Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительная модификация липопротеинов низкой плотности и пути ее фармакологической протекции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительная модификация липопротеинов низкой плотности и пути ее фармакологической протекции"

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

1 .'.Г-Г V - ^ СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

! Г. >"- - •

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

Пивоварова Елена Николаевна

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ И ПУТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОТЕКЦИИ

03.00.04 - бИОХИКИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1996

\

Работа выполнена в лаборатории экспериментальных моделей атерогенеэа Инсштута терапии СО РАМН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

академик РАМН, профессор Ю.П. Никитин

кандидат медицинских наук М.И.' Душкин

доктор медицинских наук, профессор В.И. Феденков кандидат биологических наук И.Ф. Усынин

Ведущая организация: Кардиологический научный центр

РАМН, г.Москва

Защита состоится " " 1996 года в часов

на заседании диссертационного совета К 001.37.01 Института биохимии СО РАМН по адресу: 630117 Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "41" И/' 1996 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Г. Филатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы были получены убедительные доказательства,того что окисленные формы липопро-теинов низкой плотности (ЛНП) играют важную роль в инициации и развитии атеросклероза (Estenbauer et al., 1991; Estenbauer et al., 1992). Однако, несмотря на интенсивные исследования in vivo, доказывающие несомненное участие окисленных ЛНП в патогенезе атеросклероза, механизмы клеточного окисления ЛНП остаются на данный момент недостаточно изученными.

Было показано, что все типы клеток, присутствующие в атероме (зндотелиальные, гладкомышечные, моноциты и макрофаги) способны осуществлять окислительную модификацию ЛНП. Однако доминирующую роль на ранних этапах атерогенеза играют макрофаги (МВ), трансформированные в субэндотелиалыюм пространстве из моноцитов 1фови (Yla-Herttuala, 1991).

Известно, что в организме человека в процессе жизнедеятельности постоянно образуются активные кислородные метаболиты (АКМ), такие как супероксидный анион, гидроксильныи и нитроксильный радикалы, перекись водорода и другие. Участие АКМ в инициации окисления ЛНП на сегодняшний день не вызывает сомнений. В генерации АКМ могут участвовать следующие ферментативные системы фагоцитов:

- НАДФН-оксидазная (Klebanoff, 1992; Segal,Abo, 1993),

- липоксигеназная (Nasclmento, Gilento, 1991),

- NO-синтетазная (Darley-Usmar et al., 1992),

- миелопироксидазная (klebanoff, 1992),

- ксантиноксидазная (Grum et al., 1990),

- монооксигеназная (Sevanian et al., 1990; Bagchi et al., 1993).

Альтернативны}/ путем окисления ЛНП может являться реакция Фентона, в которой сильный оксидант гидроксильныи радикал образуется в реакции взаимодействия перекиси водорода со свободными ионами железа или меди (Klebanoff, 1992).

Участие некоторых из этих систем в окислительной модификации ЛНП уже изучено. Так показано, что активация МО-син-тетазы и синтеза нитроксильных радикалов в Щ> снижает способность клеток окислять ЛНП ^езэир еЬ а1., 1992). Ксанти-ноксидазная и миелопироксидазная системы имеются только в моноцитах, в Ш> они отсутствуют или присутствуют в очень низких концентрациях (К1еЬапоГГ, 1992). В отношении липокси-геназной и НАДФН-оксидазной систем в литературе имеются достаточно противоречивые данные. Участие монооксигеназной системы в окислительной модификации ЛНП, а такие вклад ОН-ради-калов в этот процесс в литературе не представлено вовсе.

Согласно косвенным литературным данным, кроме ферментативных систем в клеточно-зависимом окислении ЛНП могут также принимать участие аденилатциклазная система и система транспорта кальция. Хотя литературные данные о их вкладе в этот процесс отсутствуют.

Определенный интерес в изучении окислительной модификации ЛНП представляет также вопрос о возможности регуляции этого процесса стероидными гормонами и окисленными производными холестерина (ХС) оксистеролами.

Настояшдя работа посвящена изучению механизмов клеточно- зависимого окисления ЛНП и поиску эффективных путей протекции этого процесса.

