Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОЧИСТКА ВИРУСОВ М И N КАРТОФЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ОЧИСТКА ВИРУСОВ М И N КАРТОФЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ"

/ -ьт

Академия наук Эстонской ССР Совет по биологическим наукам

На правах рукописи

ХЁДИЯРВ УЛРЙХ ГУСТАВОВИЧ

ОЧИСТКА ВИИГСОВ и и н КАРТОФЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОЮХ ИХ ФИЗИКО-ШИЧЕСКИХ свойств

(Диссертация написана наэстонекои языке) " 03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Таллин 1973

Акадеиия наук Эстонской ССР Совет по биологическим наукам

На правах рукописи

ХЁДРЕЯРВ УЛРЕХ ГУСТАВОВИЧ

ОЧИСТКА ВИРУСОВ Ы И ЕТ КАРЮТЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОШХ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ свойств

(Диссертация написана на эстонском языке) 03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

"^нтШцй—■

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. P'/u-iOsOJ анадамим им. К. Ай'1и>.иряэвэа

йнв. №/:Ж1

Работа выполнена в секторе вирусологии Института экспериментальной биологи* Академии наук Эстонской ССР.

рукопись содержит 148 страниц машинописного текста обычного формата, 15 таблиц и 46 рисунков. Список использованной литературы включает 147 наименований работ советских и зарубежных авторов.

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук Б.X„НУРМЙСТЕ

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,профессор В.В.ТИЛГА, кандидат биологических наук Х.Э.КАРИС, Ведущее учреждение - Эстонский научно-исследовательский институт земледелия и мелиорации.

Автореферат разослан "¿■О* февраля 1973 г. Защита диссертации состоится МЛ," марта 1973 г. в A4.no час. на заседании Совета по биологическим наукам Академии наук Эстонской ССР в г.Тарту, ул.Фр.Р.Крейцвальда, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института зоологии и ботаники АЕ ЭССР /г.Тарту,уя.Ванемуйне,21/.

Отзывы просим присылать по адресу: Эстонская ССР,г.Таллин - 200103, ул.Кохту,6. Президиум Академии наук Эстонской ССР, Совет по биологическим наукам.

Ученый секретарь совета

О Л.ПАРМАСТО

Вирусные заболевания культурных растений получают все более широкое расоространение и значительно снижают их урожаи, Особенно сильно страдают от вирусов вегетативно размножаемые растения, к числу которых принадлежит одна из важнейших сельскохозяйственных культур - картофель. Наибольший ущерб урожаям картофеля наносят так называемые мозаичные вирусы» в отношении которых пока не разработаны эффективные меры борьбы. Попытки получать путем селекции сорта картофеля, устойчивые к важнейшим возбудителям мозаики - вирусам X, Б, М и У* не увенчались успехом, Яал&кенная по всем правилам система семеноводства, со строгим контролем и удалением больных растений, не гарантирует получения безвирусного посадочного материала.

Установление мер борьбы с мозаичными вирусами картофеля в значительной мере затруднено тем, что свойства их недостаточно изучены. В первую очередь это относится к вирусу М /БМК/, ареал которого постепенно расширяется. Из общего убытка в сумме около 5 млн.рублей, причиняемого ежегодно вирусным вырождением картофелеводству Эстонской ССР, на долю ВМК приходится 2,9 млн.рублей /НашШи, 1966/. Этот вирус все более широко распространяется и в РСФСР, где снижение урожая, вызываемое им, составляет 15-30Я /Шмыгля.Абрамова , 1971/.

Наряду с ВМК заслуживает внимания и вирус я картофеля /Ъ в К/, изолированный Б.Х.НуЕмисте в Эстонии в 1960 году из мозаягных сеянцев картофеля /Йурмисте, 1960а/ о значительной распространенности которого на исходном селекционном матери-

еле, в особенности: на гибридных сеянцах, сейчас уже накопилось много данных /Й^гринств, 19606, 19620;Agixr. 1967/.Установлено также, что этот вирус имеет широкий круг растений --хозяев/Agur.ViUemsoa, 1970,1971,1972Л0 свойствах ЕНК имеются пока лишь самые сбщие сведения, не выясненными остаются и его распространенность на посевах картофеля и размер наносимого ям ущерба» М.Агур / Agux, 1968а/ на основе яэученгя инфекционных свойств ВКК и реэулнтатов наших электронно-микроскопических исследований высказала предположение, что ов представляет собою одну из форм /штаашов/ широко распространенного вируса огуречной мозаики /ВОМ/.

Для установления эффективных мер борьбы с вирусными заболеваниями необходимо выяснить источники ин^кцив и пути ее распространения на всех этапах селекции а семеноводства . В отношении вирусов ВМК и ВДК некоторые соответствующие данные получены Б.Нурмисте, П.Тамм и М.Агур, Работа с ВНЕ затруднена тем, что пока не удалось получить для него антисыворотки, которая дала бы возможность его быстро иидентифицировать»

Более углубленное выяснение вопросов, касающихся возникновения инфекция, ее распространения и интенсивности проявления, требует всестороннего изучения физических и химических свойств вирусов на молекулярном уровне и изменений этих

свойств в зависимости от условий жизни растения-хозяина и физиологического его состояния.

В литературе пока имеются лишь саше общие сведения о

физических свойствах ВМК /ВгашЗез и др. .1959; Bode, 1968/.Хи-мичеаше свойства этого вируса не изучены, 0 вне до наших

«сследованяй не было ннкаких данных, характеризующих его 'ж-зические и химический свойства.

Изучение свойств вирусов на молекулярном уровне возможно лить при наличии чистых их препаратов. Имея такие препараты мо«ио подойти к выяснению возможного сродства между отдельными вирусами и их формами и вообще к более глубокому пониманию сущности инфекционного процесса и проявления всего комплекса признаков заболевания.

Получение чистых препаратов вирусов необходимо и для производства высококачественных диагностических сывороток.

В нашей диссертационной работе были поставлены следующие задачи.

1. Изучить динамику концентрации вирионов в инокулиро-

ванных листьях и в верхушках растений при заражении bnk, ВМК

и НХК„ и физиолого-биохвмичесцую реакцию листьев Kicotlana glutinosa L. после инокуляции ВГЖ и ЁХК.

2. Выработать метода получения чистых препаратов вяк

К ВМК.

3. Изучить некоторые физические и химические свойства ВНЕ и ВМК.

Материал в методика

В качестве объекта исследований, по указанным выше причинам, были взяты следующие формы вирусов.

I. Форма нв вируса н картофеля /ШдК/ которая была изолирована M.Aryp /Agur, 1966/ при культивировании исходной формы внк на вице нloottana ruatica и поддерживается в лабораторных условиях на индикаторных растениях,при

- б -

втом в растениях Biootlaaa glutinosa она обычно содержится в высокм концентрациях, что обусловило ее выбор.

2. Форта MjjBapyca М картофеля ДМПК/, изолированная

Б. Нурмисте из репродукции гибридного сеянца картофеля 382/48эс Приекульский ранний Йыгеввской селекционной ставши.

3. Форма Хд вируса X картофеля /ВХдК/ полученная из репродукции гибридного сеянца картофеля Кшераз х Агрие /У/ йыгеваской селекционной станции. Этот вирус был взят в качестве контрольного при электрофоретической очистке, определении динамики концентрации вирусов и изучении динамики содержания минеральных элементов в зараженных растениях. Поведение ВХК при электрофорезе довольно хорошо изучено /van B«g*n-aortel, 1964в/.

