Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа

Тарасов, Илья Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа
ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа"

Тарасов Илья Евгеньевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИВЕРМЕКТИНОВ В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ИМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА.

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно - санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-2 ДЕК 2010

Москва - 2010

004615712

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ Всероссийского научно - исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор Непоклонов Анатолий

Александрович (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Светличкин Вячеслав

Владимирович (ГНУ ВНИИВСГЭ)

кандидат биологических наук Русаков Сергей

Вячеславович (ФГУ ВГНКИ)

Ведущая организация: ФГУ Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных - Всероссийский научно -исследовательский ветеринарный институт (ФЦТРБ-ВНИВИ).

Защита диссертации состоится «/4» декабря 2010года в часов на заседании диссертационного совета Д 008.006.01 при ГНУ «Всероссийском научно - исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно - исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии РАСХН.

Автореферат разослан « // » ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, л

кандидат биологических наук Юдина А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Соединения авермектинового ряда активно используются в животноводстве и агрономии благодаря высокой акарицидной, инсектицидной и нематоцидной активности (Miller T.W. et. al., 1979; Campbell W.C., et. al.,1984; Campbell W.C. 1989). Среди них наибольшее распространение получило действующее начало - ивермектин. Существует большая вероятность попадания ивермектина и его метаболитов в организм человека через продукты животного происхождения, что может привести к серьезным последствиям: дисбактериозам и аллергическим реакциям. Авермектины включены в перечень веществ, подлежащих контролю в соответствии с приказом Минсельхоза РФ о внедрении плана государственного ветеринарного лабораторного мониторинга ветеринарных препаратов № 780 от 30 мая 2003 года. Вышесказанное определяет необходимость контроля остаточных количеств данного вещества в сырье и продуктах животного происхождения.

В настоящее время, для определения остаточных количеств ивермектина в биологическом материале используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором и его различные модификации (Danaher М. et. al., 2006; Alvinerie М. et. al., 1987).

Благодаря высокой точности измерения, селективности и простоте обработки полученных данных, метод ВЭЖХ стал во многих странах «золотым стандартом» определения ивермектина. Однако метод имеет ряд недостатков, основными из которых являются высокая стоимость оборудование, сложная и многостадийная подготовка проб для анализа и его низкая скорость проведения. Не лишены недостатков и другие физико-химические и биологические методы определения ивермектина (Campbell W.C. et. al., 1989).

В качестве альтернативы ВЭЖХ за рубежом используется иммуноферментный метод (ИФА) определения ивермектина в продуктах животного происхождения на основе поликлональных антител, преимуществами которого являются высокая специфичность, скорость и простота постановки реакции. Однако некоторые авторы указывают, что использование моноклональных антител (МкА) позволяет увеличить специфичность и чувствительность анализа (Schmidt DJ. et. al.,1990; Shiwen, X. et. al., 2009). Эти данные были взяты за основу при разработке иммуноферментного метода.

Большинство работ, посвященных изучению динамики выделения ивермектинсодержащих препаратов с молоком и распределению их в органах и тканях животных, охватывают короткий период наблюдений - от 7 до 28 дней (Alan L., et. al., 2007; Alvinerie M., et. al., 1987). Но в литературе также есть данные о том, что остаточные количества ивермектина обнаруживаются у животных в течение двух месяцев после проведения обработки ивермектинсодержащими препаратами (Alvinerie М., et. al.,1994; Lifschitz А., et. al., 1999; Toutain P.L., et al., 1987). Исходя из этого, становится актуальным более детальное и продолжительное изучение периода выделения ивермектина с молоком, а также его распределения в органах и тканях животных, после применения наиболее распространенных ивермектинсодержащих препаратов. Цель работы.

Целью данной работы являлась разработка иммуноферментного метода выявления ивермектина и его определение в продуктах животного происхождения.

Основные задачи исследований.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить конъюгат ивермектина с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

2. Получить моноклональные антитела к ивермектину и изучить их иммунохимические свойства.

3. Разработать конкурентный иммуноферментный метод для определения остаточных количеств ивермектинов.

4. Оптимизировать методику подготовки продуктов животного происхождения для количественного определения ивермектина методом иммуноферментного анализа.

5. С помощью разработанного метода, изучить динамику выделения лекарственных средств с молоком и их распределение в органах и тканях крупного рогатого скота.

Научная новизна работы.

Получены моноклональные антитела специфически

взаимодействующие с ивермектином.

На основе полученных моноклональных антител разработан конкурентный иммуноферментный метод определения остаточных количеств ивермектина в продуктах животного происхождения (молоко, мясо, печень, жир).

Разработана методика подготовки проб для ИФА на основе экстрагирования и концентрации ивермектина с помощью органических растворителей.

Методом ИФА изучена динамика выделения ивермектина с молоком после • применения противопаразитарных препаратов (гиподектин-Н, дермацин, новомек).

С помощью разработанного метода изучено распределение ивермектина в органах и тканях животных после применения препаратов (новомек, гиподектин-Н).

Практическая ценность работы.

Разработаны методические рекомендации по определению остаточных количеств ивермектина в молоке, органах и тканях крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Протокол №3, 8 июня 2010г.). Утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 17 сентября 2010г.

Установлены сроки выведения ивермектина из организма животного с молоком и его распределение в органах и тканях после применения ивермектинсодержащих препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты работы по получению МкА к ивермектину;

• результаты разработки ИФА и предварительной подготовки проб для проведения анализа;

• результаты изучения выделения ивермектина с молоком и его распределения в органах и тканях.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2009, 2010 гг.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 122 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов

исследования, собственных результатов исследования, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 12 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 123 отечественных и зарубежных источника.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2007-2010 гг. в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН (г. Москва).

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю -Заслуженному деятелю науки РФ, доктору ветеринарных наук, профессору

A.A. Непоклонову за научное руководство, помощь в написании и оформлении печатных работ. А также доктору биологических наук, профессору О.А.Верховскому и кандидату биологических наук

B.В.Цибезову (AHO «НИИ ДПБ») за предоставление возможности для выполнения данной работы, за методическую и консультативную помощь в работе.

Автор выражает благодарности за методическую и консультативную помощь в работе: д.б.н., профессору Т.С. Новик, к.б.н. C.B. Овчук, к.б.н. Г.Т. Брюшининой, к.б.н. Л.В. Костиной, к.б.н. А.Ю. Козлову, к.б.н. C.B. Русакову, А.Н. Мигдалеву, A.A. Терентьеву, В.Н. Минькову, Л.М. Маханьку, М.А. Летову.

Получение конъюгата ивермектина с бычьим сывороточным альбумином.

Конъюгат был получен совместно с сотрудниками AHO «НИИ ДПБ» и любезно предоставлен для дальнейшей работы. Синтез конъюгата ивермектина с БСА (ивермектин-БСА) проведен по описанной методике

Crooks S.R.H. et al. (1998) и Schmidt D.J. et al. (1991) и проходил в три этапа. На первом этапе было произведено ацилирование ивермектина ангидридом янтарной кислоты, в результате получен продукт 5-0-сукциноиливермектин. На втором этапе под действием jV-гидроксисукцинимида (4) и N,N'-дициклогексилкарбодиимида из 5-0-сукциноиливермектина был получен активированный продукт, который использовали в качестве гаптена. Третьим этапом было получение конъюгата ивермектина - БСА, реакция протекала под действием гидрокарбоната натрия и диоксана. Полученный продукт использовали для иммунизации мышей и в качестве антигена для ИФА.

Получение моноклональных антител.

Для получения МкА специфичных к антигенным детерминантам конъюгата ивермектин - БСА двум мышам линии BALB/c внутрибрюшинно вводили антиген ивермектин-БСА 5 кратно с интервалом 2 недели, чтобы индуцировать максимальный иммунный ответ. Начиная со второй иммунизации сыворотки мышей тестировали методом непрямого ИФА на наличие специфических антител. Гибридизацию проводили по методу Kohler G., Milstain С., (1979). Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0. В качестве ростовой среды для культивирования миеломных и гибридомных клеток использовали среду RPMI-1640 (Sigma, США), содержащую 20% фетальной сыворотки теленка.