Целью настоящей работы является изучение роли некоторых метаболических систем макрофагов в окислительной модификации липопротеинов низкой плотности и поиск новых эффективных соединений, блокирующих этот процесс.

Задачи исследования.

1. Используя различные активаторы и ингибиторы изучить роль следующих метаболических систем макрофагов в окислительной модификации ЛНП:

- НАДН-оксидазной системы,

- липоксигеназной системы,

- системы цитохром Р-450-зависимых ферментов,

- аденилатциклазной системы,

- системы транспорта кальция.

2. Изучить влияние эндогенных стероидов различной структуры (оксистеролов и некоторых стероидных гормонов) на окислительную модификацию ЛНП.

3. Изучить действие природных (полифенольные соединения растении) антиоксидантов на макрофаг-зависимое окисление ЛНП.

Научная новизна. Наряду с исследованиями, которые нашли свое подтверждение в научной литературе, большинство данных было получено нами впервые.

Впервые была показана взаимосвязь индукции цитохром Р-450-зависимых энзимов с окислительной модификацией ЛНП, а такяе протекция этого процесса ингибитором широкого спектра Fe-содержащих ферментов - кетсконазодоы.

Хотя протеютшная роль гормона эпифиза мелатонина при таких патологиях !?ак рак, старение, последствия радиоактивного облучения и т.д. была продемонстрирована ранее, нами впервые была показана его способность снижать перекисное окисление ЛНП в различных системах.

Впервые было продемонстрировано, что некоторые из оксистеролов (окисленных производных холестерина, накапливающихся в атеросклеротической бляшке) могут оказывать модулирующее влияние на клеточно-зависимое окисление ЛНП.

Впервые было показано, что одним из механизмов антиате-рогенной активности антагонистов кальция вераламила и нифе-дипина является их способность блокировать макрофаг-зависимое окисление ЛНП.

Впервые на культуре макрофагов было продемонстрировано протективное действие стимулятора аденилатциклазной системы - форскалина.

Хотя в литературе ранее были описаны протективные свойства полифенольных соединений растений, в данной работе впервые было изучено антиоксидантное действие фенольных соединений некоторых растений Сибири - манкетки обыкновенной (Alchimilia vulgaris L.) и шиповника коричного (Rosa majalis Herrm.).

Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое значение данной работы состоит в выяснении некоторых механизмов макрофаг-зависимой окислительной модификации ЛНП. Так, полученные данные о стимуляции окисления ЛНП в индуцированных бенз(а)пиреном макрофагах говорят о возможном участии ксенобиотиков в развитии атеросклеротичес-кого процесса. При этом ингибитор цитохром Р-450-зависимых ферментов кетоконавол, действие которого основано на связывании свободного и составляющего комплексы с белком железа, существенно снижал окисление ЛНП в макрофагах. Откуда следует, что Ре-содержащие ферменты макрофагов могут играть значительную роль в процессе клеточно-зависимого окисления ЛНП. Эксперименты с мелатошшом (эффективным скэвенджером ОН-ра-дикалов) показали, что в условиях выхода свободного железа во внеклеточное пространство (например при воспалении) существенную роль в макрофаг-зависимом окислении ЛНП могут играть ОН-радикалы. Данные об ингибирующем действии активаторов аденилатциклазы и антагонистов кальция позволяют также предположить участие этих систем в клеточно-зависимой модификации ЛНП. В целом, полученные нами результаты позволили расширить представления о возможных механизмах макрофаг-зависимой окислительной1модификации ЛНП.

Практическое значение настоящей работы заключается в изучении ряда природных и искусственных протекторов окисления ЛНП. Выявлено, что полифенольные соединения растений Сибири (манжетки обыкновенной и шиповника коричного) обладают высокой антиоксидантной активностью и могут быть использованы в терапии атеросклероза. Обнаруженный нами протективный' эффект некоторых фармакологических препаратов, таких как ве-рапамил, нифедипин и форскалин также позволяет рекомендовать их применение в качестве антиатерогешшх препаратов. Полученные нами положительные результаты в отношении действия гормона эпифиза мелатонина на макрофаги, находящиеся в состоянии окислительного стресса, позволяют рекомендовать препарат этого гормона для фармакологической протекции атеросклероза, развивающегося на фоне окислительного стресса.