Вирусы размножали на следующих системно заражавшихся растениях! МГ^К И ВХдК на Hlootiana glutinosa, ВМ^К на Solamia deaismin Linai. Ж S.acaule Ь.

Для определения относительной концентрации вирионов использовали следуют^ локально реагирующие индикаторные растения: джя BlígE Cheaopodiux ав*г&ntlcolor Ь.И Vigaa sineneie L.¿ дня EMjjK И ВХдК tto«phxenA globosa L.

Растения выращивали в теплице при температуре 20-25°С, летом в условиях естественного освещения, зимой при дополнительном искуственном освещении /лампы накаливания и люминесцентные лампы/ в течение 20 ч. в сутки.

Чтобы получать вирусные препараты из материала, содержащего вирус в возможно более высокой концентрации, изучалась динамика концентрации вирионов в системно заражающихся растениях указанных выше видов, после их инокуляции. Через каждые

два-три дня после заражения брали средние пробы инокулжро-вакных листьев и листьев верхушки. Пробы растирали в ступке до образования однородной кашицы. Отжатый из нее сок разбавляли водой в отношении 1:4. Затем шпателем, смоченным в полученном инокулгие, осторожно натирали половинки листьев локально реагирующих растений. Другие половинки тех да листьев заражали соком здоровых растений, разбавленным водой в том

же отношение-. Через пять дней подсчитывали число некрозов.

Концентрацию вирусов BMjjK и ВХдК в системно заражающихся растениях и степень загрязненности очищенных разными методами препаратов определяли с помощью электронного микроскопа ЭМ-7. Под электронным микроскопом устанавливали также форму и размер вирионов ЕНцК, при этом препараты наносили на сетки с формваровой плвякой, сушили и оттеняли нихромом. Для негативного контрастирования использовали 2% растворы уранид-ацетата или фосфорвольфрамата-

Физиодого-биохикическую реакцию растения-хозяина к-, вирусную инфекции изучали на растениях iTlcotiena glutinosa, зараженных ш^к и ВХ^К. Растения инокулировали разбавленным водой соком, полученным от зараженных вирусами растений зтого же вида. Другую группу растендй инокулировали соком, полученным от здоровых растений. Через кащше два-три лня, с третьего по семнадцатый день после заражения, брали средние пробы я нокулиро ванных листьев. Листья собирали утром в одно и то ¿е время. Растения всех сравниваемых вариантов в каждой серии опыта выращивали н исследовали одновременно, чем обеспечивались одинаковые внешние условия.

У зараженных и контрольных растений изучались изменения

в содержанки сухого вещества, золы и некоторое минеральных элементов в течение первых семнадцати дней после заражения. Содержание сухого вещества определяли путем высушивания листьев при 105°С до постоянного веса. Для определения содержания золы сухие листья оголяли при температуре 550°С до постоянного веса. При определении содержания минеральных элементов использовали метод сректрального анализа. Спектры получали высоковольтной искрой при помощи генератора ИГ-3 и фотографировали на спектрографе ИСП-28 в спектральной области 2000-5000 А . Оптические плотности спектральных линий и фона вблизи них измеряли при помощи микрофотометра ¡№-2 .Для введения поправки на фон значения оптических плотностей переводили в единицы интенсивности при помощи характеристической кривой спектральной пластины /Прокофьев, 1951/.В качестве величины пропорциональной концентрации элементов в зйве

растений использовали отношение интенсивностей спектральных линий и фона. Все данные перечисляли на сухое вещество х выражали в отношении здоровых растений.

В целях получения характеристики BKR К и BMjjK изучали ряд их физико-химических свойств. Злектрофоретическую подвижность вирионов определяли в буферных растворах с ионной силой ОД /Miller, Golder, 1950/ в приборе для аналитического электрофореза /Цейсс, йена / при температуре 4°С,При этой же температуре определяли jfl и удельную электропроводимость растворов» В определенные моменты времени пик на нисходящей стороне фотографировался при помощи шлирея-оптиче-ской системы. Измерительным микроскопом МИР-12 измеряли рас-птпямяя пвкоя от отарга в разное время после начала опыта и

рассчитывали средиюю подвижность вирионов в данных условиях.

Ультрафиолетовые спектры поглощения препаратов измеряла при помощи спектрофотометра СФ-4А в области 200-400 ни. Ва основе оптических плотностей вирусных препаратов при 260 км и соответствующих сухих весов вирионов /определенных путем сушки препарата при 90°С до постоянного веса/ вычисляли абсорбционшй индекс вируса.

Влияние солей /ЫС1, LiCHjCOO, NaCl.KCl, MgClj.CaClg/ на устойчивость вирионов в растворе la vitro изучали при помощи спектрофотометра 0Ф-4А.

Влияния неорганических солей /LiCl, NaCl.KCl/ на ин-фекционность bn^k изучали путем определения количества некрозов на листьях растений Cheaopoälum aearaiiticolor. Для втого половинки листьев растений этого вида инокулировали вирусными растворами, содержащими соответствующие соли, а другие половинки листьев в качестве контроля соответствующими растворами солей. На пятый день после заражения подсчитывали число некрозов, измеряли площадь листьев при помощи планиметра и рассчитывали среднее число некрозов на I кв.см»

Белок оболочки вируса отделяли феяольным методом /Knight,1965/. Для определения состава аминокислот этот бедок подвергали гидролизу в растворе 5,6 h.hci в течение 24 часов при П0°С. Аминокислоты разделяли и определяли при помощи анализатора аминокислот /ф-ма Микротехна, Прага/.

Еунлеиновая кислота вируса отделялась фенольным методом /Gierer, Schräm, 1956/. Для установления типа нуклеиновой кислоты применяли цветные реакции на дезоксирибозу и рябозу, соответственно дифениламином и оршном /Лише. 1957/.

НуклеотшвднЯ состав вирусной РНК определяй стандартным методом / Smith, 1955/. РНК подвергали гидролизу в растворе 0,3 я К0Е- в течение 18 часов при 37°С. Йуклеотиды разделяли в формиатном буфере ври помопщ электрофореза,элю-ировалд 0,1 н, HCl и определяли спекрофотометрическям методом.

Содержание фосфора в ЮГцЕ определяли колориметрически ври помощи молибдата аммония /Allen, 1940/, Содержание РНК в вираонах вычисляли ксходя из содержания фосфора и ну-клеотидного состава РНК.

Содержание нуклеяновой кислоты и приблизительный молекулярный »ec BMjjK определяли на основе спектрофотометри-ческях данных /paul, 1Э59а,б/.

При очистке вирусов использовали ультрацентрифугу VAC-60»

Чистоту и гомогенность вирусных препаратов, полученных после очистке, проверяли методами электронной микроскопии, УФ-спектрофотометрии, аналитического электрофореза и ультрацентрифугирования.

Концентрация вирионов и физиолого-бнохимическая реакция растения-хозяина при вирусной инфекции

i. Концентрация вирионов. Приступая к очистке вируса нужно сначала найти время, при котором концентрация вирионов выбранной комбинация вирус-хозяин будет максимальной . При этой часто не обращают внимания на скачкообразный характер динамики концентрации вирионов и ориентируются по признакам болезни, При наших исследованиях было установлена

что пряэявл болезни не коррелируют с концентраакея вяр»ояог,

часто концентрация вирионов падает по мере обострения болезни. По-видимому имеется некоторая корреляция между появлением первых признаков болезни на листьях верхушки и максимумом концентрация вирионов. Брать листья для получения очищенных препаратов надо при максимальной концентрации вируса. Если не учитывать концентрации вирионов, нельзя надежно получать достаточно большое количество очищенного препарата хорошего качества. По некоторым вирусам /например ш^к /, имевшим кратковременный максимум концентрации, ориентируясь только

по признакам болезни, можно совсем не получить препарата.

