поверхности распределении хрокофоров. Рассмотрение проведено в рамках теор щдуктивно-резонансяого переноса энергии Ферстера - Галанана. : основу взято выражение, опасывапвзе зависимость кинетика затухая флуоресценшш донора (ftt>) от концентрации акцептора (мо) при сл чайкоы распределении колекул донора и акцептора в пределах прои вольной области 2 и.О» соответственно:

CF<tJ/F(0) 3«

-Cl/(Jd2>3 E*pi-t/T:o> Jd2(c«p{-NoJCl-exp<-(t/Xo) «Ro/ft)e}3dÜ>) Cl)

S ' 2 °Q

Здесь: 1- время; тв- врегш затухания флуоресценции донора в отсутствие акцептора; ко- крзппеский радиус переноса энергии (радиус Ферстера); к - расстояние ыажду молекулой донора и молекулой акцептора (одна из горененных интегрирования). Расчета эффективности переноса энергии при стационарном возбуждении осуде'ствляли. согласно:

во

СР/Р )|СР(1)/Р(0) ЗсП, (2)

о о ^

о

где г и гв- интенсивность стационарной флуоресценции донора з присутствии и в отсутствие акцептора, соответственно.

Были получены точные выражения, опысывалдне индуктивно-резонансный перенос энергии, и произведены расчеты для простейэих вариантов геометрии зон расшлояения донора (2) и акцептора (0),табл.1.

Таблица I.

осластя локализации: сферическая поверхность радиуса д Сфера радиуса я •Сферический слои (А,.Аг>

-1 акцепторов доноров 2 '—0—

Сферическая поверхность радиуса о Сфера радиуса о Сферический слой рис.За,4а,5а рис.36,40,56 рнс.3в,1в,5в рис.3г,4г,5г

Центры всех сфер совпадают.

Для Езхболее обгего из рассматриваемых случаев (рзс.2), обозначен аого в таблице знаком » , кинетика затухания флуоресценции описывается выражением:

а

1

СР<г>/Р<0>3 » ехрС-г/То>»ГЗ/<0^-0*) Ог©*р<-Е ><ю +

° в

а о

г I

* J £ <?хрС-Е >Й0 + J 0%хр{-£ >сЮЗ, <3)

а а ^

1 2

где е (1=1,2,3; л=1,2____7) представлены в таблице 2. Значения ^

отвечают сема различным соотношениям мевду д^ д2,о1 и 02.

- го -

Таблица 2.

3 Е . 1*

1 Е. Еа °«> «а2 А.> ».

2 Е + Е. о С V Е* А^ А4> 0,

3 V Ех Ео* Е, а4> \ * о4

4 V Е, V Е, Е* V V А*

5 Е, Е, Е» 0 > 0 > А г А I » х »

Ь V Е* Е«* Е. V Е* Аа* О.» А,

7 Е. Е, Е. А = А в А I ж

где: Е - ЕШ,»:яЛт I е. - 4Ю»М ] )

о1 о ~ ж о"

Е. - <1си /ОХ с Е(К,ОИСА*-<1>-й;>*3<зя - i Е<К,*ЖСА*- <&-«> * зйш ;

* к-1 * К»1

Ев= <гя:-мвА/о> J Е<К,С»шя; Еш.йЭ » 1 - е*Р<-(г/т > с^н »">;

I

м'-поверхностная концентрация акцептора.

Полученные вырагенкя

Рис.2 Вариант случайного расположения молекул донора и авдеп-тора в пределах сферических слоев (01,0*) и (А|Дв), соответственно.

возмоаныа точеый расчет эффективности переноса энергии яри любо* сферически сишегричноы расположении молекул донора к акцептор) и, тем садам, получение зависимостей эффективности переноса оч концентрации акцептора (рис.3), радиуса кривизны (рис.4) и глубины погружения хромофоров (рис.5; в лишдные частихш. Эти зависимости могут быть использованы дда анализа экспериментальна данных и планирования экспериментов. Нг базе этих выражений были построены модели локализации флуоресцентных зондов в дшшдном бислое и ЛЧ.

1.0 -

0.3

0.0

0.5

0.0

5в/ 7

00/ 1

л - А =0,8

1 ' 1 7'

// У' / /

' 1 * / >М4/ЗЫ&= =0,9 ' 1 1 I

Т—I—Г—1—г

2 4 8 3 10 -2 -1 (4/3)тгЕ£ Х/йо

иянИе концентрации акцептора (рис.3), радиуса жрпзЕзны сферических стиц (рнс.4) и заглублена» доноров относительно акцепторов Х=к-Ъ ю.5) на эффективность переноса энергии со сферической поверхности циуса 0 на сферическую поверхность радиуса А (а), из объема сферы циуса 0 на сферическую поверхность радауса А (б), со сферической верхвости радиуса 0 в сферу радиуса А (в) я из объема сферы радну— В" в обки сферы радиуса А (г). Для рис.3 а 4 ВЧ=С=А.