На защиту выносятся следующие положения:

Индукция бенз(а)пиренгидроксилазы бенз(а)пиреном приводит к усилению окислительной модификации ЛНП, в то время как ингибиторы системы цитохром Р-450-зависимых ферментов нивелируют этот процесс.

Некоторые оксистеролы могут участвовать в регуляции процесса окислительной модификации ЛНП.

Такие фармакологические соединения как антагонисты кальция верапамил и нифедипин, активатор ц-АШ> форсколин, а также фенольные соединения растений могут быть эффективными протекторами ЬФ-зависимого окисления ЛНП.

Апробация работы. Основные положения и выводы данной диссертационной работы были доложены на VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994) и Симпозиуме посвященном 110-летию со дня рождения академика H.H. Аничкова "Липопротеиды и атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Данная работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 23 рисунка и состоит из введения, литературного обзора, описания собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты и их обсуждения, а также выводов и списка литературы, состоящего из 217 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. ЛНП (1,02-1,063 г/мл) выделяли методом ультрацентрифугирования, очищали от КВг методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. 1251-ЛНП (удельная радиоактивность 50-80 имп/мин на мг белка) получали используя 125NaI (Bilheimer, 1972). Йодирование было проведено старшим научным сотрудником Института биохимии СО РАМН Л.М. Поляковым. Макрофаги получали из перитонеальной полости нес-тимулированных мышей линии C57B1/6J и культивировали в

-7-

24-луночных планшетах (Flow-lab) из расчета 106 клеток на лунку в среде RFMI-1640, содержащей 50 мкг/мл гентамицина и 1 мкМ C11SO4. Клеточное окисление ЛНП осуществляли преинкуба-цией МФ в присутствии ЛНП (0,2 мг/мл среды) в течении 24 часов в атмосфере 5Z СО2 и при температуре 37 С (Steinberg et al., 1989; Rankin, Jessup et al., 1992). Аутоокисление ЛНП (0,2 мг/мл среды) осуществляли преинкубацией в среде Дуль-бекко бее Ca и Mg, содержащей 10 мкМ CUSO4 при 37 С в течении разных периодов времени. Окислительная модификация ЛНП определялась тремя различными методами:

а) определением МДА флуориметрическим методом (Schuh et al., 1978);

б) определением деградации 1251-меченых ЛНП в свежей культуре № (Steinbrecher et al., 1984);

в) определением миграции ЛНП в 0.5Z агарозном геле.

Генерацию АКМ в резидентных опсонизированных зимозаном

(1мг/мл) МФ регистрировали:

а) по восстановлению нитросинего тетразолиевого синего (Rook et al., 1987), определение было выполнено совместно с сотрудником ИОПиЗЧ Шварцем Я.Ш.;

б) регистрируя ХЛ в присутствии люцигенина на хемилюми-нометре "Фотон, определение ХЛ было выполнено совместно с сотрудниками ИОПиЭЧ Зенковым Н.К. и Менщиковой Е.Б.

Индукцию бенз(а)пиренгидроксилазы К® проводили при инкубации МФ-ов в присутствии 4мкг/мл бенз(а)пирена в течении 24 часов и оценивали, регистрируя активность бенз(а)пиренгидроксилазы (Dehnen et al., 1973). Определение индукции и активности данного фермента было выполнено совместно с сотрудником ИМ Любимовым Г.Ю.

Стимулированные in vivo № получади через 24 часа после внутрибрюшинного введения зимозана (2 мг/мышь).

Полифенольные соединения были получены из корней и листьев манжетки обыкновенной и шиповника коричного путем экстракции с помощью органических растворителей по методу, разработанному Г.Р. Азовцевым (Азовцев, 1969).

При исследовании влияния гидрофобных соединении на окисление ЛНП, препараты растворяли в этаноле и вводили в растворе из расчета не более 5 мкл/мл среды. В контрольные лунки вводили соответственно эквивалентное количество этанола.

Клеточный белок и белок ЛНП определили по методу Ьо*гу (Ьо*ггу еЬ а1., 1951).

