Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фармако-токсикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественного производства

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Содержание диссертации, доктора ветеринарных наук, Скира, Василий Николаевич

1. Отзыв В.А. Дриняева (НБЦ "Фармбиомед") с приложением.

2. Справка ЗАО «Агроветсервис», выданная В.Н. Скире.

3. Письмо Департамента ветеринарии МСХ и П РФ Департамента санэпиднадзора Минздрава.

4. Письмо Департамента санэпиднадзора Минздрава РФ Департаменту ветеринарии МСХ и П РФ.

5. О переименовании авертина на абиктин (2 письма).

6. Письмо о переименовании фирмы.

7. Свидетельство о регистрации фирмы ЗАО «Агроветсервис».

8. Рецензия и письмо.

9. Материалы по применению авертина инъекционного при паразитарных болезнях жвачных и свиней.

10. Материал МДУ.:.

11.Протокол заседания комиссии, созданной 23.03.01 по решению диссертационного совета Д. 220.029.01. с приложением.

12.Основные методические подходы к тестированию тератогенной активности химических веществ.

13.Компьютерный перевод главы по токсикологии.

ФАРМБИОМЕД

Научно-биологический центр производитель экологически чистых ветеринарных препаратов и средств защиты растений

129226, Россия, Москва, ул. Сельскохозяйственная, д.12а Тел./факс +(095)181-2463, 181-0462, e-mail: pharmbiomed@mtu-net.ru

Исх. № УЗ/0/ « /3 » 2001г.

Председателю Президиума , у Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации f//. J/J c &

1 ^ уг Председателю Ученого Совета

Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Председателю Ученого Совета Ивановской государственной сельскохозяйственной академии

Уважаемые господа!

На заседании Научно-технического Совета ООО НБЦ «Фармбиомед», которое состоялось 11.03.01г. по адресу: 126229, г. Москва, ул. Сельскохозяйственная, 12а, зал заседаний, было заслушано и обсуждено сообщение старшего научного сотрудника Стерлиной Т.С., ознакомившейся в командировке в г. Иванове, в библиотеке ИГСХА с авторефератом и полным текстом диссертации Скиры В.Н. на тему «Фармако-токсикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественного производства», поданной на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук.

На заседании присутствовало 15 человек, из них 1 доктор биологических наук, 9 кандидатов биологических, ветеринарных, химических и технических наук. Выписка из протокола заседания прилагается.

Учитывая единогласное решение о выдаче отрицательного отзыва на представленную диссертацию, прошу на основании п. 18 «ГОлоягёния о'порадке присуждения научным и научно-педагогическим работникам ученых степеней и присвоения научным работникам ученых званий» от 24 октября 1994 года № 1185 снять с рассмотрения диссертацию Скиры В.Н. на тему «Фармако-токсикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественногр производства», ввиду того, что при написании диссертации соискатель Скира В.Н. не дает ссылок на патенты, опубликованные работы, гигиенические нормативы, из которых он заимствовал как идею работы, так и ее научную разработку. Для выяснения в какой степени соискатель Скира В.Н. использовал в своей работе чужой материал без ссылок ф. авторов и источники заимствования, прошу создать компетентную комиссию из числа членов / Ученого Совета ИГСХА и- привлеченных специалистов, токсикологов, ветеринаров, компетентнь/х/в области разработок лекарственных средств на основе авермектинов.

Генеральный директор ТлЯЧ/ ' В.А. Дриняев

14 НАР

В Высшую аттестационную комиссию Российской Федерации

Председателю Диссертационного совета Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Председателю Диссертационного совета Ивановской государственной сельскохозяйственной академии

HpûJ^ôMAtiJ Выписка из/заседания Научно-технического Совета Научно-биологического центра

Фармбиомед» от 11.03.01г.

Присутствовали: генеральный директор НБЦ «Фармбиомед» к.б.н. Дриняев

B.А., заместитель генерального директора по науке д.б.н. Новик Т.С., заместитель генерального директора по новой технике к.б.н. Кругляк Е.Б., первый заместитель генерального директора Мосин В.А., старший научный сотрудник Стерлина Т.С. заведующий лабораторией ветеринарии к.в.н. Головкина Л.П., заведующий лабораторией средств защиты растений Березина Н.В., заведующий лабораторией микробиологии и селекции микроорганизмов к.б.н. Березкина Н.Е., начальник ОНТК старший научный сотрудник к.б.н. Григорьева С.П., инженер-биолог ОНТК к.в.н. Волкова Г.Н., старший научный сотрудник к.х.н. Косарева В.М., старший научный сотрудник к.х.н. Авчук C.B., старший научный сотрудник Тер-Симонян В.Г., начальник производства авермектинсодержащих препаратов Яковлев Н.В., ученый секретарь НТС НБЦ «Фармбиомед» к.т.н. Чистова Т.Д.

Слушали: сообщение старшего научного сотрудника Стерлиной Т.С. о диссертации Скира В.Н. «Фармако-токсикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественного производства» на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук.

Обсуждение. В обсуждении принимали участие Дриняев В.А., Новик Т.С., Мосин В.А., Кругляк Е.Б., Головкина Л.П., Березкина Н.Е., Косарева В.М., Григорьева

Постановили: диссертация Скиры В.Н. на тему «Фармако-токсикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественного производства» не отвечает требованиям, предъявляемым к докторским диссертациям, по следующим пунктам: отсутствует научная новизна, сомнительна достоверность полученных результатов и не доказано личное участие диссертанта в представленной работе и заимствованы разработки других авторов в разделе «Результаты исследований» без ссылок на них.

