Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ УРЕДОСПОР СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ФУНГИЦИДОВ

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ УРЕДОСПОР СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ПШЕНИЦЫ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ФУНГИЦИДОВ"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕШЯ СВЛЬСЖОХОЗЯЙЗТВБННЫХ ШУЕ ИМВНИ В-VU ШИНА

ЭСВСОСЗШЙ НАУЧНО-ЙХДЕДОБІ ТЕЇЇЬСКИЙ ИШТИТУТ ЗА1ІШИ РАСТЕНИЙ

Be правах рукопяся

АНИСВДОВ Виктор Дмитриевич

ОКИСЛИШЬВДВ ФЕРМЕНТЫ ЖРВДОСДОР СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНЫ ШВНИШ Я ВЛИЯНИЕ НА НИХ ШШЦЩШ

(06.01.11 - фвюоагожогяя в senara раогэвдй)

Автореферат

дисоертацил нв соясканяе ученой о те пеня кандидата Ояологячвскях внук

Яеиширад 1975

> 'li(f С Иt c <f Сґ — ^ 6О Li с < t í V ^М /1-і

- /

6с0сошная ордена ленина шлшя сельскохозяйственных наук имзни в. и» ленина

БСЕСОШїШ ШУЧНО-ИССЕЕдаВАТШЪСШЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТИТ РАСТЕНИЙ

ОЖСЛИТВЯЬНЫВ ФЕРМВИТН УРБДССПОР СТЕБЛЕВОЙ Р1АВЧИНЫ ШВЩЦЫ И ВЛИЯНИЕ НА НИХ ФУНГИЦИДОВ

(06.Ol,IX - (Jetona г о догм в эащага paarваяй)

Автореферат

днооертацяя на сохскавде учеьой огепеци кандидата биологических наук

фя^щаъах руяопяоя

АНистгаов Викгор Дштрявядо

Де няитрад 1375

Работа проведена о IS72 по 1976 гг. во Воеооюэном научно-иооледоватедьоком инотитута защиты растений и Всесоюзном научно-иооледовагелызком институте фитопатологии.

Диооертацял изложена на _____ о границах машинописи и состоит из введения, шеотн гьав, заключения и выводов.

Работа иллвотрирована __ таблиц и „_рисунками.

Список йапользованной литературы включает в сейя _

ваше новаций, в том числе_ на иностранных языках.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Л.Н.ЛОШЮВА,

кандидат физико-математических наук А.И.МОЧАЛХИН.

Официальные опповенгш доктор йяологачеоких наук,

профеооор ЧКАНИКОВ Дмитрий Иванович,

' кандидат биологических наук ТАРДАКОВСКИЙ Станяолав Александрович.

Ведущее учреждение! Северо-КавказокиЙнвучш-иослздова-теяьолий иногитуг фитопатологии.

Автореферат разослав " -ЛиЫ 1975 г.

Защита дмоертацяи оооюягся "" г.

в "/У" чао* на У»чном Совете Всесоюзного научно-ясоледо-мгеяьокого аногагута защиты растений«

Отаыв не автореферат {в двух экземплярах, заверенные пвчанЫ)) прооим направлять по адресу: 168620, Ленинград-Пушив-е, шооое Подйельокого, з, ВИЗР. Секретарю Ученого Совета* 1

О дяоочртацией ыошао ознакомиться в библиотеке иноги-

fy»e.

Ученый оенретарь Совета

Н.Р.Гончаров

Стеблевая ржавчица ішеницм РисатА* Г€Н

£ ¿Ї///Ґ/ с/ У&М известна как возбудитель од-

ного из наиболее вредоносных инфекционных заболеваний, способных резко снижать урожай и качество зеріїа, Эпифитотии отеблевой ржавчины периодически возникают в различных странах мира, в тон числе и в СССР, и приводят к потеряй от до 60% урожая (Чумаков, 1968; Цадокс,1970( .Ствккен, Харрар,1959/.

Борьба с.ржавчиной ведется, в основном, в трех направлениях: селекция устойчивых сортов, проведение агротехнических мероприятий и прицепе іще фунгицидов. Селекция устойчивых сортов встречает значительные трудности из-ае огромного разнообразен рао ржавчинных грибов и постоянно происходя ищии в природе формообразовательный» процессами, приводящими к возникновению новых, более вирулентных рас паразита. На .высокой агротехническом фоне перспективный мероприятием в борьбе с ржавчиной пшеницы является .применение фунгицидов.

Восьма эффективен в борьбе о возбудителем ржавчины пиеницы-- цинеб (действующее начало - цинковая соль этилен-бис-дитво-карбаминовой кислоты) - препарат, обладающий контактным вавдтным действием. Его аналог - набам (натрлевая соль этилец-био-дитио-карбаминовой кислоты) не используется в практике как фунгицид из-за своей высокой растворимости, но именно поэтому набам представляет собой хорошу» модель при' изучении влияния на ферменты шшхорастворимых этилен-бис-дитиокарбаматов,

После выхода в печати ряда работ американских исследователей {Г/с С£)//#/>//г?/,1954} Ц/ее г/ е/й/ «1953), в литературе ут- , вердь о« ъ мнение о том, что ка.баы и цинеб сами по себе не оказывают фунгицидпрго действия на уредоспоры стеблевой ржавчины пшенк цы, а этим свойством обладают продукты их естественного распада, таки^- рак зтилентиураішоно- и дисульфид, этилен-бис-изотиодиа-нат и т.д. Поскольку окончательно данный вопрос не решен, вами были исследованы все эти вещества.

