Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование целлюлолитических ферментов Trichoderma raesei на труднометаболизируемых соединениях углерода

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование целлюлолитических ферментов Trichoderma raesei на труднометаболизируемых соединениях углерода"



МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАКЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЮГЕНИ К Е ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152

НАЖРАЙН АРИУНАА

ОБРАЗОВАНИЕ ДЕЯШЮЛИТИЧБСКИХ ФЕРМЕНТОВ ТпсМегта гвезе 1 НА ТРУДЙОМЕТАБОЛСЗИРУЕЫН СОЕДИНЕНИЯХ УГЛЕРОДА.

\

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического^ факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, • а лаборатории углеводов Института биохимии им. А. Н. Баха РАН я в лаборатории селекции и генетики грибных продуцентов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВНИйгенеткка).

Ваучныэ руководители - доктор биологических, лаук профессор Н. С; Егоров доктор химических, наук М. Л. Рабинович

Научный консультант - зав. секгорон генетики., и .сет-лекции грибнж .продуцентов. БНИИгекетика к. <5. н. Е. С, йзрозова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук.

. Н. А. Тиунова доктор технических наук М. К Геркет

Ееддая организация : Институт биохимии и физиологии микроорганизмов-РАН.

Зашита диссертации состоится ЪСЮ1-иЯ 1993 года

в часов на заседании специализированного ученого совета -Д 053.05.66 в Московском государственном университете иы. И.Е Ломоносова по адресу : 119899, Москва,. Ленинские горы, -'©!-. -.ологический факультет МГУ им. Ы. В. Ломоносова. .'

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан " 1993 года

Ученый секретарь \ "^щхР Шскункова КФ.

сдециа диаярованного совета

кандидат биологических каук

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема ферментативной конверсии целлюлозы, несмотря на интенсивное изучение в течение последних 30 лет, продолжает оставаться в центре внимания специалистов различного профиля - микробиологов, биохимиков, бг.отех-нологов. Особый интерес вызывает природа явлений, протеююших при глубоком гидролизе наиболее труднодоступной, зксокоулсря-доченкой целлюлозы в состазе расгителшой клеточной смети, где она образует сложную надмолекулярную структуру, с другими биополимерами, в первую очередь, с лэткином.

Именно поэтому в последнее вреш внимание привлекает вопросы, св.чзанжз с биосинтезом цехшсжаз на средах, .содержащих лкгноцелдилозные рэстительвые субстраты с низшм содержанием целлшозы. На этом направлен™ многие отечественные и зарубежные авторы видят перспективу оптжизации ферментного томплекса для утилизации наиболее труднодоступной, экранированной лигнином углеводно:} части субстрата.

Несмотря на наличие отдельна публикаций, -в настоящее время механизм синтеза цешшгаз ьа таких ?рудко.М1е?г6злцзируе-мьк нерастворкии субстратах изучен недостаточно; Известно лишь, что такие субстрат могут вызывать как активацию, так "и репрессии синтеза целлклаз. Имещчеся в литературе-' сведения показывает, что значительные резэрвы в повышении.; уровня биосинтеза целлмаз у грибсв могут закличаться в •использовании труднометаболгаируемкх соединений углерода наряду с легкомета-болиэкруемьш. не вывываипши 'сатаболитяой репрессии. -

В этой связи особый интерес прздстав.к:ег создание новых штаммов, адаптированных к синтезу целдшоллтичееких феркентов на средах .с . труднодоступной целлюлозой, а -такте изучение 'ферментных комплексов, участвующих з деградации таких трудаомета-болизируекаи субстратоЕ. , Как известно, до ностсявдгго времени пет единой точки зрения на кеханиаи ферментативного разложения нечболее труднодоступной части природной целлюлозы и роль отдельных ферментов б этом.процессе.

Дель и задали: исследований Целз кастокцей работы заключалась в изучении закономерностей и повышении уровня синтеза целлшгаз при "культивировании гриба ГПсЬойегта гееБв 1 на средах, содержащих, в качестве соединений углерода труднонетаболи-

зируемые лигнокедлюлозные субстраты, создании мутантных .шгаа-моб-продуцентов ферментов, адаптированных к: подобным.субстрата^', изучении-их ферментного комплекса и его отличий" ш гаш-" декса. известных -итаммов-продуцентов.

Научная новизна -работы. -Исследованы основные згксяамер,-. ности синтеза цэллетюлктических ферментов. ...трибам 'Ттгхйтодегш. гееээ 1 на- средах- с - аро;.шшле-ннш :Жтшцеллг^аныа;субстрг1,п2?,-.-и:"л его «адкфйкзнкяии:, при этой не обнаружат. 'Лряизй-:.;иэрр«жш .: медцу соотношением- - целлюлоз и и • лшчпма - в -субстрате- и'уровнегл.; биосинтеза целлшаз.

Еолучен-ьдтант Т.-геезеь 5/16, секретдауия^гй;в:1Р5гзш,г7раль-:" нун жидкость- цехиояаза с- более вьзаоккм-уровке.ч аггяш;остй"1ю сравнении с промышленные-шкиаюм-при- культивировзнии-на- средах с трудноште.болкзируемьми соединежяш-углерода*- -иеалейзвана его морфология. Показано, что повышение целлюлазной активности мутанта 6/16 -не-связано с изменением-чувствительности к-ката-болитной репрессия.