Иммунохимические свойства полученных МкА определяли методами непрямого, конкурентного иммуноферментного анализа и с помощью набора «Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit» («Sigma», США).

Синтез конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена

проводили по методу P.K.Nakane and A.Kawaoi (1974).

Чувствительность метода.

Чувствительность метода определяли как минимальное значение концентрации ивермектина, содержащееся в пробе, в сравнении с пробой, не содержащей ивермектин.

Специфичность метода.

Специфичность метода определяли, анализируя стандартные растворы различных концентраций близкородственных ивермектину соединений. Процент перекрестного взаимодействия определяли по формуле: % = (К1ШГ2/КИНГ1) X 100%,

где, Кинг2 - коэффициент ингибирования перекрестнореагирующего вещества, взятый в точке, находящейся на линейном участке графика (например, содержащей 50нг вещества); КШ1Г1 - коэффициент ингибирования определяемого вещества, взятый в той же точке и на том же участке графика, содержащей такое же количества вещества.

Воспроизводимость метода.

В течение трех дней были проведены измерения коэффициентов ингибирования стандартных калибровочных растворов с концентрацией ивермектина 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 нг/мл в десяти повторах. Определены статистические показатели разброса результатов - среднеквадратичное отклонение Б и относительный показатель разброса результатов -коэффициент вариации V.

Определение ивермектина в биоматериале конкурентным иммуноферментным методом.

Постановка конкурентного ИФА проходила следующим образом: коиъюгат ивермектин-БСА сорбировали в лунках микропланшета в 0,1М КББ (карбонатно-бикорбонатном буфере, рН=9,5) в течение ночи при 4"С. После четырехкратной отмывки планшета в лунки вносили калибровочные

пробы свободного ивермектина (или его аналоги абамектин, авермектин) в серийных разведениях (от 1 нг/мл до 100 нг/мл в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl, 0,1% Твина 20, рН=7,4 (ФСБТ)) и экстракты исследуемых проб биоматериала (по 50 мкл в лунку). Затем во все лунки вносили по 50 мкл пероксидазного конъюгата МкА в рабочем разведении (1/8000) на ФСБТ, содержащим 0,5% БСА и инкубировали 1 час при 37°С. Несвязавшиеся реагенты отмывали ФСБТ. Вносили по 0,1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином (МДЛ, Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0,1 мл 1 М H2SO4 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan EX (Thermo, США). После проявления и остановки реакции проводили вычисление коэффициента ингибирования связывания МкА с иммобилизованным конъюгатом ивермектин-БСА свободным ивермектином (Квнг) по формуле:

Кинг = 100 - (А450ОП /А45о К") х 100%,

где: А450ОП - оптическая плотность пробы, содержащей свободный ивермектин.

А450 К" - оптическая плотность пробы без свободного ивермектина.

Экстрагирование ивермектина из проб молока, мышц, печени и жира.

Процедура экстракции ивермектина из пробы молока.

Пробы исследуемого материала объемом 1,0±0,1мл вносили в пробирки

емкостью не менее 10 мл. Добавляли 3 мл смеси ацетон:вода (1:1) в каждую

пробирку с материалом, перемешивали 5 мин. Далее экстрагировали

ивермектин изооктаном: добавляли 3 мл изооктана и перемешивали, затем

центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в

чистую пробирку, повторяли процедуру экстрагирования ивермектина

изооктаном. Полученные экстракты объединяли и упаривали досуха при 60°С

под током воздуха. К остатку добавляли Змл ацетонитрила и перемешивали 2

мин. Затем к ацетонитрилу добавляли гексан, перемешивали и

центрифугировали при 3000 об/мин. Удаляли верхний гексановый слой. Оставшийся слой ацетонитрила упаривали досуха при 60°С в потоке воздуха. После охлаждения до комнатной температуры остаток растворяли в 500 мкл этанола, перемешивали и упаривали при 60°С в токе воздуха. Затем осадок растворяли в 50 мкл этанола, добавляли 450 мкл раствора фосфатно-солевого буфера для разведения проб и использовали по 50 мкл полученного раствора для ИФА.

Процедура экстракции ивермектина из проб ткани и органов (мясо, жир, печень).

Из образцов мышечной ткани, печени, жира готовили навеску 1,0±0,1г. Пробу измельчали с помощью ножниц, вносили в пробирку объемом не менее 10 мл, заливали 5мл этилацетата, интенсивно перемешивали ] час на шейкере, затем центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут. Надосадочную жидкость сливали в чистую пробирку. Повторяли процедуру экстракции с этилацетатом. Надосадочную жидкость после первого и второго экстрагирования объединяли, а полученный раствор упаривали при 60°С в потоке воздуха. Далее следовали этапы, описанные в процедуре экстракции ивермектина из пробы молока.

Определение ивермектина в биоматериале методом ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора.

При проведении сравнительных исследований по оценке эффективности определения остаточных количеств ивермектинов в продуктах животного происхождения использовали метод ВЭЖХ.

Определение ивермектина осуществляли по методическим рекомендациям МУК4.1.1821-03 «Определение остаточных количеств ивермектина в печени, почках, мясе, жире сельскохозяйственных животных и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии».

Препараты, использованные для обработки животных.

Новомек 1% (ООО «Ветбиохим», Россия) - серия №9 со сроком годности до 2011года и с содержанием ивермектина 1,18%. Гиподектин -Н (ООО «Ветбиохим», Россия) 0,1мг ивермектина в 1мл раствора- серия 7 со сроком годности до 2011года и содержанием ивермектина 0,013%. Дермацин (ООО «Ветбиохим», Россия) 0,1мг ивермектина в 1мл раствора- серия 6 со сроком годности до 2011 года и содержанием ивермектина 0,012%.

Изучение выделения ивермектина с молоком и его распределения в органах и тканях сельскохозяйственных животных.

Опыты проводили в хозяйствах Смоленской и Московской областей. Группу из 12 коров черно-пестрой породы массой от 400 до 500 кг 3-5 летнего возраста обрабатывали указанными препаратами в соответствии с инструкцией по применению препаратов против возбудителей паразитарных заболеваний. Согласно условиям опыта в течение 86 суток до его постановки и в период эксперимента животные не получали антибиотиков, противопаразитарных и гормональных лекарственных средств. Коровы во время опыта находились в коровнике на привязном содержании, кормление осуществляли по зоотехническим нормам. Каждое животное имело индивидуальную ушную бирку и по данным зоотехнической службы находилось в середине лактационного периода.

Трем животным применяли подкожно новомек в дозе 200мкг/кг (1

мл на 50 кг). Препарат вводили крупному рогатому скоту под кожу в

область предплечья или позади плечевого сустава из шприца с короткой

иглой с соблюдением правил асептики. Трем животным вводили

внутрикожно новомек в дозе 8 мкг/кг (0,4мл на животное). Новомек

вводили с помощью безыгольного механического инъектора БИ-7М в

область шеи два раза по 0,2 мл. Три коровы обрабатывали гиподектином -

Н - наносили на спину тонкой струйкой вдоль позвоночника из

дозирующего устройства в дозе 3 мкг/кг (15 мл на животное). Дермацин вводили однократно подкожно в область нижней трети шеи в дозе 3 мл (0,6 мкг/кг) и 3 коровы не обрабатывали. Пробы молока отбирали до обработки животных препаратами и на 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 сутки после обработки.

Для изучения распределения ивермектина в органах и тканях крупного рогатого скота отбирали пробы биоматериала от животных, обработанных препаратами гиподектин-Н и новомек.

Опыты проводили в хозяйствах Смоленской области. Группу из 24 животных черно-пестрой породы массой от 400 до 500 кг 3-5 летнего возраста обрабатывали указанными препаратами в соответствии с инструкциями по применению препаратов против возбудителей паразитарных заболеваний. Согласно условиям опыта в течение 86 суток до его постановки и в период эксперимента животные не получали антибиотиков, противопаразитарных и гормональных лекарственных средств. Коровы во время опыта находились в коровнике на привязном содержании, кормление осуществлялось по зоотехническим нормам.