Б последнее время были синтезированы новые фунгициды систем-, ного действия: плантвакс {2,3-дигидро-5-карбокоиа«ид-6-иетил-1,4 оксатиин~4,4-даокеид) и анилат(сульфокияатмоі:озтанодамкн) - яс-кореняющего действия, эффективные против ржавчины ПШЄНШЮ.

Для успешного, научно обоснованного применения суцесмуіщжх фунгицидов, а также для определения направления поиска вовых «э-й

- г -

йирательно действующих фунгицидов необходимо детальное изучение * особенностей метаболизма как растении-хоз пина(ішеница),так и возбудителя Селезни РнйС/'~>'<А ^гот/зі*.і р 1/*ч'£/с/ ,а такие механизма действия фунгитоксичных веществ. . В патогенезе растений видное место принадлежат окислительным фериеихаи(Руйин,Арциховскан,І96в).& шізнздеятельности урвдоспор стеблевой ржавчины пшеницы зги ферманзгы ^акае играют значите льну в) роль,одвако,их сиойсииа до настоящего врешті!практически не изучены,Диализ литературных данных позволил приііти к заключении,что лишь немногие аспекти окислительного метаболизма уредоопор и влияние на него фуигитокоичных вецеств можно считать ревенными.

Исследования,проводившиеся авторок £ 1972-1975 годах во Всесоюзной научно-исследовательском институте ааадти растений и во Бса союзной научно-исследовательском институте фитопатологии,имели цельюI

I»Разработать катоды выделения и очистки цитохроиоксидазы(К.Ф* I»9.3.1),гликадатоксидаэи{К,Ф. І.І.З.І),пероксшдави(К.Ф. 1.2,1. 7),каталазы(К,Ф. Х*2*1.б)и о-дифенолоксидавы(о-ДФО» К.Ф» І.ІО. 5*Х)уредоопор стеОлавоВ ржовчшгы пшеницы.

2.Ивучкть физико-химические и каталитические свойства втих ферментов.

3.Определить характер влияния етилен-бис-дитиокарйеиатов и продуктов их деградации,а также новых перспективных фуйгицидов(плант-вакс,аиалат)на каталитическую активность оксидоредуктаз урвдоспор

Экспериментальная часть.

В опытах использовали свежэсобранкш,а также хранившиеся в герметически закрытых сосудах,уродоспоры Московской популяции,представленные на 95расой 21,Соли этилен-Оис-дитиокарбашшовой кис-лоты(набам,цинеб)и продукты их деградации использовали непосредственно после синтеза*.

Синтез, фунгицидов проводилоя под руководством старшего научнрго сотрудника ВНЙИФ,кандидата химических наук П.С.Хохлова,за что ав-'аор приносит ему своп искренние благодарность.

Плантвакс фирмы Languor house- (Канада) был предварительно отделен от наполнителя путем экстрагирования Оевзолои в экстракторе Сокслета о последующей перенрит алли эацией из отанода» Анилат был синтезирован в лаборатории органической химии ВИЗР я пере- , кристаллизован* из этанола, Трудно растворимые вещества применяли в виде мелкодисперсной оуспвнаии, приготовленной ва 0,1% растворе твина-80.

Активность о-ДФО измеряли по методу Бояркина (155Л) и по .... Sister , (гans (1958), Van Наттлп tÖrou*rtr (1964)« Player (1954). Активность перокоидавы определяли по Бояркину (1$51) и по Staffortj art 6аhton (1970). гликолатокоидазн -по Hess » Totbert : (1967), катаяазы - по Плешкову (1968) и LijcH (1961), цитохроиоксидазы - по Smith (1955), содержание белка - по Лоури (1951). Аналитический диск-электрофорез в полиакриламидном геле (ПАГ) проводили по истоду Дэвиса в кодификации Сафоновых (Сафонов, Сафонова,1569). для вцявленжя ферментов в геле попользовали методы Сафоновых (Сафонов, Сафонова,. 1971). Молекулярный вес ферментов определяли на колонке о сефа-дексои G -200, предварительно откалиброваиной белками о известным молекулярным весом. Препаративный электрофоров в ПАГ проводили в стеклянном цилиндрической аппарате о внешним а внутренним охлаждением геля о использованием той же буферной системы а геля, что и при аналитическом диск-электрофорезе.

Изоалектрическое фокусирование проводил» на аппарате фирмы ¿.KB (Швеция), используя 110 ил колонку с 1% раствором амфоля-на pH 3-10.

Oie-vpu флуоресценции веществ регистрировались с помощь» флуоресцентного спектрофотометра ( Hitachi •■" HSF-3).'

I.Выделение ферментов.

Изучение ряда физико-химических и каталитических,свойств -ферментов невозможно без их выделения и очистки. При разработка методики выделения оксидоредуктаз не уредоспор обнаружили, что о-дифеволоксидаза, каталаза ш оероксидааа представлены уредо-спорах двумя формами: периплазма тичесн0В°( легко переходящей » раствор при набухания уредоспор в 'растворах шгэкой коацеятрацди соли) и энд оплаэ матиче с кой (переходявей в раствор тохько после разрушения оболочек уредоспор).