Установлено, т-:то ферментный комплекс-мутанта-6/16-характеризуется более -высокими- удельными акгивнэсткя} - -целлобкогид-родазы I, -внсокошлекулярной эндоглюганазы и ^ршкоевдазк, чем кошлекс -промыпшенвдго шташа. • Одновременно- показало, ..что-мутант-6/16 на средах с мгноцеллзсаюзным-субстратом.тюдуцкру^-ет -более-специфичный к деградации труднодеетутой--; це ышозы кошдекс-фзрмс-ктов, -чем прошшденЕьй жгшл^--.......-•Практическая -значимость - ^работы. ■ -Предлодеяа - циклическая схема превраиениа - лигноцеллшознсго сырья- -¡¡¡чем -двухстадийной обработки. Баперкой сидки-проводится-ферментативный-гидролиз сырья культурадыюй ищкостью гриба-продуцента целлшаз ■ с образованием глшозйого сиропа (20%). На- второй - гмгййфщирс-валный-остатох утилизируется грибом-продуцентом целлшлаз с образованием высокоатаивных ферментов для стадии ферментативного гидролиза.

Разрабоган состав новой ферментационной среды, на которой удалось повысить целлюлазную активность Т. геьзэ1 в 2,0-3,3 раза по сравнению с традиционно используемыми средами.

Полученный в результате многоступенчатой селекции мутант 6/16 обладал-в 1,5 раза более высоким уровнем синтеза целлллаз по сравнению с родительским гааммом я в 1,2 раза - по сравнению с лучшим промышленным штаммом.

Апробация работы. Результаты диссертации представлялись на J1 Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - аг-ропромытленному комплексу" (Черновцы, 1991), 7 Европейской конференции по использовании биомассы в знергетжс, -сельском хозяйстве, экологии, прошзленности (Флоренция, 19S2), II ЗАэж-дународноП юткфгрецции "Грибные целлюяаэы и родственные, фзр-: менты - Tricel 93" (Шйвкк, Финляндия, 1693).

Публикации. Ш р-зэузътатам диссертации оиуйлтсосанн 4 печатное работы.'

Структура и обгем диссертации. Диссертация . состоит ш.ь введения, обзора литературы, описания -объектов, п методов, исследования, изложения результатов-и их обсугдешга;; визодсв л списка цитируема й литературы. Работа иалоиена на 120 страницах, содержит 14 рисунков и 15 таблиц. Список цитеруемой .литературы включает 143 источников.

ЭКСПЕРНЫЕНТАЛЬШУ! ЧАСТЬ Объекты и -методы исследований

■ ■ Объекта!« исследований являлись два ппам1Э- Trichoderma reesei, полу^екше во Всесоюзном научнб-иссхздовэтельскок! институте генетики: ВКШ F-79 и F-12D, а таюж мутанта- этото гриба, полученные в ходе исследований.

Все-изученные штампы культивировали в азркруаж условиях в колбах на регламентной среде следущэго состава f Х):---ивекло-вичный-жэм-—4,0, солодовые роеткк-1,43, птаничшгэ"отЁ7бм-5,0; (МН4)^04-0,б. КН,Ра -0,2. bfeSO,-O.C5. В зкепегиентах, целью которых являлось повышение продугсгивносте ыутактов, • в составе указанной среди в качестве соединений углерода Енеето -свекловичного i^.va ¿обаакя^ш лчгкоцедхшозу, яргдстазлшощую собой промышленный отход фурфурольного производства с содержанием лнгпгаа и целлюлозы 45 и E0I, соответственно. Еспожзованы тагаз .кодификаций этого субстрата, полученные в процессе -вы-" полненкя данной работа В качестве источников органического азота, наряду с пиешгчнши отрубями, «саользовгля Селково-ви-тачинный концентрат (БЕК) лрошазеаного производства Культивирование осуществляли в 100 кл ферментационной среды в колбах Эрленмейера (750 мл) на качалке (250 об./мин) при температуре 28-30* С в течение 8-9 суток.

Для получения трудкометаболизируеыого субстрата гроводшш глубокий ферментативный гидролиз лигиоцелдвлозы .в peaicrope постоянного перемешивания объеиом 400 ил при температуре 50' С. В качестве источника целкояаа использовали .-фидь.траз,.-,:пудьту—. ралыюй жидкссти Т.reesei -штамма-F-1?0 и мутантов.-: этого-хриба. . Гидролиз проводили в течение 8-9 часов.

Для подучэния-мутантоз в -работе использовали.•■ следующие мутагенные факторы. .1. УФ-облучение. Облучение водных суспензий, котдай: осуществляли лампами БУВ-15. Интенсивность излучения-составляла./ около 120 эрг/4ш /сек.- • Врешь облучения варьировали-..•в---зевйси-.' «ости от приъвнязмой дозы УФ.

2. ■ Н-метал-Н-нитро-^-Естрозогуелилг-ш (НГ).- ■ Дяя обработки-конидий суспензии и раствор НГ готовили на 0,15 М фосфатном буфере СрН 6,0). Конечная концентрация мутагена в суспензиях составляла 200 ыкг/кя, вреш экспозишм - 2 и 3 часа.

Активность ферментов шлжодачнэго комплекса-по-фильтровальной -бумаге -определяли -согласно • методике, • рекомендованной комиссией IIFAG (1981). Зндоглюганазвую к целлобиазяую гкткв-ксстк определят по-методу- Клееова с соавторами (Клесов к др., 1980)-. - Цзлдобиогидролазу определяли спектрофотокетрикески, используя - в качестве субстрата п-нитрофенил-^-О-лактозид (Рабинович и др., 1986). Ксиланазу определяли, по методу,- рекомендованному комиссией IUPAC.

Редударузгаие сахара определяли со методу Яомоди-Нельссна (Sonoqui, 1952), глшозу - -гдюкозооксидззао-сероксздгзвш-ш-тодом (Бэрезлн и др., 1977).