Kpc&s того, разработанная теория позволила сущвственш yii нить способы определения сушарной юю&адн поверхности, сушарв объема в радиуса сферически! частиц в суспензии по данным перев энергии в простейших случаях локализации флуоресцентных зондов.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ СШШГРАЛЫЖ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ ШШСУЛЯРШХ ЗОНДОВ

Для того, чтобы обеспечить возшяюсгь лрнкзнения теорже конкретвш эондш и ллтптднтд: объектам, было провеяно подробное : следование спектральных в флуоресцентных свойств жстользуешх з дов. Так, бшш взжреяи спектра шглосзнш, cnairrpa ЕОЗбуаденЕЯ испускания флуоресценции (рис.6), иощтые коБффзщхенты зкстинк (£>, квантовые выхода <оо> п анизотропия са> флуоресценции, вре на еезшх возбужденного синглетного состояния íto) восьш зон (табл.З). На основе этих данных были рассчитаны величины (тайе.4). Показано таксе соответствие величины критического рада переноса, рассчитанной по теории Ферстзра в определенной зкспе ментально в растворе ПЭГ-300 для capí антрацен —> ДСН-12. подтверждает диполь-дншльный характер взашлэдействяя uessj ат зондами.

еоо

Рис.6 Спектры поглощения (1) н испускания флуоресценции (2) используемых зондов в ли посомах (а,г) и ЛЧ (б,в).

335

425 470 Х(нм)

Таблща 3.

Некоторые спвктральше и флуоресцентные характеристики Есшм&зуема зондов

Зонд Среда <ны>> О о . Т <ЕС> О А

(ГГеГ1)

Л1*ПОСОГ-Л ИЗ - - -

п-тер- ЛЧ (ФХ:Т0=и2) - о,вз - 0, 1

фзкал ЛОЯП - о,во - -

глщерпн (+-,°С) - - - 0,27

¿¿ШОСОг.Ш ИЗ <зх 0,0£3 о,б-о,а 0,21

В-ХТВ ЛЧ (®Х:ТО=112) - 0,005 - -

лгпесомы дз ФХ _ 0,(Я7 _ _

Ы-ГГЕ ЛЧ (ФХ:Т0=1:2) - о,оьо - -

стшссяа пз <5Ж - о.осз - -

Ст-ХТЕ ЛЧ (01:Т0=1:2) _ О, Ю1 - _

лппосааг пз 82 - 0,20 4,О—О,2 0,021

ЛЧ (Ф1:ТО=1 :г) 31Г.0 {339} 0,24 3,9—0,2 О,ОН

антра- лот 7750 О,24 3,-7-0,2 „

цен гязцорзн (<~>°С) - - - 0,13

ПЭГ-300 - 0,23 3,0^0,1 -

этанол 3130 аэ 0,23 4 , &—О , 1 -

лнюсаз пз <3 »3300 СЗЗЗ} О,9-1 3,3 0,57

ЛЧ (ФХ:ТО=1:2) 1ТССО 0,9—1 3,5 О, 11

К—6-9 лот - 0,9-1 3,5 0,17

глвцерзз (ы°С) - - - 0,33

этанол 15300 <370) О,9-1 3,3 -

лшхосош пз 01 39400 «713 - 0,3-0,4 0,34

ЛЧ №10=1:2) з*?с-оо £471) - - 0,30

ЯСП-12 ЛОКП 394ОО <471 > - - -

глзцарга (+4°С) - - - 0,30

Езг-гсо 43200 {4£0> - - -

ЭТЕПОЛ ■■$9200 - 0,22-О„03 -

ЛНПОСС'Л! пз ОХ 2&СКХ) <«1!5Э - - 0,30

ЩХ ' ЛЧ (®:Т0=1:2) 31600 «0 - - 0,27

лош зсеоо С40Ь> - - -

этанол 34М50 <420> - 1,3-1.4 -

"X - фосфатядилхолш; ТО - тшояеш; ПЭГ - поляэтпленгликоль. »- данные Забазарных и.Ю., НИМ КЗ РОЗСР; р®-к«г с.а„ ,19&о.

Таблздз 4.

