Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование целлюлолитических ферментов Trichoderira reesel на труднометаболизируемых соединениях углерода

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование целлюлолитических ферментов Trichoderira reesel на труднометаболизируемых соединениях углерода"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ К Е ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152

ЯАЛСРАЙН АРИУНАА

ОБРАЗОВАНИЕ ПЕЛЛХШОЛИТИЧЕСМХ ФЕРМЕЕТОВ Тг1С^еггга геезе1 НА ТРУДБОМЕТАБОЛИЗИРУЕШХ СОЕДИНЕНИЯХ УГЛЕРОДА

Специальность 03.00.07 - микробиология

А вт ореферат диссертации на соискание ученой степени, кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа, выполнена на кпфедре микробиологии биологического^-факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, в лаборатории углеводов Института биохимии им.

' А. Е Баха РАН и в лаборатории селекции и генетики грибных продуцентов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекшш промышленных микроорганизмов (ВНИИгенетика).

Научны? руководители - доктор биологических, ваук профессор Е С. Егоров,, доктор химйчесгасс -наук Ы. Л. Рабинович

Научный консультант - зав. секторов генетики.-и .се^ лекции грибньк. .продуцентов; ВНИИгенетика к. б. н. Е. С. Морозова

Ойвдвадьные оппоненты - доктор биологических наук. . Н. А. Тиунова доктор технических наук М. К Гервет

Ведуазя организация : Институт биохимии и физиологии микроорганизмов-РАЕ'

—Защита дассертации состоится '40" м^оци^- , 1993 года вЧ 3 -часов на заседании специализированного ■ ученого совета-Д 053.0516& в Московском государственном университете им. Ы. Е Ломоносова по адресу : 119899, Москва,. Дгнинекие горыг-'Биг-ологическлй факультет МГУ им. М. Е Ломоносова.:

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факуаьтета МГУ им. К Е Ломоносова

Автореферат разослан " ^0" 1993 года.

Ученый секретарь "^щхР Пискункова ЕФ.

специализированного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема фермеьтатшзкой конверсии цзллшозы, несмотря на интенсивное изучение в течение последних 30 лет, продолжает оставаться в центре внимания специалистов различного профиля - микробиологоЕ, биохимиков, бг.отех-нологов. Особый интерес вызывает природа явлений, протегаювих при глубоком гидролизе наиболее труднодоступной, высокоупорядоченной целлклозы в составе растительной клеточной сгенгай где она образует сложную надмолекулярную структуру, с другихя биополимерами, в первую очередь, с лэткином.

Именно поэтому в последнее время внимание привлекает вопросы, связанные с биосинтезом целлшаз на средах, солепгащих лЕгноцеллвлознье растительные субстраты с низким содержанием це^лолозы. На этом направлении многие отечественные и зарубежные авторы видят перспективу оптимизации ферментного комплекса для утилизации наиболее труднодоступной, экранированной лигнином углеводной части субстрата.

Несмотря на наличие отдельных публикаций, -в настоящее время механизм синтеза цехлюлаз на таких труднометаСзлгаируо-иых нерастворимых субстратах изучен недое-гаточао. Известно лишь, что такие субстраты могут вызывать как активацию, так"И репрессии синтеза целлплаз. Имеющиеся в литературе--сведении показывают, что значительные резервы в повыгкток уровня биосинтеза целлгдаз у грибов могут заключаться в "использовании трудаометабожзируемкх соединений углерода наряду слегкомета-болизкруемыни. не вызывавшими катаболитной репрессии. •

В этой связи особый интерес прэдставлпет создание новых штаммов, адаптированных к синтезу целлюлолитическнх ферментов на средах..с труднодоступной целлюлозой, а такте изучение 'ферментных комплексов, • участвующих в деградации таких трудномета-болизируемых субстратов. Как известно, до настоящего времени пет единой точки зрения на механизм ферментативного разложения наиболее труднодоступной части природной целлшозы и роль отдельных ферментов в этом процессе.

Дель к задачи исследований. Цель касгокпгей работы заключалась в изучении закономерностей и повышении уровня синтеза целлшаз при культивировании гриба Trichoderma reesei на средах, содержащих, в качестве соединений углерода труднометаболи-

- г -

зируемые лигноцеллюлозные субстраты, создании мутантаых .штаммов-продуцентов ферментов, адаптированных к. падобЕда.субстратам. изучении-их ферментного комплекса и его огличийтог.-коиг---1 . лекса. известных штампов-продуцентов.

Научная вовизна работа Исследованы основные эгкояомгрг. ности синтеза целлшолктических ферментов...грибом Тт1сЬк1еггаз гееэз 1 на средах- с • промышленным: лигно1даллппэзны2:с^стргтаа-.«г.: его кодификациями:, при этом не обнаружено: • лразазй--.:коррегяций ме вду соотношением - • целжшэзы и лигнина- в • субстрате- туровнем..? биосинтеза цеиполаз. - • ...

Получен «утант Т.-геезе1- 6/16, секретйрущкй^влруаьсуралБ-." ную жидкость - це ллшазы с более высоким • -уровнем • активиостичю сравненмо с- промышленным- шташюы -при-культивированш-на средах с труднометаболкзируенши соединениями-углерода,- -иеелейована его морфология. Шказано, что повышение целлшазной активности мутанта 6/1-6—не-связано с изменением-чувствительности к-ката-болитной репрессии.