Двенадцати животным вводили новомек в дозе 200мкг/кг (1 мл на 50 кг) и такое же количество животных обрабатывали гиподектином - Н. В качестве контрольной группы служили не обработанные животные. Пробы мышечной ткани, подкожного жира, печени отбирали у животных после убоя на 3, 7, 10, 14, 21 и 28 сутки после обработки препаратами.

Обработка полученных результатов.

Обработку хроматограмм и количественное определение ивермектина проводили с помощью программы «МультиХром». Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера. Вероятность различий считали существенной при Р<0,05.

2.РЕЗУЛБТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1.Получение моноклональных антител к ивермектину.

После проведения гибридизации было получено 670 гибридных клеточных линий устойчивых к селективной среде ГАТ. Первичный скрининг гибридом проводили методом непрямого ИФА с использованием конъюгата ивермектин-БСА и чистого БСА в качестве антигенов. При первичном тестировании культурапьных жидкостей было отобрано 11 клонов, реагировавших с конъюгатом ивермектин-БСА и не реагировавших с БСА. После проведения двукратного клонирования гибридом методом предельных разведений с целью стабилизации хромосомного аппарата одна гибридома оказалась нестабильна по продуктивности МкА. Таким образом, было отобрано 10 гибридом, продуцирующих антитела к конъюгату ивермектин - БСА, но не к БСА.

Чтобы установить, какие из полученных гибридом продуцировали МкА только к ивермектину, но не к ивермектину - БСА применили конкурентный вариант ИФА, поскольку непрямой ИФА для этого невозможен, т.к. чистый ивермектин не сорбируется на поверхность планшета. Для этого анализировали способность неконъюгированного (свободного) ивермектина ингибировать связывание МкА с конъюгатом ивермектин-БСА, иммобилизованным на планшете. Рабочие разведения МкА в культуральной жидкости определяли с помощью непрямого ИФА.

Методом конкурентного ИФА была проверена способность МкА связываться со свободным ивермектином, содержащимся в пробах в концентрациях от 0,031 до 2 мкг/мл (рис. 1).

0,00 0,50 1,00 1.50 2.00

Концентрация ивермектнз, мкг/нл

Рис. 1. Определение специфичности МкА к свободному ивермектину методом конкурентного ИФА.

Из данных, приведенных на рисунке 1 видно, что МкА двух клонов (4с6 и 7g6) конкурируют с неконъюгированным ивермектином за связывание с конъюгатом ивермектин-БСА, иммобилизованном на планшете. Таким образом, из 10 гибридом, детектирующих конъюгат ивермектин-БСА методом непрямого ИФА, только МкА клонов 4с6 и !%(> специфичны к ивермектину, в то время как МкА остальных 8 клонов узнают, по-видимому, зону «сшивки» между ивермектином и БСА. Для дальнейшей работы были выбраны МкА клона 4с6, обладающие наибольшей активностью в отношении ивермектина в конкурентном ИФА.

Изотипирование МкА клона 4с6 позволило установить их класс и субкласс. Оказалось, что гибридома продуцирует моноклональные антитела

Для получения препаративных количеств МкА клона 4с6 взрослым рожавшим самкам мышей линии ВАЬВ/с, праймированных пристаном, внутрибрюшинно вводили 5-10 млн. гибридомных клеток в 0,6-1 мл среды ЯРМ1-1640. Отбор асцитной жидкости проводили на 10-14 сутки после введения гибридом. От каждой мыши получали 3-6 мл асцита. Асцитные

жидкости хранили при -70°С для использования в дальнейшей работе.

2.3. Использование МКА клона 4с6 в конкурентном ИФА.

На следующем этапе для повышения чувствительности метода, а также для упрощения и сокращения времени при постановке анализа была проведена работа по получению конъюгата моноклонапьных антител с пероксидазой хрена.

На первом этапе МкА клона 4с6 были очищены из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на Белок-А-агарозе. Полученные продукты использовали для ИФА и для синтеза конъюгата с пероксидазой хрена. Конъюгат МкА с пероксидазой хрена был получен периодатным методом.

Иммунохимическая активность пероксидазного конъюгата была определена методом прямого ИФА с использованием в качестве антигена конъюгата ивермектин-БСА. На основании полученных данных было выбрано рабочее разведение пероксидазного конъюгата (1/8000) для использования в системе детекции ивермектина методом конкурентного ИФА (рис. 2).

3,5 3 2,5

0,5 О

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 разведение конъюгата Мат-ПХ

Рис. 2. Определение иммунохимической активности и рабочего разведения МкА, конъюгированных с пероксидазой хрена, методом прямого ИФА с конъюгатом ивермектин-БСА.

Далее была приготовлена серия проб на основе ФСБТ с концентрацией ивермектина 200, 100, 50, 25, 10, 5, 1 нг/мл. Они были проанализированы

методом конкурентного ИФА с использованием конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена (Рис. 3).

Рис. 3. Калибровочная кривая определения ивермектина методом конкурентного ИФА.

Из данных, приведенных на рисунке 3 видно, что полученная кривая имеет линейный характер в диапазоне концентраций ивермектина от 1 до 100 нг/мл. Т.е. чувствительность метода составила 1 нг/мл, при этом коэффициент ингибирования составляет не менее 5.

2.3.1. Чувствительность метода.

При исследовании проб с известным содержанием ивермектина, определенным методом ВЭЖХ было установлено, что коэффициент ингибирования (Кинг) не превышал 5% в пробах, не содержащих ивермектин. В пробах, содержащих ивермектин в концентрации 1 нг/мл и более, значение Килг было больше 5% и увеличивалось пропорционально увеличению концентрации ивермектина в пробе. Таким образом, чувствительность метода составила не более 1 нг/мл.

2.3.2.Специфичность метода.

На этапе оценки специфичности (селективности) разрабатываемого метода установлено, что ингибирование связывания антител с иммобилизованным конъюгатом - ивермектин-БСА относительно К„нг ивермектина для других соединений авермектинового ряда (абамектина и авермектина) составляет, соответственно, 45% и 83% (рис.4).

Рис. 4. Калибровочные кривые определения ивермектина, абамектина, авермектина методом конкурентного ИФА.

Таким образом, разработанный метод пригоден для количественного

определения соединений авермектинового ряда.

2.3.3.Воспроизводимость метода

При определении воспроизводимости (сходимости) анализа проверяли калибровочные растворы с концентрацией ивермектина 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 нг/мл.

Таблица 1

Результаты исследования воспроизводимости метода

Концентрация ивермектина нг/мл Среднее арифметическое К ингибирования всех определений Среднеквадратичное Отклонение Коэффициент вариации, %

100 79,5 3,1 3,9

50 66,0 3,9 6,0

20 45,4 4,4 9,8

10 26,3 3,5 13,3

5 19,4 2,7 13,9

1 13,5 2,2 16,3

В таблице 1 показано, что при анализе проб с концентрациями ивермектина 100, 50, 20 нг/мл коэффициент вариации был менее 10%. Это говорит о незначительной изменчивости вариационного ряда, то есть однородности получаемых результатов. Для калибровочных проб с концентрацией ивермектина 10, 5, 1 нг/мл коэффициент вариации находился в интервале 10 - 20%. Это говорит о средней изменчивости измерений. Из вышесказанного следует, что воспроизводимость данного метода соответствует требованиям, предъявляемым к лабораторным методам исследования.

2.4. Оценка эффективности экстракции ивермектина из проб мяса, жира, печени и молока.

Методика подготовки проб мяса, жира, печени и молока для определения ивермектина методом ИФА приведена в разделе материалы и методы. Для оценки эффективности экстракции ивермектина, а также проверки достоверности данных полученных методом ИФА, пробы после предварительной их подготовки проверяли методом ВЭЖХ. Из проб молока, мяса, жира и печени с известным количеством внесенного ивермектина, его экстрагировали и анализировали методами ИФА и ВЭЖХ (Таблица 2).