Критический радиус переноса энергии (и,), нспользуегдхх в работе данарно-акцепторных пар

ТЯспользуеше в

Донорно-акцептсрнне Среда «о расчетах п0 __

пары 1Ш) значение Ф*

п-терфенил— >антра- ЛЧ (ШТСЬпг) 2,97 2/3

цен лонп 2,95 2/3

В-ХТЕ—>ДСП-12 ЛЧ 2,59 0,52

Ы-ХТЕ—>ДСП-12 ЛЧ 2,40 О, 52

Ст-ХТЕ->ДСП-12 ЛЧ 2,63 0,52

В-ХТЕ—>ДЦХ ЛЧ 2,ВЗ О,52

Ц-2ТЕ—>ДМХ ЛЧ 2,63 0,52

Ст-ХТЕ->ДМХ ЛЧ ..... О,52

ПЗГ-ЗОО 3,47 2/3

дшшсо&н вз ФХ 3,38 2/3

антрацен—>ДСП-12 ЛЧ 3,49 2/3

ЛОШ 3,50 2/3

шаосош. ю ФХ 3,42 2/3

антрацен—>Ш£ ЛЧ 3,71 2/3

ЛОШ 3,77 2/3 .

_ лшосош ЕЗ ФХ 5,0 2/3

К—68->ЛСП-12 .14 5,О 2/3

лонп 5,0 г/з

Ф* - среднее значение фактора взажшой ориентации ¿онора е акцепторе (Рогв*вг Т.,1943».

ГЛАВА 5. ЙССЛЕЙОВАШБ БЕЗШЛУЧАГЕЛЬРОГО ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ ' ПИШУ МУ01ШШГШШ 30Ш1АШ В ЛИПШИХ ОБЪЕКТА!

Глава содеряи результата экспериментальных псследовангй шрэ-носа энергии между флуоресцентными зондаш в простейших иоделши липидных объектах - „дагасомах и ЛЧ, а такке ЛОШ. Было изгораю тушение флуоресценции доноров при стационарной возОукдекш з результате переноса энергии на акцептор«, а в случаях, когда донором служил антрацен, - еще' и кинетика затухания его флуоресценции в присутствии акцептора при импульсном возбуадении в пучке синхротропно-го излучения. Типичная картина затухания флуоресценции антрацен;

заставлена на рнс.7. Особое взимание бнло уделено повкшенкэ точ-ста подучаеггоЗ нн^ормаши. Для этого тщательно юшрялз вклад в зевке фпуоресцсншз донора» вносямиа реабсорбцяей и экранировкой

акцептора. Нз этом этапе работа поя-зллзсь возможность сопоставления экспериментальных данных по перекосу знзртан с рассчзгганньмг согласно разработанной теоржя, что явилось осеовоЗ для реязная обратных задач по восстановлена» параметров локализации зондов нз аф&эктявностн переноса, полу пенной в эксперименте.

Основное содержание главы - это рслэшге обратных задач по определенна локалпзашш флуорзснентшга зон-доз в модельных лкштдшд объектах. Для этого на основе разработанной теорав ЕШШЯГ8Я1 ("одели локализации зондов л в рамках этих гюдедеЗ производили расчет гффэктнзности переноса для коннрзтннх доноряо-акпеп-торнкх пар. Результата расчетов сопоставляла с экспериментальная! дан-ннмз и по степени соответствия ыевду ег.с: сгдгга о качественной и колн-гтвенЕС?* ссотвзтств::н , вшгаятаежй модели локаяззащхп реальной ругтурс и размерам фосФатзшш.ол!иоБого бислоя к ЛЧ.

В чзстеостн, в результате анализа данных переноса энергии с гранена на акцептора ДСП-12 я ШЯ в ляхосомах прг стационарном збуэдешш (рас.8) в рамках простейзей коделя локализации получали ¡гениа с еысокой степеяьо неоднозначности взаимного рассолопзння юра я акцегггорз (рас.9). где н.х и а - параметры локализации доза з акцептора для рассматриваемой гюдзлн (ряс .10). Расчет эффектности переноса эиерпш в этой случая осушствяллн соглэсео выра-зня:

(1)/Р(0)3 *

вхрС-<Ь/1 )-2,71»М "Пл'к/Т: < 1~В> 1 ¡Г йХГехр {2*34'ня»

Г О О О О О О

1Х--3

-5 5 15"1"?»

I, НС

с.7 Эзсаерпиеитапьвза са-:п;:ость игтессиЕностп <\т?-гсцеггцпп антрацена от срг-(и в отсутсгвкз кетеятора п в прпсугскгт 20 ижП тестера ДСП-12 (2). 3 -р:.га гшлутиса гогбугдающе-' спяхротрозЕого пзлу^енна.

®< I EiR.t) (R/R löt'ft/r< > * < I Etft.tXR/R >«j<R/R ))J3, <4

* О О ' о О

0 О

Выражение 4 описывает перзнос знергш в случае плоского бкслс Правомерность его использования обусловлена иалостью влияния щ визны поверхности на гффектЕЪНость переноса для реальных разиз] дипосои.