Установлено, сто ферментный комплекс -мутанта- 6/16 -характеризуется более -высокими- удельными-активностями- -целлобиогид-ролазы I, -высокомолекулярной эндоглшаназы и р-гаюковвдазы, чем комплекочфомыгалешюго штампа. ■ Одновременно- показано,-что мутант-6/16 на средах с лап-ноцеллюлюзным-субстратом.продуцирует ■ более специфичный к деградации труднодоступной-; цешшозы комплекс-ферментов,- -чем-прошшленный - штамм.-.........

Практическая-значимость - -работы. ■ -Предложена -циклическая-схема ■ превращения - лигноцеллюлозного сырья- -путем -двухстадийной обработки. -На-первой стадии-проводится-фермантатюзный-гидролиз сырья культуралъной жидкостью гриба-продуцента целлилаз•с образованием глюкозеого сиропа (20%). На-второй - лигнифициро-ванный--остаток утилизируется грибом-продуцентом целлшлаз с образованием высокоактивных ферментов -для стадии ферментативного гидролиза.

Разработал состав новой ферментационной среды, на которой удалось повысить целлюлазную активность Т. геезэ1 в 2,0-3,3 раза по сравнению с традиционно используемыми средами.

Полученный в результате многоступенчатой селекции мутант 6/16 обладал в 1,5 раза более высоким уровнем синтеза целлхшаз по сравнения с родительским штаммом и в 1,2 раза - по сравнению с лучшим промышленным штаммом.

Апробация работы. Результаты диссертации представлялись на JI Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), 7 Европейской конференции по использования биомассы в знергетянз. сельском хозяйстве, экологии, прокшсленности (Флоренция, 1932), II Международной такфзренции "Грибные целлюлвэы и родственные, фзр-т мэнты - Tricel 93" (Майвик, Финляндия, 1293).

Публикации. По результатам диссертации опубликованы. 4 печатное работ

Струга1 ура и объем диссертации. Диссертация . состоит .на введения, обзора литературы, описания объектов- п методов, исследования, изложения результатов-и их обсуидензя;-.-выводов л списка цитируемой литература Работа изложена за 120 страницах, содержит 14 рисунков и 15 таблиц. Список цитируемой.литературы включает 143 источников.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ • ЧАСТЬ Объекты и -методы исследований

Объектами исследований являлись два штака- Тг Schoden:» reesei, полученные во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики; ЕКШ F-79 и F-120, а такав мутанты этого гриба, полученные в ходе исследований.

Все изученные игашы культивировали в аэрируснях условиях в колбах на регламентной среде следующего состава ГХ):--ч;вега:о-вичныЯ-жэм-—4,0, солодовые ростки-1,43, паеничнж" отруб"-5,0, (NH4JjSQ, -0,6, KHjPQ, -0,2, MgS0.,-0,05. В зксперьзеитах, целью которых являлось повышение продустивности мутантов,- в составе указанной среди в качестве.соединений углерода вместо свекловичного лгул добавляли дигЕоцедлолозу, представляющую собой промышленный отход .фурфурольного производства с содержанием лигнина и целлюлозы 45 и 50Z, соответственно. Ксполвзованы тагае модификации этого субстрата, полученные в процессе вы-' полнения данной работы. В качестве источников органического азота, наряду с пшеничными отрубями, использовали -бедково-ви-тамикный концентрат (БВК) промышленного производства. Культивирование осуществляли в 100 ил ферментационной среды в колбах Эрленмейера (750 мл) на качалке (250 об./мин) при температуре 28-30* С в течение 8-9 суток.

Для получения труднометаболизируемого субстрата проводили глубокий ферментативный гвдролиз лнгноцеллшозы .в реакторе постоянного перемешивания объемом 400 мл при температуре• 50*С.. В качестве источника целлюлаз использовали ..фильтрат.".■культу-', ральной жидкости Т.reesei штамма F-120 и мутантоз.-этого-гриба. Гидролиз -проводили в течение 8-9 часов-

Для получения мутантов в работе использовали. ■■ следующие мутагенные факторы..

1. УФ-облучение. Облучение водных суспензий.ковидай: осуществляли лампами БУВ-15. Интенсивность излучения^ составляла..-около 120 эрг/мы^/сек. Время облучения варьировали-.:в; завкси-мости от применяемой дозы УФ.

2. ■ М-метал-М-нитро-.\:-штрозогуанидин (НГ)... Для обработки конидий суспензии и раствор ЕГ готовили на 0,15 М фосфатном буфере СрН 6,0). Конечная концентрация мутагена в суспензиях составляла 200 мкг/ыл, время экспозиции - 2 и 3 часа.

Активность ферментов целлюлазного комплекса-по фильтров вальной-бумаге определяли-согласно методике, рекомендованной комиссией IUPAG (1381). Зндоглюканазную и целлобиазную .активности определяли по методу Клесова с соавторами (Клесов^и др., 1980)-. • Цэллобиогидролазу определяли спектрофотокетрически, используя в качестве субстрата п-нитрофенил-^-О-лага-озид (Рабинович и др., 1986). Ксиланазу определяли, по методу, рекомендованному комиссией IUPAC.

Редуцирующие сахара определяли со методу ЧЬыоди-Нельсона (Somoqui, 1952), глшэзу - -гликозооксидазно-пероксвдазаш- мз-' тодом (Березин и др., 1977).