Скачкообразный характер изменения концентрации вирио -

нов известен у многих вирусов, например у вируса мозаики жо~ керны Auhn, Bancroft ,1961; Bell, 1964; Havräaek,I967 а/ , вируса крапчатости боба конского / КоЗаша, Bancroft ,1964/ , вируса деформирующей козаикл гороха /isadapanah, Shepherd, 1966/,вирусов огуречной и табачной мозаики /Йатг&оек:, 19676/, вируса аспермии хризантем /Oertel, 1969/.

Произведенное нами изучение динамики концентрации bhrk BMjjK и BXgK также показало ее скачкообразный характер. Концентрация BHgK в растениях Hiootlana glutinoea достигала максимальной величии в пнокулированных листьях на десятый день,а в листьях верхушки на двенадцатый день после заражения. Концентрация вирионов в инокулированных листьях во время максимума была примерно в 3 раза выше, чем в листьях Еер-хушки и оставалась таковой в течение всего периода опита.Достигнув кратковременного максимума, который удерживался в течение нескольких дней, концентрация ьирионов быстро сни*л-

- 12 -

лась и составляла в листьях верхушки на четырнадцатый лень 315Е от максимальной концентрации, а на двадцатый день падала почти до нуля. Концентрация вирионов в инокулированных листьях на четырнадцатый день составляла 17?, а на двадцатый день - примерно от максимальной концентрации.

Кривая изменения концентрации ВМ^К в растениях 8о1а-тша ¿«Навит я З.&в&иХе напоминает кривую затухающего колебания. Концентрация вирионов в листьях верхушки имеет максимум на третьей неделе после заражения» В инокулированных листьях первые вирионы были обнаружены на четвертый день после заражения, однако концентрация их в течение всего опыта оставалась низкой. Через две недели после заражения инокули-роваяные листья начинали сохнуть и опадать. На двадцать девятый день концентрация вирионов в листьях верхушки составляла 30? от максимальной величины и в дальнейшем снижалась.

В зараженных ВХ^К растениях Н1со«1апа &1\гЫаоза максимальная концентрация вирионов была отмечена на десятый лень после заражения, причем концентрация в листьях верхушки превышала концентрацию в инокулированных листьях примерно в 3 раза. На четырнадцатый день концентрация вирионов падала и составляла лишь 1% от максимальной величины.

2.Содержание минеральных элементов в зараженных вирусами растениях

Кроме своевременного сбора листьев для получения препаратов вирусов имеет большое значение и состав среды при выделения вируса /соединения растительного происхождения и добавляемые веществе/. В связи с тем, что вирионы уогут ина-

ктивироваться или осаждаться не только органическими единениями /хинонами, лабильными веществами и нек.лр./, но и под воздействием минеральных элементов ЛГоЬпзон, 19;Ргапск! х дрЛ9бб;такапав11^оааг,и119б9/,Ш1 изучали динамику изменения сухого вещества, золи и содержания некоторых неорганических элементов в двух комбинациях вирус-хозяин. Для этого были проведены 2 серии опытов, в которых использовали листья растений ШссЫапа &1и1:1аС1за . Эти растения были заражены соком, содержащим БНдК или ВХоК. Контролем служили растения, инокулированные соком здоровых растений этого чге вида. Анализы проводили с третьего но семнадцатый день после заражения. Результаты, пересчитанные на сухое вегаество , являвтея средними двух серий опытов и выражены в отношении здоровых растений.

Содержание сухого вещества в листьях зараженных вирусами растений находилось в течение первых пяти дней после заражения на уровне его содержания в листьях здоровых растений, После этого содержание сухого вещества в листьях больных растений значительно возрастало и достигало максимального значения на двенадцатый день после заражения. Как правило, содержание сухого вещества в больных растениях было в ¡же,чем в здоровых, что согласуется и с литературными лаяними других авторов /Рейфмак и др., 1966/.

Содержание золы на третий день после заражения было максимальным - г 1,2 раза выше, чем у здоровых растениР,после чего скачкообразно снижалось и на семнадцатый пень было примерно в 1,4 раза ниже, чем у здоровых растений,

вР^^да? минеральных элементов - калия, ллтгия, кадь-

няя, магния, фосфора, железа, меди, цинка, ыетраяпа, молибдена, бора и стронция на третий день после заражения было наиболее высокое, что согласуется с высоким содержанием золы.

В растениях, зараженных ВХдК, содержание натрия, кальция и магния после резкого снижения, следовавшего за максимумом, оставалось в дальнейшем относительно постоянным. В растениях, зараженных М^К , содержание указанных металлов изменилось значительно. Ясно выраженные пики имелись на двенадцатый день после заражения. На десятый день после заражения во время максимальной концентрации ЕВ^К , когда собирали листья для изготовления препаратов, содержание кальция, который способен: осаждать или инактивировать вириони,было в 1,5 раза выше, чем в здоровых растениях.

В содержании калия и фосфора в опытах с обоими вирусами наблюдались резкие отклонения от содержания этих элементов в здоровых растениях.

Концентрации марганца, молибдена, бора и стронция оставались после снижения в больных растениях^ в течение всего периода опытов нике- их концентраций в здоровых растениях.

Обращает на себя внимание широкий диапазон изменений концентраций железа, меди и цинка в дальнейшем ходе болезни /рис.1 и 2/. Содержание железа и меди снова достигало заметной величины на четырнадцатый день, а цинка на двенадцатый день после заражения. Во время пиков содержащие железа,меда и цинка превышало в 1,5-2 раза содеряание указанных элементов в здоровых растениях.

Кривые изменения относительной концентрации вирионов

РисЛ. Динамика относительной концентрации buje и содержания Ре, Си и 2а в инокодированных листьях растений líicotiana glutinosa. I - интенсивность спектральной линии - величина, пропорциональная концентрации элемента в здоровых растениях, б пересчете на сухое вещество, - интенсивность спектральной линии в зараженных вирусом растениях.

Рис.2. Динамика относительной концентрации ВХ к и содержания Ре, Си и Za в инокулированкых листьях растений Hicotiana glutinosa. I - интенсивность спектральной линии - величина, пропорциональная концентрации элемента в здоровых растениях, в пересчете на сухое вещество, - интенсивность спектральной линии в зараженных вирусом растениях.