Статистическую обработку данных 3-5 экспериментов проводили используя Ь-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Хорошо известно, что зимозан является стимулятором генерации супероксидных радикалов в К® (Маянский и др., 1992) in vitro и стимулятором асептического воспаления при внут-рибрюшинном введении. Используя зимозан, а также фермент су-пероксиддисмутазу (СОД), мы исследовали возможное участие супероксидных анионов в MD-зависимой модификации ЛНП. Данные представленные на рис.1.демонстрируют, что МФ, полученные после внутрибрюшинного введения зимозана, обладали сниженной способностью окислять ЛНП (на 66 7. по сравнению с контролем). Добавление зимозана к нестимулированным МФ в концентрации 100 мкг/мл не вызывало достоверных изменений в накоплении МДА в ЛНП и в деградации 1251-меченных ЛНП в свежей культуре Ш-ов. В концентрации 500 мкг/мл зимозан вызывал снижение этих показателей. Инкубация нестимулированных К® с СОД приводила к достоверному снижению окисления ЛНП примерно на 30 % от контрольного уровня, но не оказывала влияния на деградацию 1251-ЛНП. Полученные в культуре резидентных М5 данные хорошо согласуются с результатами Jessup et al., 1993 и Wilkins et al., 1994, которые показали, что некоторые стимуляторы НАДФН-оксидазы (такие как зимозан, липополисахариды и др.) не оказывают существенного влияния на окисление ЛНП в МФ.

in vivo

in vitto

1=1

К к I 2 3

Зимозан

Рис. I Влияние предварительного внутрибрюшинного введения зимозана (in vivo) и добавление зимозана и СОД к клеточной культуре резидентных макрофагов ( In vitro) на окислительную модификацию ЛНП (М - m , п = 4) К - контроль, I - добавление зимозана (100 мкг/мл),

2 - добавление зимозана (500 мкг/мл),

3 - добавление СОД (50 мкг/мл).

- 10 -

Рис. 2 Влияние мелатонина на окисление ЛНП в резидентных Ш (кривая I) и в преинкубированных с 50 мкМ в течение четырех часов (кривая 2). По оси

абсцисс - концентрация мелатонина в мкМ. Достоверность отличия от контроля (инкубации в отсутствии мелатонина): « Р<0,05; л « Р < 0,01 (п = 4, М - ш).

Известно, что гормон эпифиза мелатонин обладает антиок-сидантной способностью инактивировать ОН-радикалы. Для того, чтобы изучить роль ОН-радикалов в окислении ЛНП, мы исследовали влияние мелатонина на окисление ЛНП в культуре резидентных МФ и МФ, предварительно инкубированных с 50 мкм Fe-SO4 (Fuhrman et al., 1994). Результаты, представленные на рис.2, свидетельствуют о том, что при окислении ЛНП резидентными макрофагами мелатонин оказывает слабое влияние на накопление МДА в этих частицах. Преинкубация МФ-ов с FeSÛ4 приводила к значительному (в 2,5 раза) увеличению способности клеток окислять ЛНП. В этих условиях мелатонин дозозави-симо (50-2000 мкМ) сникал окисление ЛНП. Полученные результаты говорят о том, что в условиях окислительного стресса (преинкубация клеток с FeS04) индукция окислительной модификации ЛНП может быть связана с генерацией ОН-радикалов.

Одним из возможных механизмов активации АКМ может также являться индукция цитохром Р-450-зависимых ферментов (Bagchi et al., 1993) и, как следствие, усиление окислительной модификации ЛНП. В наших экспериментах мы исследовали влияние некоторых стимуляторов и ингибиторов Р-450-зависимых ферментов на этот процесс . Как видно на таблице 1, индукция бенз(а)пиренгидроксилазы в МФ после 24 часов инкубации клеток с бенз(а)пиреном сопровождалась достоверным увеличением окисления ЛНП и деградации 1251-меченных ЛНП в свежей культуре МФ-ов. Ингибиторы Р-450-зависимых ферментов метоксален и а-на&тафлавон в нетоксичных для клеток концентрациях снижали как окисление, так и деградацию 125I-меченных ЛНП до контрольного уровня (уровня инкубации ЛНП в культуре нести-мулированных МФ-ов). Ингибитор широкого спектра Fe-содержа-щих ферментов, кетоконазол, снижал эти показатели даже ниже контрольного уровня. Полученные, результаты говорят о возможном участии индуцибильных цитохром Р-450-зависимых ферментов в окислительной модификации ЛНП.