Направить выписку из протокола, отзыв на диссертацию и приложения в Высшую аттестационную комиссию Российской Федерации, Диссертационный совет Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, Диссертационный совет Ивановской государственной сельскохозяйственной академии.

Научно-технический совет выражает особое мненйЬ: просить руководство НБЦ «Фармбиомед» обратиться в компетентные органы с/шшью выяснения путей утечки конфиденциальной информации из государственных учреждений.

Председатель НТС ^ ^ Дриняев

Ученый секретарь , Zy / Т.Д. Чистова улии-илбшЛ uM^t^&uU в .л tyfy^^-eé^ У. £

ЩиЛv0[ ОС , ™ ij^u^u^ f-é J

Отзыв на диссертацию В.Н. Скиры «Фармакотоксикологическая оценка и антипаразитарная эффективность авермектинов отечественного производства»

Оценивая диссертацию В.Н. Скиры, мы не рассматривали разделов (2.3; 2.4 и 2.5), посвященных нематодирозу: они отличаются стилем оформления и изложения, временем проведения работ (1991-1992 гг.) и, судя по названию работы, не являются ее основной частью.

Результаты же исследований по фармакотоксикологии и терапевтической активности и их оценку можно свести к следующим положениям:

1. Из продуктов жизнедеятельности штамма Streptomyces avermitilis BKÜM-S-1440, автором которого диссертант не является, получена некая авермек-тинсодержащая субстанция, названная авертин. Субстанция не охарактеризована, сравнения с известными решениями не проведено, преимущества не доказаны, принадлежность авертина к природному авермектиновому комплексу не аргументирована, личное участие диссертанта не очевидно, научная новизна сомнительна (базовая работа по субстанции сравнения: Дриняев В.А., Кругляк Е.Б., Мосин В.А. и др. Аверсектин С: физико-химические и биологические свойства. Прикладн. био-хим. микробиол. 1999; 35:2:199 - 205) (см. приложение №1).

2. На основе этой субстанции получены две лекарственные формы авертина, которые по сути своей являются в лучшем случае дженериками известных препаратов: если исходить из наставления по применению, то дженериками дуотина, если из материалов диссертации, - то аверсекта (ТУ 9383-001-17266133-95) и уни-верма (ТУ 9337-004-017266133-95). При этом диссертант использует чужие материалы без ссылки на источники:

- в разделах по составу и технологии изготовления лекарственных форм (2.2.2 и 2.2.3) пункты 1-4 (с.68 и 69) взяты из ОПР на производство препарата аверсект-2 (фармации), 1996г., утвержденного Генеральным директором НПО «Фармбиомед» Юркивом В.А. (см. приложение №2), разработанного на основе патента РФ № 2054848 (приоритет 28 февраля 1995 г.);

- термин водно-спирто-полимерная основа для авертина инъекционного заимствован диссертантом из НТД на аверсект-2 (фармации) ТУ 9383-00117266133-95; наставление по применению № 13-4-2/2193 от 22.11.00 г., а основа для авертина порошка заимствована из НТД на Универм ТУ 9337-004-17266133-95 и ТУ 9337-004-17266133-00; наставление по применению № 13-4-2/924 от 30.04.97 г. (временное) и № 13-4-2/1923 от 13.03.00 г. (постоянное); первое упоминание в научной литературе термина водно-спирто-полимерная основа приводится в статье C.B. Березкиной, В.А. Дриняева, Л.П. Головкиной и др. Эффективность фармацина при гиподерматозе крупного рогатого скота. Ветеринария. 1996; 6:30 - 35) (см. приложение №3). Ссылки на это в разделе «Результаты исследований» отсутствуют.

Отсюда с неизбежностью следует, что диссертант не разрабатывал лекарственные формы, а воспользовался уже готовыми разработками, нарушив право разработчиков на интеллектуальную собственность. Несущественные изменения в оригинальном тексте, сделанные, по-видимому, с целью скрыть факт заимствования, при полном непонимании диссертантом сути производственного процесса, приводит к досадным искажениям технологии или просто к ошибкам. Фразы «получение первого (второго) этанольного обогащения экстракта» (с.68 и 69) означают увеличение содержания этанола в-растворе, что не предусмотрено технологией. Запись «массовая доля авермектинов группы В (50±5%)» (в 1% растворе!) безграмотна по содержанию и по форме. Получение 50% раствора авермектинов группы В невозможно, поскольку максимальное насыщение авермектинами водно-спирто-полимерного раствора составляет 83г/л или 8,3% (патент РФ № 2054848); самую низкую растворимость имеет авермектин В i.

Научная новизна таких «разработок» весьма сомнительна; приведенные в диссертации материалы никак не подтверждают утверждения диссертанта в разделе «теоретическая значимость», что «показана роль лекарственной формы препаратов.» (с. 8).

Кстати, слово авертин является запатентованным товарным знаком (знак обслуживания), который принадлежит другому препарату (таблеточной форме) (свидетельство № 177365) (см. приложение №4).