Фракционирование белков культуральной жидкости гриба проводили с поыояыо ультрафильтравдонного разделения на-установке Минимодуль производства Ассоциации Пластек (Ст Петербург), оснащенной хембранами Биопор Т-30 с пределом задержания 20 кДа, гель-проникавдей-хроматографии ■ на жестком>-посителе Тойе-перл НУ-50 производства Тойе Сода (Япония), а также аналитического SDS-электрофореза в градиенте полиакриламидного геля 8-20% на приборе Минивагон (Swank and.Munkres, 1971). В качестве белков - маркеров по молекулярной массе использовали набор фирмы "Pharmacia", включающий миоглобин (116 кДа), мио -глобин I+II (67 кДа), миоглобин I (43 кДа), миоглобик II (29,5 кДа), миоглобпн III (20,х кДа).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Известно, что уровень активности ферментов в культураль-ной жидкости продуцента определяется двумя основными • Дикторами: продуктивностью-используемого штамма и составом ферментационной среды. В этой связи работу проводили в двух направлениях. а именно:

1. Получение новых мутантов гриба с повяленной активностью.

2.- -Подбор состава среды с использованием в качестве • источников •-углерода -дешевого дигпотдэллшозного субстрата, обеспечивающего наиболее полное выражение потенциальной' способности мутантов ■ синтезировать целлтазы.

1. Получение мутантов Тг1с1юс!егша геезе 1 с повышенной активностью.

Первым этапом работы являлось • создание высокопродуктивного штамма, способного давать высокий выход ферментов натруд-нометаболизиручмых соединениях углерода, примером > которых является ■ лигнецеллююза.

В-качестве родительского был выбран жгаш Тг1сЬос1егта геезе! Г-79, который являлся исходным для получения, промышленного штамма Р-120. Еабор--штаммаР-79--был обусловлен тем, :что он претерпел меньше стадий-мутагенеза, чем -арс&ыаленный-штамм Г-120. На рис.1 показана схема получения мутаета -6/16, где видно, что в пропессе селекции были -использованы УФ-облучение в различных дозах, хюдгаеский мутагенез (нитрозогуанидин), чередующиеся со стадиями естественного отбора, а также отбор ка среде с аятиметаболигом - 2-дезоксиглюкозой.

На первой ступени селекции после уф-облученш-был отобран морфологически-измененный-мутант 6, отличаящийет от исходного штачма Р-79 белым цветом-конидий. На последующих этапах селекции все выделенные мутанты, независимо от используемого мутагенного фактора, сохраняли этот признак, и отбор в основном осуществляли по уровню их целлюлолитической активности. Стабильность признака образования целлвлаз в популяциях, выделен-

- о -

Р-79 | УФ 6

В6 В4

Рис. 1. Схема получения мутанта 6/16 ТгЮ'псёегта гееБе1 .

В6- 31

Е. о

УФ - ультрафиолетовое облучение; НГ - И- мет ил- ^ нит ро-N- нктрозо-

| УФ 31-67

гуанидин; 2-ДГ - 2-дезоксиглюкоза; Е. о. - отбор без применения мутагенных факторов. "

"67-1С 67-6 67-5с Е.0 6/16

ных на разных этапах селекции мутантов в каждом случае проверялась путем изучения их.естественной изменчивости и отбора наиболее продуктивного варианта. Необходимость подобной лро-верки определялась тем, что среди вариантов, полученных после обработки мутагенами, иногда появлялись колонии-с секторами и колонии, образующие в местах соприкосновения валики, что могло свидетельствовать о негаплоидном строении их генома- и Б' дальнейшем приводить к выщепленжо низкоактивных форм; - Приведенные на рис. 2 (А и Б) гистограммы показывают типичные пределы естественной изменчивости двух промежуточных вариантов Р-79-6 и Вб. последний из которых выделен из валика, образованного двумя колониями, полученными после обработки конидий НГ. Сходные и достаточно ограниченные пределы изменчивости популяций этих мутантов позволяет считать, что последний из них, по меньшей мере, не является ни диплоидом, ки гетерскарионом.

Исследование уровней биосинтеза целлшаз в популяции промежуточного варианта 67-6, выделенного-со среды с 2-ДГ, вияви-ло ее гетерогенность (рис. 3 А), что определило проведение дополнительного этапа естественного отбора, в результате которого выделен стабильный мутант 6/16 (рис.3 Б) с повышенной продуктивность а

Количество вариантов 6СН

50403020-

10

"Т"

■Р

ц.

20 60 100 140 Активность , 7. Количество вариантов 70\

60504030 20

10

Р-

1— 20 60 100 Активность , X Рис. 2. Естественная изменчивость мутантов Р-79-6( А) и Вб (Б) по уровню синтеза целлюлаз

Количество вариантов 60-1

50 40 302010

Г

а

20 60 100 140 180 Активность, X Количество вариантов

7СН 605040302010-

в

(

20 60 100 140 Активность , 7. Рис. 3. Естественная измен -чивость мутантов 67-6 (А) и 6/16 (Б) по уровню синтеза целлюлаз

- - 9 -

Мутант 6/16 морфологически отличался от исходного штампа F-79 более пушистым воздупным мицелием и белой окраской конидий. Цри росте на среде со свекловичным жомом -мутант 6/16 имел в 1,5 раза более высокую активность, чем родительский штамм, и в 1,15 раза - чем промышленный шташ F-120 (табл.1).