После прорастания уредоспор появление ферментов (часто называвшее "зкетрацеллюлирными") в культуральной ¡шдкости отмечалось рядом авторов (Гагкав , ,1959} Андреев и др.,1972; Тарабрш и др.,1973) и объяснялось разрушение« оболочек уредоспор вследствие автолиза или високой проницаемость» мембран гиф гриба. 2ых0д яерипдазыатичееккх фериевюъ, обнаруженных нами, не был связан с прорастанием уредоспор и начинался сразу же после погружения их в растворы о низкой ионной силой. Наибольший выход периплазкатических ферментов наблвдали при использовании в качестве энстрагента дистиллированной води. Следует отметить, что в естественных условиях набухание спор на поверхности листа может происходить в капельках росы. Споры, находящиеся г состоянии анабиоза, сохраняют способность выделять пвриплааыатнческие ферменты в воднуо среду, однако, количество этих ферментов, выделяемых свежесобрашшми уредоепорами, выше. Количество периплаэнатичеоних ферментов, в частности, о-ДФО, на-талазн и перовойдавы, в уредоспорах с низким процентом прорастания, было всегда ниже, чем в свежесобраиных уредоспорах (процент прорастания близкий к 100). При набухании, происходящем эа но -

сколько минут, возможность автолиза уредоспор исключена. Это дает возможность предположить, что существование периплааматичес-хих ферментов в уредоспорах биологически предопределено и не является аффектом, овяаанным о отмиранием и разложением уредоспо-ры. После удаления из уредоопор периплазматической о-ДФО, яерок-, сидавы и каталазы в уредоспорах остагтол вндошгазматические формы зткх фвривнтов, переходнике в раствор только после гоиогеняаи-! рования'уредоспор. Для выяснения вопроса о том, могут^периплаз-матичесвие ферменты выполнять в жизнедеятельности уредоспор биологические функции, отличные от таковых эндоплазиатичеокад ферментов, были исследованы фивико-хииическив и каталитические свой* отва втих фори.

Выделение и очистка периялааматических; о-Д?0. каталазы

и пероксилазн. ■

100 г предварительно отмытых насыщенным раствором сульфата амкояия уредоспор перемешивали о 500 мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 5х10"3И аскорбиновой кислоты. Экстракцию проводили в течение 50-60 мин. Спори осаждали центрифугированием и суспендировали в новой порции буфера. Операции повторяли

раз. к яадосадочной жидкости добавляли сухой сульфат аммония до' 9053 насыщения. Белковый осадок собирали о помощью центрифугирования и перерастворяли диализом против 0,05Н фосфатного буфера рН ?,0. Растаор белка наносили на колонку с.сефадексом С-50 я элюировали тем же бугром. о-ДфО, пероксидаза и каталаза елюи-ровались в пярвоы пике белка, фракции, содержащие ферменты, концентрировали и наносил» на колонку сефадекоа С-НОО. различив в молекулярных весах втих ферментов позволило разделать их между собоИ (рис.І). В некоторых случаях препарати о-ДФО и катала-зы подвергали препаративному электрофорезу в 7,5% полиакрнланид-ном геле.

Рис Л Кривая элщии белков уредоспор с колонки сефадекса £-200.

1 - суммарный белок

2 - каталаза

3 - 0-ДФО

4 - пероксидаза

Выделение эндоплазматической о-ДФО. Для выделения фермента, выходяяего в среду только при разрушении оболочек спор, материал, подученный после экстракция юв-рипдазматичеояюс ферментов, смешивали с 6-ти кратным объемом / 0,1!Л ^о о фазного буфера рН 7,0 и разругали в паровой мельнице в

течение I часа« Полноту разрушения контролировали с помощью светового или люминесцентного микроскопа.

Гомогенат центрифугировали при 40 000<j в течение ЗО мин, К надооадочной яидкооти добавляли сульфат ашаония до 15% насыщения. Осадок отделяли центрифугированием и отбрасывали, а к надооадочной жидкости добавляли сульфат аішония до насыщения.

j ¡Белок, выпавший в осадок,, собирали путей центрифугирования и парерастворклк против 0,0511 фосфатного буфера рН 7,0,

Дальнейшую очистку проводили, как и в случае периплавмати-чеокой о-ДФО, Процедура очиотки позволила увеличить удельную активность обеих форм о-ДфО в 200-250 рае.

Выделение эндоплазчатичеокой каталааы и перокоцлаэц. Разрушение уредоопор проводили так же,нак и в олучае эндо-плааматичеокоЯ о-ДФО. К полученному экстракту добавляли сухой сульфат аммония до 30J6 насыщения. Осадок удаляли центрифугированием я оупернатант доводили до 60% насыщения сульфатом аммония* Осадок белка перерастворяли диализом и дальнейшую очистку проводили тал яе» как и в случае выделения эндоплаамагических ферментов, Чистоту пари- и вндоплавматичеоких препаратов ферментов контролировали о помощью диок-электрофораза в ПАГ разной концент рации (5| 7«5| IQJS).

Выделение аатохмм-С-оксияаэы. При выделении цитохромоксидазы использовали метод, предложен вый Уайтом и Ледингемом ( White. , Lvdingham ,1961) о той рсашщей, что в качества детергента использовали тритон Х-ЮО.

рыделеци? уликолатоксида^ы, Для выделения глнколатоксйдази 10 г уредоспор разрушали в паровой ызлышце в50 ил 0t05n трис-НО! буфера рН 8,0. содврлаще= ; го Ш0-Зм цистеина и 2хіО"^ІІ аскорбиновой кисяоїн. Гомогенат подвергали двнтрифугироваиию при 20000jr в течение 20 мин., Оса-дож отбрасывали« а надооадочнуп жидкость вновь подвергали центри-'фуги^гававип при 40000^ в течение 20 мин. Надооадочнуп жидкость концентрировали и помещали на колонку сефадекоа С-25* Фракции, содержащие окоидазу гликолевой кислоты« собирали с помощь» коллектораЯ попользовали в, дальнейшей работе.