3. Фармакотоксикологические исследования, в нарушение правил (ОСТ 42-507-96), начаты с изучения не субстанции, а сразу с «разработанных» лекарственных форм и являются почти полностью заимствованными из конфиденциальных пакетов документов, переданных ранее НБЦ «Фармбиомед» в Минсельхоз РФ и Минздрав РФ в связи с регистрацией препаратов Аверсект-2, Универм, паста Эк-висект, мазь аверсектиновая.

Диссертант в своем изложении этого раздела почти полностью повторяет структуру «Материалов по обоснованию максимально допустимого уровня (МДУ) аверсектина С в продуктах питания человека» (далее «Материалы.»), которые были разработаны специалистами НБЦ «Фармбиомед» и представлены в Департамент Госсанэпиднадзора и утверждены как гигиенический норматив (ГН 2.3.2.70898) (см. приложение №5). Этим объясняется присутствие в диссертации данных по хронической токсичности (помещенных почему-то в разделы по острой токсичности 2.2.4.1 и 2.2.4.2), хотя сама постановка исследований по хронической токсичности авертина инъекционного и авертина порошка совершенно бессмысленна. Препараты применяются на животных однократно, максимум двукратно, поэтому исследовать токсичность этих лекарственных форм при столь длительных сроках введения нет никакой надобности. Подобные исследования необходимы для нормирования ДВ в нродуктах питания, но в этом случае они проводятся не с лекарственными формами, а с ДВ (как, например, с аверсектином С в «Материалах по МДУ»),

Диссертант пытался скрыть источник заимствования, но внесенная им «индивидуальность» свидетельствует о полном непонимании предмета исследований. Так, например, вызывает недоумение фраза: «.показатели эмбриотоксичного действия находились в пределах физиологической нормы» (с. 166). Изменяя и сокращая методику, диссертант делает совершенно недопустимые ошибки: из его описания следует, что при изучении эмбриотоксического действия должно быть 17 групп крыс, а в таблице представлены, по-видимому, суммированные данные, что методически неправильно. Диссертант не разделяет оценку кумулятивных свойств и подострой токсичности, хотя это разные виды исследований и по задачам, и по методикам. Для вывода об отсутствии мутагенной активности явно недостаточно одного теста, особенно наименее информативного - теста доминантных летальных мутаций (Новик Т.С., Бару Р.В., Рябова В.А. и др. Оценка мутагенной активности аверсектина С. Антибиот. химиотер. 1999; 44:7:16-20) (см. приложение № 6).

Для доказательства заимствований достаточноавнить диссертацию и «Материалы. »:впадает изложение, построение таблиц, отдельные фразы, иногда - почти целикомраницы (с небольшой модификацией). Можноавнить таблицы 2.2.4.1.8; 2.2.5.2.19 и 2.2.5.2.20 диссертации иответственно 3.2.3 и 7.2.2 «Материалов.» (цифры, естественно, другие). Практическивпадают фразы, абзацы: 73 (почти полностью), 77 и 83 диссертации иответственно 12 (почти полностью) и 34 (фразы77, 83) «Материалов.». Разумеется, диссертантарался в меруоихл изменить текст «Материалов.», но при полном непониманиити исследований такие «изменения» могут быть довольно забавными: на92 приведено загадочное определение «генетическая активность половых клетокмцов крыс», которое является всего лишь безграмотно модифицированным выражением «не проявил генетической активности на половых клеткахмцов» («Материалы. .»,95) (см. приложение № 7).

Поэтому мы выражаем сомнение не только в достоверности полученных результатов (много методических ошибок), но и в самом факте проведения таких исследований.

4. Определение остатков авертина в органах и тканях проведено с использованием методики, которую диссертант представляет как свою разработку, но которая была разработана еще в 1995-1996 гг. сотрудниками НБЦ «Фармбиомед» В.Г. Тер-Симоняном и C.B. Авчук. В настоящее время этот метод утвержден в Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава РФ и вскоре будет опубликован. В 1996 г. описание метода определения остаточных количеств авермектинов в органах и тканях, плазме и молоке животных, с помощью флуоресцентной ВЭЖХ, равно как и результаты определений остаточных количеств авермектинов в органах и тканях животных после применения аверсекта-2 и универма, было включено в материалы по изучению аверсектина, переданные в Совет по ветеринарии для регистрации аверсекга-2, а позже - уни-верма и также было включено в «Материалы по обоснованию МДУ».

Именно это описание метода буквально слово в слово (воспроизведены даже ошибки) перекочевало в диссертацию В.Н. Скиры в нарушение всяких авторских прав его разработчиков (см. приложение №.8).

Тот факт, что с помощью известного метода получены какие-то данные, вряд ли может представлять какую-то «новизну»! К тому же переписывая чужую методику, диссертант даже не потрудился вникнуть в ее суть и разобраться в формуле. Диссертант, вероятно, даже не подозревает, что в органах и тканях определяют содержание не лекарственных форм, а действующего вещества. Все это дает нам право усомниться в достоверности полученных данных.

5. Результаты работы по определению терапевтической эффективности лекарственных форм авертина недостаточны для обоснования утверждения диссертанта о превосходстве авертина по сравнению с другими аналогами (с. 176), а заявленная экологическая безопасность (с. 166 и 180) не подтверждена вообще никакими исследованиями.

Все вышеизложенное дает нам основание считать, что диссертация Скиры В.Н. не соответствует требованиям, предъявляемым к докторским диссертациям, а соискатель не заслуживает искомой степени доктора ветеринарных наук.

Генеральный директор НБЦ «Фармбиомед», к.б.н.