Совестное се рассыогренле стационарного тусення и кшетх затухания флуоресценции антрацена в присутствия зтих es ахцепто| и, в частности, исследование устойчивости решения к вариации мо^ та начала возбузшаааго ошульсе (psc.II; 'позволило получить л вольно точную количественную оценку пэрыйтров локализации ЖШ-12 ШК и суиестьенно сузить область возгдкаой локализации антраце! Из рисунка вадно, что рзсеннэ устойчаво вблюи значе! н»н0«о,тео=5 шз ддя ДСП-12. ¿аалогшшо получала: no« ro= 3,4 ни случае ДУХ. Из полученних данных удалось оценить величину пкоэе поверхности, прзходяцуюся на одну иаяекулу фосфагиднлхолина (s о,г,з-о.ь7 ни1} п толщгау гидрофобной части бкслоя (3,2^0,2 на), г результаты удалось подтвердить (рис.12) в независимо« экспергшеЕ по переносу энергии с "поверхностного" донора К-68 на "повершос ныЗ" акцептор ДСП-12 укз в рожах существенно более простой кода локализации, в которой и-1 »s, н га основа данкнх тувения толь стационарной фяусресцэшыш (рас. 13). йз рас. 12 видно, что кры связи so к ьо для двух доЕорао-акцепторных пар: антрацен—>ДСП~ е К-60 —>ДСП-12,- пересекается jeishho в точке so«= о,дз m/s н з ны. Доказательства существования безнзлучательного переноса зна гаи в это® паре зондов продгт&влзщ на рве.14, где видно, что под са поглоаення К-68 в спектра .возбуждения одаоресцекша ДСП-12 поя ляется только при встраивании донора в акцептора в дшидныЯ объек

Сечение слоя о на рас.9 плоскостью н=нс показано на рисЛ где Етриховгсой выделена зона предпочтительных значений параметр локализаций антрацена. Из рисунка следует, что гидрофобный зонд а трален против всех спаданий оказался неравномерно распределенным толгине бислоя. Зоной првЕиусествгшоЗ его локализации явилась о ласть глицериновых остатков и хзрбонилов фосфатидилхолина п, во моено, пришкакпне к ней области полярной к гидрофобной части б слоя небольооа тояциеы-

Рис.9 Область (&) ввачекяй параметров лсхглзгзацзш донора (I з G) s акцептора (И) а лппнщаом б treno е. соогвстстаутоща« эгсперзмегггельямм дашпш по тушению флуоресцзкцша антрацена акцептором ДСП-12 при стационарном возбужденна.

Рис.8 Тушеяве стационарной флуоресценция автрацеда акцепторами

дел-12 и дах.

ЩпЕЗ

Еяжгяяя пов—та бпслоя

rip&rst-

I | v

3 р.

центр, о гт-ть и бцслоа £

2СЭ-

100-

?иутреая"гя пов-тз. бпслоя

1ГТ—i—i— ,

Рас. 10 Ноде/а распологицца 0-5 0.7 0.0 зогшов о мекбрапком бясяог. H/R¡j

Рис. II Сеясь иегуцу паргш«тр©н логлпгзацяя ДСП-12 (Я) я зелгигииой х* хгра вариация иомента качала вогв^пдаамцего тшугаса СИ (я). Рис.12 Завксиыос?* удслшой штсщада (S»), срЕОЕОДащепся на одну ноле— гулу фосфоляпэда я лшгосоггалг. о? толщянм (Нэ) гклрофобзой часта бн-слоя по даишш перекоса энергия з доух доворна-агцепторных парах. 2л

0.32 0.5 0.6 „

С„ nRo/C^ (нм*) X ни

Рис. 13 Тутланшо стешпэнарпои флуорасяапцп» К—68 »г.цептором ДСП-12 в лшхосомах (1) а ЛЧ (2).

Рис.14 Спектры возбуждения ДСП—12 з отсутствие (1) и в присутствия (2) донора K-8Q в липосоыаз (а) а этаяольном растворе (2). Рис.15 Область предпочтительные значений параметров локализации антрацена (заштржговаяз).

Несколько другой подход был использовав при исследовании л лизаади флуоресцентного аналога холестерина В-Х1Е, его метила (Ц-ХТЕ) и стеароилового (Ст-ХТЕ) эфиров и других зондов в ЛЧ это« случае анализ проводили путем совместного рассмотрения пер са энергии в нескольких донорно-акцепторных парах (доноры: В-Ы-ХТЕ, Ст-ХТЕ, антрацен; акцепторы: ДСП-12, ЛЩ) при стациона возбуждении( рис.16). Рассмотрение было проведено в рамках мод

Ьц

о

ь I

,0.6

0.2

0.0 1.0

0.8

о

и,

0.4 0.2 0.0

:16а . ХВ-ХТЕ

- / ы- ХТЕ ан-Е^

- / ..аг^а; ^Ст-ХТЕ

| 1 | ■ ;16б 1 ■ I ' В-ХТЕ.Х • /4>Л

X

/ У 'антрацен

1—I—!—|—.—I—|—I—г

О 2 4 6 8 10

Рис.17 Модель локализации зондов в ЛЧ.