НЕКОТОРЫЕ ФЛЗЖСО-ШИЧЕСКЖ 11 КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

о-Аяйенолоксидааа о-ДФО уредосаор стеблевой ржавчины пивници по ряду своИсгв отличалась от о-ДФО ка клубней картофеля« чая, шляпочных грибов и т.д.: периплазиатическиА фермент отличался от зндоплаэиатичес-кого.

ОЭП,

Ш;

да

0'

ю-

№ № III

и*

Ш

«

1*

1 — Н

І

/

1

» г

—_ $

— г

г г ае Ї

1

1

і

1

і

і

Рис.г. Схема электрофореграыи О-ДФО уредоспор,

I - периплазиатическая о-ДФО (7,5% гель) ; 2 - периплазиатическая о-ДФО после ввкубации в растворе Ш мочевины (7*5$ гель)

3 - эгзоплазматическая о-ДФО (7,5$ гель)

4 - лриплазиатическая о-ДФО {3.5% гель)

5 - периплазиатическая о-ДФО (ІЩ гель)

На рис.2 изображены схемы электрофореграмм перипяазматичес-кой и эадоплаэыатяческой о- ДфО. Периплазиатическая форма фериея-та ъ большей степени представлена быстродвижуяаиися кошгонегташ эндоплаэнатическая - ме длєішодвижущимися. Инкубация о-ДФО в 8Н моче53Ве или нитратном буфере рН 3,0 в течение 40-60 мин. приводи ла к исчезновению всех медленно движущихся франяиЯ 0-&Ю. Это обстоятельство, по-гидииому, может быть объяснено тем,- что под влияние и 6М мочевины и в кислой среде происходит диссоциация О-йЮ. '

На колонке сефадекса G-200 определяли молекулярный вес фермента. Как дня пери-, так и для зндонлаэиатической формы он составил 120000* 8000, Характер кривой элюции о-дфО (рис.1) указывает на то, что фермент гетерогенен по модекулнркоиу весу, йзоэ-яектрическая точка не рипла зиат и че с кой форыы фермента находилась в интервале рН U,5-4,8» для эндоллазматической формы характерно наличие т рехизоэ лектри ческих точек в интервале рН 4,5-5,0; 6,9-?,2{ 7,9-8,0. Нри проведении изоэле к три че с ног о фокусирования фермент теряя значительную доли активности и проявлял тенденцию выпадать в осадок. С целью стабилизации фермента необходимо введение в раствор' тритона х-100 (0,01%),

о-ДфО уредоспор окисляла пирокатехин и пирогаллол. С меньшей скорость» оксилялаоь протокатехояая, хлорогеновая, кофейная к ферудоаая кислоты. Реакция окисления ДОФА была обнаружена только при окрашивании гелей после электрофореза в І1АГ. Тирозин, п-ярезол и реаарйин ферментом уредоопор tie окислялись.

С помощью препарат явного электрофореза в 11АГ периплазмати-ческий фермент был разделен на три фракции, ьн отродвижу щаяся 1 фракция о-ЙФО с больней скоростью окисляла пирогаллол, чем мед-ленводвижущаяоя, в то время, как последняя окисляла пирокатехин быстрее, чем зыоокоиодвижная.

Наибояее удобным для измерения активнооти о-дФО уредоспор сказался метод Бояркина (субстрат - пирокатехин). Этот метод был применен вами для определений константы Кихазлиса и зависимости скорости реакции от рН среды* Максимальная скорость реакции наблюдалась в области рН 7-7.2. Иодкисление раствора приво- ' дало к реэкому снижению активнооти фермента. Исследование щелоч-'ной области рН зтим методом затруднено иа-аа высокой скорости са-[Моокиолении реактивов. При исследовании зависимости активности jO-ДФО от концентрации субстрата, обнаружили« что большие концентра ции пирокатехина ингибируют активность фермента. Поэтому для вц-чиояевиа ионотанты Михавжиоа по методу Лайнуивера-Берна использовали аяачоние активности, полученные при низких концентрациях субстрата, Конотаята Кихазлиса составила 6х10~3И. Изучение влияния ингибиторов проводили в условиях, обеспечивавших оптимальное значение каталитическое активностифермента.Установили, что цианис -| тв8 калий и авнд натрия в концентрациях-l,5xI0~6u и SxIO'^M на 5QJ& ингибироіали активность периплаэматической о-ДФО. Для дости-

женин такого'же уровня ингибироваиия активности эвдоплаэматичес-кой о-ДФО необходимо било увеличить концентрацию цианистого калия в реакционной среде до гхЮ^И.

Каталаза«

При анализе в 7,5% ПАГ препаратов периплазматмческой и андо-плазматической каталазы уредоспор после электрофореза фермент был обнаружен в 5 зонах. Наибольшее количество фермента содержала ^-ая зона (рис.3). Молекулярный вес каталазы был определен методом гельфильтрации через колонку сефадекеа (^-200 и составил 240000^11000. Различий в молекулярных весах нерв- и эндопяазмати-ческой форм не обнаружили, Максимальну» скорость реакции наблюдали в области рН 7,0-8,0.

МП

м-

V .»