Таблица 1 Влияние ингибиторов цитохром Р-450-зависимых ферментов на окислительную модификацию ЛНП в культуре индуцированных бенз(а)пиреноы макрофагов (М+ш, п=3)

N Условия инкубации ТБКРП Деградация ЛНП

(нМ МДА/мг (мкг 1251-ЛНП/ белка ЛНП) иг клеточного белка за 5 ч)

1 Неинкубированные ЛНП + 1.9 0.29 + 0.1

2 ЛНП, инкубированные 14.3 + 2.7 0.74 + 0.3 без клеток

3 ЛНП, инкубированные с неин- 49.2 + 2.4 5.76 + 0.8 дуцированными К®

4 ЛНП, инкубированные с инду- 69.4 + 3.6* 11.44 + 3.2* цированными бенз(а)пиреном №

5 ЛНП, инкубированные с инду- 40.9 + 2.3** 4.86 + 1.2** цированными бенз(а)пиреном К®

+ 22.5 мкМ кетоконазола

6 ЛНП, инкубированные с инду- 26.1 + 2.4** 2.57 + 0.9** цированными бенз(а)пиреном МБ

+ 37.5 мкМ кетоконазола

7 ЛНП, инкубированные с инду- 52.6 + 3.6** 6.37 + 4.2** цированными бен8(а)пиреном №

+ 20 мкМ метоксалена

8 ЛНП, инкубированные с инду- 46.8 + 2.6** 6.31 + 3.9** цированными бенз(а)пиреном М$

+ 50 мкМ а-не^тафлавона

Примечание: * достоверность отличий между 3 и 4 (Р < 0.01);

** достоверность отличий между 4 и 5-8 (Р < 0.05)

50

40-

30

20-

10

10

—г-20

30

40 50

80 мкМ

Рис. 3 Влияние ингибиторов цитохром Р-450-зависимых ферментов на окисление ЛШ в резидентных макрофагах. ЛШ (200 мкг/мл) инкубировались с Ш 24 часа при 37°С в присутствии кетоконазола ( О ), метиралона ( □ ), метоксалена ( О ) и «¿-нафтафлавона ( О ). Пунктирной линией обозначен уровень ТЕКРП в ЛШ, инкубированных без клеток. По оси абсцисс - концентрация ингибиторов в мкМ. ж достоверность отличия от контроля (Р < 0,001), (П = 4, М ± т).

Исследование влияния ингибиторов цитофром Р-450-зависи-мых энзимов на окисление ЛНП в культуре нестимулированных МФ-ов показало, что метирапон, метоксален и а-нафтафлавон не оказывали существенного влияния на окисление ЛНП, в то время как кетоконазол дозозависимо снижал содержание ЩА в ЛНП (рис.3). Наряду с этим кетоконазол эффективно снижал аутоо-кисление ЛНП в присутствии ионов железа, но не влиял на этот процесс в присутствии ионов меди. Кетоконазол также ингиби-ровал как спонтанную, так и зимозан-стимулированную ХЛ в резидентных к® (данные представлены в диссертации). Основываясь на полученных данных можно предположить, что протекторный механизм действия кетоконазола связан с образованием хелатных комплексов с ионами железа и ингибированием тем самым Ге-содержат}« ферментов в МФ, участвующих в генерации АКМ.

Известно, что мощными регуляторами клеточного метаболизма являются стероидные гормоны. Однако их роль в процессе окислительной модификации ЛНП является недостаточно изученной. В настоящей работе мы исследовали влияние четырех стероидных гормонов на окисление ЛНП в культуре МФ и в бесклеточной среде в присутствии ионов меди (рис.4). Исследования показали, что этинилэстрадиол и гидрокортизон в фармакологических концентрациях снижали окисление ЛНП в культуре резидентных МФ, в то время как прогестерон и тестостерон такого действия не оказывали. При тестировании перечисленных выше гормонов в бесклеточной среде, содержащей ионы меди, было обнаружено, что только этинилэстрадиол эффективно дозозависимо снижал окисление ЛНП (данные представлены в диссертации). Известно, что среди стероидных гормонов человека и животных только этинилэстрадиол обладает уникальной химической структурой, имея в своем составе бензольное кольцо. По-видимому, именно эта особенность строения данного гормона лежит в основе его антиоксидантного действия (Зенков и др., 1993). Поскольку в наших экспериментах гидрокортизон не оказывал существенного влияния на аутоокисление ЛНП, действие этого гормона, обладающего противовоспалительным эффектом, по-вн-