Фракшюшрование -белков культуральной шдкости-гриба проводили с поыояью ультрафмьградионного разделения ка-устачо.и^ - Мшшмодуль производства Ассоциации Плестек (Ст -Петербург), оснащенной иэмбранами Биопор Т-ЗС с пределом задержания 20 кДа, гель-проникакгдгй- хрош.тографик-на »есткоячюеителе Тойе-перл НУ-50 производства Тойе Сода (Япония), а также аналитического SDS-электрофореза в градиенте полиакриламидного геля 8-20Х на прйоре Ыинивагон (Swank and. ¡¿unkres, 1971). В качестве Оелкоз - маркеров по молекулярной массе использовали набор фирмы "Pharnaoia", включащий мког лобик (116 кДа). шо -глобин 1+П (67 кДа), шоглобин t (43 кДа), мшглобин II (2Q.5 кДа), миоглобкн Ш (20,1 кДа).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Известно, что уровень активности ферментов-в культураль-ной жидкости продуцента определяется двумя основами ■ фактора- ми: продуктивностью используемого итамма и составом ферментационной средн. В этой связи работу проводили в-даух направлениях, а икенно:

1. Получение новых мутантов • гриба с ловженной акгиз-иость ю.

2.- -Подбор состава среды с использованием в качестве ■источников - -углерода -дешевого -лигноцэллшозного субстрата, обеспечивающего наиболее полное выражение потенциальной способности мутантов ■ синтезировать целлшазы.

1. Получение мутантов Trichoderroa reesei о повышенной активностью.

Первым этапом работы являлось создание высокопродуктивного -штгьма, способного давать высокий выход ферментов на труд-но!ктаболшз:труемых соединениях углерода, примерок-которых является ■ лигнсцеллюлоза.

В-качестве родительского был выбран пггаш Trícboderma reesei F-79, который являлся исходным для -получения промышленного nrraMMaF-l?.0. й^р--штажз F-78 -биа обусловлен тем, что он претерпел меньше стадий мутагенеза, чем-нрошшленный-штамм F-12Q. На рис.1 показана схема получения мута&га -6/16, где видно, что в процессе селекыки били--использованы УФ-облучекие в различных дозах, химический мутагенез (нктрозогуанидин), чередующиеся со стадиями естестзекного отбора, а также отбор на среде с антиметаболитом - 2-дезоксиглюкозой.

Ва первой ступени селекции после УФ-облученва- был отобран -морфологически-измененный- мутант б, отличающее* от исходного nrrajíMa F-79 белым цветом-конидий. На последующих этапах селекции все выделенные мутанты, независимо от используемого мутагенного ф^стора, сохраняли этот признак, и отбор в основном осуществляли по уровню их целлюлолитической активности. Стабильность признака образования целлюлаз в популяциях, выделе?-

Вб В4 Л Е. о

Рис. 1. Схема получения мутанта 6/16 Тг1спес1егта геезе1 .

| УФ 31-67

УФ - ультрафиолетовое облучение; НГ - И-метила-нитро-М-нитрозо-

-67-1с 67-6 67-5с | Е. о 6/16

гуанидин; 2-ДГ - 2-дезоксиглшоза; Е. о. - отбор без применения мутагенных- факторов. -

ных на разных этапах селекции мутакгов в каждом случае проверялась путем изучения их-.естественной изменчивости и отбора наиболее продуктивного варианта. Необходимость подобной проверки определялась тем, что среди вариантов, полученных после обработки мутагенами, иногда появлялась колонии- с сектораш и колонии, образующие в местах соприкосновения валики, что могло свидетельствовать о негашюидном строении их генош- и -В' -дальнейшем • приводить к ввдепленихз низкоакгившх форм: - Приведении: на рис. 2 (А и Б) гистограммы показывают типичные пределы естественной изменчивости двух промежуточных вариантов Г-79-6 и Во, последний из которых выделен из валика, образованного двумя колониями, полученными после обработки конидий НГ. Сходные и достаточно ограниченные пределы изменчивости популяций этих мутантов позволяют считать, что последний из них, по меньшей мере, не является ни дишюидсм, ни гетзрскарионбм.

Исследование уровней биосинтеза целлшаз в популяции про-ме^точаого варианта 67-6, выделенного-со среды с 2-ДГ, выявило ее гетерогенность Срис. 3 А), что определило проведение дополнительного этапа естественного отбора, в результате которого выделен стабильный мутант 6/1Б (рис.3 В) с поваиенкой продукт явностью.

Количество вариантов 60

50

40

30-

20-

10-

П

Ц-

20 60 100 140

активность , 7.

Количество вариантов 70-1

6050-1 40 3020-1 10-

Ц-

t-

20 60 100 Активность , 7. Рис. 2. Естественная изменчивость мутантов Р-79-6( А) и Вб (Б) по уровню синтеза целлшаз

Количество вариантов 60-1

50

302010

£

20 60 100 140 180 Активность,» Количество вариантов 70

5050-1

40-

30

20-

10-

I

20 60 100 140 Активность , % Рис. 3. Естественная измен -чивость мутантов 67-6 (А) и 6/16 (Б) по уровню синтеза целлшаз

• - 9 -

Мутант 6/16 морфологически отличался от исходного штамма г-?9 более пушистым воздупным мицелием и белой окраской конидий. При росте на среде со свекловичным ¡шмом мутант 6/16 имел в 1,5 раза более высокую активность, чем родительский шташ, и з 1,15 раза - чем промышленный штамм Г-120 (табл. 1).