нт^ г определенные по ивфекционности сока на растения Т1впа з1иепз1г Я вирвонов ВХ^Е на йотрЬгепа еЮЪоеа „ одновреуенно с изучением изменения содер;кания минеральных элементов, имеют скачкообразный вид /рис.1 и 2/.Концентрация вираоноЕ достигала своей максимальной величины на десятый день после заражения. В дальнейшем концентрация падала а на четырнадцатый день концентрация бн^ составляла 15% , а концентрация ВХцК 21% от максимального значения.Несмотря на снижение концентрации вирионов, признаки болезни /хлороз/, которые появились при данных комбинациях вирус-хозяин через 6 дней после заражения, обострялись. Одной из причин возникновения хлороза считают отсутствие или недостаток железа /рубин, 1972/. В связи с этим можно было бы ожидать при обострении болезни уменьшения содержания железа. Однако результаты наших опытов не подтвердили такого предположения. В опытах оШ^Е /рис.1/ наблюдалось противоположное явление - содержание «елеза при обострении болезни начинало увеличиваться и при максимуме почти в два раза превышало содержание железа в здоровом растении. Такое же, хотя более скачкообразное изменение концентрации железа, отмечалось и в опытах с ВХдК /рис.2/. Полученные результаты приводят к выводу, что обострение хлороза растений не связано с понижением общего содержания железа в растениях и,следовательно, в процессе болезни не возникает какого либо препятствия для проникновения железа в клетки растений. Возможно, что железо при вирусной инфекции не может быть нормально использовано в процессах биосинтеза, что и обуславливает хлороз. К такому заключению приходят и другие авторы Лернавина,1970/.

- 17 -

Пря сравнения изменения содержания железа и относительной концентраций вя^к выяснилось, что после седьмсч) дня содержание железа увеличивается и достигает своей максимальной величины на четырнадцатый день, В то же время относительная концентрация вируса также повышается, проходит свой кратковременный максимум и к четырнадцатому дню находится уже на низком уровне. Аналогичная картина отмечена и для меди, только увеличение содержания происходит ухе с пятого дня после заражения.

При инфекции БХдК динамика содержания железа имела более скачкообразный характер. Однако к четырнадцатому дню, когда концентрация инфекционного вируса находилась /аналогично ВНдК / на низком уровне, содержание железа было приблизительно в 1,5 раза выше, чем в здоровых растениях.

Кажется,что увеличение концентрации вируса обуславливает увеличение концентрации меди и железа, что наблюдается некоторое время и после снижения концентрации вируса. Одной из причин увеличения концентрации железа и меди и уменьшения концентрации вируса при этом может быть, повидшому, взаимодействие указанных металлов с вирусом или продуктами синтеза его.

При инфекции ВХдК привлекает внимание обратный ход кривой концентрации цинка по сравнению с кривой концентрации железа. Концентрация цинка достигает максимальной величины на 12-Й день, когда содержание «елеза и меди минимальное,, а концентрация вируса начинает снижаться, Возмокно.что при взаимодействии металлов с вирусом или продуктами синтеза «го «низкое содер*аняе ьелеза и меди каким то образом

- Iß -

компенсируется васокш содержанием ганка.

Относительно взаимоотношений we.яду вирусами и металлами в литературе имеются лишь немногочисленное данные. Результаты анализа чистых препаратов растительных вирусов показывали, что вирионы, кроме своих основных компонентов, содержат.и некоторые r/еталлы /boring и др.,1562; Тихоненко , 1966, 1971/.

D некоторых случаях неорганические катионы могут оказывать стабилизирующее действие на структуру вирионов, как например Са2+ и Mg2+ у вируса метаикл костра /Вгайсе, 1963 / и Мв2+ и Sr2* у вируса желтой мозаики турнепса ДоЬпаоа 1964/.

В других случаях те же самые неорганические элементы могут оказывать инактивирущее и /или/ осшсдащее действие на вирионы, как например K+,Mg2+,Za2+ на вирус табачной мозаики /ТРкжков .Смирнова Д947/, ваг*,Са2+,Мвг+ на вирус некроза табака, огуречной мозаики, кольцевой пятнистости табака, вирус южной мозаики фасоли и вирус мозаики люцерны / Rossouw,Fulton, 1963; prancki И др., 1966; Hull, Johnson, 1966/, Ca2+, Mga+, Cu2+, zn2+ на вирус огуречной мозаики / Peiaaeel, Tomaru, 1969^

Осаипавдее действие ионов двухвалентных металлов изучалось вами 1д vitro в отношении БН^к в присутствии солей кальция и магния. При этом выяснялось, что вирионы осаждались даже из растворов с низкой концентрацией солей /до 5*Ю~^М/ /см.стр. j» /.

К сожалению отсутствуют данные о совместном действия

указанных' выше катионов, которые позволили бы судить об их

конкурентных взаимоотношениях при осаждении.вирусов.В этом отношении представляют большой интерес опыты, которыми усханов-

- 19 -

лено неодинаковое сродство металлов с различными активным» группами белка и Ш /Еильямс, 1962/.

Осаждавшее и инактивирушее действие металлов и повышенное содержание их в зараженных вирусами растениях дают основу для понимания пока необъяснимого скачкообразного характера изменения концентрации растительных вирусов в процессе инфекция. Такое скачкообразное изменение концентрации вируса, при котором отсутствует корреляция мевду концентрацией вируса и интенсивностью проявления признаков болезни /хлороз, деформация листьев и т.д./, которые часто при снижении концентрации инфекционного вируса обостряется, можно объяснить на основе данных об изменениях концентрации металлов в зараженных расгенлях.

Исходя из сказанного и экспериментальных данных,предлагается гипотеза о взаимосвязанности между ходом болезни , вызываемой вирусной инфекцией, скачкообразным характером изменения концентрации инфекционного вируса и динамикой содержания минеральных элементов в больном растений.

Главной причиной хлоротических явлений у растений при

вирусной инфекции могет быть образование комплексов или солей

между вирионами или продуктами синтеза вируса /вирусная РНК,

вирусные белки и т.д./ и металлами. Такие соединения с кетал-лап могут в конечном итоге вызывать кажущееся /а монет быть

и действительное/ снижение концентрации варионов в больном растении и выводить из процесса обмена веществ нужные для растения минеральные элементы. При этом признает и ход болезни в растении при вирусной инфекции определяются сродством вирионов или продуктов синтеза вируса /или одновремея-

- 20 - '

но обоих/ с определенными металлами.

Очистка вирусов II и 1 картофеля

Очистка ШдК . Получение чистого препарата ШцК: было связано с обширной поисковой работой, т.к. до сих пор чистые препараты этого вируса не были получены. При изыскании метода очистки мы исходили из того, что ШдК по некоторым свойствам /круг растений-хозяев, точка инактивации и т.д./ входит в группу вирусов огуречной мозаики /ВОМ/ / Agur, 1968а/. Просматривались методы, используемые для очистки ВОМ /тоиИлзоп, 1959; таи Regeniiortel, I96I;I964a, б; Scott, 1963; Takanami, Tomaru, 1969/. Из них наиболее широко используют метод дифференциального центрифугирования /Scott, 1963/, возможности приспособления которого для очистки ВДдК били наш изучены. Недостатком этого метода является содержание в очищенных препаратах примесей протеина Ф I / Scott, 1963; тая Regwunortel, 1964 а/. В наших опытах с BHßK ,кромж этого недостатка, обнаружились и лругие-- малый выход препарата и длительность процесса очистки.Поэтому использовать данный метод в неизмененном виде для получения чистых препаратов BWgK было нецелесообразно.