Ученый секретарь НБЦ «Фармбиомед», к.т.н

В.А. Дриняев

Чистова Т.Д

К4Л. ос

ДК 615.28:615.332.

АВЕРСЕКТИН С: ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 1999 г. В. А. Дриняев, Е. Б. Кругляк, В. А. Мосин, В. Г. Тер-Симонян, Т. С. Новик, С. В. Русаков, Н. С. Березина, Н. Е. Березкина, Т. С. Стерлина

Научно-биологический центр "Фармбиомед", Москва, 129226 Поступила в редакцию 22.12.97 г.

Из сухой биомассы герготусея ах'етйпИз ВНИИСХМ-54 выделен комплекс, состоящий из восьми природных авермектинов. Идентичность полученных соединений ранее описанным авермектинам подтверждена методами ВЭЖХ, УФ- и масс-спектроскопии. Отличительной особенностью комплекса, получившего название аверсектин С, является преимущественное содержание в нем авермектинов группы В (67.5%). Аверсектин С обладает широким спектром инсектоакаронематоцидного действия и высокоэффективен как в отношении лиртогрызущих и листососущих вредителей растений, так и в отношении многих экто- и эндопаразитов сельскохозяйственных животных. В объектах окружающей среды аверсектин С быстро разлагается: период его полураспада в воде составляет 3 сут, а в почве в условиях тепличных хозяйств - 25-30 ч.

Аверсектин С - действующее вещество новых ;ысокоэффективных противопаразитарных пре-[аратов биологического происхождения аверсек-■а-2 и фитоверма, разработанных в НБЦ "Фарм-¡иомед" и предназначенных для борьбы с экто- и ндопаразитами животных и растений [1, 2]. Аверсектин С относится к группе авермектинов, ювому классу биотоксинов, обладающих инсек-'ицидной, акарицидной и нематоцидной актив-юстью.

Авермектины, продукты жизнедеятельности :ультуры Streptomyces avermitilis, впервые были гаисаны в конце 70-х годов и зарегистрированы в юллекции фирмы "Merck Sharp and Dohme" JIIIA) под родовым индексом С-076 [3]. Всесто-юннему изучению авермектинов посвящено )олыпое количество работ, наиболее полный об-!ор которых проведен в монографии, изданной юд редакцией Кэмпбелла [4]. В химическом от-юшении авермектины близки к макролидным штибиотикам. В их состав входят 16-членный гактон и дисахарид, состоящий из двух остатков шеандрозы. В процессе, роста культура синтези-)ует авермектиновый комплекс из 8 авермектино-¡ых компонентов, отличающихся между собой ал-сильными заместителями у 5-го и 25-го углеродных атомов (см. формулу, рис. 1). Описаны )сновные авермектины А1а; А2а; В1а; В2а и четыре линорных - А1в; А2в; В1в и В2в. По имеющимся литературным данным, наибольшей биологической эффективностью по отношению к нематодам от-шчаются авермектины серии В! [4]. Этим и объ-юняется тот факт, что основное внимание иссле-" *ователей в свое время было направлено на разработку способов получения авермектийа В! и его детальное исследование. Полученный в очищенном виде авермектин В1 представляет собой смесь из двух авермектиновых компонентов - В 1а и В1в. Подобная смесь, состоящая из не менее чем 80% В1а и не более чем'20% В^.была названа аба-мектином, а ее полусинтетическое дигидрирован-ное производное получило название ивермектин. На основе абамектина и ивермектина фирмой "Merck" разработан ряд препаратов как ветери-" нарного назначения, так и препаратов для защиты растений.

Коммерческие препараты, имеющие в своей основе авермектин Bj или его дигидропроизвод-ное - ивермектин, являются высокоэффективными противопаразитарными средствами. Однако необходимо отметить, что процесс выделения авермектина Bj из авермектинового комплекса, включающий многократную хроматографичес-кую очистку на инертных сорбентах с применением больших объемов органических растворителей, весьма сложный и дорогостоящий [5]. К тому же в литературе появились сведения о том, что в отношении некоторых членистоногих другие компоненты авермектинового комплекса проявляют даже более высокую токсичность, чем авермектин В! [б]. Поэтому при создании препаратов аверсект-2 и фитоверм нам представилось целесообразным использовать весь природный авермектиновый комплекс, образуемый культурой Streptomyces avermitilis. Испытания препаратов в ветеринарии и растениеводстве показали, что по своей эффективности они не уступают, а по йеко-торым показателям и превосходят препараты, из

Авермектины R

Ala Aie

В la В1б A2a

CH3 CH3 H H

CH3 CH3 H H

R26 C2H5 CH

CH3 C2H

C22-X-C

-CH=CH--CH=CHT -CH=CH--CH=CH--CH2-CHOH CH3 f -CH2-CHOH C2H5 -CH2-CHOH CH3 -CH2-CHOH

Рис. 1. Структурная формула авермектинов. готовленные на основе абамектина и ивермекти-на [7, 10].

Цель работы - получение субстанции аверсек-тина С, изучение ее компонентного состава и исследование ее биологических свойств.