Таблица. 1

ЯедлшолЕТИческая активность, мутантов Т- гееэе! при культивировании ка среда, содеркащэй свеклоскчный :аюы

Мутанты ед/.чш Отношение к активнос- Отношение к активнос-

ти тачая F-79, % ти штампа F-120 , Z

F-79-6 11,8 107,3 -.. 79,7

6-6 13,5 122,7 91,2

Вб 13,2 120,0 89,2

В6-31 15,2 138,2 102,7

6/16 16,9 153,6 114.2

F-79 11.0 100,0 74,3

м» 14,8 134,5 100.0

Таблица 2

Целлюлолитическая активность Т.гееБв! штамма Г-120 и мутантов при культивировании на средах, содержащих различные концентрация лигноцеллюлозы и 51 ппэничных отрубей

Мутанты Лигнсцеллюлоза, 1

3,0 3.5 4,0

ед/мд Z ед/мл % ед/мл Z

В5 14.1 53,2 34.0 100,0 22,5 60,3 Еб-31 33,2 125,3 29,3 86,2 31-67 - - 33,4 98,2 26,2 70,2 67-6 - - 38,8 114,1 35,7 95,7 6/15 - 46.2 -123,9 F-120 26,5 100,0 34,0 100,0 37.3 100,0

При культивировании ка среде с лигноцеллшоззым субстратом разница в активности мутанта 6/16 и промышленного штамма составляла 25% (табл. 2).

Поскольку одна из стадий селекции включала отбор на среде с 2-ДГ, необходимо было выяснить, не определяется ли повышение целлшгзной активности мутанта 6/16 его меньшей по сравнению с контрольные птакмоч F-120 чувствительностью к катаболитной репрессии. С этой целью была предпринята попытка исследовать влияние добавления в среде глюкозы ¡¡а синтез целлшаз мутантом 6/16. Ра основании дииа«ики накопления целлшаз обеими культурами (рис. 4) глюкозу в количестве 2% и 5Z вносили в среды с лигноцеллюлозой при их засеве, а также на 5 и 7 сутки культивирования. Результаты экспериментов показали, что при добавлении 57. глюкозы, независимо от сроков ее знесения в среды, син-тег целлшаз у обеих культур ' практически прекращался полностью. Добавление же 27. глюкозы приводило к одивяксвому сни-зганив целлкшазной активности на 50-65% (табл. 3).

Таблица 3

Влияние на целлюлодитическую активность мутанта 6/15 и штамма F-120 добавления к среде с лигноцеллюлозой-2% глюкозы*

Добавление глюкозы Мутант 6/16 йтзмы F-120

ед/мл % ед/ш Z

Ери посеве На 5 сутки роста Ка 7 сутки роста 15,0 41,5 13.5 39,7 17,5 49,7 16,0 46,9 12,7 36,0 11,6 33,9

Без добавления 35,3 100.0 34.1 100,0

* - указанные уровни активностей определены ка 9 сутки роста

Полученные даияке позволили сделать вывод, что увеличение целлюлазной активности мутанта 6/16 вряд ли связано с его чувствительностью к катаболитной репрессии и определяется иными изменениями в механизмах синтеза или секреции ферментов.

- 10 -

i., гсыработкз состава ферментационной среды для синтеза целлюлаз мутантами Trichoderua reesei.

Известно, что рост и развитие микроорганизмов, а также, об-jd-зование ими ферментов находятся в тесной зависимости.от питательной среда и условий культивирования.

Нами была изучена возможность предварительной-обработки яигнопеллюлозн с использованием биохимических- и физико-хши-ксгах методов, которые позволяют разрушить естественную структуру биополимеров, входящих в ее состав, и,. таким- образом, повысить-их усваиваемость микроорганизмами.

Б результате различных способов предработки лигноцеллю-лозиого -субстрата нами получены 11 модификаций исходной лигво-целлвдозы, которые использованы в качестве основного компонента питательной среды для выращивания штамма F-120, с целью выяснения роли соотноаения лигнина и целлюлозы- в среде ■ для синтеза целлюлаз и повывения активности ферментов (табл. 43.

Как следует из данных таблицы 4, использованные субстраты даот в 1,5-2 раза более высокие выходы фермента, чем свекловичный жом. - &ялучшей оказалась промытая водой и высушенная исходная лигвоцедлшоза при концентрации в среде 3-3,5%. что соответствоваю содержанию чистой целлюлозы 1.7-2,0% (табл. 4). Меньшая, но также достаточно высокая активность (.22,0-23,0 ед/мл) была достигнута и на средах с отбеленной лигноцеллшо-зой (аналог микрокристаллической целлюлозы) после последовательной обработки щелочь» и гшохлорнтом (табл. 4).

Зги результаты показали, что выход ферментов в ходе частичной экстракции субстрата щелочью, удаляадэй около 70% лигнина, не только не увеличивается, но, напротив, даже уменьшается , и лиеь при почти полном удалении лигнина целлшолити-•«пкая активность приближалась к значениям для исходной лиг-цаллшозы

На основании этих экспериментов нами был сделен вывод, что в отличие от процесса ферментативного гидролиза, в котором степень гидролиза целлюлозы определяется соотношением целлюлозы и лигнина в образце, биосинтез целлюлаз грибом не зависит напрямую от этого показателя.

При зтои необходимо отметить, что во всех изученных слу-

Таблица

■ Целлтолитическая активность штамма Т. reese; "-120 при культивировании на средах, содержали* различные концентрации высутгенной лигноцзллюпозь

Источник углерода в среде Содержание лигноцеллшо-зы в среде, 7. Содержание чистой целлюлозы в среде, I Активность (Ед/мл)

Исходная лигноцеллю-лэза 1 СО СО СЛ о 1.7 2,0 1'с.о 15.1

Исходная лигноцеллю-лоза, промытая 3.0 3,5 1.7 2.0 24,4 J 24.0 1

Лигноцелдшоза, обработанная щелочью 1,6 8.0 1,4 1.7 . 21. t 1 19.S

/¡игноце.окяоза, обработанная щелочью и гипохлоритом 1.5 1,9 2,5 1.4 1,7 2,3 22, & 23,1 16,? j

Лигноцеллюлоза,обрабо- 2,3 танная ферментами 3,5 1.1 1.7 1С,4 ! 14.3 !