Таблица 2

Определение концентрации и степени экстракции ивермектина из проб молока, мяса, жира, печени методами ИФА и ВЭЖХ.

Анализируемый материал Концентрация »несенного ивермектина, нг/мл, (п=5) ИФА ВЭЖХ

Концентрация ивермектина, нг/мл Процент экстракции ивермектина Концентрация ивермектина, нг/мл Процент экстракции ивермектина

0 0 0 0 0

молоко 1 0,85±0,08 80 0.88±0,05 88

5 4,8±0,1 83 4.45±0,02 89

10 8,5±0,23 85 9±0,3 90

25 21,75±0,37 87 23±0,9 92

мясо 5 3,7±0,3 74 4,1±0,3 83

10 8,1 ±0,23 81 8,7±0,2 87

нечет. 5 3,9±0,1 78 4±0,2 80

10 8,3±0,5 83 8,4±0,2 84

жир 5 3,55±0,2 71 3,75±0,2 75

10 7,9±0,4 79 7,9±0,3 79

Анализ полученных данных показал положительную корреляцию

результатов по определению остаточных количеств ивермектинов в пробах мяса, печени, жира и молока (г=0,87; Р<0,05).

Чувствительность разработанной иммуноферментной тест-системы сопоставима с чувствительностью ВЭЖХ.

2.5.Изучение динамики выведения препаратов на основе ивермектина из организма животных с молоком.

Для изучения выделения препаратов с молоком были исследованы

пробы, полученные от животных, обработанных ивермектинсодержащими

препаратами. Пробы были исследованы методами ВЭЖХ и ИФА. Пробы

молока отобрали на 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 сутки после

обработки животных препаратами новомек 1%, гиподектин - Н, дермацин. Препараты применяли в соответствии с инструкциями по их применению против гиподерматоза КРС.

Рис. 4. Выделение ивермектина с молоком после обработки новомеком подкожно в дозе 200мкг/кг, внутрикожно в дозе 8мкг/кг, гиподектином Н накожно поливанием в дозе Змкг/кг, дермацином инъекционным в дозе Змкг/кг.

Установлено, что пик выделения препарата новомек при применении дозы 200мкг/кг приходился на 3 сутки, когда в молоке его концентрация составляла 76-80 нг/мл. Концентрация ивермектина на 28 сутки снизилась до 1- 2 нг/мл, на 35 сутки препарат не определялся ни одним из методов исследования.

При внутрикожном введении новомека в дозе 8 мкг/кг, максимальная концентрация ивермектина обнаруживалась на 5 сутки и составляла 6-7нг/мл. Выделение препарата продолжалось 14 суток, когда концентрации составляла 1 -2 нг/мл.

Препараты гиподектин Н и дермацин выделяются в количестве, которое находится за пределами чувствительности методов ВЭЖХ и ИФА.

Полученные результаты согласуются с данными о возможности использования дермацина и гиподектина - Н для обработки лактирующих животных, и ограничивающими использование новомека примененного в

дозе 200мкг/кг для обработки молочного стада (Инструкция по применению Гиподектина-Н, Дермацина, Новомека).

2.6.Изучение распределения ивермектина в органах и тканях животых.

Для исследования распределения ивермектина в органах и тканях животных обрабатывали препаратами новомек и гиподектин-Н. Препараты применяли в тех же дозах, что и в предыдущих исследованиях. После того, как животные были обработаны, на 3, 7, 10, 14, 21 и 28 сутки осуществляли их убой и отбор проб биоматериала (мышечной ткани, печени, жировой ткани). Определение ивермектина в пробах проводилось разработанным методом ИФА и рекомендованным к применению методом ВЭЖХ.

Установлено, что максимальная концентрация ивермектина наблюдалась на 3 сутки после введения подкожно препарата Новомек в дозе 200мкг/кг и составляла 72 нг/г в мышечной ткани, 100 нг/г в печени, 100 нг/г в жировой ткани. Выделение препарата проходило в течение 21 суток. Концентрация препарата в органах и тканях составляла от 1 до 3 нг/г. На 28 сутки остаточные количества ивермектина в исследованных органах и тканях не обнаруживались.

Рис.5. Распределение ивермектина в мясе, печени и жире после подкожного введения новомека в дозе 200 мкг/кг.

При использовании препарата гиподектин - Н в ткани печени обнаруживалось незначительное количество ивермектина на уровне 2 нг/г на третьи сутки исследования. В мышечной и жировой ткани ивермектин не был обнаружен ни одним из методов исследования. На 7, 14, 21 сутки после обработки животных препаратом гиподектин-Н ивермектин не был обнаружен.

Полученные данные согласуются с проведенными ранее исследованиями, разрешающими применять препарат Новомек на мясном скоте и осуществлять убой животных на мясо через 30 дней после последнего применения препарата. Также проведенные исследования свидетельствуют о безопасности продукции животного происхождения после применения препаратов гиподектин-Н и дермацин.

з.выводы

1. Получена гибридомная линия клеток 4С6, продуцирующая моноклонапьные антитела к ивермектину.

2. С использованием моноклональных антител разработан конкурентный иммуноферментный метод, позволяющий определять остаточные количества ивермектина в биологическом материале с чувствительностью до 1 нг/мл/г.

3. Разработана методика подготовки проб биоматериала, позволяющая быстро и эффективно экстрагировать ивермектин. Степень извлечения из проб тканей и органов составляет 75% - 82%, из проб молока 80% -89%.

4. Показана динамика выделения препаратов на основе ивермектина с молоком. Установлено, что препарат новомек, примененный в дозе 200мкг/кг, выделяется на протяжении 28 суток.

5. При внутрикожном введении новомек в дозе 8 мкг/кг выделяется с молоком на протяжении 14 суток.

6. Препараты дермацин и гиподектин Н, примененные в дозах 0,6мкг/кг и Змкг/кг соответственно, не выделяются с молоком.

7. Показано распределение ивермектина в органах и тканях животных после применения ивермектинсодержащих препаратов. Новомек, введенный подкожно в дозе 200мкг/кг, обнаруживается в мышцах, печени и жире на протяжении 21 суток.

8. Выделения ивермектина после обработки животных препаратом гиподектин-Н не наблюдалось. Незначительное количество (2-Знг/г) ивермектина определялось в ткани печени на 3 сутки после обработки животных.

4.ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанный конкурентный иммуноферментный метод с использованием моноклонапьных антител может быть применен для определения остаточных количеств ивермектина в региональных лабораториях.

Разработаны и утверждены методические рекомендации по определению остаточных количеств ивермектина в молоке, органах и тканях крупного рогатого скота (Утв. Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 17 сентября 2010г.).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тарасов, И.Е. ИФА для определения ивермектина с использованием моноклональных антител/ И.Е. Тарасов и др.// Ветеринария,- 2009г.-№4- С.59-61.

2. Тарасов, И.Е. Конкурентный иммуноферментный анализ ивермектина с использованием моноклональных антител/ И.Е.Тарасов, Цибезов В.В., Верховский O.A., Алипер Т.И.//Труды ВИЭВ,- 2009.-Т.75. - С. 608-613.

3. Тарасов, И.Е. Количественное определение авермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа /И.Е. Тарасов, Костина Л.В., Цибезов В.В., Верховский O.A.// Материалы второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии» - Казань, 2009. - С.504-508.

Заказ № 129-А/11/2010 Подписано в печать 16.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасов, Илья Евгеньевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СОЕДИНЕНИЙ АВЕРМЕКТИНОВОЙ ГРУППЫ, ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ АВЕРМЕКТИНОВ

1.1. Характеристика ивермектина

1.2. Механизм биологического действия ивермектина

1.3. Терапевтическая эффективность ивермектина 16.