V «*

V »

» м

шш

I-.

- І»

Рис.3. Схема электрофореграмм каталазы х пероксидааы УреДОСПОр Р. ,

А - периплазыатичесхая каталаза В- эндоплазматическая каталаза С - периплазматическая пероксидаза Д - эндоплазкатическая пероксидаза

Регистрируя спектры поглощения растворов каталазы при различных рН^бааружшш сдвиг максимума поглощения А»Чш км, ваб-людаемого при рН 7,0 (фосфатный буфер) до Я* 360 на яри рН раствора, равного 3,0. Возможно, этот эффект был вызван дкссоцжшще! гека.от апо фермента каталазы. рК фермента равнялось 5,0'ж 9,8, что дало возможность предположить присутствие в активном центре фермента таких аминокислот, как глугаминовая кислота, гястидкн, явгкк и тирозин. ■

- 10 -

Константа Михазлиса дли каталазы уредоснор била вычислена и составила 2,5x10"%. Цианистый калий я концентрации 1,25хЮ~5Н ингибнровал активность пэриплаэиагической каталаза уредоспор на 84}6, азид натрия в концентрации 6,25x10"^ - на 70,Ингибиторы торыозиди активнооть эндоплазметичаской формы фермента слабее, чем периплаэматической. Так, цианистый калий подавлял активность андоплазматичаской формы фермента только на 63%, а азид натрия -на 60 при использовании их в тех же концентрациях, что и в опытах с лериплаэматическим ферментом.

Пегоксидаза

Элевтрофораграимы пернплазиатической лероксидазы существен- . но отличались от эндопназ мат иче с ко й (рио.З). периплазматический фермент проявляется при диск-злектрофорезе в ПАГ в 15 зонах, в то время как эндоллавматичеокая форма - только в 5. Молекулярный \вео перишдоматкческого и эндоюшзматичеокого фермента составил 40000*6000, Цорокоидава уредоспор окисляла гваякол« пирогаллол и боявидии, Кривая зависимости скорости окисления от концентра*', ции субстрата имела гиперболическую форму. Константы Михаэлиса для перечисленных субстратов были вычислены и составляй для гаа-¡явола - 7,8x10*^11, пирогаллола - Х,ЗхЮ"^Ц и бенаидина -|1»бх10~'к. Нааоимальвая окорооть реакции пероксидааы с гваяколом наблгдалась при рЫ 7,0, а о пирогаллолом - при рН 6,5. Цванистий 'валкЯ в концентрации 1,25x10 иигибировал активность периплазма* |тачеожой перокомдазы на андоплазматической - на 46%. Азид ;иа?рия в-концентрации 6,25х1о и иагибировал активность периплаз-[матьчаскоЯ формы аа вндоплааиатической - на 31%.

! Цдуохромоксядаза и гликолауонсидааа уредоопор.

' Цианистый калий на50% ингиОйровая активность цитохромок-

■ сидавы в ковцеа*радив 4,0х10"6Мгтакая же степень ингабировадия ¡доотмгалаоь при концентраций ааеда натрия, равной 1,0хЮ~3М, Активностьгяшеолатокоидааы ае изменялась в присутствии цианистого

■ кали* » концентрации 1,0х10~'м, Азид натрия, в этой концентрации |торм4ц^ окорооть окисления гликола»а йа 5-Ю^.

' ' ВЛИЯНИЕ ЭТИЛЕН-БИС-ДИГШКАШИАТШХ ФУНГИЦИДОВ НА ОКСИДОРЕДУКТАВЫ ??ЕДОСПОР р. дгапишз

Этилен-бис-дитиокарбаматы и» в чвотцоети, цинеб приме ниш с я ■как фунгициды защитного действия* поэтому изучение влияния этих .

препаратов на метаболизм уредоспор стеблевои рхазчшш пшеницы и особенно на ферментативные системы гриба приобретает особое значение. -

о-ДифенолоЕсидааа . £ таблице I приведены данные по влипни» эт иле и-бас-дитиокар-баматов на активность пе ри плазмат и че с ко И и эндоплазыатической . форм о-ДФО уредоспор.

Набам ингибирует активность о-ДФО сильнее всех исследованных фунгицидов, незначительно уступая по своему действии! лишь цианистому калию. Цинеб и слаборастворимые продукты его деградации также оказались ингибиторами фермента. Во всех случаях активность эндоплазматическоИ о-ДФО ингмбировалась слабее, чем пери-плазматической. "

Таблица I.

Концентрация этилек-бис-дктиокарбаматов и продуктов их деградации, подавляицан^активно^^ь о-дифено л оно ида эы уредо-

Соединение

Периплазматическая Эндоплазиатическая форма о-ДФО форма о-ДФО

Кон цент р В Ц К я

к

Набам 5x10 1,г5хЮ~5

Цинеб ІхІО"5 4хЮ"5

Этилентиурацдисульфид 1,8x10"^ 6 »25x10

Этилентиураммонооульфид 3,12x10"^ 6,25x10*^

Этилен-бис-изотяо- , , _5 „ ■ _5

цианат 1,6x10^ 2,8x10 '

Этнлентиомочевина 5,0x10"' 5,0x10

На рис Л представлена зависимость активности периплазмати-чесной о-ДФО от концентрации набаыа сразу после его синтеза и набамаі хранившегося в течение 10 суток при комнатной температуре Сразу после синтеза набам ингибировал активность о-ДФО вначнтвль-но сильнее, чем ыабам после хранения* Это, по-видимому, объясняется деградацией препарата и согласуется с данными, подученными р, опытах с ингибироваяиеы активности о-ДФО продуктами распада-этилен-бис-дитиокарбаматоз.