Лигношллшоза, обрабо- 1,9 танная щелочью и фер- 2.3 ментами 2,3. 1.1 1.4 1.7 11.4; lfc.4 | 1С,4 j 1

Лигкодаллхшоза, обрабо- 1,6 танная щелочью, фермен- 2,2 тами и гипохлоритом 2,7 1.1 1.4 • 1.7 1 i ,Г; 16,7 16,2

Свекловичный жом 4,0 1'7 10,7

чаях вькод фермента превышал его выход на стандартной регламентной прошпленной среде со свекловичным жомом, а расход субстрата был меньше, чем расход жома.

Исследование динашки накопления цэллюдаз при культивирования штампа Г-120 на средах с промытой высупенной лигнсцеллю-лозой и свекловичник; жоысм показало, что интеьсквное сбрчзоза-ние ферментов при росте гриба на первой из них -начинается с б-х суток, когда на второй среде этот процесс уж замедляется. Максимум накопления- цедлшаз на среде с лигяоцелдхшозой наступает на сутки позж, чем на среде со свекловйчв.ыы жомом, при сходных значениях рН культуралвнш жидкостей (рис.4).

Активность, ед. /мл рН среды

1 23456789 Продолжительность культивирования, сутки

В процессе подбора состава среда нами была обнаружена сильная зависимость активности от концентрация- лигноцеллшозы. Как видно из таблицы 3 (см. предыдущую глазу), повышение ее содержания от 3 до 4% приводило к росту активности прожшлен-ного штамма в 1,5 раза. Мутант 6/16 в этих условиях давал активность, в 3 раза превышающую активность на регламентной среде с таким же количеством свекловичного »ома- ¡»этому было сделано заключение, что дальнейшее повыпениэ активности может быть достигнуто за счет повышения содержания отхода в среде более 4%. Следует отметить, что повышение содержания целлюлозы в среде до 81 и Солее рекомендуется рядом зарубежных авторов для повышения синтеза целлюдаз С6г11о В. 1333).

- 6

г

Рис. 4. Динамика накопления целлюдаз в культуральной жидкости штамма Р-120 при росте на среде со свекловичным жомом (1) и исходной лигноцеллю-доасй (2), содержащих пшеничные огруби.

- 13 -

Исследования, однако, показали, что дальнейшее повышение содержания лигнрцеллюлозного отхода снижает активность (табл. 3), как можно полагать, за счет высокой вязкости среды и утс/диения аэрации. Козтому дальнейшее совершенствование состава среды проводилось в двух направлениях:

1.Замена исходной лигноцеллюлозы, имеющей большую вязкость, на се труднсметаболизируемый ос-таток после глубокого ферментативного гидролиза, что одновременно позволяло реализовать циклическую cxei>iy 'биоконверсии лигноцеллюлозы

2. Замэна 57. пшеничных отрубей в среде на другой источник органического-азота, более концентрированный и имеющий меньшую вязкость.

Для получения трудно.метаболизируемого субстрата проводили ферментативный гидролиз лигкоцехщояозы в реакторе постоянного перемешивания объемом 400 мл в течение 8-9 часов, при температуре 50 градусов. В качестве источника целлюлаз использовали фильтрат культурачьной жидкости Т. reesei с активностью 3C-35 ед/мл. в результате ферментативного гидролиза получены глкетз-ный сироп концентрацией до 20% и трудногидролизуемьй субстрат, содер.тсащэй 35-402 чистой целлюлозы, для культивирования мутан-

Таблица 5

Целлаталитичгская активность мутантов Г.reesei и штамма F-120 при культивировании на среде, содержащей обработанную ц&ШЕаназа'лИ лигноцеллшозу и ¡щеточные отруби (5Z)

Мутанты Содержание лигноцеллшозы з среде

3.0Z 3) 5Z - 4,5% 5,5л

ед/мл 7. л) ед/мл Z *) ед/мл X *) ед/мл Z *)

В6 15,0 65,2 15,6 51,1 - В6-31 23,7 103,0 18,9 62,0 21,7 69,5 12,3 48,4 32-67 - - ' - - 32,3 103,5 22,1 87,0 67-6 - - 33,2 106,4 16,6 65,3 6/16 - - 29,8 117,3 F-120 23,0 100.0 30,5 100,0 31,2 100,0 25,4 100,0

*) Данные отнесены к активности штамма F-120

тсь v, ¡птаммоЕ 7. reese: в качестве соединений углерода в среде. Разрушение таких субстратов в процессе ферментации происходит медленно, в результате чего сильно понижен стационарный уровень продукта-глюкозы, являющейся катаболитным репрессором, а уровень биосинтеза цедлюлаз значительно превышает выход ферментов на более легко усвояемых видах целлюлозного сырья .'[Морозова Е.С. и др., 1987J.

В таблице 5 представлены результаты использования трудно-гидролизуемого остатка. вместо исходной лигноцеллюлозн в среде культивирования. Бри зтом бшо замечено, что дальнейшее увеличение содержания остатка в среде при сохранении эффективной аэрации возможно только после замены 57. пшеничных отрубей на другой источник органического азота

В таблице 6 представлены результаты экспериментов по культивированию мутантов и штамма F-120 на средах, содержащих в качестве источника органического азота и витаминов вместо пшеничных отрубей белково-витаминный концентрат" тормовых'дрожжей (БВК), а также обработанную фермента'® лигноцедшиозу в различных соотношениях. Полученные уровни активностей показа-

Таблицаб

Целлшолитическая активность мутантов Т. reesei и штамма.