триеновых зондов и антрацена ! акцепторами ДСП-12 (а) н ДМХ ] (б) в ЛЧ.

Са, мкМ

описываемой следуксгм выражением: .

Ф9

<Р/Р0 ) = 11 у"Хо »^хр <--Ь/Хо >Ср«ехр{-цЕ1 (А^ ,Оа> - ( 1~я> , Оз>) ■

+ СЗ (1~р) / <0э-0э) Н (А ,0>-(1-я)Е (А ,А ,О)30гс1О+

^ г» ^ з э ^ р. 1ч г'

х>

I

л

г

+ 1ехрС-я£ <А ,0)-(1-о)Е (А

** ЭЭ ¡Ь 1 X

**

1а: <о1, х>я, р> н <ад, а2, аз, Ч) - параметры локализации до-зра з акцептора, соответственно (рис.17); е^ и ёэ - представлены таблице 2. Видно, что рассмотренная модель допускает наличие двух ;н локализации как для донора, так и для акцептора. Пргчэн, одна 1 зон представляет собой сфрзческую поверхность радиуса <пз>, ¡лячина которого нз варьировалась, а назначалась из физических со-!раяени2 (табл.5). Лолв ыолекул донора (р) илн акцептора (ч), при-икеаапях этой поверхности, варьировали для холестериновых зондов ЖЕ, а в остальных случаях полагали равной нулю жди единице.

Таблица 5 Параметры локализации зоаяов в ЛЧ

р са.' «г3 а » ч

В-ХТЕ в 0,9 им* 3 - - -

Ч-ХТЕ в ем в - - -

Ст-ХГЕ в г^-0,9 нн* в - - -

К-63 - нм 1 - - -

нтрацеа в - 0 в - 0

ЛСП-12 - - - - «^-0,3 ТЫ*" x

як - - - б *ч в

- ознзчает, что параметр (параметры) варьировали; а^- радиус ЛЧ;

- в соответствии с гипотезой существования водородной сеязи меягду -сн-груштоЗ холестерина я протон-акцепторными грушами фасфата-тхолина иди прилегашши молекулами водн: ►« - в соответствия с >удьтатами, полученными на дипосомах.

Такой-подход позволил выделить круг одноталннх решении обрат-[ задача относительно параметров локализации грсмофоров использу-и зондоз. Правильность полученных таким образом решений подтвер-:ась эксперЕментальнши данными и последукшм анализом кинетики ухания флуоресценция антрацена при переносе энергии на акцепторы -12 и

Количественная оценка параметров локализации триеяовых зондов Ж в ЛЧ позволила получать целый ряд интересных в биологическом

отаоиении результатов:

- сравнительное исследование локализации идентичных по прс ранственной структуре молекул В-ХТЕ и К-ХТЕ, отличающихся, сооп ственно, наличием и отсутствием протон-донорных свойств, показг что в пределах фосфатшилходинового монослоя на расстоянии от верхности частицы, не превьшащем i бы, располагается 60-70« мс кул В-ХТЕ и лишь не более 231 молекул М-ХТЕ: остальная часть «с кул этих зондов проникает в триолеиновое ядро липидных частиц;

- столь существенные различия в локализации этих двух флуо] центных зондов могут быть обусловлены только участием гидроксзш группы В-ХТЕ во взаимодействии с фосфатидилхслиноы или его гщц ной оболочкой, возмогно, за счет образования водородной связи;

- в трнолеиновоы ядре лишдшх частиц зонды В-ХТЕ, М-ХТЕ. трацен и ДМХ распределены неравномерно и сосредоточены преимуще венно в периферийной его части (рис.18), что, очевидно, отраа

неоднородность струю; триодеинового ядра;

- неоднородность ст] туш триолеинового ядра, видимому, является следом ем "организующего" влш фосфатидидхолиноБого ыс слоя на примыкаодух к I зону триолеина, в резуль5 чего эта зсна приобре1: лодобаух фосфагадглхаганс му монослою слоистую СТ] туру, которая по мере удг ния с? поверхности час постепенно нарушается;

Рис Л 8 Один из наиболее вероятных вари- - взаимодействие В-антов локализации триенових зондов и с фосфатидилхолином, оргг ДЫХ в ЛЧ, допускающий существование „