Таблица. 1

Деллшолитическая активность, мутантов Т. re ese i при культивировании на среда, содержаний свекловичный .хоы-

Мутанты ед/мл Отношение к активнос- Отношение к активнос-

ти штшав F-79, 7. ти пггаша F-120 ,%

F-79-6 11.8 107,3 ••■ 79,7

6-6 13.5 122,7 91,2

В5 13.2 120,0 89,2

В6-31 15,2 138,2 102,7

6/16 16,9 153,6 114,2

F-79 11.0 100,0 74,3

F-120 14,8 134,5 100,0

Таблица 2

Целлюлолитическая активность Т. гееБе! штамма Г-120 и мутантов при культивировании на средах, содержащих различные концентрации лигкоцеллюлозы и 52 пзеничных отрубей

Ыутанты Лигнсцеллюлоза, Z

3,0 3,5 4,0

ед/ад Z ед/мл % ед/мл X

Во 14.1 53.2 34.0 100,0 22,5 60,3 В6-31 33.2 125,3 29,3 86,2 31-67 - - 33,4 98,2 26,2 70,2 67-6 - - 38,8 114,1 35,7 95,7 6/16 - 46,2 -123,9 F-120 26,5 100,0 34,0 100,0 37,3 100,0

При культивировании на среде с лкгноцеллшозаым субстратом разница в активности мутанта 6/16 и промышленного стамма составляла 251 (табл. 2).

Поскольку одна из стадий селекции включала отбор на среде с 2-ДГ, необходимо было еыяснить, не определяется ли повышение целлюлазной активности :,;утанта 6/16 его меньшей по сравнению с контрольные штаммом Р-120 чувствительностью к катаболитной репрессии. С этой целью была предпринята попытка исследовать влияние лобавления в среде глюкозы па синтез целлвдаз мутантом 6/16. Ба основании динамики накопления целлшаз обеими культурами С рис. 4) глюкозу в количестве 2% и 52 вносили в среды с лигноцеллюлозой при их засеве, а также на 5 и 7 сутки культивирования. Результаты экспериментов показали, что при добавлении 52 глюкозы, независимо от сроков ее внесения в среды, синтез целлшаз у обеих культур практически прекращался полностью. Добавление ля 27. глюкозы приводило к одинаковому снижению целлюлазной активности на 50-65% (табл. 3).

Таблица 3

Влияние на целлюлолитическуы активность ■ мутанта 6/15 и штамма Р-120 добавления к среде с лигноцеллвдоэой-22 глюкозы*

Добавление глюкозы Мутант 6/16 йгамм Г-120

ед/мл % ед/ил X

При посеве На 5 сутки роста Ка 7 сутки роста 15,0 41,5 13,5 39,7 17,5 49,7 16,0 46,9 12,7 36,0 11.6 33,9

Без добавления 35,3 100.0 34,1 100,0

* - указанные уровни активностей определены ка 9 сутки роста

Полученные данные позволили сделать вывод, что увеличение целлюлазной активности мутанта 6/16 вряд ли связано с его чувствительностью к катаболитной репрессии и определяется иными изменениям в механизмах синтеза или секреции ферментов.

- 10 -

2. Разработка состава ферментационной среды для синтеза даидалаз мутантами Тг1сЬос1еп7а гееэе!.

Известно, что рост и развитие микроорганизмов, а такме. образование имя ферментов находятся в тесной зависимости.от питательной среда и условий культивирования.

Вами бша изучена возможность предварительной- обработки, лигноцехлшозы с использованием биохимических- и физико-хиыит ческих методов, которые позволяет разрушть естественную, структуру биополимеров, входящих з ее состав, и,, так®;- образом, повысить-их усваиваеыость микроорганизмами.

В результате различных способов предработки лигноцеллю-лозного субстрата нами получены 11 модификаций исходной лигно- -целлюлозы, которые использованы в качестве основного компонента питательно* среды для выращивания штамма F-120, с целью выяснения роли соотношения лигнина и целлюлозы-в среде'для синтеза целлюдаз и повышения активности ферментов (табл. 4).

Как следует па данных таблицы 4. использованные субстраты дшэт в 1,5-2 раза более высокие выходы фермента, чем свекловичный жом,- Ваилучией оказалась промытая водой и высушенная исходная лигвоцеллюлоза при концентрации в среде 3-3,5Z, что соответствовало содержанию чистой целлюлозы 1,7-2,031 (табл.4). Изнывая, но также достаточно высокая активность (22,0-23,0 ед/мл) была достигнута и на средах с отбеленной лигноцеллшо-зой (аналог микрокристаллической целлюлозы) после последовательной обработки иелочью и пшохлоритом (табл. 4).

Эти результаты показали, что выход ферментов в ходе частичной экстракции субстрата щрлочью, удаляющей около 70Z литника, не только не увеличивается, но, напротив, даже уменьшается, и лш> при почти полном удалении лигнина целлшолити-ческая активность приближалась к значениям для исходной лиг-целлшозы.

Ва основании этих экспериментов нами был сделен вывод, что в отличие от процесса ферментативного гидролиза, в котором степень гидраоза целлюлозы определяется соотношением целлюлозы и лигнина в образце, биосинтез целлюлаз грибом не зависит напрямую от этого показателя.