Нами были внесены некоторые изменения в отдельные этапы метода Скотта /схема I/. Сначала диализ заменили обменом буфера в колонке, заполненной Сефадексом. Г25, чем сократилось время для очистки вируса. В дальнейшем ходе работы во все буфера добавляли хелатирующий агент /ЭДТА/,аналогично модификации Такая ами-'Т омару / Talcanami, Тошаги, 1969/, элиминируя таким образом осаъдаадее действие кноговллентннх

- 21 -

ионов металлов /смотри содержание неорганических элементов в случае вирусной инфекции стр. 18/. Кроме этого первое ультрацентрифугированде больших объемов заменили осаждением виряонов в азоэлектрической точке /рй 5,8/,что дало возможность выделять вирионы из практически неограниченного количества растительного материала,

С цель» окончательной очистки препаратов, используемых в дальнейшем для изучения физико-химических свойств варионов, применяли метод дифференциального центрифугирования или электрофорез в градиенте плотности сахарозы. Злектроннокикроскопическая проверка чистоты препаратов и изучение гомогенности методом аналитического электрофореза и ультрацентрифугарованяя показали эффективность данного метода при получения чистых препаратов.

Пригодность отдельных этадоз метода проверяли путем определения инфекционности препаратов ляокулируя ими растения сь«п#ро31ик аюагва11со1ог. Замена диализа, используемого в методе Скотта, на обмен буфера в колонках Сефа-декса Г25 и прибавление ЭДТА в буферные растворы, увеличивали ивфекционность препаратов примерно в 4 раза; замена ультрацентрифугирования больших объемов осаждением в изоэ-лектрической точке увеличивала инфекционвость их примерно в 2 раза. При дальнейшем дифференциальном улътрацентрнфу-

гировании инфекпионность полученных препаратов практически не изменялась.

Благодаря разработанному нами методу очистки вя^д

/осаждение в нзоэлектрнческой точке/ были получены препарата* инфекхяонность которых превышала в два-тра раза кн-

- гг -

Схема X I. Очистка вируса Яд картофеля

ЛИСТЬЯ зараженных вирусом растений Я1со-Ыааа й11гЫдоеа. Выдержать при О0- 4°С /48 час./

+ 0,5 М цитратный буфер /рН 6,5/.содервдкй 0,1% тио-гликолевой кислоты и 0,01 моль/л ЭДТА

+ хлороформ

Измельчать в размельчителе при 8000 об./мин. /2 мин./ Центрифугировать при 5400 е /15 мин./ СУПЕРЫАТДНТ Фильтровать через стеклянный фильтр * 2 ФИЛЬТРАТ

Пропускать через колонку с Сефадекеом Г-25 Элвировать 0,005 М боратным буфером ДА 9,0/ амм

Добавлять конц. соляную кислоту до рН 5,8 Центрифугировать при 5400 е /15 мин./ ОСАДОК

Суспендировать в 0.01 М ЭДТА-0,005 Ы боратном буфере /рН $.0/

Центрифугировать при 5400 б /15 мин./

СУПЕУНАТАНТ')

Диализировать против буфера для электрофореза

ДИАЛИЗАТ

Электрофорез

ФРАКЦИИ

Центрифугировать при 105000 в /90 мня./

ОСАДОК

Суспендировать^ 0,005 Ы борат но« буфере

Центрифугировать при 5400 е /15 мин./ уу-—----------

Примечание: Полученный СУПЕРНАТАНТ можпо дальше очистит'ШШ~й5я помощи двухкратного дифференциального цея-трифугкроьаиия /90 инн. при 105000 в и 15 мив. при 5400» / Первый раз осадок вирионов суспендируется в 0,01 (1 ЭДТА + + 0,005 Н боратном бу|ере /рй 9/,второй раз в этом ке бу-

фекдаониость препаратов, получаемых, мечодом Сточта-Таха-нами-Томару,

Часть метода предварительной очистки BHgK с некоторыми изменениями была приспособлена в для очистки вх^к который служил контролем при электрофоретической очистке вирусов. Листья растений Kicotiaca glutinosa измельчали в 0,05 М цитратном буфере без добавления ЭДТА, Окончательное выделение производилось не осаждением в изоэлек-трической точке, а ультрацентрифугированием в течение 2 часов при 55000 g .

Очистка вируса Мц картофеля. Целью всех известных в литературе /Sagnall И др., 1959; Wetter ,1960; Hohejl, 1960¡Щербакова, 1964; Albrecbtova, Eltr, 1970/ методов очистки ВШС было получение препаратов для производства ав-тисывороток. Но ни один из них не обеспечивал достаточной чистоты препарата, пригодного для физико-химических исследований вируса, или же выход препарата был очень малым.Поз-тому эти методы не могли найти у нас применения. Так как физико-химические свойства BMjjK не были известны, то разработка метода очистки этого вируса потребовала проведения многочисленных опытов. Использованные приемы очистки оценивали на основе результатов злектронномикроскопического определения выхода ьирионов и полноты отделения влриоков от растительных примесей.

В дальнейшем рассматривается основная часть накопленного при разработке метода очистки BM-qK экспериментального материала в двух этапах: предварительная очистка и пополни-

тельные приемы очистки.

Первоначально ВМ-цК выделяли из растительного сока 5лътрацевтрифугировакаем. Подученный препарат, сильно загрязненный растительными примесями, суспендировали в буферных растворах с разним рй. Было установлено, что в фосфатном /рН 7,0/ и боратном /¡¡В 9,0/ буферах суспендировалось одинаковое количество вирвонов, лишь только с той разницей, что в боратном буфере суспендировалось несколько меньше растительных примесей.

Б целях освобождения вириояо^ от растительных прше-

сей было испытано несколько методов.

Во-первых, был применен метод дифференциального осаждения сернокислым аммонием. При 5#-ом растворе сернокислого аммония осаждения вирионов не наблюдалось, при 10£-ом растворе осагцалось до 80£ и в случае 20$-го раствора осаждались практически все вкрионы. Во рсех случаях вирионы были загрязнены большим количеством растительных примесей.

Во-вторых, перед выделением виряонов была использована обработка сока хлороформом с последующим нагреваннем до 55° ила £0°С. Из обработанного таким образом сока после осаждения сернокислым аммонием и последувдего суспекдирования препарата в 0,005 5,1 боратном буфере /рН 9,0/ выход вирионов составлял соответственно 25л и 15?. Однако препаратполученный при такой обработке, был так«1. сильно загрязнен растительным материалом.

В-третьих, применяя диф^.е рент дальнее оса.тленяе сернокислым аммонием /Ь% и 20?/ в сочетании с четырехкратна дифференциальным се н т рафуг и ровен и ем /60 уин гтри ЭОООО 5 и 15*/ви

при 17000й / при дальнейшей очистке препарата» окончательный выход составлял только но и в этом случае вирионы были также сильно загрязнены.

В-четвертых* после обработки забуфированно*о нитратным буфером /рН 6,5/ растительного сока в-бутиловым спиртом, в растворе оставалось только 50% вирионов. При дальнейшем осаждении вирионов 4^-ным раствором поли этиле нглико-ля /м,в.6000/ из обработанного я-бутиловым спиртом сока осаждались практически все вирионы, остававшиеся в растворе, при этом из них только половина суспендировалась в бо-ратном буфере /рН 9,0/ и была загрязнена растительным материалом.

В-пятых, при осаадении вирионов добавлением этанола в объемных отношениях 2:1 /сок:этанол/ и последующей адсорбцией растительных примесей на активированном угле был получен относительно чистый препарат, однако с низким выходом вирионов /несколько процентов/. Опыты разделения растительных примесей путем адсорбции на гидрокснлапатите оказались безуспешными. Вирионы адсорбировались на гидрокснлапатите так сильно, что освободить их от адсорбента не удавалось при элюироваюш ни в растворах с разным рНг нв в растворах разных концентраций солей.