МЕТОДИКА

Для работы использовали сухую биомассу культуры Str. avermitilis ВНИИСХМ-54, штамм НБЦ "Фармбиомед". Авермектиновый комплекс экстрагировали из биомассы 75%-ным этиловым спиртом. Очистку полученного этанольного экстракта осуществляли путем выдерживания его при температуре -35°С в течение 24 ч для удаления части липидных примесей. Пигменты удаляли обработкой экстракта активированным углем и ионообменными смолами., Очищенный экстракт концентрировали в вакууме при температуре +50°С. Из водного остатка авермектины экстрагировали многократно этилацетатом, экстракт промывали дистиллированной водой, высушивали безводным сернокислым натрием и упаривали в вакууме при +50°С до маслообразного остатка. Остаток растворяли в небольшом количестве смеси гексан : хлороформ в соотношении 3:1. Раствор наносили на колонку с силикагелем. Колонку промывали смесью гексан : хлороформ в соотношении 1:1 для удаления липидных примесей. Авермектиновый комплекс элюировали смесью гексан : хлороформ : ацетон в соотношении 1:1:1. Элюат концентрировали в вакууме досуха. Остаток растворяли в небольшом количестве хлороформа, затем аверсектин С осаждали гексаном, осадок отфильтровывали на стеклянном фильтре № 4 и высушивали в вакууме при +60°С в течение 2 ч.

УФ-спектр образца снимали в метилов« спирте на регистрирующем спектрофотометр Определение компонентного состава аверсект на С производили с помощью ВЭЖХ на хромат графе DU PONT 8.800 (США) на колонке pa3iv ром 4.6 х-250 мм с диасорбом 130-С-16Т с размер« частиц 6 мкм (фирма "Элсико", Россия). Элющ ющей системой служила смесь метанол : ацетон трил : вода в соотношении 60 : 25 : 15. Детектир вание вели в УФ-свете при 245 нм. Отдельш компоненты аверсектина С получали с помоиц ВЭЖХ, используя полупрепаративную колон ODS Zorbax 6.2 х 160 мм ("Waters", США), в сис; ме вода : метиловый спирт в соотношении 15 : i Отобранные пиковые фракции элюатов упарш ли досуха в вакууме, остаток растворяли в 0.5 ] метилового спирта. Идентификацию полученш образцов вели с помощью масс-спектроскопии приборе Finnigan МАТ-8430 (ФРГ), температу источника - 250°С, температура испарения обр; цов на прямом вводе - 180-200°С.

ТСХ осуществляли на хроматографическ пластинках фирмы "Merck" (Германия) в систе: гексан : ацетон : этиловый спирт в соотношен 16 : 6 : 1с количественной оценкой компонент в пятнах с помощью сканирующего денситомс ра фирмы "Comag" (Швейцария) с регистриру: щим интегратором "Du Pont Sp 4100" (США) п 245 нм [11].

Биологические испытания и оценку эффе тивности действия аверсектина С на вредител сельскохозяйственных культур проводили по i вестным методикам.

Поведение аверсектина С в воде изучали с г мощью ВЭЖХ после экстракции его из воды xj роформом.

Остаточные количества аверсектина С в почтив растительных объектах определяли с помо-цью ВЭЖХ-флуоресцентного метода [12, 13].

В качестве сравнения использовали стандарт-(ый образец абамектина фирмы "Merck" (США), ¡ качестве внутреннего стандарта - олигомицин [жрмы "Sigma" (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Состав и физико-химические свойства авер-ектина С. Выделенный в чистом виде аверсектин Ü представлял собой однородный аморфный по->ошок белого с кремовым оттенком цвета. Авер-:ектин С хорошо растворялся в спиртах, хлориро-¡анных углеводородах, ацетоне, практически не >астворялся в воде и петролейном эфире.

В УФ-области спектра аверсектин С имел ха-эактерный для авермектинов спектр поглощения : максимумами при 237 и 245 нм и плечом при

52-254 нм. Величины для каждого максимума аверсектина С, представленные в табл. 1, фактически полностью совпали с данными для 1бамектина, что свидетельствует о достаточно 5ысокой степени очистки образца.

При исследовании аверсектина С с помощью ЗЭЖХ на хроматограмме были обнаружены семь 1иков, обозначенных по порядку выхода номерами 1-7. Два из них, пики 5 и 6, при сравнительном фоматографировании были по времени удержи-5ания идентифицированы с авермектинами В1в и 31а стандартного образца абамектина. За неимением стандартных образцов других авермектинов, щя отнесения остальных пиков аверсектина С к хютветствующим индивидуальным авермекти-ам нами был использован известный прием хро-латографирования авермектинового комплекса с фименением внутреннего стандарта олигомици-ia А [14]. По данным авторов, использовавших этот прием, отношение времени удерживания каждого авермектинового компонента к времени сдерживания олигомицина А в определенных условиях является величиной постоянной и может служить целям идентификации компонентов.

На рис. 2 представлены хроматографические фофили олигомицина А и аверсектина С с внесенным олигомицином. Сравнение полученных результатов (табл. 2) с данными, имеющимися в татературе, показало, что относительное время сдерживания для пиков 1,2,3 я 4 полностью сов-зало с относительным временем удерживания щя авермектинов В2в, В2а, А2в и А2а соответственно [14]. Различие в показаниях для пика 7 и аверсектина А1а можно, по-видимому, объяснить различиями в условиях хроматографирования.

Таблица!. е\%сш для аверсектина С и абамектина

Длина волн максимума, нм Аверсектин С Абамектин

Таблица 2. Показатели отношений времени удерживания. авермектиновых компонентов к времени удерживания олигомицина

Аверсектин С Авермектиновый комплекс (Литературные данные [14]) пики относительное время удерживания авермек-тины относительное время удерживания

1 2 3 4 7 0.74 0.83 • 0.88 1.07 2.02 ' В2в В2а А2В А2а Ü'. Ala 0.75 0.84 0.90 1.09 2.