псевдобислоя из ФХ и ТО на периферии званным в конослой, ос3 ЛЧ. ствляется по крайней мер«

счет двух факторов: I) за счет протон-донорных свойств гидрока ной группы; 2) за счет гидрофобного взаимодействия системы цш гексановых колец и разветвленной цепи в 17 полокении (рис.1) с 1

кокнслотянка остатками фосфсшшзда,- по-шдаахжу, второй тип взая-кодействяя определяет и ковишэнное сродство М-2ТВ и самого В-ХТЕ к периферийной зоне триодеинового ядра;

- несмотря на свой высокий дидальшй момент. молекулы ДЫХ проникают в траолзиновое ядро лшшдшх частиц; это ' позволяет думать, что п ядрэ, преикуазотвеяно в п&рвферайноЯ его чзстя. существуют условия для компенсация этого дйлольеого момента;

- 89-100:5 ыодекул Ст-ГГЕ (аналога природного эфира холестерина) располагается в трполееновси ядре 14, причем, Еполне возможно равномерное распределение этого зонда по ядру: это хороао согласуется с представлениями о локализации эфзров холестерина в липопро-геинах.

?с!Г21 образом,.проделанная на «одельных лишщшх объектах работа явилась практически доказательством возмозеости применения рассматриваемого подходз с использование« безызлучательного переноса энергии к изучения геометрия и структура лшшдных объектов. С пругсй стороны, стало ясно, что данЕЫЗ подход без существенных изменения коте? бнтъ перенесен и на некоторые уже чисто биологические эбъекта, где сферическая сшкетряя, необходимая для проведения анализа в рамсах разработанной теории нарушена минимально. Одним из гаких объектов является лшопротеиш очень низкой плотности (ЛОНП).

Исследований геомзтрнчзсгих размеров ЛОНП и локализации в этих частицах флуоресцентных зсздоз бал посвяген заключительный этап на-зтоякей работы. В результате показано следужее:

- удельная площадь поверхности ЛОНП, приходящаяся на одну молекулу фосфатвдалхолина, составляет 1.13±0,04 ; это указывает на гчъс-ть з. армировании структуры поверхностного слоя этих частиц-гогшмо фосфатшшлхолина еще я других молекул, например бежа и холестерина ;

- знание плоаади поверхности ЛОНП позволило получить существенно более строгую сценку для среднего радиуса ЛОНП (16,3^0*4 еы) ю сраЕнеЕив с известшаи яз литературы значениями этой величины, юлученныш с пошлые безнзлучательнсго переноса энергии в других юнорно-акцепторзнх парах: это значительно улучшило соответствие с ханными лнтературл, полученными методами спектроскопии оптического жпения и скоростной флотации;

- флуоресцентные зонда антрацен и ДМХ локализуется в основном

в тдрофсОаол ядре этих ладапротенЕов. пргчеа, пренг^уаественно пергферяйвоа его частя г подобна расталогвнш» этих га зондов в а еедных частицах-, шлелнрувдх хгпопротеяну; это свидетельствует подобан структур! ЯОНП к ЛЧ:

- подученная яЕфориашш о хок&шзацнз зондов в ЛОШ позвали значительно умзньееть тсоэтаетстейз сзаау снЗъеша дишцщой фа сусгвазш (а значит и кэЕцзятрдгш ШШ), Езькреиньш с поОозь» п реноса аьзрпл в паре п-терфашгл — > антрацен е определайшщ с п шзы> зкстракцЕй и взвгцЕвавпя.

МЕОЛЫ

1. В ре^гшх тгсрш Сэрстерогсааго безазяучатедъвого парено энерпш про2звз£2но раоа^пропиз есвого класса гео^трнческнх шд лей, охваадвашах все случ&з срад аз с&ерачесгааи граншшн проя вавьного радвуса. Это сделало воз^аснш точное теоретическое ра а-готреагз прл^зх задач ео расчету £Ф^йбтпееости переноса энергпн частицах сферзческоЗ фор-*а в загиса^осгЕ от параметров локалвзац хроцофэров щи их сферйгчэске агзйтрпчноа распределении в предел каздой часташ. Еэеазааа уйетг. что влнянез крзвизнн повершэстп . переЕоо-энергса в_прзде.аа фсфегадажсшшозого бислоя пренебреск мало" в области рзахьшх раасэров дшосса.

2. Получены величины параметров, хараЕгеризухпзх спектрадьЕ к флуоресдаатныз свойства всзюльзуеиах (¿злекулярных зондов. Это а

" зволкло определить велячинн критического радгяуса переноса энергии пряа»шггь результата т-еорш в регзЕЕИ пряшх г. обратных задач д конкретных доЕорно-шсцешорнш: пар и лппаганх объектов.