Не один из рассмотренных вше методов не обеспечивал достаточной чистоты и выхода препаратов.

Новая методика очистки ДНцК бцд& на

основе наилучших полученных результатов предварительной очистки и состояла в следующем /схема * 2/.

о

- 26 -

Листья больных растений выдергивали в течение суток при температуре - Ю°С, измельчали в мясорубке, мацерат суспендировала в 0,05 М нитратном буфере /рК 6,7/,содержащей для предупреждения окисления 0,01 ьголъ/лсеряистокислого натрия и 0,02 колъ/л аскорбиновой кислоты. При дальнейшем перемешивании с хлороформом отделяли часть растительных при-

псесей. Выход вирионов при этом составлял около 90$, а после однократного дифференциального центрифугирования около 80$,

Для дальнейшей очистки били испытаны два приема:уль-трацентрифугированве и электрофорез в градиенте плотности сахарозы.

При ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы /ь течение 2 часов при 105000 д / основная часть ви-рионов вуесте с растительными примесями передвигалась в среднюю зону пробирки, а некоторая агрегированная часть осаждалась. С помощью данного метола невозможно было подучить препарат достаточной чистоты. Такой препарат был получен лить тогда, когда для отделения вирионов от растительных примесей был использован метод зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы.

Очистка вНрК, Ш^К и ВХ^К при помощи электрофореза.

С целью изучения возможностей полной очистки ш^к, ВМ^К и ВХдК при помощи зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы, а также изучения поведения указанных вирусов при электрофорезе были проведены следующие опыты.

В начале для электрофореза использовали электрофоретиче-

скую колонку серийного производства /тип АЭВ/,приспособленную нами для зонального электрофореза в градиенте плотности

Схема № 2. ОЧИСТКА ВИРУСА ¡¿п KAFIOvEEH

Дистья зараженных вирусом растений Solanum deaissuo иди

S. acaale Выдержать при -Ю°С /24 часа/ Измельчать при помоки мясорубки

+ 0,05 tó гатратный буфер /рН 6,7/,солерлашиЙ 0,01 моль/л

SajSOj + 0,02 молъ/л аскорбиновой кислоты + хлородорм

Смесь размежевать в размельчителе при 8000 об/мин /30 сек./

Центрифугировать при 5400 g /15 мин,/

СТПЕРНАТАНТ

Центрифугировать при 90000 g /60 млн./ ОСАДОК

Суспендировать в 0,005 М боратном буфере /рЯ 9,0/

Центрифугировать при 17000 g /30 мин./

Супернатант

Диализ против боратного буфера для электрофореза /рН 8,6/

ДИАЛИЗАТ

Центрифугировать при 17000л /50 млн./ /при необходимости/

СУПЕРНАТАНТ

Электрофорез

ФРАКЦИИ

Центрифугировать при 90000 g /60 мин,/

ОСАДОК

При необходимости Суспендировать в 0А005 М

можно повторять боратном буфере /ра 9,0/

Центрифугировать при _ ITOOOg /15 мин,/

- 28 -

сахароза. Для создания буферной системы использовали наиболее распространенный в практике вирусологии боратный буфер /рН 8,6/ / van Regewaortel ,1964 б; Poison, Russell, 1967/. Вирусный препарат, применяемый для электрофореза, диализировали против этого же буфера. Длительность элек-трофоретического процесса в данных условиях /сила тока 30 мА/ в зависимости от вируса была 50-38 часов. Для всех вирусов с цель» сравнения скорости их движения использовали феноловый красный. При электрофорезе в колонке образовывались три видимые глазом зоны, которые по порядку снижения скорости движения располагались следующим образом: первая - феноловый красный, вторая, зеленая - растительный материал и третья, нижняя белая, опалесшругощая зона - ви-рионы. После окончания электрофореза измеряли расстояния слоев от исходной линии и собирали фракции по 2 мл каждая из нижнего выхода колонки. Спектры поглощения фракций определяли в области 220-320 юл, проверяли содержание вирио-нов в них при помощи электронного микроскопа и их инфекци-онаость на индикаторных растениях.

Для лучшего сопоставления результатов с разными вирусами нами введена величина а, , которая показывает во сколько раз при данных условиях нижний край зоны фенолового красного передвигается быстрее нижнего края вирусной зоны.

По скорости движения вирусных зон в данной буферной системе изучаемые вирусы можно расположить в следующий ряд: ВМПК, BNgK и BXgK. Скорость движения BMjjK наивысшая / »= 5,6/. В связи с этим для отделения растительного ма-

«риала от вирионоь у этого вируса, по сравнению с другими вирусами, требовалось наибольшее время. При сравнении с литературными данными скорость движения BMjjK оказалась наиболее Слизкой к скоростям движения вируса У картофеля /БУК/, скорость дьижения ВЯ^К. / м, = 10,5/ значительно отличалась От скорости вируса огуречной мозаики /ВСМ/, но была близкой X скоростям движения вируса некроза табака /ВНТ/. Величины tí. , вычисленные по литературным данным /van Reg«cmort«l, 1964 б; Poison,Kueeell, 1967, соохветственво/ следующие: для ВУК - 5,4 И 4,4; БОМ - 2,5 и 2,8 и ВНТ - 8,8 и П,З.Ск0р0СТЬ движения ВХдК была незначительной / «■ = 36,5/; что согласуется и с литературными данными.

Фракции, содержащие вирионы, оказались чистыми от растительного материала, В дальнейшем эти фракции соединяли и вирионы выделяли ультрацентрифугированием. /см.схемы №1 и №2/. Полученные препараты использовали для изучения физико-химических свойств вирусов и для производства высококачественных аятисывороток.

Несмотря на то, что при помощи зонального электрофореза в градиенте плотности можно с успехом очищать вирусные препараты от растительных.примесей, этот метод не нашел широкого применения в вирусологической практике как препаративный метод. По нашему мнению- имеются по меньшей мере две причины этого:: длительность электрофоретического процесса /20-30 часов и более/ и относительно малые очищаемые объемы /1-2 мл/ в случае использования стандартной аппаратуры. Для преодоления указанных недостатков нами была разработана

- 30 -

модификация метода зонального электрофореза и создана простая аппаратура /рис.З/. Эта аппаратура состоит из колонки диаметром 36 мм и длиной 90 мм, двух платиновых электродов, двух электродных сосудов и изогнутой трубки диаметром 20 мм для их соединения.В приборе использовали трис /гидроксиметил/ аминометан-глициновый буфер /рН 8,5/ /Бат1в ,1964/ и в колонке ступенчатый граодент плотности сахарозы в этом же буфере.

При проверке нового прибора использовали два предварительно очищенных вирусных препарата / ВК^Е я ОХ^К/. Препараты для электрофореза были приготовлены таким «е образом как и при предыдущем методе, лишь с той разницей, что диализ проводила против трис-глицинового буферного раствора вместо боратного буфера.

Для отделения растительного материала от ВДрК и ВХдК требовалось 4-6 часов. При этом напряжение, наложенное на электроды, составляло 1000 в, сила тока не более 1,5 мА.

При электрофорезе в колонке также образовывались три зоны, как было показано выше, В ходе электрофореза отмечалось различие в скоростях движения зон в боратном и трис-глишновом буферах, что связано, по вид им ому, с изменениями в величинах зарядов поверхности молекул под действием буферной системы.

Полученные препараты Ш^к и БХ3К отличались высокой чистотой. Кнфекционность их превышала инфекцнонность исходных /введенных в колонку/ препаратов - В)ЦК в 2 раза.

