Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование интермедиата М в фотоцикле бактериородопсина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Образование интермедиата М в фотоцикле бактериородопсина"

РГ8 ОД МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЧЕНИ 2 5 All? tS94 - ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕЗОЛЮЦИИ 1 " ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Конраксв Андрей Юрьевич

УДК 577.355.152. Образование интермедиата Н в фотоцикла бахтериородопсзна.

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории новых физических методов Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского.

Научный руководитель:*

доктор биологических наук А.Д.Каулен.

Официальные оппоненты: , доктор биологических наук кандидат химических наук. Ведущая организация: Институт электрохимии

Защита состоится " " 1994 г.

часов на заседании Специализированного Биологического .Совета К 053.05.68 да присуждению ученой степени кандидата наук в Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория ЛИК-5.

С диссертацией южно ознакомиться в. библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 1993 г.

Ученый секрктарь Специализированного совета доктор биологических наук

А.А.Кононенко, С.В.Еремин

РАН.

Б.А.Гуляев

МПП "АКМЕ". Зак. 114. Тжр. 50

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность тепы.

Одним из наиболее интенсивно исследуемых объектов язляется i

бактериородопсин (Бр), светозависимая протонная помпа гэло^илькых бактерий Haiobacteríum salinariua. ответственная за своеобразные тип фотосинтеза, наблюдаемого у этих бактерии.

В настоящее время основной задаче« изучения Функционирования Бр является детализация процесса перекоса протона. Прогресс з области исследований молекулярных механизмов работы Бр обусловлен в первую очередь применением сэат-специ*ического метагенеза для , выяснения роли отдельных аминокислот. Кроне того, интенсивные исследования ведутся в ряде лаборатории, имеющие целья уточнение и детализацию фотоцикла для более адекватного сопоставления его отдельных стадий со стадиями перекоса протона и кснфсрмэциокных превращении белка.

До настоящего времени, причина гетерогенности образования !•'.. ключевой стадией фотоцпклз, остается непонятной. Кинетические схемы, предлагаемые различными исследователями с цель» объяснить эту гетерогенность, находятся в противоречии друг другу (varo and

Lanyi, 1991а,- Butt et al-, 19S9; Ames a.-.d Mathies, 1990; Dille: and Stockburger, 1983).

' Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение причин гетерогенности образования интермедиата М. в связи с чем были поставлены следуюзне задачи.

• I. Детально разобраться в кинетической схеме фотоцнкла. ключевой стадией которого является образование интермедиата М. 2. Уточнить значения временных констант образования

иктер'.едпзта М.

3. Исследовать процесс выброса протона и его корреляцию с образованием кнтермздоата М.

4. Уточнить кинетические параметры процесса переключения основания ЕЬкЮа от выходного ко входному протонному пути.

5. Изучить влияние различных нутаций на стадию образования интермедиата М.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые было показано, что нейтральная Форма Бр состоит из двух спектрально неразличимых форы, способных образовывать интермедиа? М с различными рк • и . константами скорости. Была выявлена фаза образования М. соответствующая конформационному превращению Оелка и необратимому Ы->и1 переходу, способствующему переключению основзнля [игффа от цепи выброса к цепи поглощения протона, кинетические параметры которой пока еще никто четко из указывал. Было показано, что появление протона в среде без буфера сопутствует этому превращению. Полученные данные способствуют более адекватному представлении о процессе депротонирования основания !11и$фа к выявляют существенную роль конформационных превращения белка при перекосе протона.

Апробация работы. Апробация проходила на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, лаборатория биоэнергетики и новых физических методов НИИ Физкко-ХимическоН Биологии им. А.Н.Белозерского 14 октября 1993 г. Основные результаты работы докладывались на 5-й Международной конференции по ретинальсодержааим белкам (Франция, 1992) и на 7-и Европейской конференции по биоэнергетике (Финляндия, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 ргбот.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 120 страницах маспнопнсного текста, зклшая 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 93 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы.

ПМ с выделяли по стандартной методике. предложенной Остерхельтом и Стокениусом (1974).

В экспериментах использовали светоадаптированкый препарат ПМ при концентрации Бр в пробе 10 мкМ. Световая адаптации достигалась при освещении постоянным светом в течение 5 мин. при комнатной температуре.