С целью однозначной идентификации компонентов аверсектина С индивидуальные пики, полученные с помощью накопительной ВЭЖХ, были изучены с использованием метода масс-спектро-скопии (нумерация пиков аналогична использованной выше - рис. 2, табл. 2).

Анализ масс-спектров и сравнение их с известными для авермектинов данными показывают, что диссоциативная ионизация всех исследована) I (б) ¡

IIi i II ' ' I i"--<

Время удерживания, мин.

Рис. 2. Хроматографические профили: олигомицина (а); аверсектина С с добавкой олигомицина (б). 7-7 -пики.

Таблица 3. Компонентный состав аверсектина С, %

Компоненты авермектинов Содержание, % группа А группа В

1а 6.0 ' 37.

1в 3.5 8.0 2а 20.0 ■ 20.

2в 3.0 2. ных образцов характеризуется как общими направлениями распада, обусловленными наличием одинаковых структурных элементов в молекулах, так и образованием специфических ионов, отвечающих конкретной структуре. Так, в масс-спектрах всех соединений в области низких масс обнаруживаются ионы с m/z 87, 113, 127 и 145, характерные для фрагментации всех авермектинов и обусловленные, по-видимому, расщеплением связей в экзоциклическом фрагменте - L-L-олеанд-росиле. -В области средних масс во всех образцах также имеются общие ионы массой 199 и 257, характерные для всех авермектинов [5]. В масс-спектрах пиков 1,2,5 vi 6 обнаруживают ионы cm/z 191, 309, 442 и 252, характерные для авермектинов серии В, а в масс-спектрах пиков 3,4 и 7 - ион с m/z 275, характерный для авермектинов серии А. При дальнейшей детализации масс-спектров было установлено, что масс-спектр пика 1 содержит ионы miz 570 и 732, присущие авермектину В2в, и пик 2 по совокупности наличия в его масс-спектре ионов массой 305,456, 566, с одной стороны, и ионов массой 584,746, 890, - с другой, может быть идентифицирован с авермектином В2а. Пик 3 имел характерные ионы с m/z 584 и 746 и поэтому может быть идентифицирован с авермектином А2в, а пик 4, имевший в масс-спектре ионы с m/z 323, 598, 760 и хорошо выраженный молекулярный ион с m/z 904, представляет собой авермек-. тин А2а. Присутствие в масс-спектре пика 5 ионов с m/z 714 и 858 позволяет определить его как авермектин В1в. Пик 6, в. масс-спектре которого выделяется молекулярный ион с массой 872, идентифицируется с авермектином В1а. Следует отметить наличие в масс-спектре этого образца пика малой интенсивности с m/z 534, характерного для авермектина А1в.

Пик 7 ~в связи с обнаружением в его масс-спектре ионов с массой 580,742 и молекулярного иона массой 886 был идентифицирован как авермектин А1а.

Исходя из полученных данных, следует заключить, что хроматографические пики аверсектина С 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 идентичны авермектинам В2в, В2а, А2в, В1в, В1а и А1а соответственно.

Авермектин А1в в наших условиях на хромат грамме не выделялся: время его удерживания сс падало с временем удерживания авермектина Е

Присутствие в авермектине С авермектина / было доказано нами с помощью сочетания мет дов ВЭЖХ и ТСХ: при хроматографированш тонком слое серия авермектинов А1; являющая суммой авермектинов А1а и А1в, хорошо отде.г лась от авермектинов серии Вь представляющ собой сумму В1а и В1в. При сопоставлении резу! татов определения авермектиновых компоне тов, полученных методами ВЭЖХ и ТСХ, оказ вается возможным вычислить содержан каждого компонента. В нашем случае содер» ние авермектинов серии А, при определении \ тодом количественной ТСХ было на 3.5% вып чем при определении методом ВЭЖХ. В то ) время содержание авермектинов серии В15 по да ным ТСХ, было на 3.5% ниже, чем по даннь ВЭЖХ. Наблюдаемая разница в определени объясняется присутствием в комплексе аверме тина А1в.

Таким образом, можно считать установле ным, что аверсектин С представляет собой ко плекс из 8 авермектиновых компонентов.

Количественное определение авермектин вых компонентов в аверсектине С былотфовер но с помощью ВЭЖХ и ТСХ с использованием качестве эталона абамектина.

Результаты анализа (см. табл. 3) показывай: что две трети комплекса (67.5%) представлен авермектинами группы В, отличительным пр знаком молекулярного строения которых являе ся наличие гидроксильной группы у 5-го углеро ного атома. Основным компонентом этой групг является авермектин В1а, содержание которо составляло 37.5%.

Авермектины группы А представлены в с новном компонентом А2а, содержание которо составляет 20%.