При этом необходимо отметить, что во всех изученных слу-

Таблица 4

. Целлюлолитическая активность штамма Т. гееБе] Р-120 при культивировании на средах, содержащих различные концентрации высушенной лигноцеллшозы

Источник углерода Содержание Содержание чис- Актив-

в среде лигноцеллшо- той целлюлозы в ность

зы в среде, 7. среде, X (Ед/ыл)

Исходная лигяоцеллю- 3,0 1,7 16,8

лоза 3.5 2,0 15.1

Исходная лигноцеллю- 3.0 1,7 24,4

лоза, промытая 3.5 2.0 24,0

Лигноцеллюлоза, обра- 1.6 1.4 21,8

ботанная щелочью 2.0 1.7 . 19,8

Лигноцеллшоза. обра- 1.5 1.4 22,9

ботанная щелочью и 1.9 1.7 гз,1

гипохлоритом 2.5 2.3 16.9

Лигноцеллюлоза,обрабо- 2,3 1.1 15,4

тайная ферментами 3,5 1,7 14,3

Лигноцеллюлоза,обрабо- 1,9 1.1 11.4

тайная щелочью и фер- 2.3 1.4 15,4

ментами 2.9 1.7 16,4

Лигноцеллюлоза,обрабо 1.6 1.1 17,5

танная щелочью, фермен- 2.2 1.4 16,7

таии и гипохлоритом 2,7 1.7 16.2

Свекловичный жом 4.0 1,7 10,7

чаях выход фермента превышал его выход на стандартной регламентной прошшленной среде со свекловичным ходом, а расход субстрата был меньше, чем расход жома.

- 12 -

Исследование динамики накопления целлюлаз при культивировании штамма Р-120 на средах с промытой высушенной лигнсцеллго-лозой и свекловичным яэысы показало, что интенсивное образование ферментов при росте гриба на первой из них начинается с б-х суток, когда на зторой среде этот процесс уке замедляется. Максимум накопления целлшаз на среде с лигноцеллкшозой наступает на сутки П032К, чем на среде со свекловичньм жомом, при сходных значениях рН культуральных длдкостей (рис. 4).

Активность, ед./мл.

рН среды - 5

Т I г

23456789 Продолжительность культивирования, сутки

Рис.4. Динамика накопления целлюлаз в кулътуральной жидкости штамма Р-120 при росте на среде со свекловичным этомом (1) и исходной лигноцелл»-лоаой (2), сэдерггйих пшеничные отруби.

В процессе подбора состава среды нами была обнаружена сильная зависимость активности от концентрации- лигноцеллюлозы. Как видно из таблицы 3 (см. предыдущую главу), повышение ее содержания от 3 до 42 приводило к росту активности промышленного штамма в 1,5 раза Мутант 6/16 в этих условиях давал активность, в 3 раза превышающую активность на регламентной среде с такт.! же количеством свекловичного лома Поэтому било сделано заключение, ' что дальнейшее повышение актизности молит быть достигнуто за счет повышения содержании отхода в срзде более 4%. Следует отметить, что повышение содержания целлшозы в среде до 82 и Солее рекомендуется рядом зарубежных авторов для повышения синтеза целлюлаз [6г11о В. 1983).

- 13 -

Исследования, однако, показали, что дальнейшее повышение содержаний лигноцэллшозного отхода снижает активность (табл.3), как можно полагать, за счет высокой вязкости среды и ухудшения аэрации. Поэтому дальнейшее совершенствование состат за среды проводилось в двух направлениях:

1. Замена исходной лигноцеллюлозы, имеющей большую вязкость, на ее труднсметаболизируемьй остаток после глубокого ферментативного гидролиза, что одновременно позволяло реализовать циклическую cxet,¡у биоконверсии лигноцеллюлозы.

2. Замена 57. пшеничных отрубей в среде на другой источник органического-азота, более концентрированный и имеющий меньшую вязкость.

Для получения труднометаболизируемого субстрата проводили ферментативный гидролиз лигноцеллюлозы в реакторе постоянного перемешивания объемом 400 мл в течение 8-9 часов, при температуре 50 градусоз. В качестве источника целлюлаз использовали фильтрат кудьтурачьной жидкости Т. reesei с активностью Х-35 ед/мл. В результате ферментативного гидролиза получены глюг.оз-ный сироп концентрацией до 207. и трудногидролизуемьй субстрат, содержащей 35-40% чистой целлюлозы, для культивирования мутан-

Таблица 5

Целлюяолитическая активность мутантов Т.reesei и штамма F-120 при культивировании на среде, содержащей обработанную

целлюлазэ.'/Ш лигноцеллкиозу и пшеничные отруби (51)

Мутанты Содержание лигноцеллюлозы в среде

3,0% 3,52» - 4,5% 5,5 7.

ед/мл Z *) ед/мл 7. *) ед/мл 7. *) ед/мл 7. *)

Вб 15,0 65,2 15,6 51,1 - В6-31 23,7 103,0 18,9 62,0 21,7 69,5 12,3 48,4 32-67 - - - - 32,3 103,5 22,1 87,0 67-6 - - - 33,2 1G6.4 16,6 65,3 6/16 - - 29.8 117,3 F-120 23,0 100.0 30,5 100,0 31,2 100,0 25,4 100,0

*) Данные отнесены к активности штамма F-120

то в к штаммоЕ Т. reesej в качестве соединений углерода в среде. Разрушение таких субстратов в процессе ферментации происходит медленно, в результате чего сильно понижен стационарный уровень продукта-глюкозы, являющейся катаболитныи репрессором, а уровень биосинтеза целлюлаз значительно превышает выход фер-мептоЕ на более легкоусвояемых видах целлюлозного сырья [йэрэ-зова Е. С. и др.. 1987].