Регистрация спектральных изменений осуществляли с помощью однолучевого спектрофотометра. сконструированного з насей лаборатории (Драчев и др., 1981. 1935). Измеряющий световой луч от кварцевой галогенной лампы КГМ (9 В, 75 Вт) проходил через моно.хроматор-HLi, фирмы Joben-ivon. термсстаткрук^ую кг зет у (длина светового пути I см) с образцом, второй монохрсматср и попадал кз фотоэлектроумно-.штель ФЭУ-128. Сигнал с СЗУ через операционный умножитель вигг Brown 3554 зк попадал на регистратор переходных процессов Dataiab-ioso, с которого сигнал поступал б компьютер ibm-286. В качестве источника возбуждавшего света использовали ■ неодимовыи лазер yg 585, сирмы quaniei с модулированной добротностьв и удвоением частоты (х= 532 нм. продолжительность

о

импульса 15 не, энергия 10-30 мДж).

Светоиндуцированные изменения рН в суспензии IIM регистрировали на установке флеш-фотолиза с использованием рН-индикаторных красителей п-нитрофенола и пиранина при 400 и 455 нм, соответственно. В обоих случаях рН-ответ вычисляли как разность оптических сигналов в суспензии ПМ, зарегистрированных в присутствии рН-кндикатора и без него.

Разложение экспериментальных кривых на экспоненты осуществляли с помощью программы discrets, написанной проф. Провенчером, которая позволяла выделить до 5 компонент одновременно. Качество разложения оценивали по разности между экспериментальной кризой и суммой компонент разложения. Тестовыми кривыми служили графические представления решений системы линейных дифференциальных уравнений первого порядка по методу Рунге-Кутта.

Дифференциальные спектры получали компьютерной обработкой 72 кривых изменения оптического поглощения в интервале 370-710 км с иагом 5 нм.

В работе применяли следующие реактивы: пиранин (8- гидрокси-1,3,6-пирентрисульфонат), п-нитрофенол, mes

(2-(л-морфолино)этан-сульфоновая кислота); глутаровый альдегид (50£-ый водный раствор), edta (этмлендиаминтетраацетат) (serva), азид натрия (sigma) и Naci категории "осч" ("Реахим").

Галобактериальный мутант D96H был любезно предоставлен проф. Остерхельтом, мах Plank Institute fur Biochimie, FRG.

Галобактериальный мутант diish был любезно предоставлен Проф. Ниделманом, Wayne State University School of Meûicine, USA.

2. Образование интермедиата M у бактериородопсина дикого

типа.

На рис.1 приведена кривая изменения поглощения при 400 км Бр дикого типа после его освещения вспыекой. Этот ответ на всшлгку рассматривается как сумма п экспонент:

S(t) = I А.»[1 - exp(-t/t.)J - £ Аj*t1 - exp(-t/i.)]

нарастание ответа

_i и

релаксация

где i- число компонент при нарастании поглощения; j- число компонент при его релаксации: t- время; характеристическое

время i(j) компонента; амплитуда ¡(j) компоненты. С помсаьп

программы discrete в кривой фотоответа (кривая I) в интервале 5-40 мс были выявлены-две компоненты релаксации с т^ 5 мс и 19 мс.

¿л

0.05-,

0.05

—3 ¡<—1нс - ^ 40 НС—^

Рис.1. Изменение оптической плотности суспензии ПМ при 4CÛ нм в ответ на лазерную вспышку (I). Условия: 100 мМ nací. 4 мМ mes. рН 7',0. (2)- кривая, полученная в результате вычитания компонент спада, найденных с использованием прогознчы discrete (tl= 5 мс а т2= 19 мс) из экспериментальной кривой; остаточные кривые, полученные в результате вычитания из кшвой (2) ее представления з виде суммы 3-х (3) и 4-х экспонент с ¿1= 1,4 мкс, t2= 60 мхе, тЗг 250 мкс и т4= 0,9 мс (4).

Вычитанием из исходной кривой суммы этих компонент получена кривая 2, содержащая только компоненты нарастания фотоответа. Эта кривая в сбою очередь может быть представлена в виде суммы -1-х компонент (в скобках дрля от суммарной амплитуды) с t = 1.4 мкс (IOS) , i2= G0 мкс (60'í)., i3= 250 мкс {20%) и г = 0.9 мс (IOS). Справа на рис.1 представлены разностные кривые, полученные вычитанием из кривом 2 сумм компонент ее разложения на 3 (кривая 31 в 4 (кривая 4) экспоненты. Как видно, наилучшее совпадение получается для суммы 4-х экспонент.