Набам тормозил скорость окисления пирокатехина сильнее,

- 12 -

чем зтилеядитиокарбаиат натрия.

РисЛ."Зависимость активности о-ДФО от концентрации фунгицидов,

1 - набей сразу после синтеза

2 - зтилендитиокарбанат натрия

3 - раствор набама через 10 суток после синтеза

Добавление ионов меди не влияло сушественно на торможение о-дифенолоксидааной реакции, набаиом. Увеличение концентрации пирокатехина снимало тормохение на 6-10%, Удаление набама с помощью диализа против 0,Ы фосфатного буфера рИ 7,0 в течение 5 суток . приводило к восстановлен»» 53% активности относительно контроля. Выделенная с помощь» препаративного электрофореза в ПАТ быстро-Движущаяся фракция о-ДФО на 38-40? сильнее ингибировалась набаиом, чем суммарный препарат фермента. Это говорит о различной чувствительности изофериентов о-ДФО к влияние набама, что согла-. суется с данными-о большей чувствительности периплазматической фракции о-ДФО к влиянию ингибиторов, чем это наблюдается в случае зндоллавматнчесхой формы, представленной,.главным образом, фракциями с низкой электрофоретической подвижность».

. . Каталаза и пероксидааа. • ,

Этилен-бис-дитнокарбаматы к продукты ихраспада ш.гибируют активность каталазы н пероксидаэы (табл.2,3).Как и в случае о-ДФО, активность периплазматических гемопротеиюв псдавгдется '

.Таблица 2.

Влияние этилен-бис-дитиокарбаматов и продуктов их деградации на активность каталазы уредоспор'( % ингмбирования при концентрации веществ 6,25x10

Не Соединения . .," риплазматическая . форма каталазы Эндоплааматичеокаи фориа каталазы

^'И н г ибирования

Набаы 55,2 40,0

Цинеб 48,2 20,0

Этилентиураидисульфид 40,2 10,2

3тилектиураммоиосульфид 15,4 7,0

Этилен-бис-изо- 50,0 15,3

тиоцианат

Этилентиомочевина * 5»0 5,1

сильнее, чей эндоплаэиатичесшх.Цри увеличении концентрации перекиси водррода или бензидина в 2 раза активность фермента в присутствии набама восстанавливается незначительно {&%), Добавление солей 2-х или 3-х валентного железа в реакционную среду не приводило к заметному восстановлению активности фермента. При удалении фунгицида о помощью диализа против дистиллированной воды в течение 3-х суток активность фермента восстанавливалась относительно контроля на 20-25>а.

Таблица 3.

Влияние этилен-био-дитиокарбаматов и продуктов их деградации на активность лероксидазы уредоспор.

Ш плазматическая йидоплаэматическая

^гда^ а« ет&рб-

_ция м вания_ция. Й вания

Набаи б.гзхю"6 85,2 6,25x10"^ 60,0

Цинеб 6,25Х10"6 40,4 3,15x10 60,0

Этилентиурам-

дисульфид 6,25x10"® 10,5 6,25x10** 70,2

Эталентиурам-

моносульфид 1,25x10*? 25,0 6,25x10 53,1

Этилев-бис-изо- 50,4

тиоцианат 1,50x10^ 4,40x10 45,4

Э тилектиоио че в ино | 2,00x10**' 30,0 2,00х10"3 5,1

- » -

Существенные различия в степени ингибирования каталаэы а пер оке идо зы уредоспор э т илен-бис-дитио кзрбамат ами не могут, быть поняты с точки зрения гипотезы о хелатировании ш металла, находящегося в активном центре фермента, так как в активном центре каталазы и пероксидазы находятся одинаковые простетические группы, представленные протопорферинои їх с железом а качестве до-норно-акцепторного центра. Для выяснения причин, обусловливавших эти различии, графическим методом был определен тип ингибирования активности каталаэы набаиом и флуоресцентным методом исследован механизм взаимодействия молекулы каталаэы и набаиа.

Графическим анализ кинетики наталазной реакции позволил уста н о бить, что иигибироввние набаиом (гхКГ^Н) происходит по смешанному типу.Влияние набаиа на каталазу проявлялось в снижении» максимальной скорости реакции и изменении сродства к субстрату;''

Очищенный препарат каталаэы имел спектр возбуждения с максимумом при длине волны, ривной 290 нм и спектр флуоресценции с максимумом - при 5^0 нм (рис.5 А^.

Только что синтезированный набам также.флуоресцировал ( Двоз0 т 310 нм, АЙСП.-365 нм). Спектр возбуждения и флуоресценции набама представлен*на рис. 5 При концентрации набама выше Ю~7Н наблюдали эффект концентрационного тушения.

При смешивании растворов каталазы и набаиа в близких полярных соотношениях спектр флуоресценции раствора изменялся (рис.5 Наряду с максимумом флуоресценции свободного'наба-

ма (365 ни) появлялся длинноволновый максимум Л = АОО-'»20 нм. Длинноволновый максимум наиболее четко проявлялся через 2-3 мин. после спешивания каталазы и набама.

Как известно, флуоресценция белков обусловлена присутствием в них трех ароматических аминокислот: триптофана, фенилаланина и тирозина. В связи с этим изучали спектры возбуздения и флуоресцен цми этих аминокислот в свободном состоянии и при введении в раствор аминокислоты набама.