В таблице 5 представлены результаты использования трудао-гидролизуеыого остатка. вместо исходной дигноцеллтаозы в среде культивирования. Ери зтом было запечено, что дальнейшее увеличение содержания остатка в среде при сохранении эффективной аэрации возможно только после замены 5Z пшеничных отрубей на другой источник органического азота

В таблице 6 представлены результаты экспериментов по культивированию мутантов и штамма F-120 на средах, содержащих в качестве источника органического азота и витамшгов вместо пшеничных отрубей белково-витаминный концентрат" кормовых- дрожжей (БЕК), а также обработанную ферментами лигноцеллплозу в различных соотношениях. Полученные уровни активностей покзза-

" Таблица -6

Целлшолитическая активность мутантов Т. reesei и штамма.

F-120 при культивировании на средах, содеряавюх обработанную . фзрментани лигноцеллюлозу и БВК в различных соотношениях

Содержание субстратов, X Целлюполитическая активность

Ыутант ед/мл 6/16 г Штамм F-120 ед/мл 2

Лигноцеллюлоза БВК

7.0 1.0 27,0 107,1 25,2 100,0

8,0 1.0 22,8 90,5 25,2 100,0

9,0 1,0 19,7 103,1 19,1 100,0

10,0 1.0 13.8 72.2 19.1 100,0

7,0 2,0 43,2 125.2 34,5 100,0

7.0 2.5 41,8 111,5 37,5 100,0

7,0 3,0 40,0 98,0 40,8 •100,0

10,0 2.0 39,0 89,2 43,7 100,0

10,0 3,0 45,9 108.5 42,3 100,0

ли, что для обеих культур наиболее оптимальнач концентрация обработанной лигноцеллюлозы составляла 10,07., а содержание БВК - 32 для мутанта 6/16 и 27. для штамма Г-120.

Дальнейшая работа по оптимизации состава среды заключалась в изучении возможного влияния на активность мутанта 5/16 содержания в среде основных солей - сернокислого аммония и од-нозамеиэнного фосфорнокислого калия - на фоне различных концентраций БВК. Излученные результаты показали, что при содер-.нании в среде 2,5% БВК концентрация сернкислого аммония может быть без ущерба уменьшена по сравнению со средой с пшеничными

Таблица 7

Целлкнолитическая активность мутанта 6/16 Т. геезеI при культивировании на средах, содержащих 10% обработанной ферментами высушенной лигноцеллшозы, различные концентрации БВК. ()г БО,, и КНгР0,

Содержание компонентов в среде, 7. Активность *

лигноцел- БВК (Ш^ЭО« КНгР0, ед/мл 7.

лилоза

10 2,5 0 0.2 45,7 95,4

10 2,5 0,3 0.1 48,1 100,4

10 2,5 0,3 0,2 55,5 115,9

10 2,5 0,6 0.2 55,7 116,3

10 2,5 0,6 0,3 41,6 86,8

10 3,0 0 0,2 46,7 97,5

10 3,0 0,1 0,2 49,9 104,2

10 3,0 0,2 0,2 52,1 108,8

10 3,0 0,3 0,1 46,6 97,3

10 3,0 0,3 0,2 54,1 112.9

10 3,0 0,3 0.3 54.2 113.1

10 3,0 0,6 0,2 49,1 102,5

10 3,0 0,6 0,3 47.1 98,3

*) активность в 7. указана по отношению к максимальной активности пггамма Р-120. полученной при росте на среде, содержащей 101 лигноцеллшозы, 37. БВК . 0,32 {НН^50^ и 0.27. КНгР04 -47,9 ед/мл.

отрубями в 2 раза, а при концентрации БВК 3,0% снижение содержания (БО. до 0,3% является необходимы).). В обоих случаях при более низких концентрациях сернокислого аммония в средах (0,3%) активность мутанта 6/16 достигала 54,0 - 56,0 ед/мл. Варьирование содержания в средах КН2Р0^ показало, что его обычная концентрация 0,2% для мутанта 6/16 является оптикисиог.

На рис. 5 показана сравнительная динаиика сизтеза целлхшаз на подобранной среде штаммом Р-120 и кутантсм 6/16. Видно, что до 6 суток синтез цадлшаз идет оыстрее у ярошишэнвого •Етак-иа, однако в последнее двое суток новый (.¡утакт синтезирует целлюлазы со вдвое большей скоростью. Необходимо подчеркнуть, что уровень синтеза ферментов на среде с обработанной целлкла-зами лигноцеллшозой и БВК в 3 и более раз лревыпает показатели для регламентной среды со свекловичные лшоу и пшеничными отрубями.

Активность, Ед/мл

72.

Рис.5. Динамика накопления целлюлаз в культуральной жидкости мутанта 6/16 (1) и штамма Г-120 (2) при росте на среде с лкгвоцел-люлозой, обработанной ферментами, дополнительно содержащей 3% бел-

ково-витаминный концентрат.

т-1-1-г

2 4 6 8

Продолжительность культивирования,сутки

Таким образом, проведенные эксперименты привели к следующим результатам;

1. Подобрана новая среда для полученного в процессе рабо-

ты продуктивного мутанта Г. геезе) 6/16, обеспечивающая накопление в культуральной жидкости целлюлаз с активностью 54,0-53,0 ед/мл;

2. В составе оптимизированной среды использовано дешевое и доступное-сырье - лигноцедахшозный отход производства фурфурола в высоких концентрациях (102) и БЕК;

3. В процессе работы определены необходимые условия подготовки лигноцеллюлозного сырья для использования в. ферментационной среде для получения целлюлаз.