F-120 при культивировании на средах, содержащих обработанную . ферменташ лигноцеллюлозу и БВК в различных соотношениях

Содержание субстратов, 7. Целлшолитическая активность

Мутант 6/16 ед/мл % Игамм F-120 ед/мл %

Лигноделлюлоза БВК

7,0 1.0 27,0 107,1 25,2 100,0

8,0 1.0 22,8 90,5 25,2 100,0

9,0 1.0 19,7 103,1 19,1 100,0

10,0 1,0 13,8 72,2 19,1 100,0

7,0 2,0 43,2 125,2 34,5 100,0

7,0 2,5 41,8 111,5 37,5 100,0

7,0 3,0 40,0 98,0 40,8 •100,0

10,0 2,0 39,0 89,2 43,7 100,0

10,0 3,0 45,9 108,5 42,3 100,0

ли, что для обеих культур наиболее оптимальна! концентрация обработанной лигноцеллюлозы составляла 10,07., а содержание БЕК - 37, для мутанта 6/16 и 27. для штампа Р-120.

Дальнейшая работа по оптимизации состава среды заключалась в изучении возможного влияния на активность мутанта 6/16 содержания в среде основных солей - сернокислого аммония и од-нозамедонного фосфорнокислого калия - на фоне различных концентраций БВК. Полученные результаты показали, что при содержании в среде 2,57. БВК концентрация сернкислого аммония может быть без ущерба уменьшена по сравнению со средой с пшеничными

Таблица 7

Целлюлолитическая активность мутанта 6/16 Т. гееБе1 при культивировании на средах, содержащих 107, обработанной ферментами высушенной лигноцеллюлозы, различные концентрации БВК, (Ш^БО, и КНгР0,

Содержание компонентов в среде, 7. Активность *

лигноцел- БВК КНгР0, ед/мл У

люлоза

10 2,5 0 0,2 45,7 95,4

10 2,5 0.3 0,1 48,1 100,4

10 2,5 0,3 0,2 55,5 115,9

10 2,5 0,6 0,2 55,7 116,3

10 2,5 0,6 0,3 41,6 86,8

10 3,0 0 0,2 46,7 97,5

10 3,0 0,1 0,2 49,9 104,2

10 3,0 0,2 0,2 52,1 108,8

10 3,0 0,3 0,1 46,6 97,3 |

10 3,0 0,3 0,2 54,1 112,9 !

10 3,0 0,3 0,3 54,2 1 ^ А 1 ;

10 3,0 0,6 0,2 49,1 102.5

10 3,0 0,6 0,3 47,1 98,3

*) активность в X указана по отношению к максимальной активности штамма Г-120. полученной при росте на среде, содержащей 1 ОХ лигноцеллюлозы, 37. БЕК , 0,37. (N^30, и 0.27. КНгР04 -47,9 ед/мл.

отрубями в 2 раза, а при концентрата БВК 3,0% снижение содержания С МН^ Б0< до 0,3% является необходимым. Б обоих случаях при более низких концентрациях сернокислого аммония в средах (0,37.) активность мутанта 6/16 достигала 54,0 - 56,0 ед/кл. Варьирование содержания в средах КН2РО^показало, что его обычная концентрация 0,2% для мутанта 6/16 является опттгальпо£.

На рис. 5 показана сравнительная, динаьика синтеза целлюлаз на подобранной среде штаммом Р-120 и мутантом 6/16. Видно, что до 6 суток синтез целлюлаз идет быстрее у нромшикнлого -.втам-ца, . однако в последнее двое суток новый мутант синтезирует целлшазы со вдвое большей скоростью. Необходимо подчеркнуть, что уровень синтеза ферментов на среде с обработанной целдзола-зами лигноцеллшозой и БВК в 3 и более раз превышает показатели для регламентной среды со свегаювичным юмом и пшеничными отрубями.

Активность, Ед/мл 48-1

40-

32-

24-

16

--1-1-1-!-

2 4 6 8 Продолжительность культивирования,сутки

Рис. 5. Динамика накопления целлюлаз в кулмуральной жидкости мутанта 6/16 (1) и пгтаа Р-120 (23 при росте на среде с лкгноцел-люлозой, обработанной ферментами, дополнительно содержащей 3% бел-ково-витаминный концентрат.

Таким образом, проведенные эксперименты привели к следующим результатам:

1. Подобрана новая среда для полученного в процессе рабо-

ты продуктивного мутанта Т. гее5е1 6/16, обеспечивающая накопление в гсультуральной жидкости целлшаз с активностью 54,0-56,0 ед/мл; «--

2. В составе оптимизированной среды использовано дешевое и доступное - сырье - лигноцелдшозный отход производства фурфурола а высоких концентрациях (102) и БВК;

3. Б процессе работы определены необходимые условия подготовки лигроцеллюлозкого сырья для использования в. ферментационной среде для получения цеялюлаз.

3- Выделение и сравнительная биохимическая характеристика компонентов цедкмдззного комплекса .чутзнта 6/16 и штамма Р-120

Представляло- интерес - выяснение причин, более высокой цел-люолитическо.Ч активности культуральной яидкости полученного мутанта изучаемого гриба по-сравнению с-промышленным продуцентом ( твтаым Р-120) при культивировании на аналогичных средах. Необходим подчеркнуть, что в экспериментах по оптимизации условий биосинтеза фермента наш определялась суммарная целлю-лгзная активность по методу Макдельс-Еебера, которая является достаточно сложным показателем и не отражает биохимически увеличение активности какого-либо конкретного компонента целлх/-лазнэго кокялекса.