рлс.З. Прибор зонального электрофореза.

/ I к 2 - электродные сосуды» 3 - колонка для электрофореза. 4 -трубка для соединения электрода ных сосудов, 5 и 6 - краны для выпуска раствора/.

а В иаК в 1,3 раза,

Н&ши экспериментальные данные позволяют предполагать, что этот метод применим и для очистит других вирусов /в том числе г ВМ^К/, устойчивых в трис-глациновом буфере.

Предложенная нами модификация электрофоретического метода отличается быстротой проведения очистки. Положительным является также то, что из-за малой плотности тока на электродах исключено' нагревание раствора и доведено по минимума вредное влияние продуктов электролиза.

В процессе выполнения основной задачи - очистки ви-

русов, нами изучено и распределение вирионов во фракциях, возникающих при электрофорезе. Таких фракций в каждой зоне имелось несколько. Проверка инфекционности на индикаторных растениях, а также злектронномя кроскопи че ское просматривание фракций, полученных в колонке типа АЭВ, показали, что основная часть вирионов находилась в белой, опалесцирующей зоне. При этом было установлено, что многие из остальных фракций, в том числе и из зоны растительного материала были также инфекционными /до 6 см от стартовой линии/. В связи с тем, что все фракции выпускались из нижней части колонка, возник вопрос: не связано ли это явление с загрязнением указанных фракций. Для проверки этого проводились повторные опыты с двумя вирусами / вн^ и ВХдК/. При этом часть фракций выпускалась из колонки сверху при помощи капилляр-сифона. И в таком случае верхние, быстро движущиеся фракции, оказались инфекционными, что дает основание предполагать о наличии вирусных микрофршщнЭ, отличающихся от основной фракции по заряду поверхности вирионов. Осталось, однако, неясным* имеются ли эти быстро двялущиеся ви-рионы с таким же зарядом в клетках,или заряд их изменился только в ходе выделения.

На основании проведенных опытов можно заключить, что метод зонального электрофореза в градиенте плотности, а особенно модифицированный нами метод, пригоден для отделения растительного материала от вн^ , ВМ^К и ВХдК. Этот ье-тод обеспечивает достаточную чистоту препаратов, которые

можно использовать для физико-химических исследований, ара этом следует отметить, что явление возникновения микрофрак-

mft вирусов при электрофорезе может метать разделвншп эти. вирусов при одновременном присутствии их в исходном материале.

Физино-химкческие свойства ШдК и BMjjK

Как уже выше отмечалось, до проведения настоящей работы физико-химические свойства ВПК а ВМК были мало изучены, так как отсутствовали достаточно чистые их препараты. Известны были лишь точки термической инактивации ВПК /Термисте, 1962 б; кgur , 1966/ и ШК /Bode ,1968/ и размеры вирионов BMK / Brandes и др., 1959; Hitehborn, Hills, 1965/. Поэтому изучение физико-химических свойств указанных вирусов представляло собой задание большой важности.

Полученные нами чистке препараты дали возможность изучить ряд физико-химических свойств BHgK и BM-qK ,

Свойства BNgK . Электронно-микроскопические снимки оттененных препаратов показали, что этот вирус представляет собой "сферическую" частицу со средним диаметром 37 нм.Средний диаметр вирусных частиц на снимках негативно контрастированиях препаратов - 30 нм.

Злектрофоретическая подвижность вирионов в буферном

растворе с ионной силой 0,1 колебалась в пределах от 10,02*

* ЮГ6 см2/®.сек /рК 3,78/ до - I.SS'KrW/B.ceH/pK 9,34/. Из о электрическая точка при pH 5,8.

Растворы BNgK имеют в ультрафиолетовой области света характерный для нуклеопротеида спектр поглощения с максимумом при 259 нм и минимумом при 241-241 нм. Отношения оптических плотностей

Л Majtc = 1,35 - 1,40; Д 280 = 0,594 - 0,596.

Д мин Д 260

Абсорбционный индекс вируса 4,9 /см^/кг/.

вгГдК является вирусом, содержащим рибонуклеиновую кислоту /РНК/. Нуклеотадный состав РНК в молярных процентах соответственно: АМФ:ГМФ:ДОФ:УМФ - 22,2:26,1:22,3:29,4.

Содержание фосфора в вирионах составляло 1,74$,а содержание FRK, расчитанное по содержанию фосфора и нуклео-тидному составу - 1В%.

Аминокислотный состав белка оболочки ВВрК в пересчете на остатки аминокислот - Лиз1Гяс:Арг:Асд:Тре:Сер:Глу: Про:Гли:Ала:Вал:адет:ИлеЙ;Тир:ФенгЦис 19 ¡4:23:47:25:38:32 г 26:28:26:37r6:20:34:I6:I2:0.

BffgK устойчив в растворах солей щелочных металлов / LiCl, MaCl, KCl, LiCHjCOO / в пределах концентраций 5*10~4 - 2,0 М, за исключением 2,0 М раствора хлористого лития, в котором вврионы разлагались на нуклеиновую кислоту, выпадавшую в осадок.и белок.

В 2,0 М растворе уксуснокислого лития вирионы оса,клались,, но не разлагались. Это указывает на существенную роль аниона при разложении вирионов. В опытах с растворами солей лития, натрия и калия установлена критическая концентрация /0,05 М/, при которой вирионы осаждались частично или полностью.

При изучении влияния солей двухвалентных металлов ка

вирионы выяснилось, что в присутствии ионов магния, при

его концентрации в растворе в пределах 5*Ю~4 - 2,0 М осаждались все вирионы. Ионы кальция при концентрации ниже

- 35 -

1,0 M вызывали полное осакдение вирионов, а в 1,0 M растворе кальция варионы частично разлагались.

Следует также отметить, что под влиянием вышеуказанных солей щелочных металлов возрастала инфекшюнность вируса в области концентрации солей 5'10-4 - 5'КГ2 М.

Предполагая, что- шк может быть одной из форм вируса огуречной мозаики /ВОМ/ / Agur , 1969 а/ лад сравнивали установленные нами свойства ШдК с литературными данными о физико-химических свойствах некоторых штаммов ВОМ / Murant » 1965; Saper и др., I965i Fraacki и др., I966ï

уал E«genmort0l ,1967; ЫппаеаХа! ,1966; Takaaami, Toaaru , 1969/. Выяснилось, что эти вирусы имеют одинаковую геометрическую форму, размеры и содержание РНК, но она различались по аминокислотному составу белка оболочки, ну-клаотидкону составу РНК и поведению в растворах солей щелочных металлов. Следует отметить, что и отдельные штаммы ВОМ, изучавшиеся разншк исследователями, также различались по аминокислотному составу белка и нуклеотидному составу РНК.

Все вышеизложенное позволяет заключить, что sttgK представляет собою особую, до сих пор не изученную, форму ВОМ, наиболее близкую по своим физико-химическим свойствам к форме q » Расхождение в некоторых химических свойствах и в химическом составе между Ш^ЕС и формой Q ВОМ, а также между формами БОМ позволяют судить о большой химической гетерогенности форм ВОМ.