Новая сре^а-включает (70:

Предработанная целлюлазами

высушенная лигноцеллюлоза - 10,0

Белково-витаминный концентрат - 2,5

Солодовые ростки - 1,43

(ИН4)г 50, - 0,3

КНгР0,, - 0,2

Мгзо^ - 0,06

3. Выделение и сравнительная биохимическая характеристика компонентов целисаазного комплекса мутанта 6/16 и штамма Г-120

Представляло интерес- выяснение причин, более высокой цел-лшолитической активности культуральной жидкости полученного мутанта изучаемого-гриба по-сравнению с промышленным продуцентом ( штамм Г-120) при культивировании на аналогичных средах. Необходимо подчеркнуть, что в экспериментах по оптимизации условий биосинтеза фермента нами определялась суммарная целт-лазная активность по методу Мандельс-Вебера, которая является достаточно сложным показателем и не отражает биохимически увеличение активности какого-либо конкретного компонента целлл-лазного комплекса..

Как уж отмечалось выше, динамика синтеза ферментов у обоих штаммов различна (рис.5). В этой связи мы предположили, что у них может отличяться и компонентный состав целлшазного комплекса Как известно, целлюлозный комплекс микромицетов состоит из нескольких основных компонентов, динамика синтеза которых различна.

Еыло проведено фракционирование белкой культуральной жидкости мутанта 6/16 и промышленного штамма Р-120 Т. геезе! с помощью ультрафильтрационного разделения на мембранах с пределом задержания 20 кДа, гель-проникающей хроматографии на жестком носителе с оптимумом разделения в диапазоне 10-80 кДа, а также аналитического БОБ-электрофореза в градиенте полиакриламидного геля 8-20?:.

На рис.6 (А,Б) приведены типичные хроматограммы гель-фильтрационного разделения белков культуральной жидкости мутанта 6/16 и промышленного штамма Г-120. Как видно из згих рисунков, мутант 5/1-6 преимущественно сектетирует белки с молекулярной массой более 40 кДа, тогда как у промышленного штамма Р-120 спектр белков более широкий, в особенности, в низкемолекуляр-ной области. Аналогичная картина была получена с помощью ЖВ-электрофореза, показавшего наличие у штамма Р-120 значительного числа полос в промежутке между 40 и 20 кДа (ркс. 7), которые значительно слабее были выражены у мутанта 6/16.

Молекулярные массы, основных белков из культур обоих штаммов приведены в таблице 8.

Таблица 8 Молекулярные массы основных белков, секретируемых мутантом 6/16 и штаммом Р-120, по данным градиентного ББЗ-электрофореза

1

1 | Мутант 6/16 1 1 | Штамм Р-120 |

I 110000 110000 |

I 60000 60000 |

| 55000 55000 |

| 32000-38000 |

1 22000-28000 | 1

Рис. 7. Данные £®5-электрофо-реза при разделении белков культуральной .жидкости мутанта 6/16 (1) и штамма Р-120 (2), выращенных на новой среде. (3) - маркерные белки

. • р/хгции

Рис.6. Гель-фильтрационное разделение целлялаз ¿гамма F-120 (Л) и мутанта 5/16 (Б) на местком геле Тойоперл HW-50. 1 - поглощение при 280 нм, 2 - эндоглшаназнзя активность, 3 - целлобиазнач активность, 4 - целлобиогидролазная (ЦБГ) активность, 5 - ксиланазная активность.

Исследование распределения ферментативных активностей но профилю хроматограмм (рис.6 А,Б) показало, что мутант 6/16 характеризуется в три раза более высокими удельными активностями целлобиогидролазы I (основной компонент целлюлагного кокшлекса гриба Т. гееяе1 с молекулярной массой 60-65 кДа по данным -электрофореза в денатурирующих условиях). Удельная целлобиаз-кая (р-глюкозидазная) активность, ассоциированная с этим же широким пиком, такие в 3-4 раза выше у мутанта 6/16 (табл. 9). Из данных литературы известно (Вегейет е1 а1, 1975) , что внеклеточная целлобиаза гриба Т. гееэе! имеет молекулярную массу 45 кДа

оЬ а1., 1992). Наиболее изучены три фермента, кодируемых самостоятельными генами: зндоглюканаза I с р1 4,5, зндогликаназа П с р1 5,3-5,4, имелцие молекулярные кассы в области 45-55 кДа, а также низкоыолекулярная зндоглюканаза, с молекулярной массой в области от 20 до 20 кЦа (приводимые здесь широкие пределы молекулярных, весов для каждого из ферментоз означают, что они могут присутствовать б культуральной жидкости в различных множественных формах, отличающихся' молекулярной кассой в результате посттрансляционных модификаций).

Удельные активности компонентов целлюлозного компекса

Таблица 9.

промышленного штамма Р-120 и мутанта 6/16 по данным гель-хроматографии

Ферменты , Мг (кБа)

Активность, ед/мг

6/16

Р-120

целлобиогидролаза I, 60

0,04 9,2

0,01

2,6

0.62

0.2

3,5

зпдоглюканаза зндоглюканаза целлобиаза ксиланаза

. 45-55

. 25 . 45 , 40

0,6 2^5

- 21 -

Как видно из сопоставления рис. б и 7, мутант 6/16 не образует в заметных количествах низкомолекулярную эндсглюканазу, тогда как у промышленного штамма Г-120 она присутствует. Кроме того, основная форма высокомолекулярной эндоглюканазы у мутанта 6/16 имеет более высокую молекулярную массу, чем у промышленного штамма. Удельная активность этой формы фермента .у мутанта 6/16 такяэ в 3,5 раза выше.