Как ухе отмечалось выше, динамика синтеза ферментов у обоих штаммов различна (рис. 5). В этой связи мы предположили, что у них мо/жт отличаться и компонентный состав целлшазного комплекса Как известно, целлюлазный комплекс микромицетов состоит из нескольких основных компонентов, динамика синтеза которых различна

Бсвая среда-включает (7,):

Предработанная целлюлазами высутэнная лкгноцеллшоза Белково-витаминный концентрат Солодовые ростки

10,0 2,5 1,43 0,3 0,2 0,06

(МНЖ БО, КИ:Р04

Было проверено фракционирование белков культуральной ¡яд-кости мутанта 6/16 и промышленного штамма Г-120 Т. геезе1 с помощью ультрафильтрационного разделения на мембранах с пределом задержания 20 кДа, гель-проникающей хрокагографли на жесгкш носителе с оптимумом разделения в диапазоне 10-50 кДа, а татаэ аналитического Я)5-элекгрофореза в градаенге лоанакрилакиднсгго геля 8-20%.

На рис.6 (А,Б) приведены типичные хроматограммы гель-фильтрационного разделения белков культур адотой жидкости мутанта 6/16 и промышленного штамма Г-120. Как видно из этих рпсужмв, мутант 5/16 преимущественно сектетьрует белки с молекулярной массой более 40 кДа, тогда как у проыышешюго штамма Г-120 спектр белков более широкий, в особенности, е нкзкеи-олэкуляр-ной области. Аналогичная картина была получена с помощью Ж-электрофореза, показавшего наличие у етамма Р-120 значи-, тельного числа полос в промежутке мезду 40 и 20 кДа Сркс. 7), которые значительно слабее были выражены у мутанта 6/16.

Молекулярные тссы основных белков из культур обоих штаммов приведены в таблице Б.

Таблица 8

Молекулярные кассы оенозных белгеов, . секретируемых мутантом 6/16 и штаммом F-120, по*данным градиентного -

3

—fUtófi

SDS-электрофореза

Мутант 6/16 | Штамм F-120

110000 60000 55000

110000 60000 55000

.а

32000-38000 22000-28000

Рис. 7. Данные SDS-электрофореза при разделении белков культуральной жидкости мутанта 6/16 (1) и штамма F-120 (2), выращенных на новой среде. (3)

— иатдогшис» fia тпгы

Рис. 6. Гель-фильтрационное разделение целлшаз птамма Г-120 (А) и мутанта 5/16 (Б) на жестком геле Тойоперл Н¥-50. 1 - поглощение при 280 нм, 2 - зндоглкканазнзя активность, 3 - целлобиазная активность, 4 - целлобисгидролазная (ЦБГ) активность, 5 - ксиланазная активность.

- 20 -

Исследование распределения ферментативных активностей по профилю хроматограмм (. рис. 6 А, Б) показало, что мутант 6/16 характеризуется в три раза более высокими удельными глстивностями целлобиогидролазы 1 (основной компонент целлюлозного комплекса гриба Т. l-eesei с молекулярной массой 60-65 кДа по данным -электрофореза в денатурирующих условиях). Удельная • целлобиаз-ная (j-глюкозидазвая) активность, ассоциированная с зтим же иироким пиком, также в 3-4 раза выше у мутанта 6/16 (табл. 9). Из данных литературы известно (Berghsm L. et al, 1975), что внеклеточная целлобиаза гриба Т. reesei имеет молекулярную массу 45 кДа.

Наиболее существенные качественные отличия наблюдаются Т. reesei содержит несколько эндоглккаказных Тенов (Kubicek К. ct al., 1992). Наиболее изучены три фермента, колируемых самостоятельными гена!®: зндоглюканаза I с pi 4,5, зндоглкканаза II с pi 5,3-5,4, ииеэаие молекулярные ¡.secи в области 45-55 кДа, а такте нмзкошдекулярная зндоглкканаза с молекулярной массой в области от 20 до 30 кТ5а (приводимые здесь шрокие пределы мслегулярнш- весов .тая каждого из ферментов означают, что они могут присутствовать б культуральной жидкости в различных множественных формах, отличающихся молекулярной массой в результате посттрат ляциокных модификаций).

Таблица 9.

Удельные активности компонентов целлнлазного компекса промышленного штамма F-120 и мутанта 6/16 по данным гель-хроматографии

Ферменты , № (kDa) Активность, ед/мг

6/16 F-120

целлобибгидролага I, 60 0,04 . 0,01

эпдоглюканаза 45-55 9,2 2.6

эндоглюкадаза 25 . ' - 0,62

целлобиаза 45 0,6 0,2

ксиланаза 40 2,5 3,5

- 21 -

Как видно из сопоставления рис. б и 7, мутант 6/16 не образует в заметных количествах низкомолекулярную зндоглюканазу, тогда ¡гак у промышленного штамма Г-120 она присутствует. Хроме того, основная форма высокомолекулярной эвдог;шканазы у мутанта 6/16 имеет более высокую молекулярную массу, чем у промышленного штамма. Удельная активность этой формы фермента .у мутанта 6/16 тате в 3,5 раза выше.

Помимо белков, участвующих в разложении целлдлоаы, лигно-целлюлозный субстрат индуцирует также синтез некоторых ксила-наз [КиЫсэк К., 1932], Нами обнаружена сопоставимая активность вксохсыэлекулярной ксиланазн у обоих итаммов (рис.6 и табл. 9).

В состав белков, секретируемьпс обоями штаммами, входит' также общий высокомолекулярный компонент с молекулярной мгссой, превьиащей 100 кЛа, невыясненной природы.

Таким образом, подученный мутант о/16 отличался о? промышленного штамма Р-120 Т. гооз«1 по ряду показателей.

Во-перзых, он характеризовался з 3-4 раза более зыеокой удельной активностью целяебиогидролазы I, вжокомолекулярной эндоглкканазы и, что особенно важно, целлобиазы. Последнее является серьезным прэк.\!уиествсм, т. к. ферментные комплексы Т. гесзе!, как правило, содержат низкий уровень целлобиазы и в качестве продукта гидролиза целлхигазы образуют в основном цел-лобиозу, а не г.таксзу.