Спектры триптофана и фенилаланина при добавлении чабана не изменялась, тогда как характер изменения спектра флуоресценции, тирозина в присутствии набаиа был сходен с таковыи каталазы (рис .5 А4,Ва).

На основании результатов, полученных при определении

фермента, и;пи ингибированкя и флуоресцентного анализа можно предположить, что в активном центре каталазы уредоопор присутствует тирозин.

■ Цитохромоксцдааа. Результаты изучения влиянии иабаыа на активность цитохроы-оксидазы представлены иа рис.6.

иГ ' " Л О*'. '

)<Внц1нПрОцик иымбнторй, М

Рио.б. Зависимость активности цнтохромоксидазы от концентрации набама. 50£-ное икгибироваиие активности цитохроиокеадазы наблюдали в присутствии иабаиа. По своей способности ингабиро-вать цгтохромоксидазу набам занимает промежуточное положение, уступая цианистому калию, но оказывая более «ильное влияние на активность фермента, чем азид натрия*

Ш'.неб и продукты его распада в концентрации не вли-

яли на активность цитохроыоксидазы. Действие труднорастворимых в водных растворах фунгицидов на нативнув цитохромоксидазу может оказаться более значительным вследствие липидного окружения фермента, Ингибируюаде действие набама, единственного из этой группы вецеств хороко растворимого в воде» указывает на возможность взаимодействия этилен-бис-дитиокарбаматов с активным центром фермента,

Гл;1 К С. лг т о си : е з а. При исследовании вл;;ян;:я эти ле н -би с -дат и ока рбаиат об про-

дуктов их распада на гли ко ла т ок снда з у было уатаноззлено, что эт.: вещества не ингибируют активность фермента, Более того, на Сам в концентрации ЗхЮ'^М оказывал некоторое стимулирующее действие на активность гликолатоксидази, Таким образом, эти лен-бис-дитио-карбаматы, оказывая сильное ингибирувдее действие на каталазу и пероксидазу уредоспор - ферменты, о с вобождашда ь клетки от перекиси водорода, - не влияют на активность гликолатокеидазы -фермента, продуцирующего перекись водорода в клетках.

ВЛИЯНИЙ'¡ШНТВАКСА И АК"ЛАТЛ НА АКТИВНОСТЬ ОКСИДОРЕДУКТАЗ УРЕДОСПОР, lío своему действию анилат и плантвакс отнооятся к фунгицидам искореняющего действия* Результаты изучения этих фунгицидов на периплазматические формы о-ДФО и пероксидаэи, ендоплазматическую форму каталазы, а также на активность цитохромоковдазы и гликол.-'то^сидазы уредоспор представлены в таблице

Таблица 4.

Влияние аиилата и плантвакоа на оясядоредуктааы уредоопор...

а и ■ и л а т_ п я а и д в а й, с _

Ферменты конценирац. % ингибиро- концентра«. у» ингибиро-___{MJ - ' вакия_[Mj_вакия

о-ДФО 5,0хЮ"3 45 1,0x10"^ 52

Каталаза 6,0хЮ~3 50 1,5x1o"4 50

Гликолатокси- ■*

даза 5,0x10 0,0 2,0x10^ 20

х Для перокоидазы ,цитохромоксидаан ингжбяроъашйя ¡ce о'я^^л-ьоГ

Анилат и плантвакс ингибирсвали активность о-ДФО и каталазы. Исследованные концентрации фунгицидов не оказывали существенного влияния на активность перонсидазы и цитохромоксидазы. Плентвако в концентрации 5хЮ~^М даже несколько активировал пероксидазную реакцию. Присутствие анилата не влияло на скорость реакции, катализируемой гликолатоксидазой, в то время как плантвакс ингиби-ровал активность этих ферментов. Таким образом» анилат к плант^ вакс различаются по механизму действия* Оба фунгицида оказались значительно менее сильными ингибиторами ферментативной активности уредоспор, 'чем этилен-бис-дитиокарбакаты.

- 18 -

Следует отметить, что при обработке втими препаратами проростков ливийцы (1?5 раотвором опрыскивали 5-ти, 6-ти и 7-днев-вые проростки) обнаружили,значительное увеяичение активности каталазн и перокоидазы в проростках,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Выоокая активность периплавматических ферментов и их отличие по ряду овойотв от вндоплазматических форм позволяет предположить, что эти ферменты выполняют неодинаковые биологичеокие функции в жизнедеятельности стеблевой ржавЧини пшеницы. Возможно, функции периплаэматичеоких ферментов заключаются в осуществлении первичных контактных процессов между паразитом и растениеи-ховкинсш и оолаблении ващитных барьеров последнего.