Культура макрофагов

ю мкг/мл

Рис. 4 Влияние стероидных гормонов (гидрокор-тизояа □ , атинилэстрадиола О , прогестерона ®и тестостерона Ш ) на окислительную модификацию ЛШ в культуре перитонеальных макрофагов мыши. Достоверность отличия от контроля: * Р < 0,05; + * Р < 0,001 (М £ т, п = 4).

юоЬ

Q

Рис.5 Влияние оксистеролов (7-кетоХС □ ; 25-ОНХС О ; 7-ОНХС Я ; 22-ОНХС 9 ) на окисление ЛШ в макрофагах. По оси абсцисс - концентрация оксистеролов в мкг/мл.* достоверность отличия от контроля Р < 0,05 (М ± т, п — 4),

димому связано с ингибированием генерации АКМ в Ш>.

Одним из классов стероидных соединений, обладающих высокой биологической активностью, являются окисленные производные холестерина (ХС) - оксистеролы (Smith, Johnson., 1989). В последнее время было показано, что некоторые оксистеролы внутриклеточного происхождения (такие как 25-,27-ОНХС и образующийся в результате внеклеточного окисления ЛНП 7-кетоХС), накапливаются в значительных количествах в ате-росклеротических повреждениях сосудистой ткани (Bjorkhem et al., 1994) и могут играть существенную роль в процессе ате-рогенеза. В данной работе мы исследовали влияние некоторых оксистеролов на окислительную модификацию ЛНП в №. Данные, представленные на рис.5 показывают, что 25-ОНХС дозозависимо стимулировал, а 7-кетоХС ингибировал окисление ЛНП в резидентных Щ>, в то время как 22-ОНХС и 7-ОНХС не оказывали существенного влияния на этот процесс.

Большое значение в регуляции метаболизма клеток имеет аденилатцикдазная система. В последние годы было показано, что стимуляторы биосинтеза цАШ> могут тормозить развитие пенистых клеток и способствовать выведению ХС при участии ли-попротеинов высокой плотности (Etingen, Hajjar, 1985). В наших экспериментах мы использовали известный стимулятор аде-нилатциклазы форскалин и дибутирил ц-AMi. Как показано на рис.6, форскалин в относительно низких концентрациях (1-100 мкМ) эффективно ингибировал окисление ЛНП в К®, дибутирил ц-АШ> (в концентрации 1 и 2 мМ) обладал подобным эффектом. Полученные результаты говорят о возможном участии аденилат-циклазной системы в протекции УФ-зависимой окислительной модификации ЛНП.

В последние годы стало известно, что некоторые антагонисты кальция могут проявлять антиатерогенную активность, снижая образование атером в сосудах, не оказывая при этом существенного влияния на липопротеиновый обмен в русле крови (Kjeldsen, Stender, 1989). В наших экспериментах на культуре Ш> нифедипии дозозависимо снижал образование ЩА в ЛНП (рис.7). Верапамил в концентрации 50 мкМ также достоверно

Таблица 2 Влияние ПХС (полифенольных соединений) растений и БГТ на окислительную модификацию ЛШ в культуре ПМ (М+т. п«3)

N Условия инкубации Концент- ТБКРП Деградация ЛНП

рация (нМ МДА/мг (мкг 1251-ЛНП/

антиокси- белка ЛНП) мг клеточного дантов белка за 5 ч)

1 Неинкубированные ЛНП 1,4 + 0,8 0,4 + 0.2

2 ЛНП, инкубированные 15,3 + 2,1 0,6 + 0,2

без клеток

3 ЛНП, инкубированные с 48,7 + 2,9 4,0 + 0,6

ПШ

4 ЛНП, инкубированные с 10 мкг/мл 29,6 + 3,8* 1,5 + 0,4"

ПШ + ПК из листьев 50 мкг/мл 15,1 + 2,6* 1.0 + 0,2"