Во-вторых, мутант 6/15 не образовывал низко молекулярную зндоглюканазу.

В этой связи необходимо ответить следующее обстоятельство. В настоящее время полагают, что наиболее зажжи компонентами целлюлэзного комплекса ТпсЬойегта геезе1, определяющими способность ферментного комплекса гриба к деградации высокоу-порядочешоЯ, кристаллической целлюлозы, являются неллобиогид-ролазы I и II, а также эндоглсканазы I и II - белки с молекулярными масса».« в пределах 40-60 кДа [КиЫсек К., 1992]. Особенностью этих ферментов является то, что в их состав входит, помимо активного центра, • так называемый сорбцискньй или целлю-лозоспязывашяй домен (Рабинович М.Л. я др., 19381. Кроме этих ферментов в состав цэджшазного кошлекса данного гркба, как правило, входят другие, более нмзкомслзкулярные эндоглкканазы строкой специфичности, не принимающие участия в деградации

кристаллической целлюлозы. Эти ферменты не содержат цехиоло-зосвязьшашего домена, и их функцией, как полагают, является разрушение смешанных Оета-глюканов, присутствующих в растительной клеточной стенке.

Целью кашей работы являлась селекция штамма, . способного утилизировать наиболее трудно мегаболизируемуя часть целлюлозы липюцеллшозного субстрата, предварительно подвергнутого "глубокому ферментативному гидролизу. Видимо, этим обстоятельством и объясняется отсутствие у него' значительного синтеза кизкомо-лекулярнкх зндоглкжаназ при одновременном повышении уровня синтеза высокомолекулярных ферментов, специфических к'разрушении кристаллической целлюлозы Низкоколекуашршэ зндоферменгы,; присутствущке- у .промавленного штамма, очевидно, - не .требовались _ ),мутанту, поскольку субстратом для их расщепления служат наиболее доступная часть целлюлозы и родственных бета-глхка-нов, удалявшаяся нами в процессе предгидролиза.

ВЫВОДЫ:

1. Б результате многоступенчатой селекции, из игамма Т. геезэ1 Р-73 получен морфологически измененный мутант 6/16, обладаний в 1,5-раза "более высоким уровнем синтеза целлслив"-по-сравнению с родительским штаммом и в 1,2 раза - по сравнении с .лучшим промышленный штаммом 5-120 этого гриба...

■' 2. Исследована дикашка и показана вззьтаассть •зЙежтиЕ-. нсго синтеза цедлюгаз мутантом 6/16 и промышленным итаккои-г-120 на средах с содержанием трудзометаболизкруемого лиго4я-" цкреванного сырья до 10% при наличии з среде- органического источник? ■ азота. -

3. Разработаны общие принципы нспольсоваккя труднокзтабо-. лизируемого целлюлозосодершшего субстрата с высокий содержанием лагниЕа для ьоэьшеная биосинтеза, цехчдааз грибом ТПсЬос)еггга геег^г. В результате проведенной оптинизаэди активность ферментов в среде культивирования удалось повысить в 2-3,3 раза по сравнению с традиционно исиойьзуемыми средами.

4. Изучен спектр ферментов синтезируемых мутантом 6/16,в сравнении с промышленным штаммом,. ва среде с наиболее трудно- расщепляемой целлюлозой. Показано, что ферментный комплекс но-лученного мутанта характеризуется более высокими удельными ак-

тивпостлми ферментов, принимающих участие в деградации [фисталличес:сой иедлюлозьс целлобиогидролазы 1, эндоглюканазы с молекулярной массой 60 кДа и целлобиазы, тогда как у промышленного кгакма обнаруживается высокая активность ш;огочолеку-лярксй эндоглокаказы.

5. Ерэдлодана циклическая схема биоконверсии лигяопеллю-лозы путем двухстадийной трансформации. Ка первой стадии проводится его ферментативный гидролиз культуральной жидкостью гриба-продуцента целлшаз Т. геезз<-с образованием.глякозного сиропа концентрацией до 20%. На второй стадии труднометаболи-зируемый, обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибоа-продуцентоа целлюлаз с образованием высокоактивных "ферментов для стадии гидролиза.

l.Elena S. i/orozova, Ariunaa Jaisrain, Elena A. Perekhod, Mikhail L Rabinovich. Production of T. reesei cellulases on highly liliaceous carbon sources. TRICEL 93: Second International Conference on Fungal Cellulases and related Enzymes. June 2-5, 1S93, MajVic, Finland. Accepted.

2. Ma,,,...-.- S. K.varatskhelia, fiivi N. Salakaya, Elena S. i.forczova, Manana Salakaya. Ariuna Jaisrain, Elena Perekhod, Mikhail L. Rabinovich. Complex bioconversion of secondary - biomass resoui-ces : Abstracts of 7th European conference on biomass for energy and environment, agriculture and industry. October 5-9, 1SS2, Florence, Italy, p. 110.

3. Аряукаа Далсраин, Морозова S. С., Рабинович M. JL Культивирование гриба Trichoderna reesei на лигноцеллгалозном материале. В тез. докладов Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу". 14-18 октября 1991, Чэр-новш, Украина, с. 147.

4. Mikhail L.Rabinovich. Ariuna Jaisrain, Elena Perekhod, Elena S. iforozova, Малика S. Kvaratskhel ia,' Givi N. Salakaya, Manana Salakaya. Complex bioconversion of secondary biomass resources : Reports of 7th European conference on biomass for energy and environment, agriculture and industry. October 5-9,

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1992, Florence, Italy, pp. 1343-47.