Так, феруловая кислота, в больших количествах накапливающаяся в листьях уотойчивых сортов пшеницы, тормоаит прорастание уредоспор стеблевой ржавчины, а метиловый афир феруловой кислоты является самоингибитором прорастания уредоспор {Macho ef а/-I97I). В то же время по панны денным, о-ДФО уредоспор способна скиблять феруловую кислоту. Согласно ВеосмельцезоЯ (1974)* такие субстрата о-ДФО» как кофейная и протокатеховая кислоты, ослабляют кнгибирующее действие феруловой кислоты. Таким образом, периплазматические ферменты, по-видимому, могут играть определенную роль в процессах прорастания уредоспор,

Периплазматическиеферменты подвергаются прямому воадейст — , вию фунгитоксичннх веществ. Этилен-бис-дитиокарбаматы даже в низких концентрациях ^подавляют активность этих ферментов и препятствуют выполнению ими жизневноважных функций, чем, В08М0ЖИ0, и объясняется высокая эффективность этилен-бис-дитиокарбаматных фунгицидов как фунгицидов защитного действий. Кроме того, проникая через внешнюю мембрану, этилен-бис-датиокарбаматы и продукты их деградации ингибирувт активность многих вндоплазмати-ческих ферментов, в том числе о-ДФО, каталазы, пероксадазыи аитохромоксидазы, что приводит к нарушениям в метаболизме уредоспор, в частности, в дыхании и феиольном обмене,

Ингибирсвание этиле н-бис-дитио карбаиатами активности ката-лазы а перокоидазы и отсутствие торможения гликодат оке ида зн ой : реакция способствует накоплению в уредоспорах перекиси водорода" - вещества, обладающего;высокой токсичностью.

Е Ы В О Д Ы t

1. Разработаны методы выделения и очистки окаидоредуктаэ уредоспорі цятохроиоисидаэы, о-дифенолокоидааы, пвроксидаэы, каталааы и глинолитоксидааы*

2. о-Дифенолоксидава, пероксидаза и катадаза представлены в уредоспорах» по крайней мере, двумя формами» периплавматичес

кой и эндоплазматичеокой» эти две формы существенно различаются по своим физико-химическим свойствам! фрикционному ооотаву, иэоэлектрическим точкамі субстратной специфичности, чувствительности к ингибиторам.

По своему ингиблрувдаму действию на окислительные форме нты уредоспор искореняющие фунгициды вначитальяо уступают фунгицидам защитного дейь££ия, при атом плантванс снижает каталитическую активность о-дифоколокакдазы, каталааы и уя и ко лат око и-даэы, а анцлат - о-дифеиолокоидааы и каталааы*

Ц. Набам и цннвб являются онльнымк ингибиторами металлсодержащих ферментов (о-дифеналоноидазы, пероксидазы, каталазы» цитохроыоксид&зы), Фяавопротеин * гли но лат о ковдаза не иигибиру-ется вт и ла н»би а-дитко ка рбамата ни.

5* В основе торможения каталазной реакции набамом лежит взаимодействие его а тирозином - амийокнолотой, входящей > состав активного центра фермента* ■ ■"'.■>

б* Продукты деградации волей этилен-бис-дитиокарбаминовой кислоты по своей способное*« ингибироваг* исследованные ферменты уступают набаму и шнебу*

7. Нахшшвм защитного действия цинеба на стеблевую ржавчи ну пг?і<\а включает ішгибироваїшв активности окислительных фар-центов ^ локализовавшие на клеточной отенке (пдршглаэматйчаеккх) вследствие чего4 могут происходить нарушения процессов проpacta ниа и внедрении паразита в ткань раота нкя-хоаяина• Угкыенив актийновти цитоплаэыатичешеих ферментов может приводить к серьезным нарушения« энергетического, фенольного и перешеного метаболизма уредовпорі

Іахергіалм диссертации опубликованы в следующих padotut

I. Механизм взаимодействия фунгицида Набама о каталазой уредоспор стеблевой ржавчины пшеницы (соавторы! Михеев Г»й*, ііочалкин A.M., Логннова Л.II,).Виофизика растений. Материалы

первого Всесоюзного сшшовиуыа по молекулярной и прикладной био-Иэике раотениЯі Краснодар, 1974, с.67-68. * ;

2. Влияние этилен-бис-дитиокарбаматных фунгицидов и продуктов их декомпозиции на окислительные ферменты уредоспор отеб-лпвой ржавчины пшеницы { Рисс)гу;а growrts Pen f THfrcj . Доклады ВАСХНЙЛ, Нз12, с.7-9,1974. (соавторы» Логинова Л.И., Мочалкин А*И.|Мочаякина К.И.,Хохлов П.С.).

3. Влияние новых системных фунгицидов на окислительные ферменты уредоейор ржавчины пненяцы. Бюллетень ВИЗР, .101, с.44-46 , 1974. (соавторы! Поляков И.М.»Логинова Л.Н.).

4« физиологические и биохимические оообенпости оксидоредук-таз уредоопор Ptsce/ґіїа oramin/s / ІїіҐіС/ . Бюллетень В№Р, »ЗІ, 0,61-63,1974. 7

5. Механизм действия и метаболизм пестицидов. Третий Всесоюзный бнохнынчеокий оъеад (Рига, октябрь J974). Рефераты научных докладов. Том 2. Рига, 1974. (соавторы! Богданова II.Б., Волокитина Ній.,8арубина м,А*,Зыкова С.II.«Карчик О.Н.Дасталь-ева Т.Б.,ЛоГваова Л.Н.,МаковеЙчукА,Ю.,Новожилов К.В., ПетроваТ.ТЛ.

6* Молекулярные механизмы дчйсткга иммунизирующих фунгицидов. ._.... ХП Международный Ботанический конгресс.Тезисы секционных докладовіСекция 15«Ленинград»1975,(соавторы:Богдош>ли Н.ЯІ,Поляков И.ИцйаруОвна М,А,,ВыкотС,Н. »Касталмиа Т.Е., Карчи к О.Н., Логинова ЛІНІ(Соколовская Е.Л.).

Заям 490, Тир: 200. «кв. 14.05,1975г. бесплатно

Институт уоов»ршвнствования слідоваг«л«й, Ротапринт