1.4. Распределение ивермектина в органах и тканях животных и выделение его с молоком

1.5. Методы анализа ивермектинов в продуктах животного происхождения

1.5.1. Физико-химические методы

1.5.2. Биологические методы

1.5.3. Химико-биологические методы

1.5.4. Методы подготовки проб для анализа ивермектина 41 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение конъюгата ивермектина с бычьим сывороточным альбумином

2.2. Получение моноклональных антител

2.2.1. Иммунизация

2.2.2. Миеломная клеточная линия

2.2.3. Культивирование клеток

2.2.4. Слияние клеток и выращивание гибридом

2.2.5. Криоконсервация гибридом

2.2.6. Получение асцитных жидкостейусо держащих МКА

2.2.7. Получение МКА из асцитных жидкостей

2.3. Иммунохимические свойства моноклональных антител

2.3.1. Субтипирование МКА '

2.3.2. Методы твердофазного иммуноферментного анализа

2.4. Получение конъюгата моноклональных антител с пероксидазой ^ ^ хрена

2.5. Метрологические параметры метода ИФА

2.5.1. Чувствительность метода

2.5.2. Специфичность метода

2.5.3. Воспроизводимость метода '

2.6. Постановка конкурентного ИФА

2.7. Приготовление калибровочных проб

2.8. Отбор проб биоматериала

2.9. Экспериментальная контаминация образцов

2.10. Экстрагирование ивермектина из проб молока, мышц, печени и ^ жира

2.11. Определение ивермектина в биоматериале методом ВЭЖХ с использованием флюоресцентного детектора

2.11.1. Реактивы и оборудование

2.11.2. Подготовка реагентов и растворов

2.11.3. Условия хроматографирования

2.11.4. Отбор и подготовка проб для анализа

2.11.5. Метрологические характеристики метода

2.12. Препараты, использованные для обработки животных

2.13. Изучение выделения ивермектина с молоком и его определение в органах и тканях сельскохозяйственных животных

2.14. Обработка полученных результатов 65 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка иммуноферментного метода определения ивермектина в продуктах животного происхождения

3.1.1. Получение конъюгата ивермектина с бычьим сывороточным альбумином

3.1.2. Получение МКА к ивермектину

3.2. Использование МКА 4с6 в конкурентном ИФА

3.2.1. Чувствительность метода

3.2.2. Специфичность метода

3.2.3. Воспроизводимость метода

3.3. Оценка эффективности экстракции ивермектина из проб мяса, жира, печени и молока

3.4. Изучение динамики выведения препаратов на основе ивермектина из организма животных с молоком

3.5. Изучение распределения ивермектина в органах и тканях животных

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа"

Актуальность работы ! 1

В связи с глобальным распространением и интенсивным использованием в сельском хозяйстве химических средств, в том числе ветеринарных препаратов, возникает проблема1 их контроля в получаемой животноводческой продукции. Препараты, могут выделяться у обработанных животных в виде исходных соединений и их метаболитов с молоком, накапливаться в органах и 1 тканях животных и в случае вынужденного убоя или не соблюдения времени выдержки животного после обработки препаратами попадать с продуктами животного происхождения в организм человека. Это может привести к развитию дисбактериоза и аллергических реакций. Для предотвращения этого необходимо разрабатывать и совершенствовать методы контроля ветеринарных препаратов, применяемых в сельском хозяйстве [1,28].

Авермектины - одна из наиболее востребованных групп соединений, используемых как в агрономии, так и в ветеринарии во всем мире. Благодаря высокой акарицидной, инсектицидной и нематоцидной активности эти соединения широко применяются в мировой и российской сельскохозяйственной практике в качестве антипаразитарных средств. Данная группа соединений была открыта в середине семидесятых годов прошлого века. Семейство авермектинов включает ряд естественных и полусинтетических молекул макроциклических лактонбв, таких как авермектин, абамектин, ивермектин, аверсектин и др., отличающихся по некоторым структурным и физико-химическим свойствам [12,13,100].

В настоящее время в качестве основного, утвержденного метода для определения остаточных количеств ивермектина в биологическом материале используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флюоресцентным детектором и его различные модификации [64].

Благодаря высокой точности измерения, селективности и простоте обработки полученных данных метод ВЭЖХ стал во многих странах «золотым

I I стандартом» определения ивермектина., Однако он имеет ряд недостатков, основными из которых являются: высокая стоимость оборудования, сложная и многостадийная подготовка проб для анализа, а также низкая скорость его I проведения. Не лишены недостатков и другие физико-химические и биологические методы определения ивермектина [32].

В качестве альтернативы ВЭЖХ за рубежом используется иммуноферментный метод определения ивермектина в продуктах животного происхождения на основе поликлональных антител. Преимуществами данного метода являются: высокая специфичность, скорость и простота постановки реакции, а также сравнительно невысокая стоимость процедуры анализа [93]. Однако по сравнению с поликлональными антителами моноклональные антитела имеют ряд преимуществ по специфичности и чувствительности вместе с невысокой стоимостью процедуры анализа [106]. Этот факт был взят за основу при разработке иммуноферментного метода.

Большинство работ, посвященных изучению динамики выделения ивермектинсодержащих препаратов с молоком и распределению их в органах и тканях животных, охватывают короткий период наблюдений - от 7 до 28 дней [36,41,42]. Но в литературе также .'есть данные о том, что остаточные количества ивермектина обнаруживаются у животных в течение двух месяцев после проведения обработки ивермектинсодержащими препаратами [42, 92, 117]. В нашей работе мы более детально рассмотрели период выделения ивермектина с молоком, а также его распределение в органах и тканях животных после применения наиболее распространенных ивермектинсодержащих препаратов. 1 1 I

Цель работы ]

Целью данной работы являлась разработка иммуноферментного метода выявления ивермектина и его определение в продуктах животного I происхождения.

Основные задачи исследований

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Получить конъюгат ивермектина с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

2. Получить моноклональные антитела к ивермектину и изучить их иммунохимические свойства. I

3. Разработать конкурентный иммуноферментный метод для определения остаточных количеств ивермектинов.

4. Оптимизировать методику подготовки продуктов животного происхождения для количественного . определения ивермектина методом иммуноферментного анализа.

5. С помощью разработанного 'метода изучить динамику выделения лекарственных средств с молоком и их распределение в органах и тканях крупного рогатого скота.

Научная новизна работы

Получены моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с ивермектином.

На основе полученных моноклональных антител разработан конкурентный иммуноферментный метод определения остаточных количеств ивермектина в продуктах животного- происхождения (молоко, мясо, печень, жир).

Методом ИФА изучена динамика выделения ивермектина с молоком I после применения противопаразитарных препаратов (гиподектин-Н, дермацин, новомек).

I )

Практическая ценность работы

Разработаны методические рекомендации по определению остаточных количеств ивермектина в молоке, органах и тканях крупного рогатого скота I методом иммуноферментного анализа.

Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ГИГУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Протокол №3, 8 июня 2010г.). Утверждены I I

Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 17 сентября 2010г.

Установлены сроки выведения ■ ивермектина из организма животного с молоком и его распределение в органах и тканях после применения ивермектинсодержащих препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения: I

• результаты работы по получению МКА к ивермектину;

• результаты разработки ИФА и предварительной подготовки проб для проведения анализа;

• результаты изучения выделения ивермектина с молоком и его распределения в органах и тканях.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2009, 2010 гг.).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы три научные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 122 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов исследования, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 12 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 123 отечественных и зарубежных источника.

Заключение Диссертация по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Тарасов, Илья Евгеньевич

5. ВЫВОДЫ

1. Получена гибридомная линия клеток 4С6, продуцирующая моноклональные антитела к ивермектину.

5. При внутрикожном введении новомек в дозе 8 мкг/кг выделяется с молоком на протяжении 14 суток.

6. Препараты дермацин и гиподектин-Н, примененные в дозах 0,6мкг/кг и Змкг/кг соответственно, не выделяются с молоком.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанный конкурентный иммуноферментный метод с использованием моноклональных антител может быть применен для определения остаточных количеств ивермектина в региональных лабораториях.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Тарасов, Илья Евгеньевич, Москва

1. Абрамов В. Е. Теоретическое обоснование создания новых препаративных форм альбендазола и клозантела для борьбы с эндо- и эктопаразитами с. ж.//Дисс. д. вет. наук.-2000.- 55 с.