манжетки

5 ЛНП, инкубированные с 10 мкг/мл 21,4 + 2,8* 0,9 + 0,2"

ПШ + 1ЙС из корня 50 мкг/мл 11,3 + 0,4" 0,5 + 0,1*

манжетки

6 ЛНП, инкубированные с 10 мкг/мл 25,3 + 3,6* 1,2 + 0,4*

ПШ + ПФС из шиповника 50 мкг/мл 12,5 + 0,9" 0,7 + 0,2*

7 ЛНП, инкубированные с 50 мкМ 30,1 + 4,1" 1,9 + 0,5*

ПШ + токоферол 100 мкМ 20,4 + 2,2" 1,4 + 0,4*

8 ЛНП, инкубированные с 10 мкМ 20,8 + 2,4" 0,9 + 0,4*

ПММ + БГТ 20 мкМ 16,2 + 1,9* 0,6 + 0,2*

Примечание: * р < 0,05 по сравнению с ЛНП, инкубированными с ПММ.

ДШТИРИД-цАМ»

ФОРСКАЖН

ю о

0.5 1 2

1 10 50 100 МКМ

Рио. б Влияние стимуляторов цШ на окисление ЛШ в макрофагах. По оси ординат - концентрация препаратов в инкубационной среде. Достоверность отличия от контроля: * Р < 0,05; * * Р < 0,01 ( Ы ± т, п = 3

Беа о 25 50 75 100 25 50 75 МО 20 мкИ клеток

Рис. 7 Влияние антоганнстов кальция вераламила и нифедашна на окислительную модификацию ЛНП I—I и восстановление нитротетразолиевого синего (НСТ-тест) евяю в культуре перитонеальных макрофагов мыши. К - контроль. Достоверность отличия от контроля: * Р < 0,05; * * Р < 0,01 (Ы ± и, п = 3).

снижал окисление ЛНП, однако дальнейшее повышение концентрации этого препарата не приводило к существенным изменениям уровня МДА в ЛНП. Как видно на рис.7, антиоксидантный эффект изученных антагонистов кальция коррелировал с их способностью сникать восстановление НБТ в вимозан-активированных К®. Полученные данные говорят о том, что одним из возможных антиатерогенных механизмов действия антагонистов кальция может быть их способность ингибировать генерацию АКМ и, как следствие, вызывать снижение окислительной модификации ЛНП.

Одним из подходов антиоксидантной терапии при атеросклерозе может быть использование полифенольных соединений растений (ПФС), обладающих в силу своей структуры свойствами ловушек АКМ (Зенков и др., 1994). В настоящей работе были изучены свойства ПФС из некоторых растений Сибири - шиповника коричного и манжетки обыкновенной. ПФС данных растений в фармакологических концентрациях оказались эффективными протекторами окисления ЛНП как в культуре К® (таблица 2), так и в бесклеточной системе в присутствии ионов меди (данные представлены в диссертации). Необходимо отметить, что ПФС растений, особенно ПФС из корня манжетки, обладали более выраженным протективным действием по сравнению с высокими концентрациями а-токоферола (50 и 100 мкМ). Полученные данные позволяют рекомендовать изученные соединения растительного происхождения в качестве новых средств в терапии атеросклероза.

Таким образом, проделанная нами работа позволила выявить некоторые ранее неизученные механизмы МФ-зависимого окисления ЛНП, а также рекомендовать в качестве антиатерогенных препаратов соединения, механизм действия которых может быть связан с активацией аденилатциклазной системы, с ограничением входа кальция в клетку, а также вещества, обла-дазядае выраженным антиоксидантныы действием, такие как поли-фенольные соединения растений.

выводы

1. Добавление зимозана в среду инкубации резидентных МФ-ов не влияло на окислительную модификацию ЛНП, а добавление супероксиддисмутазы снижало этот процесс на 30X. Макрофаги, полученные через 24 часа после предварительного внут-рибрюшинного введения зимозана обладали даже сниженной способностью окислять ЛНП.

2. Гормон эпифиза мелатонин оказывал слабое влияние на окисление ЛНП в культуре резидентных макрофагов. Однако после преинкубации макрофагов с ионами железа, мелатонин эффективно дозозависимо снижал окисление ЛНП.