Противопаразитарная активность аверсект на С. Результаты изучения акарицидного и инее тицидного действия аверсектина С в отношеш ряда вредителей овощных культур, плодовых и д коративных растений приведены в табл. 4. Прив денные данные свидетельствуют о высокой э< фективности аверсектина С в отношении как ли тососущих, так и листогрызущих насекомь Изучение нематоцидной активности аверсекти] С, проведенное в сравнении с абамектином и иве мектином в отношении рисовой нематоды {Ар elenchoid.es ЬезБег), показало, что величина СЕ для "аверсектина С составила 1.0 мкг/мл. Абаме тин оказался более токсичным: СК50.для него ра нялась 0.7 мкг/мл. Любопытно, что аверсектин

Таблица 4. Эффективность аверсектина С в отношении вредителей растений

Вредитель Растение-хозяин Концентрация аверсектина С в рабочем растворе, мкг/мл Сроки наблюдения, сут Процент гибели

Паутинный клещ ■ retranychus Urticas Koch. Огурцы, томаты 2.0 2.0 73. 92.0 91.

Персиковая тля Myzoides persicaes Sul2 Огурцы, перцы, 16 16.0 6 5 96.3 90. ' ■ табак, .16.0 7 95. черная смородина 16.0' 4 100.

3озанная тля \iacrosiphus rosae Розы 4.0 3

Захчевая тля Aphis gossipii Перец 8. колорадский жук iieptinolarse decenelineata

1ичинки 1-го возраста Картофель 2.0 3 100.

-го возраста 2.0 3 90.

5-4-го возраста 2.0 3 70. капустная совка Sarathra brassicae Тичинки 2-го возраста Капуста 8.0 • ) 7 100.

Зепная белянка Pieris гарае Капуста 8.0 ' 7 100.

Сетчатая листовертка Tortricidae sp. (гусеницы) Яблоня 6.0 2 ■ 100.0"

Золосистая пяденица leometridae lycia (гусеницы) Яблоня 6.0 2 100. жазался слаботоксичным в отношении афидиуса АрЫсИш таХпсапае) — энтомофага персиковой ли - и среднетоксичным в отношении фитосейу-гюса.{РкуШеМш эр.) - энтомофага паутинного шеща.

Результаты изучения действия аверсектина С и эндо- и эктопаразитов крупного и мелкого ро-■атого скота, оленей, верблюдов и свиней на юлыпом поголовье спонтанно инвазированных кивотных показали высокую эффективность грепарата, не отличающуюся от эффективности [бамектина и ивермектина [15, 16].

Поведение аверсектина С в окружающей срее. Одним из важных критериев при выборе :редств защиты животных и особенно растений )т вредителей является скорость их деградации в )бъектах окружающей среды - в воде, почве, ку-(а они попадают и где накапливаются в результате их применения.

Из литературных данных известно, что при выдерживании водных растворов на солнечном свету абамектин подвергается фотолизу и период его полураспада составляет 12 ч. В отсутствие солнечного света абемектин сохраняется практически неизменным в течение 28 сут [4]. В отношении поведения абамектина и ивермектина в почве из литературных данных известно, что они оба про.чно связываются с почвенными элементами и практически не вымываются из верхних слоев почвы. Таким образом, можно предположить, что попадание их в дождевые стоки исключаются. Однако в связанном состоянии абамектин, и особенно ивермектин, могут сохраняться в почве достаточно долго. Так, в лабораторных условиях абамектин сохранялся в почве в неизменном состоянии 20-47 сут. Ивермектин при пониженной температуре может сохраняться в почве до 240 сут. В летнее время, и особенно при солнечном освещении, сроки его полураспада сокращаются до 7-14 сут. Накопление в объектах окружающей среды ве

Рис. 3. Динамика деградации аверсектина С (1) и абамектина (2) в воде (% от исходного содержания). ществ, обладающих инсектицидным и немато-цидным действием, может привести к нарушению экологического равновесия. В связи с этим мы посчитали целесообразным исследовать поведение в воде и почве аверсектина С в сравнении с абамектином и ивермектином. Нами было установлено, что при хранении водных растворов аверсектина С и абамектина в защищенном от света месте при температуре +18°С и pH 7.3 период полураспада первого составил 3 сут, тогда как содержание второго в конце 4 недель хранения снизилось не более чем на 40% (рис. 3). При хранении образцов подзолистой почвы с внесенными в них аверсектином С, абамектином и ивермектином в лабораторных условиях период полураспада аверсектина С составил менее 7^ сут, абамектина - 7-14, а ивермектина - более 28 сут. В опытах, проведенных в тепличных условиях, в почве, обогащенной органическим веществом, период полураспада аверсектина С составил 25-30 ч. Полученные данные свидетельствуют о том, что авер-сектин С значительно быстрее разрушается в воде и почве, чем абемектин и ивермектин.

На основании представленных материалов можно сделать следующее заключение: аверсек-тин С, выделенный из биомассы актиномицета Str. avermitilis ВНИИСХМ-54, представляет собой комплекс из 8 компонентов, идентифицированных как природные авермектины. Основными компонентами аверсектина С являются авермектины группы В. На их долю приходится две трети всего авермектинового комплекса, причем содержание авермектина В1а составляет 37%. Аверсек-тин С обладает широким спектром инсектоакаронематоцидного действия и высокоэффектив< как в отношении листососущих и листогрызущ) вредителей растений, так и в отношении ряда э то- и эндопаразитов сельскохозяйственных ж вотных, не отличаясь в этом отношении от ш роко известных авермектинсодержащих препар тов a6àmekthha и ивермектина. Больше преимуществом авермектина С по сравнению абамектином и ивермектином является его быс рая инактивация в объектах окружающей сред] в воде и почве. Приведенные данные свидетел ствуют о том, что аверсектин С является перспе тивным действующим веществом для создания i его основе различных препаративных форм ДJ ветеринарии и растениеводства.