Выделение в нарастании ответа при 400 нм компоненты с г= 0.9 мс еце не означает, что эта компонента отражает в явном виде образование интермедиата М. Это скорее свидетельствует о процессе, происходящем с i= 0.9 мс и предшествущем распаду М. Поэтому правильнее было бы эту компоненту рассматривать как лаг-фазу спада ответа. '

I,4-мкс-компонента соответствует образованию интермедиата ь. спектр которого перекрывается со спектром интермедиата М.

60- и 250-мкс компоненты относятся непосредственно к образсвэнив интермедиата М. Кинетика рзспада интермедиата l. регистрируемая „при 520 нм. может быть представлена в виде суммы тех же компонент, что и кинетика образования М. однако вклад компоненты с ВО мкс в фотоотзэт при 520 нм меньше, а Б фотоответ при 610 км больше, чем вКйад этой компонента в фотоответ при 400 нм.

На Рис.2 представлены дифференциальные спектры, которые позволяют Солее полно охарактеризовать компоненты образования М с t= 60 мкс и с г= 250 мкс. Эти спектры были получены вычитанием

дифференциального спектра, измеренного через 10 мкс после лазерной вспышки из спектров, измеренных через 40, 60 и 80 мкс (рис.2, кривые 1-3) и вычитанием спектра, измеренного через SO мкс после вспышки из спектров, измеренных через 200 , 250 и 300 мкс после вспышки (кривые 4-6). Полученные таким образом спектры отражает образование интермедиата М и соответствующий ему распад l. которые выгл'ядят как две фазы образования М. Видно, что образовании М, происходящему с т= 60 мкс соответствует распад интермедиата г, с дифференциальным максимумом при 555 нм, в то время как образования М с t= 250 мкс соответствует распад интермедиата ь с

а

дифференциальным максимумом при 535 нм. Интермедиат К распадается с образованием l с константой скорости 1.4 мкс, и поэтому его вклад в спектор, измеренный через 10 мкс должен быть минимален. Действительно, если переход К—>l необратим, 99,9% интермедиата К должно перейти в l за 10 мкс после вспышки. В случае же обратимого К;—»l перехода вклад интермедиата К в спектр как первой, так и второй фазы распада l должен быть одинаков в рамках последовательной схемы Варо и Лани (1991). Если же принять, что существуют два параллельных фотоцикла, в которых два интермедиата М образуются с разными скоростями, вклад интермедиата К может различаться степенью сдвига равновесия К-—-l на дзух параллельных путях•образования ь. Поэтому различие дифференциальных максимумов распада l может говорить лиаь о существовании дзух параллельных

«

путей распада l, приводящих к спектрально неразличимым интермедиатам М. »■

Выше отмечалось, что компонента с i= I мс свидетельствует о процессе, происходящем между образованием и распадом М. Лаг-фаза,

НМ

нм

Рис.2. А. Дифференциальные спектры, измеренные для Сактериородопсина дикого типа в присутствии 2 M Nací, рН 7,0 через различные интешалы времени после вспышки: I- 0,01; 2- 0,04; 30,1; 4- 0,3; 5- 0,5. Б. Дифференциальные спектры, представляющие образование M и соответствующий ему распад ь-интермедиата с константами скоэости ti= 60 мкс (кривые 1-3) и т2= 260 мкс (4-6).

подобная наблюдаемой при 400 км, присутствует и в релаксации ответа при 520 нм. При 335 нм, где локализована /»-полоса поглощения ретиналя, наряду с очень быстрыми компонентам;!, отвечающими транс-цис изомеризации хромофорной группы (Kuschmxtr and Hess, 1981), присутствует медленная компонента увеличения оптической плотности с r= i мс, которая составляет 15" амплитуды ответа.