Свойства ВМцК. Растворы чистых препаратов а'/^К имели

- 36 -

поглощение я ультрафиолетовой части света, которое характерно для нуклеопротеида. Спектры, коррегированные в отношении рассеяния света, имели максимум оптической плотности при 267 нм, а минимум оптической плотности при 245 нм. Отношение оптических плотностей: Д шкс = 1,29,

Д мин

_ 0^53, и некоррегкроЕанных относительно рассеива-

hm

ния света спектрах максимум оптической плотности при 257-261 нм, а минимум при 245-246 нм.

На основе спектров поглощения вирусов / Paul, 1959а, б/ установлено, что среднее содержание нуклеиновой кислоте в вирионах BMjjK равно 4,5?, а молекулярный вес их находится в пределах 90 *Ю6 - 100 'Ю6.

ВЫВОДЫ

1. При изучении динамики содержания вирионов в растениях Ricotiane glutinosa , зараженных ШцК или ВХ^К И В растениях Solamua demissum и S. acaule ,зараженных BMjjK установлено, что содержание вирионов изменяется скачкообразно. Максимальная концентрация ШдК и ВХ^К наблюдалась на ДО-й день, a BMjjK через три недели после заражения. Содержание fflgK -после кратковременного максимума быстро снижалось почти до нуля. Полученные- в опытах результаты показывают необходимость учитывать происходящиа в ходе развития заболевания большие колебания в концентрации вирионов и собирать листья для получения вирусных препаратов ври максимальном содержании в них вирионов.

2. Содержание макроэлементов / ira, к, с«, Ug , р / и микроэлементов / Fe, Cu, za. Ma, Mo, в, Sr / в зараженных BHgK и ЩдК листьях Hlcotiaaa glutinosa также менялось скачкообразно. Повышение содержания всех этих элементов наблюдалось на третий день после инокуляции, затем следовало понижение* которое через несколько дней, в зависимости от элемента и от вируса, сменялось новым повышением , при этом во время второго пика концентрация некоторых элементов в больных растениях превышала ношшнтрацю» их в здоровых растениях до 1,5 - 2,0 раз.

Предлагается гипотеза о взаимозависимости между ходом болезни, вызываемой вирусной инфекцией, скачкообразным характером изменения концентрации инфекционного вируса и дв-

- 38 -

намикой содержания минеральных элементов в больном растении.

Главной причиной хлоротических явлений растений при вирусной инфекции может быть образование комплексов или солей между вирионами или продуктами синтеза вируса /вирусная РНК, вирусные белки и т.д./ и металлами. Такие соединения с металлами могут в конечном итоге выэввать кажущееся /а может быть и действительное/ снижение концентрации вирионов в больном растении и выводить из процесса обмена вешеств нужные для растения минеральные элементы.При этом признаки и ход болезни в растении при вирусной инфекции определяются сродством вирионов или продуктов синтеза вируса /или одновременно обоих/ по отношению к определенным металлам.

3. Создана несложная аппаратура для быстрой очистки вирусов от растительных примесей усовершенствованным методом зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы, обеспечивающая хороший выход препарата и удовлетворительное его качество. Длительность процесса с использованием трис-глицинового буфера при напряжении 1000 в - 46 часов.

4. Впервые получены чистые препараты ЕИ^к . Для этого были разработаны два способа их получения¡выделение вирионов осаждением в изозлектрической точке и очистка при помощи а/ди£ференциального центрифугирования и б/зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы.

5. Разработан метод получения чистого препарата

-33-

ШцК с использованием дифференциального центрифугирования и зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы. Впервые получен этим методом препарат ВМ^К достаточной чистоты и в количестве, позволяющем изучить его физико-хи-кические свойства,

6. Полученные чистые препарата дали возможность изучить основные физико-химические свойства Ш^К . Установлено, что вирио» ШдК имеет "сферическую" форму со средним диаметром при оттененных препаратах 37 км, а при негативно контрестированных - 30 нм; содержание РНК в вирио-

пах - 1Ь%, нуклеотидный состав РНК в молярных процентах А№ФгГМФ:Ш£гУЙ> - 22,2:26,1:22,3:29,4; изоэлектрическая точка вируса при рН 5,6; состав белка оболочки вируса, выраженный в остатках аминокислот: Лиэ:Гис:Арг:Асп:Тре:Серг Глу:Про:ГлигАла:Вал:Мет:Клей:Тир:ФенгЦис - 19:4:23:47:25: 38:32:26:37:6:20:34:16:12:0.

Б отношении физико-химических свойств выяснилось некоторое сходство БНдК с ВОМх одинаковая геометрическая форма, размеры и содержание РНК. Однако вирусы различались по аминокислотному составу белка оболочки, нуклеотидному составу РНК и поведению в растворах солей некоторых ояно-и двухвалентных металлов. Ва основании имеющихся данных делается вывод, что в случае судя по его фиэико-хи-

мическим свойствам мы имеем дело с до сих пор не изученной формой ВОМ,. наиболее близкой по своим свойствам к форме

7. Определены впервые следующие физико-химические свойства ВМцК: спектр поглощения в ультрафиолетовой об-

ластя света / коррегирован в отношении рассеивания света/,

характерны* для нуклеопротеида, имеет максимум оптической

плотности при 267 нм; минимум оптической плотности - при

245 в*. Отновегая оптических плотностей Д = 1,29 и

Д мин

= от958.

•^260

Среднее содержание нуклеиновой кислоты в влрионах равно 4,5*.

8. Открывваяся в результате проведенных исследований возможность получения чистых препаратов позволяет при-

ступить * изготовлению высококачественных антисывороток на этот вирус и изучить его распространенность на разных этапах селекпии и семеноводства, установить степень вреда,наносимого им картофелеводству и выяснить пути инфекции, что необходимо для разработки мер борьбы с ним.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Некоторые; данные о так наз. вирусе я картофеля.Изв.АН ЭССВ,- Биология, 17 /4/:385-588,1968 /рез.эст.,англ./ /в соавторстве с К.Олсперт и К.Тарасовой/.

2. Методика очистки вируса М картофеля. Изв.АВ ЭССР, Биология, 19/Э/;231-234, 1970/на англ.яз.,рез.эст.,русся./ /в соавторстве с К.Олсперт и К.Тарасовой/.

3. Об исследовании так наз. вируса я картофеля электрофоре-тическим методом. Иэв.АН ХСР, Биология, 20/1/:79~ез,1971 /на эст.яз.грез.русск.,англ./ /в соавторстве с К.Олсперт и К.Тарасовой/.

4. Некоторые давнае о физико-химических свойствах вируса Я картофеля. Тезисы докладов У1 Всесоюзного- совещания по вирусным болезням растений, ч.Н:93, 1971.М. /в соавторстве с К.Олсперт/.

5. Несложный и быстрый метод зонального электрофореза для окончательной очистки некоторых вирусов растений. Изв.АВ ЭССР, Биология, 21/2/г189-192,1972.

6. Содержание неорганических элементов в инокулированных листьях Н1со£1ада еХи-Ыпова при инфекции вирусами I и1 картофеля, Изв.АВ ЭССР, Биология, 21 /4/:357-365,1972 /рез.эст.,англ,/ /в соавторстве с Х.Хёдреярв/,

Улрих Густавович Хёдреярв. Очистка вирусов М и н картофеля и изучение некоторых их фкзико-хиынческих свойств. Автореферат диссертации. На русской языке. Подписано к печатя Э£/1 1973. Печатных листав 2,75. У четш-издателъских листов 1,71. íhpa*. 250. Заказ Я 46. Ротапринт AHI ЭССР, г. Таллин, ул. Сакала, 3. Бесплатно.