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Скира, Василий Николаевич

Выводы

1. Аверсектин С не проявил мутагенной активности в тесте Эймса на Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98, ТА 100 при отсутствии или наличии метаболической активации.

2. Аверсектин С не оказал мутагенного действия в тесте индукции доминантных летальных мутаций при пероральном введении белым беспородным-крысам-самцам в дозе 2,25 мг/кг (1/40 LD50).

3. При пероральном введении аверсектина С в дозе 8,82 мг/кг (1/5 от LD50) и одно- (0,2 и 2 мг/кг) и семикратном (0,2 мг/кг/день) подкожном применении препарата у мышей-гибридов F]CBAxC57BI/6 количество аберрантных мета-фаз не превышало контрольных значений. При однократном пероральном введении мышам (8,82 мг/кг) препарат не проявил антимитоти-ческой активности.

Библиография Диссертация по биологии, доктора ветеринарных наук, Скира, Василий Николаевич, Москва

1. Пат РФ № 2054848. МКИ C12P1.06, 17/18; С 12 R 1:465.

2. Пат. РФ № 2070799 МКИ А 01 № 63/00.

3. Оценка мутагенности новых лекарственных средств: Метод рек М3 РФ. М 1992; 31.

4. Малашенко A.M. Методы учета мутаций у лабораторных мышей. Генетика 1967; 16: 33-41.

5. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах: Метод указания. М 1977.

6. Метод учета хромосомных аберраций как биологический индикатор влияния факторов внешней среды на человека: Метод указания. М 1974.

7. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лунник Н.В. Классификация и методы учета хромосомных аберраций в соматических клетках. Генетика 1972; 5: 133-141.

8. Плохинский H.A. Руководство по биометрии для зоотехников. М 1969.

9. Бочков Н.П. Система оценки химических веществ на мутагенность для человека: общие принципы, практические рекомендации и дальнейшие разработки. Генетика 1975; 10: 156—169.

10. МК-933: microbial mutagen test with and without rat liver enzyme activation. TT#77-8068. Merck Co 1978.

11. M K-933: mouse lymphoma citotoxicity study. TT#79-8034. Merck Co 1980.

12. MK-933: unscheduled DNAsynthesis in human IMR90-fibroblasts. TT#80-8205. Merck Co 1980.

13. M1C-936: ninety-four week dietary carcinogenicity and toxicity study in mice. TT#83-002. Merck Co 1983.

14. MK.-936: one-hundred-five week dietary carcinogenecity and toxicity study in rats with fiftv-three week interium necropsv. Final report. TT#82-099-0. Merck Co 1982.

15. Ivermectin and abamectin./Campbell W.C. ed. New-York; Berlin; Heidelberg; London; Paris; Tokyo 1989; 105-107.1. Поступила 27,05.987,'Ь ¿¿л^

16. НПО Фармбиомед Государственный Научный Центр по антибиотикам (ГНЦА)

17. Утверждаю" Генеральный директо член-корреспо^нт РА профессор1997 г1. Материалыпо обоснованию максимально допустимого уровня (МДУ) аверсектина С в продуктах питания человека

18. Согласовано/^ Директор по^йауке1. Москва199721.2. Результаты и обсуждение

19. Среди крыс, получавших аверсектин С в дозе 1/20 от LD50 в течение 60 суток, падежа не отмечали. Также отсутствовали видимые признаки токсикоза.

20. Таким образом, при схеме введения аверсектина С в дозе 1/10 от LD50 ежедневно в течение 2-х месяцев у изучаемого препарата были выявлены кумулятивные свойства, которые были оценены при выведении коэффициента кумуляции.150 ehr1. К кумуляции= =3,78150 ас

21. По значению К кумуляции аверсектин С относится к 3 классу соединений, обладающих умеренной кумуляцией. Кумулятивный эффект подчиняется зависимости "доза-время-эффект".

22. Изучение подострой токсичности аверсектина С при пероральномвведении для крысят-отъемышей 2.2.1 .Материалы и методы

23. В качестве тест-объекта для изучения субхронической токсичности аверсектина С при пероральном его введении выбрали крысят-отъемышей.

24. Крысятам-отъемышам самцам в возрасте 2-3-х недель с исходной массой 25-35 г в течение 2-х месяцев ежедневно через рот вводили аверсектин С в дозах 1/400 и 1/4000 от LD50 для половозрелых крысчислу фагоцитированных микробов).

25. Индекс переваривания (среднее число убитых микроорганизмов на 1 подсчитанный нейтрофил).

26. Анализы показателей микрофлоры и определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови проводили через каждые 2 месяца от начала опыта.

27. При изучении влияния аверсектина С на окисление свободных радикалов использовали установку БЕТА-2-анализатор и метод иммунохемолюминисценции, основанный на сверхслабом свечении биосред клеток в видимой области спектра.

28. Статистическую обработку данных всех видов исследований проводили по Стьюденту-Фишеру с использованием ^критерия (10).

29. В течение всего опытного периода (240 суток) не отмечено гибели крыс ни в одной из опытных групп.

30. Аверсектин С в трех тестированных дозах не оказывал отрицательного влияния на внешний вид, видимые физиологические функции и поведение крыс.

31. Животные росли и развивались без отклонений от нормы.

32. Динамика прироста массы тела в течение всего опытного периода в