3. Для ресення обрати загшч по определенна расположения хр шфоров из данных переноса энергия впервые была использована кив тика затухания флуоресценция донора в присутствии акцепторов. Пок. зато, что из хкЕетаческнх дяяшг мозжа извлечь дояоднительнув и форыацюз о локалжзашш флуоресцентных зондов в лшхосомах.

4. Бпервие с кспользованЕШ кинетически даяннх о серено энергии произведена количественная оценка расстояния от централь» плоскости бкслоя лшшсш до скуласта локализации зондов 4-{п-да» тзшмвостнрнл)-м-додеш1тирадшз^ (ЛСП-12) а 4- .икетвлаыннохалю

üffiX); оно равно i.sio.i и í.'/ío.i ш, соответственно. Неожидан-бшю обнаружено, что гидрофобные молекулы зонда антрацена в ли-шом бислое локализуются преимущественно около поверхности ыемб-ы в слабополярной области глицериновых остатков и карбонилов фатитилхоляна. Кроне'того, на основании данных о локализации 'оресцентных зондов получена оценка площади поверхности бислоя юсом, приходящейся на одну молекулу фосфолапнда - о,¿5-0,02 нм*.

5. Новое фяуоресцзнтное вещество 4-(5~(фзнилоксазолил-2)-1-[тадеш5л)пнридшЕха (К-68) вперше использовано в качестве донора ¡ргин электронного возбущепяя. Получэнн экспериментальные дока-•ельства существования безызлучателького переноса энергии с этого :ора на акцептор ДСП-12 в липшшых объектах. Использование этой юрно-акцепторноЗ пары позволяло оценить величины площади поверх-:ти на одну молекулу фосфолшида липосом, липидных частиц, моде-lyraax лшюпротепны (ЛЧ), ж лшгопротезнов очень низкой плотности Ш): о,6а^о,о2; o,57¿o,ois п 1,13^,03 ш/, соответственно. На шашга этя! данных произведена оценка среднего радиуса ЛОНП:

3^0,4 ЕМ.

6. Для количественно® оценки параметров локализации флуоресш-аих органических молекул в биологических объектах впервые ис-ьзован подход, оснований на совместном рассмотрении результатов енсса энергии в шести донорно-акцепторных парах. В результате азано, что использование этого подхода может многократно умень-ь неоднозначность решения обратных задач по отысканию параметров зллзащш из экспериментальных данных переноса энергии.

7. Впервые проведено сравнительное исследование локализации оресцентного аналога холестерина В-хо.,естатриена и его метилово-и стеароилового эфиров в ЛЧ. 3 результате установлено, что гидр-ильная группа В-холестатриена принимает участие во взаимодейст-

с фосфатндилхолнном или его гидратной оболочкой. Благодаря это-не менее 50-70$ молекул этого зонда локализуются около поверх-ти ЛЧ. В случае ж метилового эфира поверхностную локализацию ет иметь нэ более 23% молекул, а в случае стеаринового эфира -ее ИХ. Оставшаяся часть молекул располагается в пределах три-инового ядра ЛЧ.

8. В результате исследования локализации триеновых зондов трацена и ДМХ установлено неравноерное распределение этих а по ЛЧ и. в частности, по триалеиновскну ядру. На основании сделан вывод о неоднородности структуры триолеинового ядра ЛЧ ляшейся, по-видимому, следствием "органнзувдего" влияния фоо дилхолшового ыонослоя на прилегающую к нему зону триолеяна.

Э. Показана однотипность расположения флуоресцентных а Ш и антрацена в ЛЧ и в ЛОНП, что свидетельствует о схо; структур этих частиц и указывает на правомерность использован) в качестве кодели ЛОНП.

СПИСОК РАБОТ, ОКУЕЛЙКОВДНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Добрецов Т.Е., Курек Н.К.. Ыахов В.Н., Сырейдаова Т.И., манко М.Н. Использование сшхротронного излучения для изу1 времени затухания флуоресценции зонда в фосфолипшщых мембран! присутствии акцептора энергии.- В кн.: Труды vi Всесоюзного i щаяия по использованию ашхротронного излучения -Сй-84, Ноз бирск, 1984, с.302-303.

2. Курек Н.К., Добрецов Г.Е., Ыахота Ю.В.. Зволинский В.П. Bpí затухания флуоресценции зондов, используемых в исследовании 6i гических мембран.- Журнал прикладной спектроскопии, 1985, т.43, (с.579-584.

3. Курек Н.К. Анализ неэкспоненциального затухания фяуоресц« зондов, используемых для изучения биологических мембран, по дг фазово-модуляцаонной флуорсметрш: Тез.докл. на Всесоюзном coi нии "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппарг ное обеспечение", Рига,РЫИ,1985, с.87-88.