Помимо белков, участвующих з разложении целлялоаы, лкгно-целлшозный субстрат индуцирует также синтез некоторых ксила-наз [КиЫсэк К., 1992]. Нами обнаружена сопоставимая активность высокомолекулярной ксиланазы у обоих штаммов (рис. 6 и табл. 9).

3 состав белков, сэкретируемых обоими штаммами, входит' также общий высокомолекулярный компонент с молекулярной массой, превышающей 100 кДа, невыясненной природа

Таким образом, полученный мутант 6/16 отличался от промышленного штамма Р-120 Т. геезе! по ряду показателей.

Во-первых, он характеризовался в 3-4 раза более зысокой удельной активностью целлобиогидролазы I, высокомолекулярной эндоглюканазы и, что особенно важно, целлобиазы. Последнее является серьезным преимуществом, т.к. ферментные комплексы Г. гесзе1, как правило, содержат низкий уровень целлобиазы и в качестве продукта гидролиза целлюлозы образуют в основном цел-лобиозу, а не глюкозу.

Во-вторых, мутант 6/16 не образовывал низкомолскуляоную эндоглюканазу.

В этой связи необходимо отметить следующее обстоятельство. В настоящее время полагают, что наиболее важными компонен- . тами целлюлазного комплекса Tгlchodernla геезе1, определяющими способность ферментного комплекса гриба к деградации высокоу-порядоченной, кристаллической целлюлозы, являются целлобиогид-ролазы I и II, а также эндоглюканазы I и II - белки с молекулярными кассами в пределах 40-60 кДа [КиЫсек К., 1992]. Особенностью этих ферментов является то, что в их состав входит, помимо активного центра,-так называемый сорбциснный или целлю-лозосвязывакшй домен [Рабинович М.Д. и др., 19831. Кроме этих ферментов в состав целлюлазного комплекса данного гриба, как правило, входят другие, более низкомслекулярные эндоглюканазы широкой специфичности, не принимающие участия з деградации

ВЫВОДЫ:

1. В результате многоступенчатой селекции, из штампа Т.геезв! Р-79 получен морфологически измененный мутант 6/1&, обладающий в 1,5-раза "более высоким уровнем синтеза целашлаз -по -сравнению с родительским штампом и в 1,2 раза - по сравнению с промышленным штаммом Р-120 этого гриба.

• ■ 2. Исследована динамика и показана вйзш.'изость •зффектив-нсго синтеза целлюгаз мутантом 6/16 и промышленным татаьаюы-Р-120 на средах с содержанием труднометаболизируемого лкгЕУ.фи-. ш:рс ванного сырья до 10% при наличии в среде- органического источника азота.

3. Разработали общие принципы использования труднокзтабо-. лизируемого целлшозосодержащего субстрата с высоктл .содержанием лигнина для повышения биосинтеза целлшаз грибом Тг1сЬос!егта гое^еь В результате проведенной оптимизации активность ферментов в среде культивирования удалось повысить з 2-3,3 раза по сразвению с традиционно используемыми средами.

4. Изучен спектр ферментов синтезируемых мутантом 6/16,в сравнении с промьшшенным штаммом,, на среде с наиболее трудно- расщепляемой целлюлозой. Показано, что ферментный комплекс "полученного мутанта характеризуется более высокими удельными ак-

тивкостями ферментов, принимающих участие в деградации кристалличес:сой целлюлозы: целлобиогидролазы 1, эндоглшаназы с молекулярной массой 60 кДа и целлобиазы, тогда как у промышленного штамма обнаруживается высокая активность ге;з;сомолекулярной эндоглзсканазы.

5. Предложена циклически схема биоконверсии лигноделлю-лозы путем двухстадийной трансформации. На -первой стадии проводится его ферментативный гидролиз культуральной жидкостью гриба-продуцента целлюлаз Т. reese* с образованием.гллкозного сиропа концентрацией до 2ОХ. На второй стадии труднометаболи-зируешй, обедненный целлюлозой остаток субстрата утилизируется грибоы-продуцентои целлшаз с образованием высокоактивных 'ферментов для стадии ■ гидролиза.

l.Elena S. ÎAjrozova, Ariunaa Jalsrain, Elena A. Perekhod, Mikhail L Rabinovich. Production of T. reesei cellulases on highly lignaceous carbon sources. TRICEL 93: Second International Conference on Fungal Cellulases and related Enzymes. June 2-5, 1993, MajVic, Finland. Accepted.

2. Marncuca S. Kvaratskhelia, Givi N. Salakaya, Elena S. Morczova, Manana Salakaya, Ariuna Jalsrain, Elena Perekhod, Mikhail L. Rabinovich. Complex bioconversicn of secondary • biomass resources : Abstracts of 7th European conference on bicrass for energy and environment, agriculture and industry. October 5-9, 1992, Florence, Italy, p. 110.

3. Ариунаа Яглераип, Морозова E. С., Рабинович М. JL Культивирование гриба Trichoderma reesei на лигноцеллшозном материале. В тез. докладов Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу". 14-18 октября 1991, Черновцы, Украина, с. 147.

4. Mikhail L.Rabinovich. Ariuna Jalsrain, Elena Perekhod, Elena S. Morosova, Manuka S. Kvaratskhel ia. ' Givi N. Salakaya, Manana Salakaya Complex bioconversion of secondary biomass resources : Reports of 7th European conference on biomass for energy and environment, agriculture and industry. October 5-9, 1992, Florence, Italy, pp. 1343-47.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.