2. Апалькин В.А. Эффективность пурона при паразитозах телят./ Ф.А.Волков, В.В.Тарасов, О.В. Шевченко // Профилактика паразитарных болезней животных ивермектином. 1991. - С.22-26

3. Апалькин В.А. Эффективность ивомека при паразитозах жвачных животных/ Н. М. Понамарев // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями животных.- 1992.-С. 111-114.

4. Апалькин В.А. Лечебная и экономическая эффективность ивомека в животноводстве Горного Алтая / Н.М. Пономарев // Профилактика гельминтозов животных,-1991 .-№.2.-С.26-31.

5. Апалькин В.А. Ивомек при гиподерматозе в Сибири / С. Д. У гай // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных.- 1997.-С. 183-184.

6. Бёккер Ю. Спектрометрия.// Тезерсфера.-2009.- С.376-377.

7. Васильяров Г.Г. Концентрирующие патроны./ Г.С.Алексеев// ДИАПАК. -2007-Вып. 2.- 56 с.

8. Викторов A.B. ВЭЖХ-флуоресцентный метод определения микроколичеств аверсектина С в растительных объектах. / и др.// Биотехнология.- 1996.-№6.-С.55-62.

9. Волков Ф.А. Ивермектин в ветеринарии./Апалькин В.А.//-1995.1.1. Новосибирск.-С.5-6.

10. Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды (перечень) Дополнение №3 к ГН 1.2.1323-03 Гигиенические нормативы ГН 1.2.1876,-06.

11. Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды (перечень) Дополнение №6 к ГН 1.2.1323-03 Гигиенические нормативы ГН 1.2.2221- 07.

12. Головкина Л.П. Природный авермектиновый комплекс и его модификации в борьбе с паразитами животных.// Дисс. д. биол. наук.- Тюмень.-2003.-с15-16.

13. Гульчинская Т. С. Авермектинсо держащие инъекционные лекарственные средства на российском рынке ветпрепаратов// Зооиндустрия.-2001.-9с.

14. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа./ А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М.Гаврилова. М.: Высш. шк.- 1991.-23с.

15. Жданова В.В.// Критерии оценки методов исследования: электронная версия// Методическое пособие "Вектор-Бест" Совершенствование качества работы клинико-диагностических лабораторий. Новосибирск, 1999.

16. Иванова A.B. Борьба с гиподерматозом крупного рогатого скота и эффективность некоторых препаратов группы макроциклических лактонов в борьбе с этим заболеванием.// Перспективные технологии и новые разработки.2004. Электронный ресурс.

17. URL: http://www.sibpatent.ru/default.asp;?khid=54028&a 11=1 &sort= 1 (дата обращения 13.09.2008).

18. Кузьмин: A.A., Антгельминтики в ветеринарной медицине.//Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УАА11. 2003. Электронный ресурс. URL материала: http://vetmedical.ru/publish/?id=:33 (дата обращения 14.08.2010).

19. Матвенцев В.Д. и др. //А. с. СССР № 1145668 (1981).• ■ 1 . ' ''

20. Материалы симпозиума МСД AFBET. Современные исследованияпо борьбе с животными паразитами., Австралия^ 1983, 20 с.

21. МУК 4.1.1012-01. Определение массовой концентрации аверсектина С в органах и тканях. животных, плазме и молоке методом флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

22. МУК 4.1.1821-03. Определение остаточных количеств ивермектина в печени, почках, мясе, жире сельскохозяйственных животных и молоке методомвысокоэффективной жидкостной, хроматографии;

23. Непоклонов A.A. Новое в борьбе с гиподерматозом крупного рогатого скота//Животноводство России.-2000.-№5.-с.22-26

24. Непоклонов A.A. Оздоровление стад крупного рогатого скота от гиподерматоза/ЛВетеринария.- 2002.-№ 10.-с.З.

25. Непоклонов A.A. Внутрикожное применение Новомека при гиподерматозе / Г.Т. Брюшинина и др.//Ветеринария.- №10.-2001.- с. 11-12.

26. Непоклонов A.A. Гиподектин для профилактики и лечения при гиподерматозе / Брюшинина Г.Т. //Ветеринария.-1998.-№3.-с.6-9.

27. Павлов С.Д. Сравнительная оценка препаратов системного действия при гиподерматозе крупного рогатого скота. /Окунев А. М. // Сибирский вестник с/х науки. -1990. №6. - 66-69.

28. Русаков С. В. Экологические аспекты применения ивомека, дуотина и фармацина в ветеринарии. Дисс. к.биол.наук.-1997.- с.20-21.

29. Сафиуллин Р.Т. Экономически обоснованные схемы дегельминтизации ремонтного молодняка свиней при кишечных нематодозах в специализированных хозяйствах // Тр. ВИГИС.-М.-1992.-Т.31.-С.106-116.

30. Семенов C.B. Новая лекарственная форма ивермектина, ее фармакологические свойства и эффективность при лечении паразитарных болезней животных.//Дисс. к. биол. Наук.-М.-2009.-163 с.

31. Сидоркин В.А. Научные основы разработки и применения новых отечественных противопаразитарных лекарственных средств. // Дисс д.вет.наук.- Саратов.-2002.-467с. \

32. Тарасов И.Е. ИФА для определения ивермектина с использованием моноклональных антител/ Л.В. Костина, В.В. Цибезов, А.Ю. Козлов, A.A.

33. Непоклонов, Т.Н. Алипер, О.А. Верховский. // Ветеринария. 2009.- №4.-с.59-61.

34. Тарасов И.Е. Конкурентный иммуноферментный анализ ивермектина с использованием моноклональных антител/ JI.B. Костина, В.В. Цибезов, А.Ю. Козлов, А.А. Непоклонов, Т.И. Алипер, О.А. Верховский. -М.: Труды ВИЭВ.-том75.- 2009.- 692с.

35. Ямов В.З. Эффективное средство при гиподерматозе КРС./ М.Н. Евстафьев // Вопросы ветеринарной арахноэнтомологии.-Тюмень.- 1986.-вып.З.-с.9-10.

36. Ямов В.З. Средство ликвидации гиподерматоза./ Окунев A.M., Захаров Р.В // Уральские нивы.-1989.-№11.-С.22-23.

37. Alan L. Chicoine. Ivermectin use and resulting milk residues on 4 Canadian dairy herds./ David A. Durden, George MacNaughton, and Patricia M. Dowlin // Can Vet J.- 2007.-Vol.48.-P.836-838.

38. Alva-Valdes R. Efficacy of ivermectin in oral paste formulation against immature gastrointestinal and pulmonary nematodes in cattle./ G.W.Benz, D.H. Wallance, J.R Egerton., S.J. Gross, J.W. Wooden// II Amer. J. Vet. Res. 1984. - N4. - P.685-686.

39. Alvinerie M. Cinétiques plasmatiques de l'ivermectine chez la vache/ J.F. Sutra, P. Galtier, P.L. Toutain. //Recueil MedVet.- 1993.-169.- P.259-261.

40. Alvinerie M. Determination of ivermectin in milk by high performance liquid chromatography./J.F.Sutra, P.Galtier and P.L.Toutain // Ann Rech Vet.- 1987.-18.-P.269-724.

41. Alvinerie M. Ivermectin in goat plasma and milk after subcutaneous injection./ J.F. Sutra, P. Galtier // Vet. Res. -1993. -V. 24, 5. -P. 417-427.

42. Anastasio A. Residue study of ivermectin in plasma, milk and mozzarella cheese following subcutaneous administration to buffalo (Bubalus bubalis)./ M. Esposito, M. Amorena et al.// J. Agric Food Chem. -2002. -V. 50, 18. -P. 52.

43. Alvinerie M. Microdose d'ivermectine chez la vache laitiere: concentration plasmatiques et residue dans le lait./ J.F.Sutra, P. Galtier, P.L.Toutein// Rev. Med.- 1994.- p.761-764.

44. Armour J. Efficacy ivomec F against parasites of cattle. / K. Bairden, J.M. Preston // II Vet. Ree. 1980. - V. 107. - N6. - P.226-227.