4. Добрецов Г.Е., Курек К.К., Махов В.Н., Сырейщшова Т.И., Яга ко М.Н. Ферстеровский перенос энергии мекду флуоресцентными зог в моделях биологических мембран. - Москва, 1987, 5€ с. (прег Физического института им. П.Н. Лебедева J6II).

5. Курек Н.К., Добрецов Г.Е. Анализ синглет-синглетного пере энергии в мембранах, v. Перенос энергии в частицах сферической мы.- Москва, 1988, 31 с. Рукопись депонирована в ВИНИТИ 01 аг

88 Г., J2499-B83. Реферат: я. Биофизика, т. 33, JM. с. 731-732.

Курек Н.К., Дашин Е.Н., йск&е Д.В., Ыиссюль Б.В. Исследование кализашга флуоресцентных аналогов холестерина и его эфнроа в ладных моделях мембран и дшгоггротекнов. - Украинский биохимический ряал, 1988, Т.60, JS4. С.67-74.,

Белевнч Г.В., Дубур Г.Я.. Добрецов Г.Е., Курек Н.К., Спирин Н.М. .язываняе антагонистов с*** ряодишша, нкфедапина а верапакила с дельными я биологическими мембранами: флуоресцентный анализ. -»логические мембраны, 1988, т.5, #7, с.768-776.

Лапазш Е.Н., Курек Я.К. йяуорэсщгрутаие производные холестерина исследования мембран а дзшоцротеинов. - Украинский биохимический ■риал, 1989, т.61. Ш. с.98-112.

. Курек Н.К.» Лашин Е.Н.. ДобрецоЕ Г.Е.. Тур Й.Н;, Афанасяади .0. 4-с5-(®5Ншюксазолил-2)-Г-пеЕтадешшпириданиа - фдуоресцент-а зонд для определения плодадп поЕзрхностя мембран и липопротеи-щ. - Биологические иеибраны, ГЭв9, т.6, JS7. с.725-732.

). Курек Н.К., Лахпаз Е.Н., Иоффе Д.В.. Ыиссзоль Б.В., Сырейдшковз Л*... Якгмекно М.Н. Безызлучательный перенос энергии для опредеде-и локализации Флуоресцаруших аналогов холестерина з моделях ла-зпротеинов: Тезисы докл. на Всесоюзном совецании по молекулярной аминесиенют. Караганда» КГУ, IS89, с.53.

[. Ktirek U.K., Lap^hin E.N. , Syrejshchifcova Т. I. , YdLkiaenka M.N. «г use of synchrotron radiation to mvestigatra th« Xocalnation of luarescent prctv^«; in iKjd^l lipoproteins.— ttuclear Instruments and »thods in Physical Research, v.fi2S2, p. 4<50-4TZ.

2. Dcbrft 5Dv Q.E. , Kursk N.K, , Machov V.N., Syrajshchikova T.I., akuM^nko M.M- Oe?t£?rnii nat i crv of fluorescent prober localization in wijranes by n^adlvativp ciifgy transfer. - J. Siochem. Siophys. sthcds, 19S9, V.!9, p.259-274.

3. Гуляко А.А., Курек H.K., Спирин М.У., Сгмонов A.H., Харатонен-эв А.Н. Исследование пространственных взаимоотношений медду гемаг-татинином вируса гриппа а липидной фазой в мембрана липосом. -зпросы вярусологки, 1989, т.34, й2, С.145-149.

4. Добрецов Г.Е., Лаяния Е.Н., Курек U.K., Косникоз В.В.. Айдыра-

лиев Р.К. Теоретические и аксперкантаяьныд основы яра^ененЕЯ флу< ресцентных зондов в диагностике. - В с<3. Бжфгззаческие Методы Дна: ностики. Москва, 1990. с.64-93.

15. Курек Н.К.. СыреСгякова Т.П., Ягаагэшю JLH. Спехтражш кинетические исследования биологических объектов в пучках синхр тронного излучения ускорителя С-60 SilAH. - Тезисы до1иада на Все с. юном совеааяии со использований сннхротрснного Езлучешк СИ-9 ЙОВОСНбИрСЕ, 1990.

16. Lapshln Е.М. , ttatorsrteov G.£. t fcjr&aovi tsiiy 3.1-3., Rukhtin А.Ы SVripkiпл V.T. , Кш-iflc N.K. Dasteroination of LoM-Don-sity end У»г Low-Density Lipoprotein«. - ln> fipplicition of FluorsK&csrvt Protw In Kardical Di aqnosii, p«rt 2j ft Fluorescent As&ay »cr Athisrogan Lipoproteins, 1991, р.ЗЗ-JOS.

Заказ 301. Тираж 100. Объем 1,5 и.л. Опгечатано в типографии НИИ