3. Индукция бенз(а)пиренгидроксилазы бенз(а)пиреном в макрофагах сопровождалась усилением сгагслительной модификации ЛНП. В то же время добавление ингибиторов цитохрсм Р-450-зависимых ферментов (кетоконазола, метоксалена и а-нафтафлавона) вызывало снижение окисления ЛНП до уровня неиндуцированных 1.0-ов.

4. В культуре резидентных макрофагов только кетоконазол эффективно дозозависимо снижав окислительную модификацию ЛНП, а также спонтанную и зимозан-стимулированную люциге-нин-зависимую хемилюминесценцгао . Обнаруженная нами способность кетоконазола ингибировать окисление ЛНП в присутствии ионов железа, но не ионов меди свидетельствует о том, что антиоксидантное действие этого препарата может быть связано с образованием хелатных комплексов с нонами железа.

5. Среди изученных нами стероидных гормонов эффективной способностью снижать окисление ЛНП в культуре резидентных макрофагов обладали этинилзстрадиол и гидрокортизон, в то время как в бесклеточной системе только этинилзстрадиол препятствовал окислению ЛНП.

6. При исследовании некоторых окисленных производных холестерина было обнаружено, что 25-ОНхолестерол ингкбиро-вал, а 7-кетохолестерол стимулировал окисление ЛНП в культуре макрофагов.

7. Добавление дибутирил-цАМЕ и форскалина в среду инкубации резидентных макрофагов приводило к эффективному снижению окисления ЛНП , что говорит о том, что повышение внутриклеточного уровня цАК© может приводить к снижению способности клеток окислять ЛНП.

8. Обнаруженная нала! эффективная способность антоганис-тов кальция верапамила и нифедипина блокировать окисление ЛНП в культуре макрофагов может лежать в основе одного из механизмов антиатерогенного действия этих препаратов.

9. Высокой способностью блокировать окисление ЛНП как в культуре макрофагов, так и в бесклеточной системе в присутствии конов меди обладали полкфенольные соединения растений Скб5фн (манжетки обыкновенной и шиповника коричного) , что позволяет рекомендовать использование этих соединений для более детального изучения как перспективных антиатерогенных препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Душкин М.И., Бросалина И.И., Пивоварова Е.Н. Образование окисленных производных холестерина при окислении ли-попротеинов низкой плотности и их влияние на биосинтез эфи-ров холестерина и триглицеридов в макрофагах // VI симп. биохимии липидов: тезисы докл. - Санкт-Петербург.- 1994. - С. 34-35.

2. Душкин М.И., Верещагин Е.И., Гребеньщиков А.Ю., Са-фина А.Ф., Пивоварова ЕЛ., Никитин Э.П. Роль окисленных производных холестерина в нарушении липидного обмена в макрофагах при их трансформации в пенистые клетки // Липопроте-иды и атеросклероз: Тез. докл. симп., посвященного 110-летию со дня рождения акад. Н.Н. Аничкова. - Санкт-Петербург.-1995. - С. 36.

3. Пивоварова Е.Н., Душкин М.И., Рагино Ю.И., Никитин Ю.П. Фармакологические подходы к протекции окислительной модификации липопротеинов низкой плотности // Липопротеиды и атеросклероз: Тез. докл. симп., посвященного 110-летию со дня рождения Н.Н. Аничкова. - Санкт-Петербург.- 1995. - С. 80.

4. Душкин М.И., Зыков А.А., Пивоварова Е.Н. Влияние природных полифенольных соединений на окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности // Бвлл. экспер. бнол. мед. - 1993. - T. СХ 1, N.10. - С. 393-395.

5. Dushkin M.I., Zenkov N.K., Menshikova Е.В., Pivova-rova E.N., Lyubinov G.Yu., Volsky N.N. Ketoconazole inhibits oxidative modification of low density lipoprotein // Atherosclerosis. - 1995. - V.114. - P. 9-18.

6. Душкин М.И., Зенков U.K., Менщикова Е.Б., Пивоварова E.H., Любимов Г.Ю., Вольский Н.Н. Влияние иигибиторов цитох-рома Р-450 на окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности // Вопр. мед. химии. - 1996. - Т.42, N.1. - С. 23-29.