45. Armour F. Persistent antelmintic activ of ivermectin in cattle. / K.Bairden, A.F. Batty et al. //Vet. Rec.-1985. -V. 116. -P. 151-153.

46. Barth D. Investigation of the efficacy of ivermectin against ectoparasites in cattle/ I.H.Sutherland // Zentralblatt fur Bacteriologies, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene.-1980.-Abt.-I.-267.-319.-№57.

47. Barth D. Persistent anthelmintic effect of ivermectin in cattle.// J. Vet. Ree.-1983.-V. 113.- №14.- P. 300.

48. Benakhla A. L hypodermosis bovine en Algeria: reflexions sur la mise en place d un project de controle./A. Benakhla, C. Boulard// Commission of the European Communities, Brussels. 8 10 May. 1992. P. 77-84.

49. Benakhla A. Comparative efficacy of different insecticides in the treatment of cattle hypodermosis in northeastern Algeria/ Losson B., Lonneux J.F. et al. // Vet.Res.-1998.-V.29.-P.21 -29.

50. Benz G.W. Use ivermectin in Cattle, Sheep, Goats, and swine./ R.A.Roncalli, S.J. Gross // In Ivermectin and Abamectin; Campbell W.C., Ed.: Sprigtr-Verlag.-1989.-P.201-215.

51. Burg R.W. Avermectins, new Familiy of potent Anthelmintic: agents production organism and fermention. / E.E. Miller, I.B. Baker et al.// Antimicrob. Agent Chetmother.-1979.-V.J 5.-N3.-P.361-367.

52. Burg R.W. Isolation and Characterization of the Producing Organism. / Stapley E.O. // In ivermectin and Abamectin; Campbell W.C., Ed.: Sprigtr-Verlag.-New York.-1989.-P.24-33.

53. Campbell W.C. Ivermectin: a potent new antiparasitic agent.// Science.-1983.- P.823-828.

54. Campbell W.C. Ivermectin:a review of efficacy and safety./G.W. Benz5

55. J. Vet.Pharmacol.Ther.-1984.-P. 1-16.i

56. Campbell W.C. Ivermectin and Abamectin//Springer -Verlag.- New York.-1989.-P.362

57. Chiou R: Determination of ivermectin in? human plasma and- milk by highperformance liquid chromatography with fluorescence detection./ R.J. Stubbs, W.F. Bayne // J. Chromatogr.- 1987.- P. 196-202.

58. Chiu S. H. L. Metabolism and Tissue Residues./ Lu Y. H.// NY.- 1984,1i I

59. Chiu S.H:E. Metabolism ofdvermectin in tissues of cattle, sheep and rats/ Ii.Sestokas, R. Taub et al. //Drug. Metab. Disp. -1986. -V. 14. -P. 590.

60. Chiu S. H. L. Compative in vivo and in vitro metabolism of ivermectin in of steers, sheep, swine and rat/ Taub R., Sestokas E., Lu A. Y. IT., Jacob T. A.// Drug Metab. Rev. -1987.-№18.-P. 289-302

61. Crooks S. R. H. Detection of Ivermectin Residues in Bovine Liver Using an Enzyme Immunoassay./others// Analyst 123;-nö. 2.- 1998.-P. 355-58.

62. Crooks S.R.H. Review of methodology for the determination of macrocyclic lactone residues in biological matrices./ M. Danaher, L.C. Ho wells, V. Cerkvenik-Flajs, O'Keefe M.//Journal of Chromatography.- 2006.- P. 175- 203.

63. Crooks S.R.H. Detection of unwanted residues of ivermectin in bovine milk by dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay: / P. Ross, C.S. Thompson, S.A. Haggan, C.T. Elliott//Luminescence.- 2000:- P.371-376.

64. Danaher M; Review of methodology for the determination of macrocyclic lactone residues in biological matrices./ Howells L.C., Crooks S.R., Cerkvenik-Fläjs V., O'Keeffe M.// J. Chromatogr., Analyt. Technol. Biomed. Life Sei.-2006.-P. 175-203. !

65. David A. Durden Ivermectin use and resulting milk residues on 4. Canadian dairy herds./ George MacNaughton, and Patricia M. Dowling// Can. Vet. J.-2007.-August.- P. 836-838.

66. De Montigny P. Liquid chromatographic determination of ivermectin in animal plasma with trifluoroacetic anhydride and N-methylimidazole as the derivatization reagent./ J.S. Shim, J.V. Pivinichny //J. Biomed Anal.- 1990.- P.50711.

67. Doeglas J. Monoclonal antibodies for immunoassay of avermectins / Schmidt et al.// J.Agric.Food Chem.- 1990.-Vol.38.-P.1763-1770.

68. Europen Communities/Brussels 1993- pp.71-84.

69. Duce I.R. Actions of dihydroavermectin Bla on insect muscle./ Scott R.H. //Br. J.Pharmacol.- 1985.-V.85.№ 2.-P.395-401.

70. Egerton J.R. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: efficacy of the Bla component. / D.A. Ostlind, L.S. Blair// Antimicrob. Agents Chemother.- 1979.- V.15.-P.372-378.

71. Egerton J.R. 22,23-Dihydroavermectin-Bl,a new broad-spectrum antiparasitic agent./ J. Birnbaum, L.S. Blair // Br. Vet J. 1980.-V.136.-P.88-97.

72. Egerton J.R. The anthelmintic efficacy of ivermectin in experimentally infected cattle. / C.H. Eary and D. Suhayda // Veterinary Parasitology.- 1981.- V.8.-P. 59-70.

74. Empel W. Efficacy of ivermectin against actoparasites in heifers. /iL

75. Kozanecki M. // Proc.l4m Wrld. Congr. on diseases of cattle held on 26-29 August in Dublin. P.5-840.

76. Feng X. P. Study of the nematode putative GAB A type-A receptor subunits: evidence for modulation by ivermectin. / J. Hayashi, R. N. Beech et al.// J. Neurochem.-2002.-Vol. 83.-P. 870-878.i

77. Floate K. D. Thin-Layer Chromatographic Detection of Ivermectin in Cattle Dung./ W. G. Taylor, R. W. Spooner// Journal of Chromatography.- V. 694.-1997.-P. 246-51.

78. Guillot F.S. The infectivity of surviving Psoroptes ovis on cattle treated with ivermectin./ W.P. Meleney // Vet. Parasitol.- 1982.- V.10.-P. 73-78.

79. G. Albers-Schonberg. Avermectins Structure Determination./ et al.// J. Am. Chem. Soc.- 198l.-V. 103.-№14.-P. 4216-4221.

80. Halley B. A. The environmental impact of the use of ivermectin: environmental effects and fate./ T. A. Jacob , A. Y. H. Lu // Chemosphere.- 1989.-V.18.-P. 1543-1563.

81. He J. Multiresidue analysis of avermectins in bovine liver by immunoaffinity column cleanup procedure and liquid chromatography with fluorescence detector./ X.Hou, H.Jiang, J.Shen // J. AOAC Int.- 2005.-V. 88.-№4.-P.1099-1103.

82. Hotson I.K. Efficacy of topically administered ivermectin aqainst cattle parasites / W.I. Bliss, I.L. Cox, R.A. Roncalli, I.H. Sutherland // Vet.Parasitol.-1985.-P.112.

83. Jacob T.A. Ivermectin: a potent new anti-parasitic agent. / Science.-1983.-V.221.-P.823-828.

84. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). Residues of some veterinary drugs in food animals (FNP 41-14) FAO Food and Nutrition Paper: WHO.- 2000.-P. 53-57.

85. Jozef Vercruysse Breed difference in the pharmacokinetics of ivermectin administered subcutaneously to Holstein and Belgian Blue calves/ et al. //Veterinary Parasitology.-2008.-P. 137.

86. Kass I. S. The effects of avermectin and drugs related to acetylcholine and 4-aminobutyric acid on transmission in Ascaris suum./A.O. Stretton and C. C. Wang//Mol. Biochem. Parasitol.- 1984.-V. 13.-P. 213-225.