Измерения кинетики прогонировзния pfí-кндикатора з среде без буфера выявляют интересную корреляцию скорсти появления протона со скоростью этой фазы фотоцикла. Нарастание ответа п-нитрофенола в среде, содержащей 100 мМ Haci, pH 7,0, описывается одной экспонентой с с= i мс. В присутствии 4 мМ mes про то киро ва кие пиракина по своей скорости полностью совпадает с образованием М, то есть выброс протона описывается двумя экспонентами, соответствующими двум фазам образования М. Сравнение кинет;« протонирования п-нитрофенола в дистиллированной воде, в растворе 100 мМ Nací, и в среде, содержащей 100 мМ Nací и 20 мМ мдС12 выявляет эффект увеличения амплитуды рК-ответа в зависимости от концентрации соли, скорость же протонирования индикатора практически не меняется, следовательно, величина поверхностного заряда мембраны слабо влияет на кинетику протонирования рН-индикатора.

Было обнаружено, что ряд воздействий индуцирует у Бр дикого типа появление 3-й компоненты в образовании М. На рис.3 показаны оптические ответы при 400 нм. В SOVom глицерине (кривая 3) 3-я компонента составляет 2Ь% амплитуды ответа с i = 2.5 мс. Третья компонента с '= I мс появляется после добавления ионоз с.и3+ в

Рис.3. Влияние состава среды на кинетику образования М при 400 км у Бр дикого типа. I) 40%-ый раствор сахарозы, 2 мМ luci3; 2) 2 ыМ Luci3; 3) 80%~ы& глицерин; 4, 5) 402 раствор сахарозы, 2 кМ lucí. до и после добавления 10 мМ ЭДТА, соответственно.

Рис.4 А. Кинетика образования М и протонирования иираника в незабуференком растворе 100 мМ Nací, рН 7,0; Б. Кинетическое представление образования М согласно схеме (I), приведенной в тексте.

водную суспензии им (кривая 2), После добавления Lu3> б суспензию ПМ, содержащую сахарозу (40%), эта компонента с константой скорости t= 3.6 мс составляет 35% общей амплитуды (кривая I).

На рис.3 приведены кривые изменения поглощения при 400- нм суспензии ПМ в 402-ом растворе сахароза, содержащем 2 мМ lu3+ до и после добавления 10 мМ ЭДТА (кривые 4 и 5). Связывая ионы i.u3+. ЭДТА снимает их действие, восстанавливая форму ответа, наблюдаемую

о+

в отсутствии Lu . Амплитуда ответа не меняется, т.е. 3-я компонента появляется за счет первых двух. Следует отметить, что появление 3-й компоненты образования М не есть замедление какса-

с

"либо из остальных. Они присутствуют в разложении с таким же

соотношением амплитуд, как и в стандартных условиях.

Эти данные предлагается интерпретировать, исходя из следующей

схемы образования М у Бр дикого типа: L 60 мкс, м I мс t м,

1 1 1 (Г)

. 250 мкс u I мс

2-- 2-' 2

Такая схема позволяет довольно просто объяснить наличие 1-мс-лзг-фазы в релаксации ответов при 400 и 520 нм и отсутствие в явном виде этой компоненты в образовании М. В рамках сходной схемы можно объяснить появление в явном виде I-мс-компонента при образовании М и распаде l под действием ионов lu3+ или в ВОТ-ом глицерине - появлением обратной реакции ;:з М в L:

г 60 мкс. ц Г мс

-► М^-• л,

г 250 мкс I мс t (2) 2' ■• 2 2

Большая вероятность движения протона вдоль мембраны по сравнению с его выходом в среду, обусловлена, вероятно, наличием на поверхности мембраны цепи протонных доноров - акцепторов. Такая

о

сеть протонных ловушек, очевидно способна довольно длительное время удерживать протон, который в присутствии буфера получает возможность быстро выйти в среду. Достаточно на I А увеличить расстояние между донором и акцептором, как вероятность переноса протона между ним:; уменьшается на порядок, и соответственно увеличивается ьероятность перехода Н+ в раствор (Gutman and Nachiiei, 1990). Если такие изменении происходят в пурпурной мембране при переходе М—>м', то выход протона из прпмемОранного слоя в среду должен коррелировать с этим переходом, что мы и видим з отсутствие буфера. Предполагается, что переход М—>м' отражает конформационную перестройку белка, необходимую для "переключения" основания со стороны выброса к стороне поглощения протона.

На рис.4 приведены кривые образования М и протокировзния пиргиша s отсутствие буфера, а также графическое представление решений системы дифференциальных уравнении методом Рунге-Кутта для кинетической схемы (I). Константы скоростей подбирались так, чтобы кажущиеся константы соответствовали константам, найденным разложением.

2. Три, компоненты в образовании интермедиата М у мутанта

D96K.

Оптически! ответ D96N Бр при 400 км в интервале до 40 мс после Есаг-та представляется в виде суммы 4-х компонент: I мке (ICS). 55 мкс.(233), 220 икс (42%) и I мс (253). Наиболее быстрая компонента как и у Бр дикого типа отражает образование интермедиата l, а три остальные компоненты - интермедиата М. Релаксация оптического ответа при 400 нм у мутантного белка происходит монозкепонекциально с i= 1,6 с. Большая разница между

скоростями образования и распада интермедиата М делает сэбя Ер довольно удобным объектом для исследования этого интермедиата. Прежде всего, интермедиата к и 0 ке могут исказить кинетику образования М, по причине того, что при очень медленной р-елзксацил М они практически не регистрируются. По зтоа жз причине они не могут вносить вклад в дифференциальные спектры, отрэжаивде образование М и соответствуйте распад е..

Из дифференциальных спектроз, измеренных в интервале 0,01 - 3 мс после вспыики (ряс.5) следует, что макс;1мум, ссотЕетствукЕий 1-й и 2-й компонентам образования М расположен при 410-412 км, а у

с

3-й компоненты сдвинут на 8 нм в коротковолновую область (1 , =

* ГГкЗХ

404 нм). Кинетика распада интермедиатз с,, описывается темп же тремя компонентами, что и образование М. 53- и 220-мхс компонента в образовании М. как и в случае Бр дикого типа, предстазлякт из себя образование двух М из двух спектрально различиях д с •дифференциальными максимумами при 560 и 540 км, а образованию третьего М соответствует распад г., дифференциальной спектр которого хорошо представим как сум;« дифференциальных сг.ектрсз, соответствующих распаду первого и второго ь.

В фотоответе, измеренном, при 335 нм 1-мс-компокента представлена как дополнительная компонента к первым очень быстрым двум, соответствующим Б?—-К и К—>г. переходам, что аналогично Бр дикого типа.

Кинетика протонирования пиранина в суспензии ПМ 09Ь» Бр в среде без буфера описывается одной зкспснектси с 1 мс. Сна одинакова у Бр дикого типа и аэбк Бр в отсутствие буфера и совпадает с третьей компонентой образования М. В присутствии 4 мМ

ДА

ни

Рис.5.А. Дифференциальные спектры, измеренные для d96n Бр в присутствии 100 мМ Nací, рН 7,0, 20 С. Кривые 1-7 - спектры, измеренные через 0,01, 0,04, 0,1, 0,3, 0,5, I, 3 мс, соответственно. Б. Дифференциальные спектры, полученные путем вычитания спектра, измеренного через 10 мкс после вспышки из спектров, измеренных через 40 и 80 мкс (кривые I, 2), спектра, измеренного через 80 мкс из спектров,, измеренных через 200 и 300 мкс (кривые 3, 4) и спектра, измеренного через Г мс из спектра, измеренного через 3,5 мс (кривая 5).

мез протонирование пирзнина ускоряется до скоростей образования М. то есть появление протона в среде аппроксимируется тремя экспонентами, соответствующим трем стадзиям образования М у Бр.

Представляется не совсем случайным созпэдэние скорости появления протона з среде без буфера с 3-й компонентой образования М у мутанткого белка. Отзег рН-индикатора имеет ту же температурную зависимость, что и 3-я компонента М. Замена Н^О на о2о вызывает .замедление первых двух компонент образования М в 5 раз, в то время как 3-я компонента замедляется з 3 раза. Скорость появления дейтрона в среде, измеренная с помощью питанииа, также уменьшается по сравнению со скоростью появления протона з аналогичных условиях в 3 раза, как у Бр дикого типа, так и у В9б3 Бр.

Ионы ьиэ+ слабо влияют на образование М у ЕЭб.ч Ер, а з 8С«-ом глицерине первые две компоненты ускоряются до 7 и 70 мкс, а третья замедляется до 2,5 мс, так же, как и у Бр дикого типа.

Кинетически переход м—-н' хороио разреигм у Бр оззя с с

перехода I мс. Предполагается, что это происходи? из-за наличия

обратной реакции М—»г, у мутанткого белка. Лля' списания процесса

образования !■', у 09бл Ер предлагается схема, подобная схеме,

•предложенной для описания образования М у Бр дикого типа з

присутствии ионов г,и3+:

г р I «с .

220 же „ I мс * (3 ]

п2 2

Графическое ее представление дако на рис.6., где также представлены образование интермедиата М при 4СО км ;;

1

f— 1 лс —V— 40 не Я 1«—1 НС—^—4D КС Я

Рис.6. А. Кинетика образования интермедиата Ми протокирования аниона пиранина в отсутствие буфера у D96N Бр в среде, содержащей IOO мМ tiaci (рН 7,0, 20°С); Б. Кинетическое представление образования интермедиата М, исходя из схемы (3), приведенной в тексте.

протокировакие аниона пиранина в среде.без буфера.

3. Кинетический анализ действия азида на бактериородопсин D96N. »

Кинетика образования М при 400 ни, измеренная при рИ 5,0 для D96N Бр в отсутствие азида описывается суммой 3-х экспоненциальных компонент с tj= 55 мкс (З5й). i2= 220 мкс (45%) и xg= I мс (20%). Трехкомпонентному образованию М, которому соответствует трехкомпонентный распад интермедиата l, может соответствовать несколько модельных схем:".

55 мкс

L2

г _1мс

220мкс

- it -

Б).

Б5мкс

220мкс

1нс Imc

m1

m;

B)

55мкс

220MKC

1HC

а также несколько других, представляющих вариации первых двух. Для того, чтобы кинетически охарактеризовать действие азида, мы построили по методу Рунге-Кутта кривую, представляющую из себя графическое решение системы дифференциальных уровкений, .составленных, исходя из рассматриваемых схем. Константы скоростей подбирались так, чтобы полученная кривая совпадала с " экспериментальной кривой образования М в отсутствие азида. Оказалось, что независимо от схемы, для наилучшего представления эффекта азида необходимо предположить, что аз:и действует на все три М одновременно. Зависимость подобранных таким образом констант скоростей распада М^ и от концентрации азида представлена в

т1/2(кс) 101

10"

10

10

-1]

V

\

Рис.7. Зависимость скорости распада Mj и У D96N Ер при рН 5.0 от концентрации азида.

* -3

ю -' 10

-1

10"

1 2 101 10

10J На.Ч,СкМ)

логарифмической шкале на Рис.7. Видно, что азид в концентрации 2.4 ускоряет распад М до 20 мкс и его эффект далек от насысения.

При рН 5,0 в присутствии азида из М образуется бато-форма с дифференциальным максимумом при 630 нм. При концентрации азида 2М, скорость ее образования близка к скорости образования интермедиата М в отсутствие азида. Эта 0-подобная форма за I мс переходит в форму с дифференциальным максимумом при 633 нм. На рис.8 предстазлены спектры, полученные путем вычитания из дифференциального спектра, измеренного через 100 мкс после вспылки, спектра, измеренного через 50 мкс после вспышки (кривая I). Этот спектр предстазляет образование 0-подобного интермедиата (интермедиа? № практически отсутствует). Его образованию сопутствует исчезновение полосы поглощения при 500 нм, что соответствует распаду интермедиата ь. Кривая 2 представляет из себя разность между дифференциальным спектром, снятым через 2,2 мс и спектром, снятым через 1,1 мс после вспышки. Видно, что второй бато-интермедиат с дифференциальным максимумом при ■ 638 нм образуется непосредственно из первого (исчезновение полосы при 5S0-600 нм в отличие от исчезновения полосы при 490-510 нм, характерного для распада ь). Второй бато-интермедиат со скоростью 4-5 мс переходит в форму, сходную с иктермедиатом к. Таким образом, при довольно сильном отличии скоростей действия азида и распада l. бато-форма с дифференциальным максимумом при 630 нм образуется со скоростями образования М б отсутствие азида. Первые две компоненты обнаруживаются в распаде ь в присутствии 2М азида, что говорит о двух независимых интермедиатах i, распадающихся с разными скоростями, образуя два разных М. Ускоряя распад М, азид вызывает исчезновение 3-й компонента в распаде l, и ее появление в переходе двух батоформ. Зто можно легко объяснить, исходя из схемы

ЛД

0. 01

0. С05 -

о

-0.005

с

Рис.8. Спектры, полученное как разность между дифференциальными спектрам;, измеренными для dsös Ed пси рК 5.0. 20'С в присутствии 2М азида через ICO и 5С мхе (I)', через 2.Г. и 1,1 мс "(2), через 10 и 3 *мс (3) после вспыли. 'kphsí.' i представляет распад интермедпата l и образование батсформы CS3C. кривая 2 - переход двух батсфсрм С630—СоЗЗ с константой сксрссги I мс, а кривая 3 - распад* С638 с образованием :.'-псдсбнсго • интернедиата.

Б, в рамках которой третья компонента распада р обусловлена необратимой реакцией м—м', а две первые формы М образуются из двух форм интермедиата р. На оскозан-.м этой схемы действие азида з кокцентращт 2М (pH 5,0), описанное вкзе. выглядит слгдуЕп:м

образом

о

(4)

L2

220 мкс м i mc

i mc у,, кмз 4 mc tt

-''Ь""40 мкс-ОоЗо-N

'2

*

ННз.20 МКС ^Qjjdü

.Интересно отметить, что батоформа с ' дифференциальным максимумом при £33 км переходит в форму, сходную с интермедиагом к. Этст переход занимает 4-5 мс в Н20 и 7-8 мс в d2o, что коррелирует с быстрой компонентой распада М у Бр дикого типа, в два раза замедляющейся в d2o. Вероятно, Бр в течение фотоцикла претерпевает по меньсеи мерз два конйормациоккых перехода за I мс и- за 4-5 мс, которые как бы запрограммированы на более ранних стадиях фстоцикла'. к примеру, на стадии транс-цис изомеризации, и не зависят от того, протонировако или депротокирозано шиффово основание.

4. Две Формы бактериородопсина.

3 образовании кнтермедиата М, измеренном при. 400 нм для dusn Ер. выделяются те же компоненты, что и в образовании М у Ер дикого типа, но с соотнесением амплитуд 60- и 250-мкс компонент 1:1.

Было обнаружено, что при понижении рН вторая компонента образования М исчезает с рК 6,2. При изменении рН 7,5->5,5 амплитудз фстосигнала при 400 нм уменьшается на половину у dusn Бр. Уменьшение амплитуды фотосигнала'у Бр дикого типа составляло

При повьзекии рН с 7,5 до 10,6 часть белка (10-153) переходит б форму с 'дифференциальным максимумом при 460 нм (Рис.9). Следующая часть белка (60-703)' переходит в эту форму очень медленно с константой скорости порядка нескольких часов. Понижение рН до 7.5 вызывает возврат 503 белка обратно в форму с максимумом при 563 км, а остальная часть остается в форме с дифференциальным максимумом при 460 нм, которая, как оказалось, стабильна при нейтрально..: рН в течении нескольких дней.

На Рис.10 показано образование интермедаата М при 400 нм, рН

Рис.9. А. Слектш поглощения. измененные для ои^к Ео пои юН 7,5 (I) и 10,6 (2). Спекгок поглощения, измененные пгаг рН 10,6 (3) и рН 7,5 (4) после инкубации пси сН 10,6* б течение 5 часов. Спектры 5 и 6 изменены пои юН 7,5 после того, как процедура изменения рН 7,5—¡10,&—.7,5* была позтссека 2 и 3 раза соответственно (время инкубации при сН 10,6 около I кш). В. Разность между спектиаки 4 и I.

ДА АА

Рис.10. Изменения оптическсй плотности пси 400 нм у а:15;,' Бр при рН 7,5 до и после инкубации при сН ¿0.6 з течение 5 чассв (комвые I и 2 соответственно). Ксизая 3 - изменение оптаческо'й плотности/при 400 ю-!, рН 5.5 после инкубации пзи сН 10.6 в течение 5 часов. Кривая 4 - разность между конными I и 2.и представление фазы ее нарастания компонентой с г= 249 мкс.

7,5 до к после инкубации при рН 10,6 в течение 5 часов. Видно, что 10-15^, что по значения соответствует вкладу второй компоненты в образование М.

амплитуда ответа падает на 50S после перехода Бр568->Бр460. При зтсм, как видно из разностного ответа, компонента с i= 250 же исчезает практически полностью, з то нромя как компонента с с= 60 мке не меняется.

Особенность мутанта diisn заключающаяся в его способности образовывать форму Бр460 при высоких рН и стабильность этой формы при нейтральном рН позволяет продемонстрировать гетерогенность белка. Это xepeso согласуется с выдвинутым предположением, что кинетически разделимые фазы образования М отражают образование К в параллельных фотециклах. Соотношение амплитуд 55-60 и 220-250 мке ш-шонент может отражать соотношение дзух спектрально неразличимых форм Ер. Анализируя данные, полученные для различных мутантов, можно отметить, что соотношение форм Бр варьирует в зависимости от мутации, з то время как для определенной мутации, так же как и для Бр диксго типа, это соотношение довольно постоянно.

ВЬЗОДК.

1. Было показано, что бактериородопсин состоит из дзух спектрально неразличимых, форм, фотоцикл которых проходит с образованием интермедиата М с константами скорости 55-60 мке для перзеи Формы и 220-250 икс для второй и с разными рК появления интермедизта М в фотоцикле (2.5 и 6,2)

2. Б фстоцикле бактериородопсина существует необратимый

переход M—M' с константой скорости I мс, который отражает t конформационку» перестройку бедка и переключение основания Еиффа • от выходного ко входному протонному пути.

3. Появление протона в среде без буфера сопутствует M—M* конформационному переходу.

4. Переход M—M ' проявляется в явном виде как отдельная фаза образования M в фзтоц;<клз бактеркорсдопсика дикого типа з результате воздействия ионов лютеция или в £С"-ом глицерине.

, 5. Мутация D96N значительно злила г на стад-ив сбрззсвзн;ся

интермедиата М. Ее эффект схож с воздействием у.оксв на

бактериородопсин дикого типа.

6. Кинетический анализ действия азида на зззя бактериородопсин выявил, что первые две фазы распадз интермедиата l язляются азид-незазис:я-1ыми, что соответствует выводу о тем. что они предстазлявт два параллельных пути.

7. Была предложена схема образования интермедпатэ м у бактериородопсина дикого т:ша и у бактериородопсика Э95:;.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Drachev L.A., Kaulen А.Э. , Xonrakcv A.Yu. 1S92.

• Interrelation of M-intermediates in bactericrhodopsm photccycla.

* FEBS Lett., 313, 248-250.

2. Drachev Î..A., Kaulen A.D. , Konraliov A.Yu. 1953. Or. ti".e tvo pathways oi the M-interir.ediate formation in tfc.a pï-.ctccylco o: bacteriorhodopsin. 21осЬел131гу ar.d Mole;ular 3iolcç" International, 30, 461-469.

с

3. Orachav L.A., Kaulen A.D., Komrakov A.Yu, 1992. Relationship of M-intermediates in bacteriorhodopsin photocyclo. Structures and Functions of Retinal Proteins. Ed. J.L.Rigaud. Colloqua 1KSERM. Vol.221, p.159-162.

4. L.A.Drachev and A.Yu.Komrakov. 1992. The relationship of M-intermediates in bacteriorhodopsin photocycle. 7-th European Sioenergatics Conference. EEEC Short Reports, v. 7, p. 3.

5. Л.А.Драчев, А.Д.Каулен, А.Ю.Комраков. 1994. Природа многокомпонентное™ образования штермедиата М при фотоцикле бактериородопсина. I. Анализ образования интермедиатов М у бактериорсдопсина дикого типа. Биохимия, Т. 59, н1, С. 126-136.

6. Л.А.Драчев, А.Д.Каулен, А.Ю.Комраков. 1994. Природа многокомпонентное™ образования штермедиата М при фотоцикле ^ бактериородопсина. 2. Три компоненты образования М-интермендиата

у мутанта бактериородопсина d96h. Биохимия, Т. 59, нЗ, С. 393-399.

7. Л.А.Драчев, А.Д.Каулен. А.Ю.Комраков. 1994. Природа ккогоксмпокентности образования штермедиата М при фотоцикле бактериородопсина. 3. Кинетический анализ действия азида на фотоцикл бактериородопсина D96H. Биохимия, Т.59, нЗ, С. 400-407.

8. A.Yu.Komrakov and A.D.Kaulen. 1994. On the two forms of bacteriorhodopsin. FEBS Lett, (accepted).