87. Kass I. S. Avermectin Bla: a paralyzing anthelmintic that affects interneurons and inhibitory motoneurons in Ascaris. / Wang C. C., Walrond J. P., Stretton A. O. W.// Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 1980.-V.77.-P.6211-6215.

88. Khan M.F. The feasibility of exterminating warble fly (Hypoderma species) on regional basis.//Vet.Parasitol.- 1977.-№3.-P.217-223.

89. Kofer J. Trial of ivermectin against ectoparasites of cattle and calves.// Rew.Appl.Entomol.-1989.- V.72.-P. 197-199.

90. Kojima K. Determination of 22,23-dihydroavermectin Bla in dog plasma using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography./ K. Yamamoto, Y. Nakanishi, H.Katae // J. Chromatogr.- 1987.-V. 413.-P. 326-31.

91. Kohler G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity/ G. Kohler, C.Milstain//Nature. 1976.-Vol.256.-P.495-497.

92. Li J.S. Immunoaffinity column cleanup procedure for analysis of ivermectin in swine liver. / X.W Li., H.B. Hu // J. Chromatogr. B. Biomed Sci. Appl.- 1997.- V.696.-№1.- p.199-171.

93. Lifschitz A. Bioequivalence of ivermectin formulations in pigs and cattle. / Pis A, Alvarez L et al.// J. Vet. Pharmacol. Ther.- 1999.-V. 22.-P. 27-34.

95. McDonald P.D. Solid Phase Extraction Application guide and Bibliography./ Bouvier E.S.P.// A Resource for Sample Preparation Methods Development, Waters, Milford, MA.-1995.

96. Michael H. Fisher. The chemistry and pharmacology of avermectins/ Mrozik. Helmut// Annual Review of Parasitology and Toxicology.-1992.-P.537-553.

97. Mitsui Y. Simple and sensitive enzyme liked immunosorbent assay for ivermectin./ H. Tanimori, T. Kitagawa, Y. Fujimaki, Y. Aoki // Am. J. Trop. Med. Hyd.- 1996.-V.54.-№3.- p.243-248.

98. Nakane P.K. Peroxidase-labelled antibody a new method of conjugation/ A. Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22. - № 4. - P. 1084-1092.

99. Niec R. Anthelmintic action of ivermectin in cattle. / Eddi C., Gomez B. // Revista de Medicina Veterinaria (Buenos Aires).- 1982.-V. 63.-P. 456-458.

100. Nordlander I. Determination of ivermectin residues in swine tissues an improved clean-up procedure using solid-phase extraction. / H. Johnsson // Food Add Cont.- 1990.-V. 7.-P. 79-82.

101. Omura S. Ivermectin: 25 years and still going strong / H.Johnsson // International Journal of Antimicrobial Agents.-2008.-P. 91-98.

102. Ostlind D.A. Insecticidal activity of the anti-parasitic avermectins./ S. Cifelli, R. Lang // Vet.Rec.-P. 105-168.

103. Pivnichny J.V. Direct determination of ivermectins in plasma at nanogram levels by high-performance liquid chromatography. / J.S.K. Shim, L.A. Zimmerman//J. Pharm. Sei.- 1983 .-V. 72.-P. 1447-50.

104. Sams R. Chemical assay of avermectins by high performance liquid chromatography with fluorescence detection.// Vet. Parasitol.- 1993.-V.48.-P.59-66.

105. Samsonova J.V. Biosensor immunoassay of ivermectin in bovine milk./ G.A. Baxter, S.R. Crooks, C.T. Elliott // J. AOAC Int. 2002.-V.85.-№4.- P.879-882.

106. Samsonova J.V., Determination of ivermectin in bovine liver by optical immunobiosensor./ G.A. Baxter, S.R. Crooks, C.T. Elliott // Biosens Bioelectron.-2002.-V. 17.-№6-7.-P.523-529.

107. Schmidt D.J. Monoclonal antibodies for immunoassay of Avermectins./ C.E.Clarkson, T.A.Swanson, M.L. Egger, R.E.Carlson, J.M.Van Emon, A.E. Karu // J. Agric. Food Chem.- 1990.- V.38.- p.1763-1770.

108. Schnitzerling H.J. Normal phase liquid chromatographic determination of nanogram quantities of ivermectin in cattle blood or plasma./ Nolan J. // J. Assoc. Anal. Chem.- 1985.-V. 68.-P. 36-40.

109. Shiwen X. Preparation and characterization of monoclonal antibodies against avermectin./ L. Shu, S. Dongbo and G. Donghua. // Hybridoma (Larchmt).-2009.-V.28.-№3 .-P. 173-6.

110. Simpson N. Sample preparation for chromatographic separation and overview./ T.A. Dean, J.W.Oudsema, C.F. Pool //Anal. Chim. Acta.- 1990.

111. Snyder L.R. Practice of Liquid Chromatography//J.J. Kirkland, Wiley-Interscience.- N-Y.-1971.

112. Stapley E.D. Avermectins, antiparasitic lactones produced by Streptomyces avermitilis isolated from a soil in Japan.// Trends in Antibiotic Research. Japan Antibiotics Research Association.-Tokyo.- 1982.- P. 154-170.

113. Swan G.E. Persistent anthelmintic effect of ivermectin in cattle. / Harvey R.G.// Journal of the South African Veterinary Association.-1983.- V.54.- P.249-250.

114. Tarry D.W. Progress on the warble fly eradication scheme in Great Britain. In:C.BOULARD u H.THORNBERRY (Hrsg.).Warble fly control in Europe. A symposium in the EC-Programme.Brussels 16./17.9/1982.A.A. Balkema/Rotterdam/Boston 1984, S.73-77.

115. Taylor W.G. Thin-layer chromatographic detection of ivermectin in cattle serum./ TJ. Danielson, R.L.Orcutt // J. Chromatogr.- 1994.-V. 661.-P. 327-33.

116. Tolan T.W. Determination of avermectins in plasma at nanogram levels using high-performance liquid chromatography with flourescence detection./ P.Eskola, D.W.Fink, H.Mrozik, L.A. Zimmerman // J. Chromatogr.- 1980.-V. 190.-P. 367-76.

117. Toutain P.L. Plasma and milk kinetics of therapeutic doses of ivermectin for dairy cows./ M. Alvinerie, P. Galtier // Proc. of 4th Congress of European Association for Veterinary Pharmacology and Toxicolody,Budapest, Hungary.-1988.-P. 165-170.

118. Toutain PL. Kinetic and insecticidal properties of ivermectin residues in the milk of dairy cows/ et 2X.II J. Vet Pharmacol Ther.- 1988-Vol. 11.-P.288-291.

119. Tway P.C. Determination of ivermectin in cattle and sheep tissues using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection./ J.S. Wood, G.V. Downing // J. Agricul. Food Chem.- 1981.-V.29.-P.1059-63.

120. Weber N.E. Use of Xenobiotics in Food-Producing Animals in the United States/ D.H. Hutson, D.R. Hawkins, G.D. Paulson, and C.B. Struble// Xenobiotics and Food-Producing Animals. Washington, DC: American Chemical Society.- 1992.

121. Weimin Shi. Determination of multiresidue of avermectins in bovine live r by an indirect competitive ELISA./He Jihong, Jiang Haiyang, Hou Xiaolin, Yang Junhong, Shen Jianzhong// J. Agr. Food Chem.- 2006.-V. 54.-№17.-P. 6143-6146.

122. Wesley L. Shoop. Structure and activity of avermectin and milbemycins in animal health. / Helmut Mrozik, Michael H. Fisher.//Veterinary Parasitology.-1995.-P. 139-156.

123. Yaswinskii T.A. Effectivenss of evermectin in the tretment of eguine Parascaris equorum and O.equi infections. / Hamm D. // Amer. J. vet. Res.-1982.-V.43.-№6.-P.1095.

124. ZiefM. Sample preparation. / Kiser R.// Am.Lab.-1990.

Информация о работе

Тарасов, Илья Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 06.02.05

Диссертация

Определение ивермектинов в продуктах животного происхождения методом иммуноферментного анализа - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы