Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями

Карначук, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями"

На правах рукописи

КАРНАЧУК Ольга Викторовна

ОБРАЗОВАНИЕ И РАСТВОРЕНИЕ СЕРОСОДЕРЖАЩИХ МИНЕРАЛОВ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Томском государственном университете

Научный консультант — академик РАН М. В. Иванов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

А. С. Яненко

В. М. Горленко И. Н. Гоготов

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН

Защита диссертации состоится 23 октября 2006 г., в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117811, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан « 21» сентября 2006 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: г. Москва, 1178] 1, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2., Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Ученому секретарю Совета Т. В. Хижняк. Факс (495) 1356530.

Ученый секретарь

диссертационного Совета й_

кандидат биологических наук сЛйу Т. В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большое значение диссимиляторного восстановления сульфатов в процессах образования минералов хорошо известно исследователям, а работы Г. А. Надсона (1903) по образованию карбоната кальция на сероводородных озерах и Б. Л. Исаченко (1912) по наблюдению сульфидов железа внутри клеток сульфатвосстанавливающих бактерий стоят у истоков возникновения геологической микробиологии наряду с работами X. Эренберга (1838) и С. Н. Виноградского (1887, 1888). Исследования последних двух десятилетий привели к существенной корректировке наших знаний о сульфатредуцирующих бактериях (СРБ). Толерантность к кислороду (Krekeler et al., 1997; Minz et al., 1999; Schramm et al., 1999; Matsui et al., 2004) и возможность его использования в качестве конечного акцептора электронов (Cypionka, 2000), ранняя (3.47 млрд. лет назад) эволюция сульфатного дыхания (Shen et al., 2001; Shen and Buick, 2004), его вероятное монофилетическое происховдение (Wagner et al., 1998; Stahl et al., 2002) и распространение внутри различных доменов через горизонтальный перенос генов (Klein et al., 2001; Zverlov et al., 2005), a также активность СРБ в широком диапазоне температур и кислотности среды, предполагают более широкие возможности сульфатредукторов в сфере геохимических преобразований. Особое значение имеют геохимические реакции, приводящие к осаждению или растворению минералов, связанные с мобилизацией или выведением из круговорота соединений различных элементов. Эти реакции можно охарактеризовать как ключевые пункты биогеохимических циклов элементов.

Образование сульфидов железа и, прежде всего, пирита, в результате микробной сульфатредукции в современных осадках Мирового океана определяют как важнейший биогеохимический процесс выведения серы из ее глобального круговорота (Иванов, 1983; Ehrlich, 1996). Большое значение этот процесс имеет в высокопродуктивных экосистемах прибрежных осадков, получающих значительное количество биогенов и реакционноспособного железа, наряду с терригенным органическим веществом. Хотя образование сульфидов было описано в осадках прибрежных маршей (Howarth, 1979; Howarth and Giblin, 1983; Howarth and Merkel, 1984), детальное изучение образования различных восстановленных форм серы в мелководных морских осадках, подверженных активному антропогенному влиянию, ко времени начала наших исследований не проводилось. Осадки северо-западного шельфа Черного моря, получающего более 75% всего речного стока и отличающегося высоким содержанием автохтонного и аллохтонного органического вещества и железа, являются одним из ярких примеров таких экосистем.

Наряду с морскими осадками, характеризующимися высокими концентрациями сульфата, существуют наземные экосистемы, где высокое содержание S042" может обеспечивать активные процессы сульфатредукции и сульфидообразования. Это зоны гипергенеза сульфидных руд и многочисленные

места хранения отходов добычи и переработки металлов. Активные окислительные процессы являются причиной высокой концентраций ионов SO/' и различных форм железа. Окисление сульфидных минералов сероокисляющими микроорганизмами традиционно рассматривают как основной биогеохимический процесс в этих экосистемах, где преобладают окисленные условия и часто низкие значения pH среды (Иванов, Каравайко, 2004). Новые данные о физиологии СРБ предполагают, что эта группа бактерий может принимать участие в образовании вторичных сульфидов в экосистемах, характеризующихся высоким содержанием S042", несмотря на окисленные и кислые условия среды. Хотя отдельные сообщения о присутствии значительной популяции СРБ в окисленных зонах хвостохранилищ добычи металлов были известны из литературы (Fortin et al., 1996; 2000), их активность, распространение и разнообразие оставались малоизученными. Современные методы молекулярной экологии, позволяют достоверно описать микробное сообщество, включая культивируемые и некультивируемые микроорганизмы, осуществляющие диссимиляторное восстановление сульфатов.

Исследование образования сульфидов в условиях повышенной концентрации ионов металлов, отличных от железа, имеет большое прикладное значение для создания современных биотехнологий очистки от металлов. Существенный недостаток наших знаний в области устойчивости СРБ к катионам тяжелых металлов ограничивает их использование в технологиях (Johnson, 2000; Sani et al. 2001; Valls, de Lorenzo, 2002). К моменту начала наших исследований СРБ, способные развиваться в условиях концентраций, превышающих сотню мг/л ионов Cu(II) и других металлов, были неизвестны. Существовало мнение, что СРБ не могут играть значительной роли в образовании сульфидов, отличных от железа, в силу высокой токсичности ионов металлов для микроорганизмов (Davidson et al., 1962; Ehrlich, 1996).

Так как сульфаты обладают значительно большей растворимостью и составляют большой резервуар в природе, то внимание исследователей, изучающих процессы микробной сульфатредукции, было в основном направлено на исследование восстановления растворимых сульфатов. Однако некоторые экосистемы могут содержать большие количества нерастворимых сульфатов/сульфитов. Следует отметить, что здесь и далее мы используем химическую классификацию, следуя которой, нерастворимыми называют соединения, если их количество, переходящее в раствор, составляет менее 0.01 г вещества на 100 г воды. Примером являются сульфаты бария в морских осадках (особенно в зонах гидротерм и холодных сипов), сульфаты радия, распространенные в отходах урановых рудников, и сульфиты кальция, которые образуются в больших количествах в промышленности при улавливании S02 и часто захораниваются вместе с бытовыми отходами. Возможность участия СРБ в восстановлении нерастворимых сульфатов/сульфитов не получила детального рассмотрения. Однако, учитывая масштабы образования этих соединений, их возможное восстановление может вносить вклад в потоки серы в природе.

Цель и задачи исследования. В связи с отмеченными малоизученными вопросами в нашем знании о геологической активности СРБ, цель настоящей работы состояла в изучении реакций цикла серы и металлов, осуществляемых СРБ и связанных с образованием и растворением минералов. Следующие задачи были сформулированы для достижения поставленной цепи*.

1. Изучить особенности процесса образования сульфидов железа и пирита в осадках мелководных шельфовых зон, характеризующихся высокими скоростями микробной сульфатредукции.

2. Исследовать распространение и активность СРБ в экосистемах, связанных с добычей и переработкой сульфидных минералов.

3. Определить состав микробного сообщества, диссимиляторно восстанавливающего сульфаты, включая культивируемые и некультивируемые формы в экосистемах, связанных с добычей и переработкой сульфидных минералов.

4. Выделить СРБ устойчивые к катионам металлов, изучить их физиологию, возможные механизмы устойчивости к металлам и реакции осаждения сульфидов металлов.

5. Изучить реакции использования нерастворимых сульфатов и сульфитов в качестве акцептора электронов чистыми культурами и природными популяциями СРБ и определить возможность образования минералов в качестве конечных продуктов этих реакций.

Научная новизна работы. Результаты исследования расширяют представления о процессах диагенетического пиритообразования в шельфовых зонах Мирового океана и описывают особенности микробной сульфатредукции в мелководных морских экосистемах в условиях антропогенного стресса. Показана зависимость скорости образования пирита от суммарной скорости микробной сульфатредукции и окислительно-восстановительных условий среды в осадках, характеризующихся относительно высокими концентрациями

реакционноспособного железа. Впервые исследованы процессы образования диагенетических сульфидов в мелководных осадках северо-западного шельфа Черного моря, изучен их изотопный состав и закономерности процесса фракционирования стабильных изотопов серы в условиях высоких скоростей осадконакопления в системе близкой к замкнутой по сульфату.

зоне вторичного сульфидного обогащения, характеризующейся анаэробными условиями, но и в окисленной зоне коры выветривания сульфидных месторождений и экосистем, связанных с хранением отходов добычи и переработки металлов. Охарактеризовано филогенетическое разнообразие СРВ в отходах добычи и переработки металлов. Показано преобладание групп СРВ с неполным окислением органических субстратов (Desulfobulbus spp. и Desulfovibrio spp.) в экосистемах, связанных с добычей и переработкой металлов, а также спорообразующих Desulfosporosinus spp., Desulfotomaculum spp, и Clostridium spp. в условиях низкого рН и повышенной концентрации металлов.

Впервые выделены в чистую культуру и охарактеризованы СРВ устойчивые к ионам двухвалентной меди и шестивалентного хрома. Показано, что устойчивость к меди у СРВ может определяться двумя механизмами — образованием сульфидов меди и активным энергозависимым транспортом меди из клетки. Последовательности, родственные генам рсоА, кодирующим оксидазу— центральный белок системы рсо у энтеробактерий, и pcoR — белок-регулятор двухкомпонентной киназной системы pcoRS, были ПЦР-амплифицированы из изолятов СРВ, устойчивых к меди. Выделение штаммов СРВ, способных к росту при высоких концентрациях меди позволило впервые провести исследование образования сульфидов меди с использованием методов рентгено-фазового и рентгено-флуоресцентного анализов и продемонстрировать возможность образования кристаллических сульфидов меди — ковеллита, халькоцита и халькопирита чистыми культурами СРВ.

Впервые показана способность использовать ханнебахит (CaS03) в качестве конечного акцептора электронов и исследованы закономерности восстановления других нерастворимых соединений серы чистыми культурами СРВ.

Практическая значимость работы. Обнаруженные закономерности Протекания процесса микробной сульфатредукции в прибрежных осадках могут быть использованы для моделирования антропогенного влияния на мелководные шельфовые зоны Мирового океана, и в частности, для прогнозирования гидрохимической ситуации на северо-западном шельфе Черного моря.

Выявленные закономерности образования сульфидов в экосистемах, связанных с добычей и переработкой металлов, важны для создания технологий по очистке этих экосистем, таких как искусственные ветланды, активные зоны сульфатредукции и реакционные барьеры. Определенные скорости пиритообразования в коре выветривания рудных месторождений могут быть использованы при оценке естественных процессов аттенюации металлов.

Штаммы СРВ толерантные к ионам металлов могут быть использованы для изучения механизмов устойчивости и создания на их основе новых технологий осаждения меди, хрома и других металлов. Преимуществом биогенного осаждения в виде сульфидов является их низкая (по сравнению с образующимися при химической очистке гидроксидами) растворимость и возможность использования традиционных методов гидрометаллургии для извлечения металлов. Возможность рециклирования сульфидов металлов, образуемых в

схемах очистки сточных вод, основанных на сульфатредукции, приобретает особое значение с введением в ряде Европейских стран законодательства, запрещающего образование твердых отходов (например, гидроксидов металлов) при очистке сточных вод (van Houten et al., 2006). Определение основных кристаллических фаз сульфидов меди, образуемых чистыми культурами СРБ, может быть использовано при разработке методов рециклирования меди, осажденной в сульфатредукционных условиях. Важной особенностью некоторых из устойчивых изолятов является их активный рост на дисахаридах и полимерах, которые могут быть использованы как альтернативный субстрат спиртам (этанолу и метанолу), используемым в настоящее время в ряде промышленных схем для технологий осаждения металлов СРБ. Сведения о механизмах, определяющих устойчивость к меди у Desulfovibrio spp. и Desulfomicrobium sp. BL, могут быть использованы в дальнейшем при конструировании генно-инженерно модифицированных СРБ, устойчивых к меди.

Полученные выводы и закономерности восстановления ханнебахита (CaS03) СРБ и образования нерастворимых продуктов важны в процессе менеджмента отходов предприятий, сжигающих ископаемое топливо и улавливающих S02 на скрубберах. Исследование представляет теоретическую основу для усовершенствования и создания новых биотехнологий с использованием процесса бактериальной сульфатредукции. Нерастворимые отходы промышленности, содержащие ханнебахит, могут быть использованы для контроля парниковых газов в местах захоронения бытовых и промышленных отходов (через переключение конечных этапов разложения органического вещества с метаногенеза на сульфатредукцию) и в качестве субстрата роста для СРБ при осаждении металлов в системах с низким содержанием S042".

Отдельные этапы работы были поддержаны проектами Департамента Образования США (Title IV), грантами ИНТ АС (01-2333) и ИНТАС (01-0737), 6-й Рамочной программой Европейской Комиссии (BioMineE contract 500329), грантами ФАО РФ А04-2.12-725 и РНП 2.1.1.7338.

Личный вклад соискателя. В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке методологии и экспериментальных подходов, и обобщении полученных результатов. Автор принимал личное участие во всех экспедиционных работах (кроме отбора проб донных отложений залива Батабано), начиная с этапа планирования и организации исследований до конкретного осуществления полевых экспериментов, анализа результатов и их литературного оформления.

Съезд Британского геологического общества (Ноттингем, Великобритания, 2001), Ш-е Международное совещание «Геохимия биосферы» (Новороссийск 2001), Международные симпозиумы по биогидрометаллургии (Оуро Прето, Бразилия, 2001; Афины, Греция, 2003), 1 и 2-ю Международные конференции по Арктической микробиологии (Рованиеми, Финляндия, 2004; Инсбрук, Австрия, 2006), 1-ю Международную конференцию по экологической, промышленной и прикладной микробиологии (Бадахос, Испания, 2005), 105-й съезд Американского микробиологического общества (Атланта, США, 2005), 11-й Симпозиум по Экологии Микроорганизмов (Вена, Австрия, 2006).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 47 печатных работах, включая 26 экспериментальных работ, 4 главы в монографиях и 17 тезисов конференций.

Место проведения работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, были получены автором за время работы в лабораториях биогеохимии ИБФМ АН СССР (1982-1985), микробной биогеохимии ИНМИ АН СССР (1985-1987), группе рудной микробиологии ИНМИ АН АрмССР (19881991), Томском государственном университете (1992 — 2006). Отдельные этапы работ были проведены в Институте биотехнологии и биоинженерии, Технологического университета Тампере и на Кафедре микробиологии университета штата Огайо.

Автор искренне признателен коллегам и соавторам Д. Бэнксу, М. Б. Вайнштейну, Дж. Виллиамс, Г. И. Гоготовой, Е. В. Дейнеко, А. X. Каксонен, К. Карлстрем, А. Ю. Леин, Б. Э. Линдстрему, Ю. М. Миллеру, Б. Б. Намсараеву, Д. Никомрат, В. П. Парначеву, Н. В. Пименову, И. И. Русанову, К. Сасаки, Д. А. Старынину, В. А. Шакола, Е. А. Филипенко, Б. Френгстаду, Д. Хобману, С. К. Юсупову, а также студентам и аспирантам кафедр Физиологии растений и биотехнологии и Экологического менеджмента Томского государственного университета А. Герасимчук, А. Демянчук, А. Давыдову, Д. Ивасенко, А. Казаченок, С. Курочкиной, Т. Рычковой, О. Сухановой и Ю. Франк совместно с которыми были получены результаты этого исследования.

Искренняя благодарность Е. А. Бонч-Осмоловской, В. Ф. Гальченко, В. М. Горленко, С. Н. Дедыш и Т. Н. Назиной за помощь в формулировании положений автореферата диссертации.

Автор благодарит Группу Норильский Никель за предоставленную возможность и помощь в отборе проб.

Искренне признательна А. М. Адаму, Э. Г. Африкяну, В. И. Гридневой, Р. А. Карначук, Г. М. Маркосяну, Я. А. Пухакка и О. X. Туовинену за помощь в организации и проведении исследований.

Автор в неоплатном долгу перед М. В. Ивановым, который направлял, помогал и консультировал на протяжении всего периода исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 200 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,

обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа содержит 57 рисунков и 17 таблиц.

Основные защищаемые положения.

1. В мелководных шельфовых осадках окраинных и внутренних морей протекает высокоинтенсивный процесс микробной сульфатредукции, сопровождающийся образованием диагенетических сульфидов железа. В условиях высоких концентраций реакционноспособного железа скорость образования пирита зависит от суммарной интенсивности процесса восстановления сульфата и окислительно-восстановительных условий среды.

2. В экосистемах, связанных с отходами добычи и производства металлов, сульфатредуцирующие микроорганизмы ответственны за образование вторичных аутигенных сульфидов. Этот факт подтверждается измеренными скоростями сульфатредукции, анализом стабильных изотопов окисленных и восстановленных соединений серы и присутствием многочисленного сообщества СРБ.

3. В исследованных экосистемах отходов добычи и переработки металлов преобладают СРБ родов Desulfobulbus и Desulfovibrio, осуществляющие неполное окисление органических соединений. Методами, основанными на культивировании, обнаружены разнообразные спорообразующие Firmicutes, включая новых представителей рода Clostridium, способных к диссимиляторной сульфатредукции.

4. В природных экосистемах существуют СРБ, устойчивые к высокому содержанию ионов меди (II) и хрома (VI). Сульфатредукторы, растущие при высокой концентрации ионов Си2+, способны образовывать сульфиды меди: ковеллит, халькоцит и халькопирит.

5. СРБ способны использовать нерастворимые сульфаты - барит и англезит, и нерастворимый сульфит, ханнебахит, в качестве конечного акцептора электронов. При восстановлении англезита может образовываться вторичный сульфид, галенит.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ГЕОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

В обзоре литературы приведены материалы по истории и современным данным в области геологической деятельности сульфатредуцирующих бактерий.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Геологическая деятельность СРБ была изучена в прибрежных мелководных осадках Японского моря (залив Восток, бухта Троица) (Карначук и др. 1990), осадках и альго-бактериальных матах бухты Кратерная (Курильские острова, Охотское море) (Карначук и др. 1989), осадках залива Батабано (Карибское море) (Намсараев и др. 1990), осадках северо-западного шельфа Черного моря (Karnachuk and Ivanov, 1992), водной толще и осадках меромиктического соленого

озера Шира (Республика Хакасия) (Карначук, Парначев, 2001; Пименов и др. 2003), подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья (Карначук и др. 2001), отходах горнодобывающих и металлургических предприятий и связанных с ними экосистемах в Норильской промышленной зоне, гг. Мончегорске и Заполярном на Кольском полуострове (Karnachuk et al., 2005). Исследованные экосистемы характеризовались широким спектром окислительно-восстановительных условий, pH среды, содержания органического вещества и концентрации различных неорганических соединений, а также ионов металлов (табл. 1, 2). Концентрация ионов Си2+ и Ni2+ в отходах горнодобывающих и металлургических предприятий составляла от 0.1 до 80 и от 3 до 500 мг/кг сухого веса, соответственно.

Eh, pH, щелочность, концентрацию растворенного кислорода, содержание сероводорода, сульфата, ортофосфата, аммония, нитритов, общего железа, сухого остатка, перманганатную окисляемость определяли стандартными методами. Определение интенсивности сульфатредукции и образования различных восстановленных форм серы в условиях максимально приближенных к in situ проводили в изолированных пробах воды и осадков с применением радиоактивномеченного сульфата натрия (Карначук, 1990; Karnachuk et al., 2005). Краткосрочную инкубацию проб (не более 24 часов) осуществляли в условиях in situ или при максимально приближенной к ним температуре в темноте. Определяли включение метки отдельно во фракции кислоторастворимых сульфидов, пирита, элементной и органической серы. Для анализа стабильных изотопов серы CdS сжигали до S02 и анализировали на масс-спектрометре МИ-1201 (ПО Электрон, Сумы, Украина).

Определение численности микроорганизмов проводили методом десятикратных разведений с последующим посевом на элективные среды. СРВ учитывали на среде Видцеля (Widdel, Bäk, 1992). Отдельно проводили определение численности на среде с различными донорами электронов: 1) лактатом, ацетатом, пропионатом, формиатом, глюкозой, бензоатом и Н2; 2) кислыми (pH 3.5) и нейтральными (pH 7.2) условиями среды; 3) добавками Си2+ (150 мг/л), Ni2+ (200 мг/л) и Со2+ (200 мг/л). Анализ численности СРВ в морских экосистемах проводили также на среде Постгейта (Postgate, 1984). Культивирование проводили при температуре 4°С и 28°С. Выделение чистых культур сульфатредуцирующих бактерий и определение их фенотипических характеристик проводили известными методами (Postgate, 1984; Widdel, Bäk, 1992).

Пробы для анализа методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) фиксировали 96% этанолом или параформальдегидом. Визуализацию результатов проводили с использованием эпифлуоресцентного микроскопа (Axioskop 2 plus, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Germany). Проведение гибридизации и процедура подсчета клеток подробно описаны (Karnachuk et al., 2005; Карначук и др., 2006). Известные из литературы род- и группо-специфические 16S г RNA олигонуклеотидные зонды (MedProbe Eurogentech, Seraing, Belgium), использованные в наших исследованиях перечислены в таблице 3.

Таблица 1. Пределы изменения некоторых физико-химических параметров в исследованных пробах прибрежных осадков морей

Место отбора проб Глубина, м т, "С pH Eh, mV Сорг, % от сухого вещества

Японское море, 1-23 15- 17 7.18-7.6 -130:+280 0.6 - 6.2

бухта Троица

Японское море, 9-26 14- 17 7.05-7.6 +16 : +105 1.5-3.2

залив Восток

Охотское море, 0.5 - 23 4-20 6.3 - 7.28 -197 : +320 0.03 - 12

бухта Кратерная, Курильские острова

Карибское море, залив Батабано 0.2 - 9.0 30-32 6.75 - 8.25 -80 : +60 1.54-9.0

Черное море, северо-западный шельф 10-25 7-20 7.73 - 8.45 но но

- измерения не проводили

Таблица 2. Пределы изменения некоторых физико-химических параметров в исследованных пробах осадков, подверженных воздействию предприятий добычи и производства металлов

Тип осадков Обозначения т, pH Eh, Сорг,

мест отбора °с mV %от

проб сухого вещества

Осадки ветландов,

получающих дренажные Т2, ТЗ, Т4,

воды хвостохранилищ Т5, Т7,

отходов добычи и К1, К7, К9, 8.2-12.0 6.3 - 8.88 -84 : +350 0.23 - 1.13

производства металлов и К12

сточные воды

производства металлов

Осадки хвостохранилищ Т1,Т6, Т7, отходов добычи и Т9

производства металлов К2,КЗ,К10, 2.0-23.0 1.97 - 9.28 - 100:+400 0.12- 12.1

К11, Ха114, Ха115

Для определения филогенетической принадлежности культивируемых микроорганизмов методом гель-электрофореза в денатурирующем градиенте (DGGE) первоначально проводили амплификацию участков V4 и V5 гена 16S рРНК с использованием праймеров 357F (5'-GC-clamp-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3') и 907R (5' -CCG ТСА ATT СМТ TTG AGT ТТ-3'). Разделение амплифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием системы Decode™ Universal Mutation Detection System (BioRad, Hercules, CA, U.S.) в

Таблица 3. Олигонуклеотидные зонды, использованные для FISH анализа

Зонд Целевые Последовательность (5'-> 3') Целевой Конце

организмы участок нтрац

16SpPHK ия

E. coli форма

мида

(Об. % )

NON338 Отрицательный ACTCCTACGGGAGGCAGC 338-355 10

контроль

DSR651 Desulforhopalus CCCCCTCCAGTACTCAAG 651-668 35

DSS658 spp. Desulfosarcina, TCCACTTCCCTCTCCCAT 658-685 60

Desulfofaba,

Desulfococcus, и

Desulfofrigus spp.

DSV698 Desulfovibrio spp. GTTCCTCCAGATATCTACGG 698-717 35

DSV214 Desulfomicrobium CATCCTCGGACGAATGC 214-230 10

DSV407 spp. Desulfovibrio spp. CCGAAGGCCTTCTTCCCT 407-424 50

DSV 1292 Desulfovibrio spp. CAATCCGGACTGGGACGC 1292-1309 35

DSD131 Desulfovibrio sp. CCCGATCGTCTGGGCAGG 131-148 20

DSMA488 Desulfarculus, GCCGGTGCTTCCTTTGGCGG 488-507 60

Desulfomonile, и

Syntrophus spp.

Sval428 Desulfotalea и CCATCTGACAGGATTTTAC 428-446 25

Desulfofustis spp.

660 Desulfobulbus spp. GAATTCCACTTTCCCCTCTG 660-679 60

221 Desulfobacterium TGCGCGGACTCATCTTCAAA 221-240 35

DSB985 spp. Desulfobacter и CACAGGATGTCAAACCCAG 985-1003 20

Desulfobacula spp.

DSF672 Desulfofrigus и CCTCTACACCTGGAATTCC 672-690 45

Desulfofaba spp.

DSC 193 Desulfosarcina spp. AGGCCACCCTTGATCCAA 193-210 35

DCC209 Desulfococcus spp. CCCAAACGGTAGCTTCCT 209-226 25

DSS225 Клон SVAL1 TGGTACGCGGGCTCATCT 225-242 40

Dtm229 Desulfotomaculum AATGGGACGCGGATCCAT 229-247 15

линейном градиенте мочевины и формамида между 30% и 65% (100% денатурирующие условия определяли как 7 М мочевину и 40% формамид) в 8% акриламидном геле.

Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программы BioEdit, а также инструмента BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

(Altschul et al., 1997). Последовательности выравнивали и проводили филогенетический анализ с использованием пакета ARB (http://www.arb-home.de).

Исходное филогенетическое дерево было построено методом ближайшего соседа (neighbor-joining) и участки ДНК, соответствующие полосам в DGGE-геле были добавлены с использованием parasimony analysis. Bootstrapping analysis был основан на 1000 репликациях для установления доверительного уровня для каждого узла дерева.

В экспериментах с культурами рост СРВ определяли, измеряя концентрацию белка в среде (Lowry, 1951) и образование сероводорода (Cline, 1969). Образование ацетата в культурах определяли методом газовой хроматографии.

Геномную ДНК выделяли как описано Самбрук с соавт. (Sambrook et al., 1989), а также с использованием PowerSoilTM DNA Isolation Kit (МО BIO Laboratories. Inc). Плазмидную ДНК выделяли по известным методикам (Hardy, 1987) и с использованием MiniPrep Kit (QIAGEN). Для амплификации последовательностей генов 16S рРНК использовали специфичные для Bacteria праймеры 27F (5 ' -AGAGTTTG ATCCTGGCTC AG-3 ') и 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'). Для амплификации последовательностей, родственных генам рсо, использовали праймеры pcoRl 5'-CAG GTC GTT ACC TGC AGC AG-3' иpcoR2 5'-CTC TGA TCT CCA GGA CAT ATC-3' для генаpcoR и pcoAl 5'-CGT CTC GAC GAA CTT TCC TG-3' и pcoA2 5'-GGA CTT CAC GAA АСА TTC CC-3' для генаpcoA (Trajanovska et al., 1997). Температурные режимы и условия амплификации описаны в соответствующих публикациях (Karnachuk et al., 2003; Karnachuk et al., 2005). ПЦР-продукты секвенировали коммерчески в DNA Sequencing Facility, Institute of Biotechnology, Helsinki University.

Рентгено-фазовый анализ кристаллических фаз осадков проводили на XRD Multi Flex (Rigaku/MSC, Woodlands, TX) с монохроматическим CuKa излучением и источником энергии 40kV — 40 mA. Элементный состав образцов определяли количественно с использованием флуоресцентного спектрометра Shimadzu Rayny EDX-800 (Shimadzu corp., Kyoto, Japan).

Подробное описание методов отбора проб, измерения физико-химических параметров среды, аналитических и молекулярных методов приведено в опубликованных работах.

Глава 3. ИНТЕНСИВНОСТЬ СУЛЬФАТРЕДУКЦИИ И ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ В ПРИБРЕЖНЫХ ОСАДКАХ МОРЕЙ

Одной из важнейших сторон геологической деятельности СРВ является образование сульфидов при взаимодействии ионов металлов с конечным продуктом восстановления сульфата, сероводородом. Железо, самый распространенный металл, а также четвертый по содержанию в земной коре элемент, имеет наибольшее значение в природе и производстве. Биогенные сульфиды железа являются обычными компонентами как современных, так и древних осадков и включают тетрагональный дефицитный по сере Fe2+- сульфид маккиновит FeS-F107S (Lennie et al., 1995), грейгит Fe/+,Fe2+,S4 (Vaughan and Ridout, 1974) и пирит FeSî- В то время как метастабильные маккиновит и грейгит

Рис. 1. Суммарная интенсивность сульфатредукции и содержание

органического вещества в осадках бухты Троица (♦) и залива Восток (о) Японского моря; альго-бактериальных матах и осадках бухты Кратерная (а) (Охотское море) и осадках залива Батабано (о) (Карибское море).

являются объектом возможного реокисления, кристаллический пирит значительно более стабилен и устойчив к окислению. Процесс преобразования сульфатредукционного сероводорода в пирит является основным механизмом выведения из круговорота и захоронения серы и железа в морских осадках, где вследствие высокого содержания сульфатов процессы их биологического восстановления могут протекать с высокой интенсивностью.

3.1 Скорости процесса сульфатредукции и образование диагенетических сульфидов. В наших работах (Karnachuk, Ivanov, 1992) и работах других авторов (обзор см. Skyring, 1987; Wijsman et al,, 2001; Lein et al., 2002) показано, что шельфовые зоны Мирового океана, получающие большие количества органического вещества и биогенов со стоком рек, характеризуются экстремально высокими скоростями бактериальной сульфатредукции. На долю шельфовых отложений, по разным оценкам, приходится от 50% до 90% всей диссимиляторной сульфатредукции, протекающей в экосистемах Земли (Иванов, 1979; Jorgensen, 1982; Волков, Розанов, 1983). По расчетам Бернера (Berner, 1982) количество захораниваемой в приустьевых отложениях и осадках шельфа S-пирита оценивается около 3.9 х 1013 г в год. Поэтому изучение образования диагенетических сульфидов в мелководных шельфовых зонах Мирового океана имеет особое значение.

Высокое содержание аллохтонного и автохтонного органического вещества является определяющим фактором интенсивного процесса сульфатредукции в изученных нами прибрежных экосистемах (рис. 1). Среди исследованных осадков бухты Троица (Японское море) выделяются максимальные значения скорости сульфатредукции, полученные для иловых отложений в районе судоходного канала, загрязненного углеводородами нефти и другими органическими веществами, а в заливе Восток осадки в центре залива, где скапливается основная доля терригенного вещества (Карначук и др., 1990). Максимально высокие

6 8 10 12 С„пг, % от сухого вещества

Японское море, бухта Троица I Японское море, залив Восток I Охотское море, бухта Кратерная, маты I

Рис. 2. Пределы изменения доли новообразованного пирита в суммарной восстановленной сере в прибрежных

Охотское море, бухта Кратерная, осадки

Карибское море, залие Батабано Черное море, конус выноса Днестра

Черное море, конус выноса Дуная

О 20 40 60 80 100

% от суммарной восстановленной серы

—i-1—

во юо морских осадках.

интенсивности сульфатредукции в альго-бактериальных матах бухты Кратерная связаны с высокими скоростями продукционных процессов.

Мы впервые детально изучили скорость образования пирита в краткосрочных экспериментах с радиоактивной меткой в различных типах осадков мелководных прибрежных зон Японского, Охотского, Карибского и Черного морей. Минимальные и максимальные доли новообразованного пирита от суммы всей восстановленной серы при измерении скорости сульфатредукции в условиях приближенных к in situ в изученных осадках представлены на рисунке 2. В осадках бухты Троица (Японское море) в пирит переходило от 3 до 92.4% метки, залива Восток (Японское море) — от 1.6 до 49% (Карначук и др., 1990). Незначительные скорости образования (0.0-0.47% всей восстановленной серы) пирита были зафиксированы в альго-бактериальных матах бухты Кратерной. Большие количества образовывались в грунтах этой экосистемы — 0.3-64.5% (Карначук и др., 1989). Доля новообразованного пирита от суммарной восстановленной серы в грунтах залива Батабано колебалась в широких пределах от 0 до 89.2% (Намсараев и др., 1990), также как и в осадках северо-западного шельфа Черного моря — от 0.5 до 99.8% (Иванов и др., 1992).

В изученных пробах скорость образования пирита обратно коррелировала с суммарной интенсивностью сульфатредукции. В условиях максимально-высоких скоростей восстановления сульфата интенсивность образования FeS2 была низкой, в то время как наибольший процент радиоактивной метки накапливался в пирите в пробах, где общая интенсивность сульфатредукции была небольшой. Определения скорости образования пирита по разрезу иловых колонок прибрежных районов Японского и Черного морей показало, что при увеличении скорости сульфатредукции большее количество метки обнаруживалось в кислоторастворимых сульфидах (КРС) и меньшее в пирите (рис. 3, 4).

В изученных морских экосистемах существовала зависимость между долей пирита в суммарной восстановленной сере и окислительно-восстановительными условиями места отбора пробы. Наибольший процент метки обнаруживали в пирите в пробах, характеризующихся более окисленными условиями с ОВП + 80 : + 300 mV. Присутствие окислителей является важнейшим фактором при преобразовании КРС в пирит (Rickard, Morse, 2005). В роли окислителя может

% общей восст. серы; интенсивность CP х 10"1, цмоль см*э сут1; ОВП, mV О 20 40 60 80 100

Рис. 3. Изменение образования восстановленных форм серы (в % от общей скорости сульфатредукции), суммарной интенсивности сульфатредукции и окислительно-восстановительного потенциала по профилю осадков станции 2, залив Восток, Японское море.

% общей восст. серы 0 20 40 60 80 100

Интенсивность CP, цмопь см"3 сут"1

Рис. 4. Изменение образования восстановленных форм серы (в % от общей скорости сульфатредукции) и суммарной интенсивности сульфатредукции по профилю осадков станции 65Б, конус выноса Дуная, Черное море.

выступать не только кислород, но также нитраты и оксид марганца (Aller, Rude, 1998; Schippers, Jorgensen, 2002). Окислители выполняют две основные функции. Во-первых, окисление фракции КРС происходит значительно быстрее, чем окисление пирита, и это в свою очередь способствует накоплению FeS2 в осадках, подверженных окислительным процессам. Во-вторых, окисление сульфида может происходить не до наиболее окисленной формы серы, сульфата, а приводить к

образованию недоокисленных форм, таких как полисульфиды (Rickard, Morse, 2005). Полисульфиды являются одним из основных агентов, приводящих к преобразованию КРС в пирит.

Необходимо отметить, что шельфовые зоны морей получают значительное количество реакционноспособного железа со стоком рек и его содержание, как правило, не является фактором, лимитирующим образование пирита. В частности, в изученных осадках северо-западного шельфа Черного моря содержание суммарного растворенного железа достигало 807 mmol кг"1 (Wijsman et al., 2001). Таким образом, высокие скорости диагенетического пиритообразования в прибрежных морских осадках приурочены не к «сульфидной» зоне, характеризующейся максимальной скоростью восстановления сульфата, а к зоне переходной между окисленными и восстановленными условиями и слабоокисленным осадкам, где суммарная интенсивность процесса сравнительно невелика.

3.2 Изотопный состав окисленных и восстановленных форм серы. Изотопный состав сульфидов является надежным показателем их генезиса и служит важным инструментом для изучения биогеохимических процессов цикла серы. Процесс диссимиляторного восстановления сульфатов характеризуется наиболее значительным разделением стабильных изотопов серы по сравнению с другими биогеохимическими реакциями цикла серы. Сульфатредуцирующие бактерии используют преимущественно легкий изотоп 32S, оставляя остаточный сульфат обогащенным тяжелым изотопом 34S. В наших исследованиях образования сульфидов в различных экосистемах проводили также определение изотопного состава окисленных и восстановленных соединений серы.

Особенный интерес представляет изученный нами изотопный состав соединений серы в мелководных осадках северо-западного шельфа Черного моря. Экосистема мелководного шельфа находится под влиянием выноса трех крупнейших рек, Днепра, Днестра и Дуная, составляющих 75% всего речного стока в Черное море (Виноградов и др., 1992). Большое количество биогенов, поступающих со стоком из сельскохозяйственных областей Украины, Болгарии и Румынии, в начале 70-х годов привело к резкому увеличению продуктивности фитопланктона и бактериопланктона (Zaitsev, 1993). Увеличение количества биомассы, образующейся на шельфе, с одновременным поступлением терригенного органического вещества привело к активизации деструкционных процессов и, в свою очередь, к эпизодическому истощению растворенного кислорода на мелководье, гипоксии и массовой гибели бентосных организмов. Максимальные интенсивности процесса сульфатредукции были обнаружены нами в иловых отложениях в приустьевых районах Днестра и Дуная (Иванов и др., 1992).

В мелководных осадках шельфа Черного моря наблюдали значительный эффект изотопного фракционирования (A34S), определяемый по разности между изотопным составом окисленной и восстановленной серы. A34S увеличивался с глубиной осадков и достигал в нижних горизонтах 76.6 %о. Современная адаптация модели Рииса (Reese, 1973), предполагает возможность изотопного

со

Я< 80

<о

1 70

(О

0 60

о.

1 50

I 40

О.

•В" 30

<о

£ 20

О ю

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 534Э, %о

Рис. 5. Зависимость эффекта изотопного фракционирования Д348 в пробах осадков северо-западного шельфа Черного моря от изотопного состава КРС (■) и сульфатов (♦).

эффекта, за счет активности СРБ до 70 %о (Вгиппег, ВегпаБсош, 2005), а изящное введение в расчет возможного дополнительного фракционирования при диспропорционировании элементной серы (СапПеЫ, ТЪатс1гир, 1994) и тиосульфата (.Го^епзеп, 1990) предоставляет возможность трактовки высоких Д345 в слабоокисленных-слабовосстановленных системах. Модель дополнительного фракционирования за счет диспропорционирования продуктов окисления сульфатредукционного Н25 может только отчасти быть применима к нашим результатам, так как в наших пробах высокий изотопный эффект был связан не только с облегчением восстановленной серы, но также с существенным утяжелением остаточного сульфата (рис. 5). При фракционировании, связанном с диспропорционированием, происходит только облегчение восстановленных продуктов, но не утяжеление сульфата.

Высокий эффект изотопного фракционирования, включающий существенное утяжеление сульфата, вероятно связан с формированием системы, близкой к замкнутой по сульфату в условиях высоких скоростей осадконакопления в приустьевых участках шельфа Черного моря. Резкий градиент концентрации сульфата, сопровождаемый значительным возрастанием изотопного эффекта, был особенно заметен в верхнем и подповерхностном (до 2 см) горизонте осадков (рис. 6). Эффект изотопного фракционирования Д348, рассчитанный как для моносульфидов, так и для пирита, показывал сильную обратную корреляцию с концентрацией сульфата поровой воды (рис. 7). Скорость процесса сульфатредукции также может влиять на величину эффекта изотопного фракционирования. В изученных осадках Черного моря прослеживалась обратная

■ ♦ ♦ Л

X 2 *> Я = 0,86 X

\ ш / ♦

\ ■ ■ V у/ *

Р12 = 0,75 " \ X ♦

■ ♦ /

б343; Д345, %«; скорость СР х 10"1цмоль см"3 сут"1 -40 -20 0 20 40 60 80 100 О -2 -4 -

3 62 8 -

I. 10" £ 1214 -

16 -18 -

О 50 100 150 200 250

Б/БСи, мг/л

Рис. 6. Изменение бисульфата (1); 5348моносульфидов (2); 5348пирита (3); Д345 (4); интенсивности сульфатредукции (5) и концентрации сульфата (6) по профилю осадков станции 65В.

Д34Зпирита

0 20 40 60 80

400 ^ = 0,8683 дРеЭ ♦ РеЭг

с \ Л.

1— 300 • Ь\ л *

О со 200 - д\ ♦ \ \д \ ♦

со 100 -п . Я2 = 0,9162

0 20 40 60 80 100

Д34Змоносульфидов

Рис. 7. Зависимость эффекта изотопного фракционирования (Д348) от содержания сульфатов в осадках северо-западного шельфа Черного моря.

зависимость эффекта изотопного фракционирования от интенсивности сульфатредукции (рис. 8).

Зафиксированные нами максимальные интенсивности сульфатредукции, сопровождающиеся резким снижением концентрации сульфата и увеличением

■ 14

A34S - 12 - 10 'z u -а с; ° ^моносульфидов

■ 2 ■ V R = 0,608 ^^ СП со 2 д. а." о л Б А R2 = 0,591

- 4 I m S о \ А

■ ■ ■ 2 ф н X S А *

80 60 40 20 0 -20 -40

A34S; 534S, %o;

Рис. 8. Зависимость эффекта изотопного фракционирования (Ä34S) и изотопного состава моносульфидов от интенсивности сульфатредукции в осадках северозападного шельфа Черного моря.

величины изотопного фракционирования в верхних горизонтах иловых колонок свидетельствовали в пользу активизации процессов диссимиляторного восстановления сульфатов в небольшой промежуток времени, предшествовавший нашим исследованиям. Результаты изотопного анализа и экспериментов с меткой подтверждаются другими фактами, такими как (1) «нетипичное» для морских осадков максимальное накопление восстановленных соединений серы в верхних горизонтах; (2) присутствие раковинного материала в слоях подстилающих высокосульфидные верхние горизонты илов. Более поздние исследования сульфатредукции в приустьевых районах шельфа показали снижение скоростей сульфатредукции в 90-е годы (обзор см. Lein et al., 2002), что, несомненно, связанно со снижением поступления загрязнителей со стоком рек в результате экономической рецессии в большинстве стран бывшего Советского блока, контролирующих большую часть водосборной площади рек Дуная, Днестра и Днепра.

Глава 4. ГЕОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ СРБ В ОТХОДАХ ДОБЫЧИ И ПЕРЕРАБОТКИ МЕТАЛЛОВ И СВЯЗАННЫХ С НИМИ ЭКОСИСТЕМАХ

Тогда как осадки морей и пресноводных водоемов традиционно рассматривают как экосистемы, где сульфатредукция представляет важную составляющую круговоротов серы, углерода и металлов, геологическая активность СРБ в отходах горнодобывающих и металлургических предприятий, часто содержащих большие количества сульфата, до наших исследований оставалась малоизученной. Сульфиды металлов, в первую очередь железа, в

отходах добычи и переработки металлов, угля и сланцев, подвергаются химическому и биологическому окислению. В результате денудационных процессов происходит формирование дренажных вод, характеризующихся повышенными концентрациями сульфатов, металлов и часто низким рН.

Наши исследования впервые представили количественную оценку геохимической активности СРБ и продемонстрировали образование аутигенных сульфидов в отходах добычи и переработки металлов (КатасЬик е1 а1., 2005).

4.1.Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов.

Геологическая деятельность СРБ была изучена нами в двух географически удаленных районах, специализирующихся на добыче руды и цветной металлургии, - Норильской промышленной зоне и гг. Мончегорске и Заполярном на Кольском полуострове. Оба региона относятся к числу получающих наибольшую нагрузку на окружающую среду от добычи и переработки руд цветных металлов — сульфидов меди, никеля и кобальта. Распространение и активность СРБ изучали в хвостах забалансовых руд после добычи меди (пирротинохранилище, Норильск, сайт Т9); ветландах, получающих дренажные воды из хвостохранилищ отходов после флотации медной руды (Норильск, Т1-Т5) и гидрометаллургической добычи меди (Норильск, Т6); заболоченных почвах, подверженных влиянию стоков из цеха электролизного получения кобальта (Норильск, Т7); осадках ручья, получающего стоки из цеха электролиза никеля (Мончегорск, К1); осадках канала, получающего суммарные сточные воды от комплекса предприятий по получению никеля (Мончегорск, К2); осадках хвостохранилища, получающего суммарные стоки от производства никеля и дренажные воды со шлакотвала металлургического получения никеля (Мончегорск, КЗ); осадках прудов-накопителей рудничных дренажных вод при добыче полиметаллических руд (Заполярный, К8, К9, К11); осадках пруда, получающего стоки со шлакоотвала металлургического получения меди и никеля (Заполярный, К10).

Большинство исследованных проб характеризовалось высокими концентрациями сульфата. Изученные гидрохимические показатели и изотопный состав серы сульфата свидетельствовали в пользу того, что его источником было окисление остаточных сульфидов. В большинстве биотопов измеренная нами скорость сульфатредукции составляла заметную величину и была сопоставима с интенсивностью процесса, описанной для морских и пресноводных осадков. В целом, в пробах хвостохранилищ и ветландов в Норильске скорость образования пирита была выше по сравнению с пробами Кольского полуострова, и основное количество радиоактивной метки обнаруживали во фракции хромовосстанавливаемой серы (ХВС) (рис. 9). Основной составляющей фракции ХВС является пирит, также в нее входит элементная сера. Полученные различия в интенсивности образования пирита были связаны с различным уровнем рН среды. Осадки и почвы Норильской промышленной зоны характеризовались более развитыми процессами окисления сульфидов и соответственно, рН, сдвинутыми в кислую сторону (рис. 10). Слабокислые условия среды благоприятствует

р □ Норильск

s и 20- а Кольский п-ов □

со

л с; о S X 15 А D □

CL'" о 10- □ □ о

л ь о о X m S о X 5 n А □ 4 A t t А * L* лА □ А □ □ а □ о □

<D X s и ■ 20 40 60 80 100

ХВС, % от общей восст. S

Рис. 9. Доли ХВС в общей восстановленной сере и суммарная интенсивность сульфатредукции в пробах хвостохранилищ и ветландов Норильска и Кольского полуострова.

400 300

0 -100 -200 -300 -400

А ш * А о Dà □ А Рл А

2 3 4 5 6П TtP 8 9 10 1

о Норильск А Кольский П-ОВ □

РН

Рис. 10. Значения окислительно-восстановительного потенциала (ЕЬ) и рН в пробах Норильского и Кольского полигонов.

образованию пирита, в то время как в слабощелочных условиях баланс сульфидов железа сдвинут в сторону образования маккиновита (Berner, 1964; Howarth, 1979). В отличие от Норильской промышленной зоны, отходы предприятий цветной металлургии на Кольском полуострове подвергаются обработке известью, что приводит к нейтрализации кислоты и созданию химической обстановки, способствующей осаждению ионов металлов в виде гидрооксидов.

Необходимо отметить, что большинство исследованных проб Кольского полуострова характеризовались слабо-окисленными (Eh=50-100 mV) или

14 ■ А К7/3-5)

10 -

6 АК7(0-1)

4 К1(0-2) 2" К1<гЪ кю д 1С7(8-11) КЗ(0-5) + О K9I0-SI О К2(0-5) 0*2(0-5) КЩЫ) KS/0-5)

K12(4-«)J

-100 0 100 200 300 400 500 Eh, mV

Рис. 11. Суммарная интенсивность сульфатредукции и окислительно-восстановительный потенциал, измеренные в пробах осадков ветландов и хвостохранилищ Кольского полуострова. Станции отбора проб обозначены курсивом, в скобках — горизонт отбора проб в см.

окисленными (Eh>300 mV) условиями (рис. 11). Также заметное образование сульфидов происходило в некоторых из проб Норильского полигона, Eh которых превышал 300 mV. Данные гидрохимического анализа, стабильной изотопии и присутствие серо-окисляющих Acidithiobacillus ferrooxidans свидетельствовало, что в тех же горизонтах протекали процессы окисления сульфидов. Таким образом, окисление сульфидов и восстановление сульфата не были разобщены и протекали в одном и том же горизонте осадка. Хотя о присутствии культивируемых СРВ в окисленных осадках хвостохранилищ сообщалось ранее (Fortin et al., 1996; 2000), наши исследования впервые продемонстрировали образование сульфатредукционных вторичных сульфидов в окисленных условиях хвостохранилищ забалансовых руд.

В силу развития процессов окисления сульфидов железа в осадках хвостохранилищ присутствует значительное количество железа, и содержание реакционноспособного Fe не лимитирует процесс образования вторичных сульфидов. В изученных нами отходах добычи и переработки металлов содержание железа достигало 70 г/кг. Скорости образования аутигенных сульфидов в хвостохранилищах и ветландах, получающих дренажные воды, подчинялись закономерностям, описанным ранее для морских осадков. Наиболее высокая скорость образования пирита была обнаружена в пробах, характеризующихся наименьшими скоростями сульфатредукции (рис. 12). Наблюдаемая в шельфовых морских осадках тенденция более высоких скоростей образования пирита в слабо-окисленных и окисленных условиях подтвердилась и для изученных нами осадков ветландов и хвостохранилищ.

Рис. 12.

Относительная пропорция

хромвосстанавливаем ой серы (ХВС) в общем пуле восстановленной серы, рассчитанная для экспериментов с добавками в осадках ветландов в Норильске (Т2 и Т5) и осадках ручья в Мончегорске (К1).

4.2. Изотопный состав окисленных и восстановленных соединений серы. Изучение изотопного состава сульфидов отходов и хвостохранилищ имело особое значение для подтверждения возможности образования вторичных сульфидов в этих экосистемах. В некоторых пробах, как в Норильске, так и на Кольском полуострове, моносульфиды и пирит имели более легкий изотопный

б^Э, %0

-25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30

1 2

Рис. 13. Вариации изотопного состава серы (5348) сульфата поровых вод, ангидрита и пирита в изученных образцах Норильского полигона и Кольского полуострова. Обозначения: сульфат поровой воды, Норильск (1); ангидрит, Норильск (по Гриненко, Гриненко, 1974) (2); моносульфиды, Норильск (3); ХВС, Норильск (4); пирит рудоносных интрузий, Норильск (по Гриненко, Гриненко, 1974) (5); моносульфиды, Кольский полуостров (6); ХВС, Кольский полуостров

(7); пирит рудных залежей, Кольский полуостров (по Гриненко, Гриненко, 1974)

(8).

ХВС, % от общей восст. Э

состав серы по сравнению с пиритом рудных залежей (рис. 13). Известные значения изотопного состава серы пирита руды в Норильской и Талнахской рудных интрузиях изменяются в пределах от +2.7 до +16.3%о и ангидрит осадочных отложений от +14 до +23 %о (Гриненко, Гриненко, 1974). Измеренные нами значения серы пирита облегченные до -9.5%о и моносульфидов до -11.2%о однозначно свидетельствуют об их биогенном происхождении. Несмотря на высокие концентрации сульфата, образующегося в окислительных процессах, утяжеленный в результате сульфатредукции остаточный сульфат занимал достаточное место в пуле и нам удалось зафиксировать его значение до +25%о в одной из проб. В большинстве проб сульфат характеризовался облегченными значениями по сравнению с ангидритом осадочных пород, что также служило доказательством активного протекания процессов окисления первичных сульфидов.

4.3. Распространение и разнообразие сульфатредуцирующих бактерий. До

недавнего времени состав сульфатредуцирующего сообщества в местообитаниях, подверженных влиянию добывающего и перерабатывающего металлы комплекса, оставался неизученным, несмотря на то, что некоторые исследователи обнаруживали высокую численность СРБ в этих экосистемах (Wielinga et al., 1999; Fortin et al., 2000). Мы впервые провели исследование численности, сопровождаемое определением филогенетического состава культивируемых и некультивируемых СРБ, в отходах горно-добывающей и металлургической промышленности и ветландах, получающих дренажный материал из хвостохранилищ.

Общая численность СРБ, определяемая методом предельных разведений, в Норильских пробах изменялась в небольших пределах около 107 клеток см"3. В пробах, отобранных на Кольском полуострове, обнаружили значительные колебания количества СРБ от 2.5 104 (проба К11) до 2.5 ' 108 (проба КЗ) клетоксм"3. Наибольшее количество клеток обнаруживали при использовании в качестве доноров электронов лактата, этанола и глюкозы по сравнению с ацетатом и бензоатом. В пробах, характеризующихся рН близким к нейтральному, обнаруживали меньшее количество клеток СРБ способных к росту при рН 3.5 (рис. 14). Однако в пробах с кислыми условиями среды, как, например, осадки пирротинохранилища в Норильске, на некоторых субстратах количество ацидофильных/ацидотолерантных СРБ превышало число клеток, обнаруживаемых в условиях нейтральной среды (рис. 15). Для большинства изученных проб прослеживалась известная для многих морских и пресноводных экосистем тенденция отсутствия корреляции численности бактерий, учитываемых на селективных средах, с интенсивностью процесса сульфатредукции.

Численность СРБ, рассчитанная по количеству клеток, дающих положительный сигнал со специфическими олигонуклеотидными зондами при

Глюкоза Этанол Лактат Ацетат Бензоат

Рис. 14. Численность СРБ в осадках ветланда, получающего дренажные воды из хвостохранилища флотации руд в Норильске (Т5), определенная методом предельных разведений с различными донорами электронов и при разных условиях культивирования. рН 7.2, 28°С;

ШЯ рН 7.2, 4°С; 12123 рН 3.5, 28°С;

■1 рН 3.5, 4°С.

Глюкоза Этанол Лактат Ацетет Бензоат

Рис. 15. Численность СРБ в осадках

пирротинохранилища в Норильске (Т9), определенная методом предельных разведений с различными донорами электронов и при разных условиях культивирования.

ЕМЗ

pH 7.2, 28°С; pH 7.2, 4°С; pH 3.5, 28°С; рН3.5, 4°С.

проведении флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), часто значительно превышала количество культивируемых организмов, учитываемых методом предельных разведений. Наши результаты соответствуют современным представлениям о том, что культивируемые микроорганизмы, составляют только небольшую часть сообщества, присутствующего и функционирующего в экосистеме. В таблице 4 представлена доля СРБ от общего числа клеток, окрашиваемых DAPI, которая гибридизовалась с олигонуклеотидными зондами в осадках трех станций на Кольском полуострове. Осадки К10 отобраны со дна ручья протекающего по шлакооотвалу плавильного цеха в г. Заполярный, проба К11 — осадки хвостохранилища на руднике Каула-Котсельваара и К12 — осадки ветланда, расположенного в непосредственной близости к комбинату по переработке руды и производству цветных металлов в Мончегорске. Результаты FISH показали, что виды Desitlfobulbus spp. широко распространены в изученных экосистемах. Desulfobulbus spp. также доминировали в большинстве накопительных культур, полученных из осадков Норильского региона. Современные данные свидетельствуют о широком распространении Desulfobulbus

Таблица 4. Определение СРБ в осадках хвостохранилищ и ветландов, получающих дренажный материал от добычи и переработки руд цветных металлов, на Кольском полуострове, методом FISH с род- и группо-специфическими олигонуклеотидными зондами. Количество гибридизующихся клеток представлено как % от общего числа клеток, окрашивающихся DAPI.

Род- и группоспецифические Станции отбора проб

олигонуклеотидные зонды К10 К11 К12

Desulfovibrio spp. DSV698 0 0 0

Desulfovibrio spp. DSV1292 8.0 4.5 4.9

Desulfovibrio spp. DSV407 0 0 0

Desulfomicrobium spp. DSV214 1.0 0.4 1.2

Desulfovibrio spp. DCD131 1.2 0 0

Desulfobacterium spp. 221 0 0 2.2

Desulfobulbus spp. 660 0 4.0 15.3

Desulfosarcina-Desulfococcus spp. DSS658 0.51 0 0

Desulfobacter-Desulfobacula spp. DSB985 0 0 0

Desulfoarculus-Desulfomonile spp. DSMA488 1.3 0 5.4

Desulforhopalus spp. DSR651 0 0 2.1

Desulfotalea-Desulfofustis spp. Sval428 10.2 6.1 0.7

Desulfotomaculum spp. Dtm229 0 0 0

Сумма, от общего количества клеток, 22.2 15.0 31.8

учитываемых с DAPI, %

Численность микроорганизмов, прямой счет 2.8 2.0 3.5

с DAPI, х 109 клеток мл"1

в биотопах с окислительно-восстановительным потенциалом, изменяющимся от окисленных до слабо-восстановленных значений (Тезке е1 а!., 1996; Заяв е1 а!., 2002), где они могут использовать также альтернативные акцепторы электронов, включая кислород. Оба региона, в которых проводили исследование бактериальной сульфатредукции, расположены в условиях крайнего Севера, а Норильский полигон — в зоне вечной мерзлоты. Психрофильные СРБ, гибридизующиеся с зондом 8уа1428, были обнаружены во всех из изученных проб осадков и их доля достигала до 10.2% от общего числа клеток в осадке (проба К10). Зонд, специфичный для другой группы умеренных психрофилов, рода Пеяи1/ог}юра1№, также давал положительный сигнал как в некоторых из проб осадков Кольского полуострова, так и в накопительных культурах из Норильских осадков.

Окисляющие органику до ацетата бактерии порядка Ве5и1ймЬгюпа1ез являются важной составляющей сульфатредуцирующего сообщества в осадках

хвостохранилищ и ветландов. Наряду с данными FISH, показывающими, что значительная доля сообщества относилась к Desulfovibrionales, PCR-DGGE анализ накопительных культур показал, что их количество увеличивалось в культурах, выращиваемых в условиях повышенной концентрации Cu(II), Ni(II) и Со(И). На рисунке 16 приведены результаты PCR-DGGE для накопительных культур, полученных из осадков шлакоотвала в г. Заполярном (К10), растущих на среде с этанолом с добавлением различных концентраций Cu(II). Секвенирование частичных последовательностей гена 16S рРНК, экстрагированных из геля показало, что наряду с СРВ в накопительных культурах присутствовали несульфатредуцирующие организмы. Характерные обитатели почв Agrobacterium (2D, 3D, 4D), Ralstonia (2В, ЗВ, 4В) и Acidovorax (2С, ЗС) составляли значительную часть сообщества, растущего на среде для СРВ без добавления меди. Добавление меди снижало разнообразие бактерий в культуре, о чем свидетельствовало уменьшение количества полос в геле. Однако, как Agrobacterium, так и Ralstonia могли переживать начальную концентрацию меди 300 мг " л'1. Грам-положительных бактерий рода Desulfosporosinus (2Е, ЗЕ, 4Е) обнаруживали во всех вариантах опыта. Эти спорообразующие СРВ часто

Рис. 16. DGGE — профили ПЦР-амплифицированных частичных последовательностей генов 16S рРНК из накопительных культур СРВ, культивированных в отсутствие Cu(II) (дорожка 2), присутствие 200 мгСи(Н) л'1 (дорожка 3) и 300 мгСи(И) л"1 (дорожка 4). Дорожки 1 и 5 — стандартная смесь.

обнаруживают в шахтных водах и местообитаниях, загрязненных различными металлами. Секвенирование фрагментов генов 16S рРНК, представленных на геле полосами 4J и 4К показало, что обе бактерии являлись представителями рода Desulfovibrio. Участок 16S рДНК размером 515 пар оснований одной из бактерий характеризовался высоким процентом гомологии (99.8%) с D. puteaiis. Второй филотип, родственный Desulfovibrio (515 п.о.) имел 98.3% гомологии с D. magneticus. Фрагменты, соответствующие полосам 4J и 4К не амплифицировались из накопительных культур, выращенных без добавления меди и с добавлением 200 мг Cu(II) л"1. Внесение больших количеств меди создавало селективные условия для роста Desulfovibrio, в то время как при низких концентрациях другие представители консорциума были более успешны в конкуренции за субстраты роста.

4.4. Культивируемые СРБ. Общеизвестно положение, что методы, основанные на культивировании, не отражают все биоразнообразие микроорганизмов в экосистеме. Однако выделение накопительных и чистых

1 г з *

2А

2В ЭВ 4В

iiSHV 40

РЯНСЕ iE 4Е

культур остается важным с точки зрения изучения физиологии и возможной геологической активности бактерий. Нами были выделены 7 чистых культур СРБ из осадков ветландов, получающих шахтный дренаж из хвостохранилищ в Норильске (Т4, Т5), хвостохранилища пирротина (Т9) и осадков ручья, дренирующего шлакоотвал плавильного производства (К10) и изучены их фенотипические и филогенетические характеристики. Анализ последовательностей генов 16S рРНК близких к полным, и фенотипические характеристики показали, что изоляты относились к различным филогенетическим линиям, обладающим способностью к диссимиляторному восстановлению сульфатов. Штаммы BL и KN, выделенные из осадков ветландов, относятся к недавно установленному классу Deltaproteobacteria. Филогенетический анализ показывает, что оба штамма относятся к роду Desulfomicrobium и образуют кластер вместе с валидно описанными D. baculatum, D. apsheronum, D. macestii и D. norvegicum. Все члены группы характеризуются гомологией последовательностей 16S рДНК более 99% (рис. 17). Оба штамма, Desulfomicrobium sp. BL и Desulfomicrobium sp. KN относились к психроактивным формам. Оптимальная температура роста для штамма BL составляла 25° С (|Дтах = 0.235 час'1), при этом штамм активно рос при 12 и 4°С с максимальной удельной скоростью роста 0.036 и 0.021 час'1, соответственно. Дальнейшее изучение физиологии Desulfomicrobium spp., выделенных из проб Норильского полигона, показало, что штамм BL обладал системой устойчивости к меди, родственной рсо-оперону (см. Главу 5).

Все остальные изоляты, полученные из проб Норильского полигона и Кольского полуострова, принадлежали к спорообразующим Firmicutes. Desulfosporosinus sp. ОТ и Desulfosporosinus sp. MV, выделенные из осадков хвостохранилищ в Норильске, показывали 96.8 и 96.6% гомологии, соответственно, с Desulfosporosinus orientis. Еще один изолят Desulfosporosinus sp. MS был выделен из осадков шламоотвала на Кольском полуострове (К10). Его ближайшими родственниками были Desulfosporosinus auripigmentii с гомологией 98.4% и Desulfosporosinus meridei с гомологией 97.5%.

Последовательности генов 16S рРНК близкие к полной помещает два сульфатредуцирующих организма, выделенных из осадков шлакоотвала на Кольском полуострове, внутри гетерогенного рода Clostridium. Штамм Clostridium sp. RL находится внутри одной группы с Desulfotomaculum guttoideum, процент сходства между штаммами — 97.2%. Таксономическое положение D. guttoideum было недавно пересмотрено на основании последовательности гена 16S рРНК (Stackebrandt et al., 1999). Ближайший родственник штамма RL из валидно описанных видов — Clostridium amygdalinum, с гомологией 99.3%. Другой штамм, Clostridium sp. КА, занимает особое положение внутри рода Clostridium, так как относится к отдельной глубоко-ветвящейся группе внутри кластера I. Большинство родственных ему последовательностей принадлежат некультивируемым организмам. Единственный культивируемый организм, относящийся к этой линии внутри Clostridium охарактеризованный ранее, Clostridium sp. FCB90-3, был выделен из рисовых чеков и его способность к диссимиляторному восстановлению сульфата осталась неизученной (Chin et al.,

Clostridium pascal, X9B738

Clostridium pepüdovorans, AF15B796 Clostridium tetanomorphum, XB8184 Clostridium scatologenes, Y18313 Clostridium subterminale, AF241842 Clostridium botulinum, L37S85 Clostridium frigidicamis, AF069742

uncultured bacterium, AY570608 uncultured bacterium, DQ125504 uncultured bacterium, DQ125852 Clostridium sp., A J229251 Clostridium sp. KA Clostridium cylindrosporum, Y18I79 Clostridium purinolyicum, M60491 98%r 'Clostridium sulfatireducens', A Y9438G1 Clostridium sp. rl "Clostridium boliviensis', AY9438S2 Clostridium amygdaSnum, AY353957 Clostridium saccharolyticum, Y1818S Clostridium celerecrescens, AJ295B59 Desullotomaculum guttoideum, Y115B8 Clostridium xylanolyticum, X71855 Desullosporosinus meridiei, AF076247 Desulfosporosinus auripigmenti, AJ493051 Desullosporosinus sp. MS Desulfosporosinus orientis, Y11570 Desulfosporosinus sp. OT Desulfosporosinus sp. MV

Desullotomaculum acetoxidans, Y115B6 Desuifotomaculum ruminis, Y11572 Desulfomicrobium macestil, AJ237B04 Desulfomicmbium norvegicum, AJ277897 Desulfomicrobium apsheronum, UB4865 Desulfomicrobium sp. KN Desulfomicrobium baculatum, AJ277894 'Desulfomicrobium hypogeium', AF132733 Desulfomicrobium sp. BL AY928663 Desulfomicrobium escambiense, U02489 Desulfomicrobium orale, AJ2S1628

Firmicutes

Deltaproteobacteria

Рис. 17. Филогенетическое положение чистых культур СРБ, выделенных из хвостохранилищ и ветландов, определенное методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Масштаб показывает 10% расхождения последовательностей.

1999). Оба выделенных нами штамма Clostridium активно восстанавливали сульфат для окисления различных органических субстратов. Наши данные показывают, что способность к диссимиляторной сульфатредукции возможно более широко распространена внутри Clostridium, чем полагали раньше.

PCR-DGGE анализ накопительных культур подтверждает широкое распространение в исследованных биотопах филотипов, родственных выделенным нами Desulfomicrobium spp. и сульфатредуцирующим Firmicutes. Фрагменты генов 16S рРНК из накопительных культур, полученных в различных условиях (донор электронов, рН, температура, концентрация меди) были ПЦР-

rßß! П— Di 91J uncu P-DG

Destdfovi)rio carbino/icus, DQ1B62Q1 Desulfovlbrio magneUcus, D43944 uncultured bacterium, AB2342S9 DOGE K10_4k, Elh pH7T2 ВСиЗОО

Desotlovbno tructosovorans. AF050101

99% I

«П

(43a

I r DOGE K10_4), EthpH7T3BCu3D0 ^ Desultovbtlo putealts, AY574979

Desultcvürlo longieachertsts, Z24450 Desulfovlbrio sp. AI, AY92S6ei Desulfovlbrio sp. A4, A Y92B662 Desultovlbrlo sp. A2, A Y7703S2 Desulfovlbrio sp. R2, AY0S9411 Desultwibrio termitidls, X87400 DGGE T5_4o, EthpMTT* DOOE T5_4e, EthpH7T4 DGGE T5_4d, EthpH7T4 DOQE T4_5b, EthpH7T4 DGGE T5_4f, E1hpH7T4 DOGE T0_6b, EthpH7T4 Desultomlcroblum sp. KN - Desultomicrobium norvegicum, AJ277897 DGGE T5_№, EthpH7T4Cu150

■ Desulfomlcmblum sp. BL DGGE T5_Be, EthpH7T4Cu1S0

■ Desulfobacterium catechoHcum, AJ237602 DGGE K12_15f, Li cpH7T4

DGGE K12_15g, LacpH7T4 Desuttobotulus sapovorans. МЭ4402

DGGE K10_3B, EthpH7T28Cu200 Ralstonia pickemi, AY741342 DGGE K10_3c, EUipH7T28Cu20D uncultured eoil bacterium, DQ123743

Dellaproteobacteria

,_|B

1-|E

1 и

DGGE T4_3e, LacpH7T4 Pseudomonas stutzen, AF237G77 9ff)ir DGGE T5_ße, EthpH7T4Cu150

__> uncultured bacterium, AB237Ö95

'-Sullurospirillum arsenophilum. Ш5964

S3%— DGGE T5_6k, EthpH7T4Cu150 П- DGQE T5 6I, EthpH7T4Cu150

V-Sprochaeta sp. Crapes, AF357917

[К DGGE K1_Bk, LacpH7T28Cut DO

_P uncultured bacterium, AY667253

9mi '-uncultured bacterium. AJ4ÖS100

gwDGGETS_6j,EthpH7T4Cu1S0 T I DGGE T4_3d, LlcpH7T4

uncultured bacterium, AB062694 uncultured bacterium, АВ1544Й9

Spirochaeta smaiagdlnaa, US0597

Spirochaeta stenostrepta, M34264 M8B724 DGGE T4_3b, LlcpH7T4 uncultured Bacteroldetes bactelun, AY996584 3GE T4_5a, EthpH7T4

uncultured Bacteroldetes bacterium, AY193184 in, DGGE T4_3e, LacpH7T4 9Bl4~l DOGE T9 Bd, GlupH7T4

99%'-a ctl no bacterium SM3G, DQ195847

_I '-Tessaracoccus bendigoensis, AF038504

I |_г DGGE K12_18t, AcepH7T4

I L uncultured actincbacterium, AY9219G4

_i- DGGE TS fle, GlupH7T4

L Cellulomortas sp. IF016246. ABD23367

Betaproleobacteria Gammaproteobacteria Epsilon proteobacteria

Spirochaetes

Bacteroideles Actinobacteria

Рис. 18. Филогенетическое положение филотипов из DGGE геля. Последовательности добавлены с использованием parsimony analysis к дереву, построенному ранее методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Обнаруженные в накопительных культурах филотипы обозначены жирным шрифтом, выделенные нами чистые культуры — жирным курсивом.

амплифицированы и разделены с помощью DGGE. ДНК из полос экстрагировали из геля и секвенировали. Общее число секвенированных частичных последовательностей гена 16S рРНК составляло 61. Филогенетическое положение филотипов, отличных от Firmicutes, обнаруженных в накопительных культурах, показано на рисунке 18. Накопительные культуры, выращенные в условиях

низких температур на этаноле, характеризовались наиболее интенсивно окрашенными полосами на геле. Секвенирование ДНК показало, что эти филотипы имели высокий процент гомологии с Desulfomicrobium sp. KN. Родственные последовательности обнаруживали не только в осадках ветланда из которого был выделен штамм KN, но и в осадках хвостохранилища в Норильске (полосы DGGE T9_6b; DGGE Т9_6с), что свидетельствует о конкурентоспособности штамма в условиях накопительных культур и широком распространении. Desulfomicrobium sp. KN имел селективное преимущество только при росте на этаноле, на средах и лактатом и ацетатом последовательность не амплифицировалась. На средах с этанолом штамм KN доминировал как при низкой температуре, так и мезофильных условиях. В тех же условиях при добавлении меди обнаружен филотип, родственный Desulfomicrobium sp. BL. Как показали наши дальнейшие исследования штамм BL содержал последовательности, кодирующие устойчивость к меди (см. Главу 5).

Наряду с СРБ накопительные культуры содержали разнообразных несульфатредуцирующих Bacteria. Несколько филотипов, выделяемых как из Норильских проб (Т4_3е; T9_8d; Т9_8е), так и из осадков Кольского полуострова (K12_18f) принадлежали к классу Actinobacteria. Представителей этого класса часто обнаруживают в различных типах почв, в том числе в анаэробных условиях рисовых чеков (Akasaka et al., 2003) и они могут получать преимущество по сравнению с другими типами при культивировании на жидких средах (Chin et al., 1999). Значительное число филотипов как из Норильских (T4_3d; T5_6j; T5_6k; Т5_61), так и из Кольских (К1_8к) накопительных культур попадало в отдел Spirochaetes. Спирохеты регулярно обнаруживают в сульфатредуцирующих условиях из различных экосистем с использованием современных методов молекулярной экологии (Nakagawa et al., 2002; Koizumi et al., 2005).

Последовательности, родственные выделенному нами

сульфатредуцирующему Clostridium sp. КА, амплифицировались из различных накопительных культур, как из проб Кольского полуострова, так и из осадков Норильского полигона. Близкородственные штамму КА последовательности были амплифицированы из культур, растущих с этанолом в кислой среде (DGGE T9_llb) и с лактатом в нейтральных условиях (DGGE K10_13b) (рис. 19.). В обоих случаях культивирование проводили в присутствие меди в среде. О возможном широком распространении подобных филотипов в местообитаниях, загрязненных металлами, свидетельствует тот факт, что наиболее близкородственная филотипу DGGE T9_llb последовательность представлена некультивируемым клоном AKAU4083, выделенным из почв, загрязненных ураном (Brodie et al., 2005, неопубликованные данные).

Филогенетический анализ последовательностей из DGGE геля показал, что большое количество культивируемых в наших условиях организмов относилось к отделу "Firmicutes". 9 филотипов относилось к Clostridium. Близкородственные последовательности T5_2b, Т5_2с, T5_2d и Т5_2е амплифицированные из культуры, полученной из осадков ветланда, показывали высокую степень гомологии с психрофильным видом Clostridium bowmanii, выделенным из микробного мата в Антарктике (Spring et al., 2003). Однако способность

Clostridium

Desulfosporosinus

JDGGE T3_2b, LacpH3.ST4

---¡ET5 2e, LecpH3.ST4

IE T5_2d, UepH3.ST4

Ctostnetum bcwmanii, AJ50G120 DOGE T5_2e, La cpИЗ.ST4 Clostridium pascui X9G73B I Clostridium sporogenss, AY442B1B " Ctosfridlurr) botulinum, L37585 i DOGE T9_8b, GlupM7T4 L uncultured bacterium, AY122598

Clostridium sp.FCBX-3. AJ229251 Clostridium sp. KA DOQE K10_l3b, LaepH7T4Cu450 uncultured bacterum, DQ1 DGQE T9_11b, E1hpH3.6T28Cu2DD — Cfosfridum cyiiiKjmspaum, Y1B179 66% POPE K12_1 So, AoepH3.5T4 Г^- eubacterium clone BSV51, AJ229C03 fbg% DGQE K12_18«, AoepH3.ST4 />в4 <■ Clostridium sp. ХВЯО, AJ£29234

1............Clostridium poputeti. X718S3

'Clostridium sultatireducene'. AY943861 Clostridium sp. RL Clostridium ryianotyOcum. X7185S Deeu/fotomaculum guttotdeum, Y11563 Clostridium punnotybcum, UB0491 DGQE K12_1Tc, LacpH3.ST4 DGGE K12_17d, LacpH3.CT4 uncultured bacterium, ЛМ116737

DesulTceporcsinut sp. 44л~ТЗа. AY082482 Desmtosporosinus orients. Y11570 Desuttosporoslnus яр. ОТ DOGE K10_3e, EthpH7T2ftCu200 undiluted bacterium, М621ВД2 D&suItosporoslnus sp. MV Desuitosporostiws aurpigmenti, AJ4930S1

- Desulfosporosinus sp. MS D esuttosporosinu S meriofe/, AF076247

DGGEK10 13a.UcpH7T4Cu4S0

OQOE Kt0_13c, UcpH7T4Cu450 DOQE K10_13d, UcpH7T5Cu4S0

— uncultured bactenum, AY524564 Desulftobaclenum ctilorarBspirans, U68S28

ЭОЕ K10_12b, LacpH3.ST4 "Geosinus fermentans", DQ14S536 AnaerovibrlQ glycerin!. AJ0109$0 94%DOGE К1_вд, UcpH7T2BCu100 OesiJf otomaci/lLim sp. G55

uncultured bacterium, AY604051 • 'Desutlvtomacuhm 'educens' U95951 Desullattimaajluv rumtrus, Y1 IS72

Desulfotomaailum ngrificane. X6217S Desultotomacuium putel, AF0S3934

Desutfotomacuhim acetondans, Yt 15вв DGGE T9_11d, E1hpH34T2&Cu200 uncultured low G+C Gram-posllve bacterium, AF351221 DGGET9_12f, EthpH7T2SCu200 DGGE T9_12g, ElhpH7T26Cu200

IE K1_1 Ot, Е*рМ7Т2вСи100 uncultured bactenum, AB237717 DGQE K1_4h, EthpH7T2ftCu100 DGGE K1_SI. EthpM7T2eCu100

Oesutfotamaculum geathermicum, Y115Б7 Dasuttotomacuhim kuinetsovll, Y11589 r DGGE T9_11a, EthpM3.5T2BCu200 "uncultured bacterium, AY122903 IGGE T9_Ba, GlupH7T4 uncultured bacterium, AY57063S DGGE T4_3a, LaepH7T4

MotHcutes bacterium рАСШЗ, AY237308 I DGGE T9_6*, EthpH7T4 1 uncultured bactenum, DQ080143 , BaciSus ¡eotgaU, AF2210H2 Г bacterium !rT-RS2, AJ29 EG 94 L uncultured Bacitus sp.. AY0B23B7 DGGE T9_Bc, GlupH7T4 DGGE T9_9i, GlupH3.5T4 - Baciius sp. SB45. AJ229233 DGGE T9_9b, GlupH3.5T4 DGGE T9_6e, ElhpH7T4 uncultured bacterium, АУ799Э44 Bacitus Urmus. D1626B

Рис. 19. Филогенетическое положение Firmicutes из DGGE геля. Последовательности добавлены с использованием parsimony analysis к дереву, построенному ранее методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Полученные филотипы обозначены жирным шрифтом, выделенные нами чистые культуры — жирным курсивом.

Desulfotomaculum

Bacillus

представителей Clostridium, чьи филотипы были амплифицированы из накопительных культур, осуществлять диссимиляторную сульфатредукцию остается недоказанной.

Последовательности, попадающие в род Desulfotomaculum, амплифицировались как из Норильских (Т9_11а; T9_lld; T9_12f), так и из Кольских проб (Kl_8g; Kl_9h; Kl_8i; Kl_10i). Несколько филотипов, амплифицированных из накопительных культур, полученных из осадков пирротинохранилища в Норильске, занимали удаленную позицию близко к корню ветви Desulfotomaculum. Последовательности T9_lld и T9__12f имели низкий процент сходства с культивируемыми Desulfotomaculum. Еще один филотип, Т9_11а, также занимал одну из наиболее глубоких ветвей в дереве Firmicutes и наиболее близкородственный к нему культивируемый организм, Desulfotomaculum kuznetsovii показывал только 86.8 процентов сходства. Остальные родственники были представлены клонами некультивируемых организмов, многие из которых были получены из подземных водоносных горизонтов. Вся группа удаленных филотипов Desulfotomaculum занимала более глубокую позицию по отношению к корню дерева по сравнению с Desulfotomaculum acetoxidans, считающимся наиболее древним видом рода, произошедшим от несульфтаредуцирующего предка (Stackebrandt et al., 1997). В наших исследованиях традиционный подход, основанный на культивировании в сочетании с PCR-DGGE мониторингом культур, позволил выявить присутствие разнообразного сообщества Desulfotomaculum в осадках, загрязненных металлами. В то время как эти организмы не были обнаружены методом FISH со специфическим олигонуклеотидным зондом на Desulfotomaculum (Dtm229).

Несколько последовательностей (Т4_3а; Т9_6а; Т9_8а) попадало в класс Mollicutes с родственными последовательностями, выделенными из низкотемпературного нефтяного месторождения (Grabovski et al., 2005) и дехлорирующих консорциумов. Неожиданным результатом явилась амплификация нескольких последовательностей, попадающих в род Bacillus (Т9_6е; Т9_8с; Т9_9а; Т9_9Ь), так как культивирование проводили в анаэробных условиях. Однако известно, что Bacillus ранее выделялись в чистую культуру в анаэробных условиях, а также амплифицировались при создании библиотеки клонов из почв рисовых чеков (Chin et al., 1999).

Глава 5. УСТОЙЧИВОСТЬ К ИОНАМ МЕТАЛЛОВ И ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ КУЛЬТУРАМИ СРБ

Высокие концентрации тяжелых металлов характерны как для экосистем, подверженных техногенному влиянию, так и некоторых природных местообитаний. Повышенное содержание металлов часто обнаруживают в сточных водах, осадках прудов-отстойников, дренажных рудничных водах, естественных и искусственных ветландах, созданных для их очистки. Высокие концентрации ионов металлов также характерны для зон гипергенеза месторождений полиметаллических руд и цветных металлов. До настоящего

времени весомым доказательством того факта, что СРБ не могут играть важную роль в образовании сульфидов металлов (в отличие от сульфидов железа) рассматривали токсичность многих тяжелых металлов для СРБ (Davidson, 1962; Ehrlich, 1996). Описание СРБ, устойчивых к высоким концентрациям двухвалентной меди и других тяжелых металлов (Karnachuk et al., 2003) позволяет пересмотреть наши представления об их возможном участии в диагенетических преобразованиях металлов, отличных от железа.

5.1. Выделение и изучение чистых культур СРБ устойчивых к меди.

Чистые культуры СРБ устойчивые к повышенным концентрациям Си2+ были выделены из различных экосистем, включая сточные воды предприятия «Ролтом» по производству шариков-подшипников (штамм R2), осадки отстойника Челябинского металлургического комбината (штаммы AI, А2, A4) и осадки ветланда, получающего дренажные воды из хвостохранилища отходов переработки руды в Норильске (штамм BL). Максимальная начальная концентрация меди в среде, позволявшая рост штаммов AI, А2, A4, R2 и BL составляла 600, 2600, 325, 800 и 450 мг Си2+/л, соответственно. Хотя все штаммы проявляли устойчивость к меди их рост замедлялся при концентрациях превышающих 20-50 мг Си2+/л. Штаммы А2 и A4 также росли при повышенной концентрации ионов Со2+ (400 и 450 мг/л, соответственно), Ni2+ (400 и 225 мг/л,

Рис. 20. Филогенетическое положение устойчивых к меди Desulfovibrio sp. Al, Desulfovibrio sp. A2, Desulfovibrio sp. A4 и Desulfomicrobium sp. BL, определенное методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Масштаб показывает 10% расхождения последовательностей.

Г "I— Desulfomicrobium sp. BL

1—— Desulfomicrobium escambiense

Desulfovibrio desulfuricans subsp. desutfuricans

------Desulfovibrio cavernae

-Desulfovibrio irtdonesiensis

---Desulfovibrio fruclosomrans

0.10

соответственно) и Сс12+ (190 и 225 мг/л, соответственно), но не выдерживали начальной концентрации Сг6+ более 25 мг/л.

Близкие к полным последовательности гена 16Б рРНК были ПЦР-амплифицированы и секвенированы. Филогенетический анализ показал, что штаммы Я2, А1, А2 и А4 относились к классу БеИаргс^еоЬа^па и попадали в один кластер внутри рода Иет^о^Ьпо (рис. 20). Процент гомологии между штаммами А1, А2 и А4 составлял от 99.5 до 99.8% и между штаммами А1,А2 и А4 и штаммом К2 изменялся от 97.9 до 98.2%. Вези//оп'Ьгю longreachensis был наиболее близкородственным из валидно описанных видом для штаммов А1, А2 и А4, с процентом гомологии 99.1, 98.8, и 98.7, соответственно. Наиболее близким родственником штамма Я2 был ОеьиЦох&по ¡егтШсИя (99.3% гомологии).

Штамм ВЬ также относился к Бе^ргсЯеоЬайепа, роду ВезиЩтгсгоЫит и попадал в один кластер с "Оеяи^оппсгоЫит hypoge¡um" (99.3% гомологии), Оеш1/опйсгоЫит арзЬегопит (99.2% гомологии), Ое.чи]/от1сгоЫит ЪасиШит (99.1 % гомологии). Два других близкородственных вида Оеяи1/от1СгоЫит norvegicum (97.6% гомологии) и Оаи1/от1сгоЫит тасеяШ (97.5% гомологии) также относились к этому кластеру (рис. 17).

Все Оеяи1/ог1Ьпо Брр. показывали значительные сахаролитические свойства и росли с глюкозой, фруктозой, сахарозой и крахмалом. Для штамма А4 скорость роста с углеводами составляла: 0.084 час"1 на глюкозе, 0.054 час"1 на сахарозе и 0.037 час"1 на крахмале. Рост на углеводах сопровождался экспоненциальным увеличением концентрации НгБ в среде, что свидетельствовало об окислении Сахаров через диссимиляторное восстановление сульфата.

Штаммы А1, А2 и А4 росли оптимально в мезофильных условиях с оптимумом 30-37° С. В экспериментах штамм ВЬ проявлял психроактивные свойства и рос на среде с лактатом в пределах 4-35°С, с оптимумом при 25сС.

5.2 Механизмы устойчивости к меди у СРБ. Медь в отличие от таких металлов, как кадмий или свинец, может оказывать двойственное действие на живые организмы. Ее повышенные концентрации оказывают токсический эффект на все типы клеток, но небольшие количества меди необходимы многим из них для построения медьсодержащих белков. Медь рассматривают как «современный» биоэлемент (8о1юг, Бюуапоу, 2003), так как она не являлась существенным элементом для клеток, существовавших в восстановленных условиях Архейской Земли. В этот период анаэробные условия гарантировали связывание меди в виде сульфидов, имеющих очень низкую растворимость и таким образом, недоступные для живых клеток. С появлением кислорода в атмосфере, у аэробных клеток возникла необходимость эволюции системы гомеостаза меди, обеспечивающей транспорт небольших количеств Си, необходимых для построения белков, внутрь клетки и препятствующей поступлению больших количеств меди, которые могут оказывать токсическое действие. Основную роль в поддержании гомеостаза меди играют АТФазы Р-типа, описанные для многих представителей всех трех доменов жизни. Наиболее изученными системами гомеостаза Си у микроорганизмов являются сие-оперон Е.

coli (Rensing, Grass, 2003) и CopA, СорВ АТФазы Enterococcus hirae (Solioz, Stoyanov, 2003).

Выполненный нами поиск последовательностей, родственных генам сорА и сорВ Е. hirae и Е. coli, с использованием программы BLASTN (Altschul et al., 1997) среди опубликованных полных геномов эубактериальных СРБ и исследования других авторов, направленные на изучение распространения среди бактериальных геномов мотивов, характерных для Р-типа АТФаз (Coombs, Barkay, 2005), не выявили последовательностей родственных сорА и сорВ.

Кроме закодированных на хромосоме систем гомеостаза меди сие и cus, было показано, что у Е coli устойчивость к меди может определяться закодированной на плазмиде системой рсо (Brown et al., 1995). Гены, родственные рсоА и pcoR, были ПЦР-амплифицированы нами с использованием рсоА- и pcoR-специфичных праймеров из всех изолятов СРБ, устойчивых к меди (рис. 21, 22). Искомые продукты отсутствовали при ПЦР-амплификации геномной ДНК музейных штаммов Desulfovibrio desulfuricans АТСС7757 неустойчивого к меди и

Рис. 21. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР-амплификации с праймерами рсоА1-рсоА2. Дорожки: 1 - маркер размеров фрагментов ДНК (ДНК фага X Hindlll)', 2 - положительный контроль, плазмида рРА87 (Е. coli ED8739); 3 - геномная ДНК Desulfovibrio sp. R2; 4 - геномная ДНК Desulfovibrio sp. AI; 5 - геномная ДНК Desulfovibrio sp. А2; 6 - геномная ДНК Desulfovibrio sp. A4; 7 - геномная ДНК Desulfomicrobium sp. BL; 8 -отрицательный контроль.

1 г 34567 89 Рис. 22. Электрофорез в агарозном геле

продуктов ПЦР-амплификации с праймерами pcoRl-pcoR2. Дорожки: 1 -маркер размеров фрагментов ДНК (pBlue Script SK BspRl); 2 - положительный контроль, плазмида рРА87 (£. coli ED8739); 3 и 4 - плазмидная ДНК Desulfovibrio sp. R2; 5 - геномная ДНК Desulfovibrio desulfuricans АТСС7757; б -геномная ДНК Desulfomicrobium sp. 63; 5 - геномная ДНК Desulfovibrio sp. R2; 9 -отрицательный контроль.

другим двухвалентным катионам металлов и Desulfomicrobium sp. 63, СРБ, устойчивого к повышенным концентрациям шестивалентного хрома, но не двухвалентной меди.

636 Ьр 611 bp'

458 bp

Ген рсоА кодирует мульти медь-оксидазу (multi-copper oxidase) -центральный белок системы рсо. PcoR - белок-регулятор двухкомпонентной киназной системы регуляции PcoRS. Таким образом, наличие существования геномно-кодируемой системы гомеостаза меди в СРБ остается недоказанным. В этих условиях горизонтальный перенос системы рсо, находящейся на плазмидной ДНК энтеробактерий и патогенов растений Pseudomonas syringae (Bender, Cooksey, 1987; Mellano, Cooksey, 1988a,b; Cha, Cooksey, 1991) может быть механизмом, обеспечивающим толерантность к меди у СРБ.

5.3 Кинетика роста и образование сульфидов меди чистыми культурами СРБ. Штамм А2 рос с максимальной скоростью при начальной концентрации меди в среде 20 мг/л (табл. 5). Добавление 50 мг/л увеличивало лаг-фазу до 25 часов и снижало скорость роста до 0.166 час"1. Присутствие меди в среде в концентрации более 100 мг/л вызывало изменение характера роста, при этом наблюдали несколько пиков увеличения биомассы вместо экспоненциального роста, наблюдаемого в присутствии меньших концентраций меди.

Таблица 5. Кинетика роста Desulfovibrio sp. А2 в среде, содержащей медь.

Начальная Продолжительность (хтах Td

концентрация лаг-фазы (час1) (час)

меди (час)

(мг Си/л)

0 10 0.191 ±0.0095 3.63 ±0.18

0.007 13 0.208 + 0.011 3.33+0.19

10 13 0.215 ±0.0095 3.23 ±0.14

20 14 0.276 ± 0.035 2.55 ±0.35

35 18 0.234 ± 0.008 2.96 ±0.11

50 25 0.166 ±0.045 4.39 ± 1.24

В серии наших экспериментов был охарактеризован минералогический состав осадков, образуемых чистыми культурами СРБ, устойчивыми к меди, с использованием современных методов рентгено-фазового и рентгено-флуоресцентного анализов. На рисунке 23 показаны дифрактограммы осадков, полученных после роста Desulfovibrio sp. Al, Desulfovibrio sp. A4 и Desulfovibrio sp. R2 в течение 6 дней на среде Видделя (Widdel and Bak, 1992) с лактатом. Ковеллит (CuS) составлял основную твердую фазу осадков. В осадке, полученном в культуре после роста Desulfovibrio sp. А4, обнаруживали также небольшие количества смитита (FegSn). В контроле без инокулята ковеллит отсутствовал, но присутствовали следы продуктов окисления меди в виде куприта (Си20), броханита (Cu4(S04)2(0H)6) и тенорита (СиО).

Элементный анализ, проведенный методом рентгено-флуоресценции, показал, что Си и S были доминирующими элементами во всех осадках,

"20 CuKa

Рис. 23. Дифрактограммы осадков, полученных при росте Desulfovibrio sp. A1 (A), Desulfovibrio sp. R2 (В) и Desulfovibrio sp. A4 (С), растущих в присутствии 200 мгСи2+/л в течение 144 часов и контроля без инокулята (D, Е). В - броханит, Ср - куприт, Cv - ковеллит, Sm - смитит, Т - тенорит.

полученных при росте культур (табл. 6). Два контрольных образца показывали меньшее содержание S. Относительное содержание Си увеличивалось в каждом образце по мере увеличения концентрации меди со 150 до 200 мг/л.

Увеличение времени инкубации до одного месяца и концентрации меди до 2540 мг Си2+/л влияло на состав образующейся кристаллической фазы. При выращивании Desulfovibrio sp. А2 на среде с лактатом в этих условиях основной составляющей осадка был халькоцит (Cu2S) (диагностические пики 3.587, 3.172, 2.786, 2.354, 1.935, 1.886 и 1.729 А) с меньшим количеством халькопирита (CuFeS2) (диагностический пик 3.035 А). Основными составляющими абиотического осадка были куприт (Си20) (диагностические пики 2.462, 2.127, 1.505 А) и элементная медь (диагностический пик. 2.084, 1.276 А), которые в небольшом количестве присутствовали также и в вариантах опыта с культурой.

Осаждение меди в виде сульфидов снаружи клетки является эффективной стратегией выживания при повышенных концентрациях Си в среде. Специфические системы, такие как рсо, могут включаться в тех условиях, когда выход H2S недостаточен для осаждения меди (Karnachuk et al., 2003). Кристаллические сульфиды меди более стабильны и менее подвержены реокислению по сравнению с коллоидными аморфными сульфидами. Условия культивирования могли влиять на состав сульфидов меди, образуемых устойчивыми изолятами. Ковеллит образовывался при краткосрочной инкубации,

Таблица 6. Элементный анализ осадков, полученных при росте штаммов Al, А4 и R2 и контроле без инокулята, растущих в присутствии 150 и 200 мгСи2+/л, выполненный методом рентгено-флуоресценции.

Осадок Си % S% Cu:S mol отношение Fe % Zn %

А1 Си150 54.5 24.2 1.1 3.6 17.3

А1 Си200 74.8 14.3 2.6 2.3 7.2

А4Си150 56.4 18.2 1.6 4.9 19.2

А4 Си200 72.9 15.2 2.4 5.0 6.4

R2 Си150 14.5 11.9 0.6 4.2 4.8

R2 Си200 72.6 14.2 2.6 1.7 11.2

Си150 59.3 3.0 9.8 4.4 22.7

контроль

Си200 66.7 1.5 22.8 10.3 15.6

контроль

в то время как при инкубации в течение месяца основными сульфидами были халькоцит и халькопирит. Кристаллические сульфиды меди не образовывались в контроле без инокулята хотя небольшие количества химического сульфида (в виде Ка23) добавляли в среду в качестве восстанавливающего агента.

5.4. Образование Н->8 и осаждение СгГУР при его различной концентрации в среде чистыми культурами СРБ. Наиболее значимым результатом воздействия СРБ на металлы является осаждение их двухвалентных катионов в виде малорастворимых сульфидов. Наряду с этим сульфатредукторы могут оказывать как минимум два других типа воздействия на металлы. Это использование некоторых металлов (железо (III), марганец (IV), хром (VI), уран (VI), технеций (VII) в качестве конечных акцепторов электронов и химическое восстановление сульфатредукционным сероводородом. Оба типа воздействия часто приводят к образованию малорастворимых продуктов. Примером подобных реакций является восстановление шестивалентного хрома до трехвалентного, выпадающего в осадок в виде гидроокиси хрома.

В серии наших экспериментов было изучено образование Н28 и осаждение Сг (VI) из раствора музейными культурами СРБ и штаммом 63 (Карначук, 1995). Штамм 63 был ранее выделен нами из осадков глубоководной части Черного моря и характеризовался наибольшей устойчивостью к хрому по сравнению с остальными изученными СРБ. Пробы осадков для выделения были любезно предоставлены М. Б. Вайнштейном.

В качестве органических доноров электронов при росте на среде с сульфатом штамм 63 использовал лактат, фумарат, малат, этанол и пируват. Культура образовывала большое количество сероводорода (до 600 мг/л среды)

Desullovibrb termitkhs, X87409

99%

-Desulfomicrobium orate, AJ251823

i— 'Desulfomicrobium hypogeium\ AF132738

Desulfomicrobium escambiense, U02469 — Desulfomicrobium apshetonum, U64B65

i- Desulfomicrobium macestii, AJ237604 !Desulfomicrobium norvegicum, AJ277897

- Desulfomicrobium sp. 63, A Y6661SS

- Desulfomicrobium baculatum, AJ277894

0.10

Рис. 24. Филогенетическое положение устойчивого к хрому Desulfomicrobium sp. 63, определенное методом ближайшего соседа (neighbor-joining). Масштаб показывает 10% расхождения последовательностей.

при росте на среде с этанолом, накапливая в среде биомассу до 3.2 мг белка/мл. В то же время другие спирты, такие как изопропанол, бутанол, изобутанол, метанол и глицерол не поддерживали рост культуры. Бактерии росли в автотрофных условиях, в атмосфере Н2/СО2 или на среде с формиатом. Не поддерживали рост штамма ацетат, пропионат, бутират, сукцинат, цитрат, оксалат, бензоат, ацетон, глюкоза, лизин, серин, треонин, а-аланин. Кроме сульфата, акцептором электронов для культуры могли быть тиосульфат и сульфит, но не элементная сера или нитрат. Обнаружена способность штамма расти на средах с лактатом и фумаратом без сульфата. Пируват и холин не поддерживали процесс брожения. В клетках обнаружен цитохром Саз, цитохромы ¿-типов и десульфовиридин отсутствовали.

Последовательность близкая к полной гена 16S рРНК штамма 63 длиной 1343 п.о. была ПЦР-амплифицирована и секвенирована. Анализ последовательности помещает штамм 63 в класс Deltaproteobacteria, род Desulfomicrobium (рис. 24). Штамм попадает в один кластер с Desulfomicrobium norvegicum DSM 1741т, гомология последовательностей с которым составляет 99.8%. Процент гомологии с другими родами этого кластера внутри Desulfomicrobium составляет: 99.6% с D. baculatum, 99.6% с D. macestii и 99.3 с D. apsheronum. Надо отметить, что внутри кластера последовательности гена 16S рРНК у D. norvegicum и D. macestii полностью совпадают (Hippe et al., 2003).

В экспериментах по влиянию шестивалентного хрома его ингибирующее действие проявлялось в снижении количества сероводорода, образуемого штаммом 63, растущим на среде с лактатом, начиная с концентрации 52.5 мг Сг6+/л. Однако, даже при концентрации Сгб+ 106 мг/л бактерии продолжали

восстанавливать незначительное количество сульфата. В вариантах опыта с различными концентрациями Сг6+ в среде на продукцию сероводорода D. nigrißcans В-1492 увеличение концентрации шестивалентного хрома вело к постепенному снижению содержания H2S в вариантах опыта. При 70 мг Сг6+/л образования сероводорода не обнаружено.

Наиболее эффективное осаждение шестивалентного хрома из раствора было зафиксировано при росте штамма 63 на среде с этанолом. Полное осаждение хрома обнаружено при концентрации не превышающей 17.5 мг/л. В вариантах опыта с большей начальной концентрацией шестивалентного хрома его осаждение снижалось и достигало только 43% в варианте 106 мг Сг6+/л. При росте этого штамма на среде с лактатом полное осаждение хрома происходило только при его концентрациях не превышающих 3.5 мг Сг6+/л. Еще меньшие величины осаждения хрома были получены в экспериментах с термофильным Desulfotomaculum nigrißcans В-1492. Уже при начальной концентрации 1.75 мг Сг6+/л его осаждение составляло только 83%.

Соединения хрома хотя и содержатся в небольших концентрациях, но широко распространены в земной коре. Наибольшее биогеохимическое значение имеют соединения хрома в степени окисления +3 и +6 (Ehrlich, 1996). Шестивалентный хром высоко токсичен частично вследствие его высокой растворимости в виде хромата (СЮ42~) и бихромата (Сг2072~). Неферментативное окисление Сг+3 до Сг+6 может происходить в почвах в процессе окисления биогенными или абиогенными оксидами Mn(III) и Mn(IV) (Bartlett, James, 1979). Подобные окислительные процессы могут приводить к повышению содержания Сг+6 до уровня, при котором сказывается его высокий токсический эффект. Кроме того, Cr46 поступает в экосистемы в результате загрязнения отходами кожевенного и гальванического производств, стоками от производства красителей, стали, автомобилестроения и атомных электростанций.

Возможным механизмом снижения токсичности соединений шестивалентного хрома является его восстановление до трехвалентного состояния с последующим осаждением в виде гидроокиси Сг(ОН)3. Исследования последних лет показывают, что широкий спектр бактерий может восстанавливать Сгв+, используя его в качестве акцептора электронов. Однако исследования других авторов и наши данные свидетельствуют в пользу того, что наибольшее значение имеет процесс восстановления хрома под действием сероводорода, образовавшегося в результате сульфатредукции. Существенной проблемой, ограничивающих осаждение хрома в сульфидогенных условиях, является устойчивость бактерий к Cr"14. Desulfomicrobium sp. 63 при росте на лактате проявлял существенно большую устойчивость к хрому по сравнению с изученными ранее культурами. Таким образом, Desulfomicrobium sp. 63 является наиболее устойчивой к Сг+б чистой культурой СРВ описанной к настоящему времени. Устойчивость к Сг+6, образование больших количеств сероводорода и эффективное осаждение хрома позволяет рассматривать Desulfomicrobium sp. штамм 63 как перспективный организм для использования в биотехнологиях очистки от хрома. СРВ способные к осаждению хрома в условиях его высокой концентрации в природных экосистемах могут играть важную роль в

биогеохимических циклах металлов в восстановленных осадках, а также в процессах естественного осаждения токсичных соединений. Выделенный из осадков глубоководной зоны Черного моря ОезиУот1сгоЫит ер. 63 свидетельствует о присутствии в таких экосистемах организмов, устойчивых к хрому. Геохимическая активность этих организмов может являться существенным механизмом детоксикации в загрязненных морских осадках.

Глава 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАЛОРАСТВОРИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЫ В КАЧЕСТВЕ АКЦЕПТОРА ЭЛЕКТРОНОВ

Большинство сульфатов хорошо растворимо в воде, однако анион 5042" может образовывать также малорастворимые и нерастворимые соединения. Здесь и далее мы используем химическую классификацию, по которой все вещества, растворимость которых ниже 1 г в 100 г воды относят к малорастворимым и если в раствор переходит менее 0.01 г вещества, то такие соединения относят к нерастворимым. Среди малорастворимых соединений ангидрит (Са504) и гипс (Са8042 Н20; logKSo = - 4.60) являются основным депо природной окисленной серы, а нерастворимые англезит (РЬ804; 1о«Кх0 = - 7.85) и барит (ВаБ04; ^КБо = -9.97) менее распространены, но образуются в процессах обмена, испарения и гидратации в коре выветривания, а также связаны с гидротермальным и осадочным генезисом. Техногенный процесс сжигания больших количеств ископаемого топлива привел к накоплению существенной массы нерастворимого ханнебахита (Са503 0.5Н20; 1о£Кз0 = - 6.51), образующегося при улавливании двуокиси серы в СаСОз на фильтрах-скрубберах.

Способность СРБ использовать гипс в качестве источника сульфата давно известна и использовалась микробиологами для выращивания этой группы бактерий на элективных питательных средах. Однако изучение кинетики процесса ранее не проводилось. В наших экспериментах было показано, что чистые культуры СРБ могут использовать гипс, ханнебахит, англезит и барит в качестве единственных акцепторов электрона при окислении органических субстратов. Количество образуемой биомассы и конечного продукта восстановления, сероводорода, находилось в прямой зависимости от растворимости соединения-акцептора электронов при росте Оехи1/о\чЬпо ер. 112 (Рис. 25 А.Б). Исследование роста остальными изученными штаммами сульфатредуцирующих бактерий (О. 11еяи1/ипсат АТСС 7757, Оеяи1/от1сгоЫит тасеэШ В-1598, Ое5и1/от1сгоЫит Бр. штамм 63, Ое$и\(от¡егоЪшт эр. штамм 84, Оет1/отгсгоЫит ер. штамм 92) подтвердило закономерности, полученные для штамма 112. При этом количество Н28, образуемое различными штаммами в одних и тех же условиях, варьировало незначительно и зависело в большей мере от используемого нерастворимого акцептора, чем от видовой принадлежности штамма.

При росте всех изученных штаммов в периодической культуре с ханнебахитом, англезитом и баритом не наблюдали классической кривой роста с выраженной экспоненциальной фазой. Вместо этого образование биомассы характеризовалось диауксией или иногда наличием более двух пиков прироста биомассы (рис. 23Б). Такой характер роста в совокупности с данными об

Время, час

Рис. 25. Образование Н28 (А) и биомассы (Б) культурой Оези1/ошЬгю Бр. Я2, растущим с нерастворимыми акцепторами электрона в периодической культуре. 1 — растворимый сульфат натрия; 2 - гипс; 3 - ханнебахит; 4 — англезит; 5 — барит.

изменении рН и кривыми роста, полученными при выращивании культур на качалке и в статических условиях позволяет предположить возможный механизм использования малорастворимых акцепторов электронов СРБ (Karnach.uk й а1., 2002). По нашим представлениям вероятным механизмом является сдвиг химического равновесия вследствие транспорта доступных анионов акцептора внутрь клетки. Из-за чрезвычайно высокого сродства к ионам сульфата/сульфита, бактерии способны поглощать из среды то небольшое количество анионов, которое находится в насыщенном растворе. СРБ способны извлекать акцепторы, находящиеся в растворе в очень низкой концентрации и таким образом, стимулировать выведение в раствор новой партии анионов.

Как показали наши эксперименты, природные популяции СРБ также способны восстанавливать сульфат из барита. Исследования проводили, добавляя

барит в пробы подземной воды палеогеновых отложений. Концентрация S042' в этих подземных водах редко превышает 5 мг/л. При этом в исследованных образцах обнаружена высокая численность СРБ — до 106 клеток/мл. Внесение осадка сульфата бария стимулировало образование сероводорода в пробах и составляло 177% от контроля. В серии экспериментов было показано, что этанол является субстратом, обладающим наибольшим стимулирующим эффектом на сульфатредукцию в экосистеме. Одновременное внесение этанола и BaSÜ4 увеличивало продукцию сероводорода в 22 раза. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что в экосистемах, содержащих нерастворимые сульфаты, при наличии подходящих условий может происходить мобилизация серы из твердой фазы под действием СРБ. Такое взаимодействие особенно важно для экосистем подземных вод, характеризующихся большой площадью контакта водной фазы с твердой фазой вмещающих пород.

6.1. Геохимическое значение восстановления малорастворимых соединений серы СРБ. Использование нерастворимых соединений серы СРБ не только приводит к мобилизации и восстановлению окисленной серы, но и высвобождает связанные с нею катионы. Рентгенофазовый анализ осадка образованного в экспериментах по выращиванию бактерий с гипсом в качестве донора электронов показал наличие новой твердой фазы — кальцита СаСОэ (диагностический пик 3.04 А). Образование кальцитов в процессе сульфатредукции в предшествующие геологические эпохи хорошо документировано на примере месторождений серы и нефтяных месторождений с карбонатными коллекторами (Иванов, 1964). Последние данные о процессе карбонатообразования, протекающего в современных седиментационных системах, предполагают его комплексную природу, связанную с деятельностью сообщества микроорганизмов, включая и СРБ. Используя современные методы анализа кристаллической фазы осадка, мы подтвердили возможность образования кальцита чистыми культурами СРБ без участия других групп микроорганизмов.

Мобилизация бария из барита может иметь серьезные последствия для экосистем, так как в растворенной форме он является токсичным как для прокариот, так и для эукариот, выступая в роли физического антагониста калия и кальция в некоторых биохимических реакциях, а также для Na-K насосов. В наших экспериментах рентгеноструктурный анализ осадков, образованных при выращивании штаммов 63, R2, АТСС 7757, не выявил диагностических пиков, соответствующих ВаСОз, витериту, что подтверждает исследования других авторов (Bald! et al., 1996). Анализ наших и литературных данных позволяет предположить, что СРБ могут играть важную роль в цикле бария. Микробная сульфатредукция в восстановленных нижних слоях осадков рассматривается как наиболее вероятный механизм мобилизации катионов бария из осадков, обнаруженный И. Грейнертом с соавт. (Greinert et al., 2002) в зоне холодных метановых сипов в заливе Дерюгина (Охотское море). Наряду с использованием синтезированных в лаборатории и коммерческих реактивов малорастворимых сульфатов и сульфитов нами была исследована возможность использования природного минерала англезита. Рентгенофазовый анализ показал, что основной

Рис. 26. Дифрактограмма осадка, полученного после выращивания Ое$и1/огп1сгоЫит Бр. 63 с природным англезитом в качестве акцептора электронов. Ц, церуссит (РЬСОз); А, англезит (РЬ304); Г, галенит (РЬБ).

составляющей использованного природного образца был церуссит (РЬСОз), а англезит содержался в меньшем количестве (рис. 26). Характер и величина прироста биомассы и образования сероводорода, а также изменение рН при росте штамма 63 на природном англезите соответствовал таковым полученным для коммерческого сульфата свинца. Рентгеноструктурный анализ осадка, полученного при культивировании подтвердил образование новой твердой фаза — галенита (РЬБ). О его присутствии свидетельствовали диагностические пики 2.943 и 2.10А, отсутствующие в контроле без инокулята (рис. 26). Генезис англезита в природных экосистемах связывают с вторичным окислением галенита в зоне выветривания. Данные наших экспериментов свидетельствуют о возможности существования в природе обратного процесса - образования галенита при участии СРБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

восстановленных к слабо-окисленным. Наши наблюдения согласуются с механизмом образования пирита по полисульфидному механизму (Berner 1970, 1984). Присутствие окислителей играет важную роль в преобразовании моносульфидов железа в пирит (Rickard, Morse, 2005). В слабоокисленных условиях наиболее вероятно присутствие частично окисленных форм серы, таких как полисульфиды, являющихся основным агентом, приводящим к преобразованию кислоторастворимых сульфидов в пирит. Кроме того, присутствие окислителей приводит к быстрому окислению метастабильных моносульфидов железа и увеличению доли пирита.

Экстремально высокие скорости сульфатредукции в прибрежных морских осадках являются следствием значительного антропогенного стресса, что было продемонстрировано нами на примере северо-западного шельфа Черного моря. В период наших исследований в 1987 году экосистема шельфа получала максимальное количество органических загрязнителей и биогенов со стоком рек Дуная, Днестра и Днепра. Резкое увеличение содержания органического вещества привело к максимальному развитию процессов микробного восстановления сульфата, сопровождавшемуся выходом сероводорода в воду, снижением концентрации кислорода и гибелью бентосных животных. Измеренные нами наибольшие скорости сульфатредукции в верхних горизонтах осадков приустьевых районов, резкое снижение концентрации сульфата и формирование системы, близкой к замкнутой по сульфату, в слое осадков 0-2 см, подтверждают вывод об активизации микробной сульфатредукции в небольшой период времени, предшествовавший проведению исследований.

Тогда как геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий в морских экосистемах не вызывает сомнения, возможность их участия в геологических процессах в зонах гипергенеза месторождений сульфидных металлов оставалась недоказанной. Отходы металлургической и, особенно, добывающей промышленности составляют до 90 % от объема исходной руды, размещаются на хранение в природных экосистемах и занимают большие территории. Окислительные процессы, происходящие в них, представляют постоянный источник загрязнения ионами металлов и сульфатом. Наши исследования продемонстрировали, что наряду с биологическими процессами окисления сульфидных руд и образованием вторичных гидроксидов и гидроксисульфатов железа, в отходах добычи и производства металлов происходит образование вторичных сульфидов. Анализ стабильных изотопов окисленных и восстановленных соединений серы подтверждает образование аутигенных сульфидов. Тот факт, что сульфатредукционное облегчение восстановленных продуктов серы наблюдали на фоне высоких концентраций первичных сульфидов, а биологическое утяжеление сульфатов при большом количестве SO42' , образуемого при окислении сульфидов, также свидетельствует о том, что бактериальный сульфидогенез является значимым процессом. Процесс образования аутигенных сульфидов металлов не лимитируется окисленными условиями среды и низкими температурами. Наши исследования показывают, что процессы окисления сульфидных руд и образования вторичных сульфидов могут быть не разделены пространственно.

Культивирование, FISH анализ, PCR-DGGE анализ и секвенирование последовательностей генов 16S рРНК показывают, что разнообразное сообщество, способное осуществлять диссимиляторное восстановление сульфатов, существует в экосистемах богатых сульфидами. В изученных пробах двух, географически удаленных регионов, Норильского промышленного комплекса и Кольского полуострова доминировали группы СРБ с неполным окислением субстратов. Desulfovibrio spp. и Desulfobulbus spp. преобладали как среди культивируемых организмов, так и групп, определяемых молекулярными методами. Психрофильные Desulfofustis spp. были важной группой в бореальных экосистемах. В условиях кислой среды доминировали спорообразующие формы Desulfosporosinus spp., Desulfotomaculum spp. и Clostridium spp. Представители родов Desulfovibrio и Desulfosporosinus являются важными группами в условиях повышенной концентрации металлов. Выделение чистой культуры Clostridium sp. КА, способного к диссимиляторной редукции S042" и образующего удаленную группу внутри рода Clostridium, а также родственных ему филотипов в накопительных культурах, выращенных у условиях высокой концентрации металлов, свидетельствует о присутствии новых форм СРБ в экосистемах отходов добычи металлов.

Роль сульфатредуцирующих бактерий в осаждении сульфидов металлов, отличных от железа, оставалось спорной, в силу предположения о том, что высокая концентрация тяжелых металлов препятствует развитию СРБ. Выделение изолятов, устойчивых к меди и другим металлам, позволило нам изучить образование сульфидов меди чистыми культурами СРБ. Рентгено-фазовый и рентгено-флуоресцентный анализ показали наличие халькоцита, ковеллита и халькопирита в осадках, образуемых чистыми культурами, устойчивыми к высоким концентрациям двухвалентных металлов.

Филогенетический анализ показал, что большинство чистых культур СРБ, устойчивых к меди, попадало в один кластер внутри рода Desulfovibrio. Также был выделен устойчивый к меди Desulfomcrobium sp. BL. Последовательности ДНК, родственные рсо-опреону Е coli, кодирующему устойчивость к меди были ПЦР-амплифицированы из всех выделенных штаммов СРБ, растущих при высокой концентрации Си2+. Известные факты отсутствия последовательностей системы гомеостаза меди (cus, сие, сор), в полностью секвенированных геномах Desulfovibrio vulgaris и Desulfovibrio desülfuricans, кодирование рсо-оперона на внегеномной ДНК энтеробактерий, возможный перенос системы рсо в другие почвенные бактерии позволяет предположить возможность горизонтального переноса генов в эволюции устойчивости к меди у СРБ.

Наши исследования показывают, что возможным источником аутогенного образования сульфидов металлов могут быть не только растворимые сульфаты, но и нерастворимые сульфаты бария, свинца и сульфит кальция. Ханнебахит (CaS030.5 Н20) наряду с гипсом является распространенным отходом производства, образующимся при улавливании S02 в дымовом газе. Широко распространена практика использования в этом процессе фильтров-скруберров, на которых происходит образование осадка, содержащего избыток извести, гипса и сульфита кальция. Существует практика захоронения подобных отходов

совместно с бытовыми твердыми отходами, а также на поверхности хвостохранилищ в местах выработки руд.

Наши исследования показывают, что сульфатредуцирующие прокариоты играют важную геологическую роль не только в современных морских осадках, но и в отходах добывающей и перерабатывающей металлы промышленности, содержащих высокие концентрации вторичных сульфатов. Микробное восстановление сульфатов может протекать в окисленных условиях среды, и эти условия способствуют образованию химически более стабильного сульфида железа, пирита. Высокие концентрации ионов металлов не лимитируют образование аутогенных сульфидов тяжелых металлов и в природных экосистемах существуют сульфатредукторы способные осуществлять осаждение. Образование вторичных сульфидов имеет большое значение как в процессах естественного снижения высокой концентрации ионов металлов, так и в различных биотехнологиях очистки отходов и сточных вод от металлов. В процессах биоремедиации возможным субстратом могут служить нерастворимые соединения окисленной серы, образуемые как отходы других технологических процессов.

ВЫВОДЫ

1. В мелководных осадках шельфа окраинных и внутренних морей происходит активное образование диагенетического пирита. В изученных биотопах доля новообразованного пирита от суммарной восстановленной серы составляла от 0.2 до 99.8%. Наибольшие количества пирита образовывались в осадках, характеризующихся минимальными скоростями сульфатредукции и окисленными условиями с окислительно-восстановительным потенциалом от +80 до +300 mV.

2. В отходах добычи и производства металлов и связанных с ними экосистемах происходит образование аутогенных вторичных сульфидов, что подтверждается изотопным составом серы восстановленных продуктов и окисленных субстратов. Максимальные доли пирита от суммарной восстановленной серы обнаружены в окисленных и слабо-окисленных осадках (Eh от +100 до +400 mV), характеризующихся слабокислыми условиями среды (рН 5.5 - 6.5) и низкими скоростями сульфатредукции.

3. Микробиологическими и молекулярно-биологическими методами показано, что разнообразное сообщество СРВ присутствует в экосистемах отходов горнодобывающих и металлургических предприятий. В сообществе доминируют СРБ родов Desulfobulbus и Desulfovibrio, осуществляющие неполное окисление органических субстратов. Культивирование в условиях низких рН среды выявляет большое количество спорообразующих форм, осуществляющих диссимиляторное восстановление сульфатов: Desulfosporosinus spp., Desulfotomaculum spp. и Clostridium spp. Представители родов Desulfovibrio и Desulfosporosinus обладают селективными преимуществами при культивировании в условиях повышенных концентраций металлов. В низкотемпературных экосистемах значительную часть

сообщества составляют психрофильные/психроактивные Desulfotalea-

Desulfofustis.

4. Выделены в чистую культуру и охарактеризованы 4 штамма рода Desulfovibrio: Desulfovibrio sp. Al, Desulfovibrio sp. A2, Desulfovibrio sp. A4 и Desulfovibrio sp. R2, а также Desulfomicrobium sp. BL устойчивые к содержанию меди в среде до 2600 мг/л. Последовательности, родственные генам системы рсо, кодирующую устойчивость к меди у энтеробактерий, амплифицированы методом ПЦР из всех устойчивых изолятов.

5. Выделена чистая культура Desulfomicrobium sp. 63, являющаяся наиболее устойчивой из изученных ранее штаммов, к высоким концентрациям шестивалентного хрома в среде [до 105 мг/л Сг6+]. Процесс осаждения хрома под действием штамма 63 протекает наиболее эффективно при низких концентрациях Сг6+ не превышающих 17.5 мг/л при использовании этанола в качестве субстрата роста.

6. Впервые показана способность чистых культур СРВ использовать нерастворимые сульфаты (англезит, барит) и сульфит (ханнебахит) в качестве терминальных акцепторов электронов для окисления органических соединений. Вероятный механизм использования малорастворимых соединений заключается в транспорте доступных анионов S042" и S032" в клетки бактерий, что сдвигает химическое равновесие и приводит к выделению новой партии анионов в раствор.

7. С использованием современных методов рентгенофазового и рентгено-флуоресцентного анализов впервые показано образование минералов галенита, ковеллита, халькоцита и халькопирита чистыми культурами СРВ.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Карначук О.В., Намсараев Б.Б. Иванов М.В. Современные процессы восстановления сульфатов в осадках бухты Кратерной // Биология моря. 1989. N 3. С. 59-65.

2. Намсараев Б.Б., Карначук О.В., Борзенков И.А., Старынин Д.А. Микробиологические процессы в донных осадках бухты Кратерной // Биология моря. 1989. N 3. С. 52-58.

3. Карначук О.В. Процесс бактериального восстановления сульфатов, как показатель мониторинга загрязнения морской среды. 1989. Иркутск. С.57.

4. Карначук О.В., Иванов М.В. Образование восстановленных соединений серы при бактериальной сульфатредукции в прибрежных морских осадках // Тезисы докладов 9-го Международного симпозиума по биогеохимии окружающей среды. Москва. 1989. С. 81

5. Намсараев Б. Б., Карначук О.В. Количественная оценка бактериальных процессов разрушения органического вещества в прибрежных осадках //

Тезисы докладов 9-го Международного симпозиума по биогеохимии окружающей среды. Москва. 1989. С. 83.

6. Карначук О.В., Намсараев Б.Б., Иванов М.В., Борзенков И.А. Процесс бактериальной сульфатредукции и его роль в разложении органического вещества в осадках прибрежных районов Японского моря Н Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 1.С. 140-147.

7. Иванов М.В., Намсараев Б.Б. Нестеров А.И., Карначук О.В., Борзенков И.А., Большаков A.M. Участие микроорганизмов в разрушении органического вещества в прибрежных донных осадках Японского моря // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 2. С. 321-329.

8. Намсараев Б.Б., Лухиойо М., Бейота М., Миравет М.Е., Мицкевич И.Н., Карначук О.В., Иванов М.В. Участие микроорганизмов в деструкции органического вещества в донных осадках залива Батабано (Куба) Н Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 5. С. 903-911.

9. Иванов М.В., Леин А.Ю., Карначук О.В. Новые доказательства биогенной природы сероводорода в Черном море // Геохимия. 1992. N 8. С. 1186-1194.

10. Karnachuk O.V., Ivanov M.V. Geochemical activity of sulfate-reducing bacteria in coastal shallow sediments of the Sea of Japan, Okhotsk, Carribean and Black Seas // Iinteraction of Biogeochemical Cycles in Aqueous Systems, Part 7, SCOPE/UNEP, Sonderband. Hamburg, 1992. P. 181-191.

11. Ivanov M.V., Lein A.Yu., Karnachuk О. V. New evidence for a biogenic origin for H2S in the Black Sea // Geochemistry International. 1993. V.30 (3). P. 112-121.

12. Карначук О.В. Влияние шестивалентного хрома на образование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями // Микробиология. 1995. Т. 64. N 3. С. 315-319.

13. Карначук О.В. Мобилизация фосфата из нерастворимых соединений под действием сульфатредуцирующих бактерий // Микробиология. 1995. Т. 64. N 4. С. 559- 563.

14. Карначук О.В., Максимова Н.М., Романенко И.В., Ванина Ю.Н. Мобилизация ортофосфата в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья // Труды II совещания «Экология пойм Сибирских рек и Арктики». 22-26 ноября 2000. Томск: SST, С. 154-160.

15. Карначук О.В., Ивасенко Д.А., Давыдов А.А., Филлипенко Е.А., Дейнеко Е.В. Генетическая характеристика сульфатредуцирующей бактерии, устойчивой к повышенным концентрациям ионов двухвалентной меди // Биотехнология на рубеже двух тысячелетий Материалы международной конференции 12-15 сентября 2001. Саранск: Изд-во Мордовского университета, С. 229.

16. Карначук О.В., Парначов В.П., Бэнкс Д., Френгстад В. Особенности биогеохимии высокосульфатного меромиктического озера Шира // Геохимия биосферы: Материалы Ш-го международного совещания, Новороссийск 1015 сентября 2001. Ростов-на Дону: Изд-во Ростовского университета. С. 3233.

17. Banks, D., Parnachev, V.P., Frengstad, В., Holden, W., Karnachuk, О. У., Vedernikov, А.А. The hydrochemistry of the Altaiskii, Askizskii, Beiskii, Bogradskii, Shirinskii, Tashtipskii and Ust'Abakanskii regions, Republic of

Khakassia, Southern Siberia, Russian Federation // Data report. Nor Geol Unders Rap 2001.006/ 2001. Trondheim. - 116p.

18. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Tuovinen O.H. Growth of sulfate-reducing bacteria with hannebachite, gypsum, and anglesite as electron acceptors. Abstracts International Biohydrometallurgy Symposium, September, 16-19, 2001, Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil, P. 91.

19. Карначук O.B., Парначев В.ГГ. Биогеохимическая характеристика водной толщи озера Шира // В: Вопросы географии Сибири. 2001. Вып. 24, Томск: Изд-во ТГУ. С. 172-182.

20. Карначук О.В., Романенко И.В., Максимова Н.М., Вагина С.Э. Эволюция биогенных элементов в водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья // Environment of Siberia, the Far East and the Arctic: Selected papers presented at the International Conference ESFEA 2001. Tomsk, Russia. September 5-8, 2001/ Eds. Zuev V.V. and Turov Yu.P. Tomsk, 2001. P. 121-127.

21. Pimenov N.N., Rusanov 1.Г., Karnachuk O.V., Brjanseva L.A., Rogosin D.Yu. Microbial processes of carbon and sulfur cycles in the salt lake Shira (Khahasia) // 8-th International Conference on salt Lakes, 23-26 July, 2002, Zhemchuzhny, Republic of Khakasia, P. 119.

22. Banks, D., Parnachev V.P., Holden W., Frengstad В., Vedernikov A.A., Karnachuk О. V. Alkaline mine drainage from metal sulphide and coal mines: examples from Svalbard and Siberia // In: Mine Water Hydrogeology and Geochemistry / Eds. Younger P.L. and Robins N.S., Geological Society, London, Special Publications,

2002. 198. P. 287-296.

23. Banks D., Karnachuk O.V., Parnachev V.P., Holden W. Frengstad B. Groundwater contamination from rural pit latrines: examples from Siberia and Kosova/ J. CIWEM. 2002. V. 16. P. 147-152.

24. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Tuovinen O.H. Growth of sulfate-reducing bacteria with solid-phase electron acceptors / Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 482-486.

25. Пименов H.B., Русанов И.И., Карначук О.В., Рогозин Д.Ю., Брянцева И.А., Лунина О.Н., Юсупов С.К., Парначев В.В., Иванов М.В. Микробные процессы циклов углерода и серы в озере Шира (Хакасия) / Микробиология.

2003. Т. 72. N 2. С. 259-267.

26. Парначев В.П., Вишневецкий И.П., Макаренко Н.А., Петрова А.И., Копылова Ю.Г., Сметанина И.В., Карначук О.В., Туров Ю.П., Клопотова Н.Г., Джабарова Н.К., Бэнкс Д., Березовский А.Я. Природные воды Ширинского района Республики Хакасия. Томск: Изд-во Томского университета, 2003. -183с.

27. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Nicomrat D., Frank Yu.A., Ivasenko D.A., Phyllipenko E.A, Tuovinen O.H. Copper resistance in Desulfovibrio strain R2 / Antonie van Leeuwenhoek. 2003. V. 83. P. 99-106.

28. Karnachuk O.V., Pimenov N.V., Yusupov S.K., rvanov M.V., Lindstrom E.B., Puhakka J.A., Tuovinen O.H. Sulfate reduction potential in sediments impacted by tailings and smelter effluents in the Norilsk region, northern Siberia / In: Book of

Abstracts, International Biohydrometallurgy Symposium, September 14-19, 2003, Athens.

29. Banks D., Parnachev V.P., Frengstad В., Holden Ж, Karnachuk О. V., Vedernikov A.A. The evolution of alkaline, saline ground- and surface waters in the southern Siberian steppes. Appl. Geochem. 2004. V. 19. P. 1905-1926.

30. Karnachuk O.V., Puhakka J.A., Frank Y.A., Yusupov S.K., Kaksonen A.H., Pimenov N.V., Ivanov M.V., Lindstrdm E.B., Tuovinen O.H. Bacterial sulfate reduction in Russian arctic sediments impacted by the mining industry / In: Abstracts, International Conference on Arctic Microbiology, 22-25.03.2004, Rovaniemi, Finland, P. 29.

31. Karnachuk O.V., Pimenov N.V., Yusupov S.K., Frank Y.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Ivanov M.V., Lindstrdm E.B., Tuovinen O.H. Sulfate reduction potential in sediments in the Norilsk Mining area, Northern Siberia. Geomicrobiol. J. 2005. V. 22. P. 11-25.

32. Karnachuk О. V., Frank Y.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Sasaki AT., Tuovinen O.H. Isolation and characterization of new copper-resistant sulfate-reducing bacteria. In: Book of Abstracts, 1st International Conference on Environmental, Industrial, and Applied Microbiology. March 15-18th 2005, Badajoz, Spain, P. 699.

33. Gramp J.P., Karnachuk O.V., Frank Y.A., Sasaki K„ Bigham J.M., Tuovinen O.H. Biogenic sulfides produced by sulfate-reducing bacteria The American Society for Microbiology (USA, Washington), 105th General Meeting: June 5-9, 2005.

34. Карначук O.B., Пименов H.B., Юсупов C.K., Франк Ю.А. Пухакка Я.А., Иванов М.В. Распределение, разнообразие и активность сульфатредуцирующих бактерий в водной толще озера Гек-Гель, Азербайджан. Микробиология. 2006. Т. 75. N1. С. 1-9.

35. Karnachuk О. V., Frank Y.A., Pimenov N. V., Yusupov S.K., Ivanov M. V., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., LindstrdmE.B. Tuovinen O.H. Diversity and activity of sulfate-reducing bacteria in Russian Arctic subsurface sediments impacted by the mining industry. Joint International Symposia for Subsurface Microbiology (ISSM-2005) and Environmental Biogeochemistry (ISEB XVII). August 14-19,h,

2005, Jackson Hole, Wyoming.

36. Gramp J.P., Sasaki K., Bigham J.M., Karnachuk О. V., Tuovinen O.H. Formation of covellite (CuS) under biological sulfate-reducing conditions. Geomicrobiol. J.,

2006. V. 23. P. 1-7.

37. Karnachuk О. V., Sasaki K., Gerasimchuk A.L., Sukhanova O., Ivasenko D.A., Kaksonen A.H., Puhakka J.A., Tuovinen O.H. Precipitation of Cu-sulfides by copper-tolerant Desulfovibrio isolates. 2006. (in press).

38. Karnachuk О. V., Pimenov N. V., Yusupov S.K., Frank Yu.A., Gerasimchuk A.L., Dedinsky V.A., Kaksonen A.H., Lindstrdm E.B., Ivanov M.V., Puhakka J.A., Tuovinen O.H. Sulfate reduction in the oxic zone of mine tailings and metal-polluted sediments in boreal ecosystems. In: Book of Abstracts. 11th International Symposium om Microbial Ecology, Vienna, Austria, August 20-25, 2006. P. A77.

Тираж 120 экз. Заказ № 731. Отпечатано в КЦ «Позитив» 634050_г. Томск, по. Ленина. 34а

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карначук, Ольга Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ГЕОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ 15 БАКТЕРИЙ

1.1. Современные взгляды на сульфатредуцирующие микроорганизмы

1.2. Биогеохимические реакции цикла серы и углерода, осуществляемые СРБ

1.3. Осаждение карбонатов

1.4. Образование сульфидов металлов

1.4.1 Сульфиды железа

1.4.2 Образование сульфидов металлов отличных от железа

1.4.3 Биотехнологическое значение осаждения металлов

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Краткая характеристика изученных экосистем

2.2. Методы отбора проб воды и осадков и их гидрохимическая характеристика

2.3. Методы определения восстановленных форм серы и кристаллических фаз осадков

2.4. Определение численности и исследование биоразнообразия микроорганизмов

2.5. Выделение, ПЦР-амплификация и секвенирование ДНК

2.6. Схема постановки экспериментов в присутствии хрома, меди и нерастворимых соединений серы

Глава 3. ИНТЕНСИВНОСТЬ СУЛЬФАТРЕДУКЦИИ И ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ В ПРИБРЕЖНЫХ ОСАДКАХ МОРЕЙ

3.1. Скорость процесса сульфатредукции и образование диагенетических сульфидов

3.2. Изотопный состав окисленных и восстановленных форм серы

3.3. Геохимическое значение диссимиляторной сульфатредукции в прибрежных мелководных осадках

Глава 4. ГЕОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ СРБ В ОТХОДАХ ДОБЫЧИ И ПЕРЕРАБОТКИ МЕТАЛЛОВ И СВЯЗАННЫХ С ?

НИМИ ЭКОСИСТЕМАХ

4.1. Интенсивность сульфатредукции и образование сульфидов

4.2. Изотопный состав окисленных и восстановленных соединений серы

4.4. Распространение и разнообразие сульфатредуцирующих бактерий

4.3. Культивируемые СРБ 96 4.6. Роль СРБ в геохимических реакциях в отходах добывающей и металлургической промышленности

Глава 5. УСТОЙЧИВОСТЬ К ИОНАМ МЕТАЛЛОВ И

ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ КУЛЬТУРАМИ СРБ

5.1. Выделение и изучение чистых культур СРБ устойчивых к меди

5.2. Механизмы устойчивости к меди у СРБ

5.3. Кинетика роста и образование сульфидов меди чистыми культурами СРБ

5.4. Образование H2S и осаждение Cr(VI) чистыми культурами СРБ

5.5. Геохимическое и биотехнологическое значение осаждения меди, хрома и других металлов СРБ

Глава 6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕРАСТВОРИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ 145 СЕРЫ В КАЧЕСТВЕ АКЦЕПТОРА ЭЛЕКТРОНОВ

6.1. Восстановление нерастворимых соединений серы чистыми культурами СРБ

6.2. Использование нерастворимых сульфатов природными популяциями

6.3. Геохимическое значение использования нерастворимых соединен ий серы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями"

Актуальность проблемы. Большое значение диссимиляторного восстановления сульфатов в процессах образования минералов хорошо известно исследователям, а работы Г. А. Надсона (1903) по образованию карбоната кальция на сероводородных озерах и Б. JL Исаченко (1912) по наблюдению сульфидов железа внутри клеток сульфатвосстанавливающих бактерий стоят у истоков возникновения геологической микробиологии наряду с работами X. Эренберга (1838) и С. Н. Виноградского (1887, 1888). Исследования последних двух десятилетий привели к существенной корректировке наших знаний о сульфатредуцирующих бактериях (СРБ). Толерантность к кислороду (Krekeler et al., 1997; Minz et al., 1999; Schramm et al., 1999; Matsui et al., 2004) и возможность его использования в качестве конечного акцептора электронов (Cypionka, 2000), ранняя (3.47 млрд. лет назад) эволюция сульфатного дыхания (Shen et al., 2001; Shen and Buick, 2004), его вероятное монофилетическое происхождение (Wagner et al., 1998; Stahl et al., 2002) и распространение внутри различных доменов через горизонтальный перенос генов (Klein et al., 2001; Zverlov et al., 2005), а также активность СРБ в широком диапазоне температур и кислотности среды, предполагают более широкие возможности сульфатредукторов в сфере геохимических преобразований. Особое значение имеют геохимические реакции, приводящие к осаждению или растворению минералов, связанные с мобилизацией или выведением из круговорота соединений различных элементов.

Наряду с морскими осадками, характеризующимися высоким содержанием сульфата, существуют наземные экосистемы, где высокое л содержание SO4" может обеспечивать активные процессы сульфатредукции и сульфидообразования. Это зоны гипергенеза сульфидных руд и многочисленные места хранения отходов добычи и переработки металлов. Активные окислительные процессы являются причиной высокой концентраций ионов SO4" и различных форм железа. Окисление сульфидных минералов серуокисляющими микроорганизмами традиционно рассматривают как основной биогеохимический процесс в этих экосистемах, где преобладают окисленные условия и часто низкие значения рН среды (Иванов, Каравайко, 2004). Новые данные о физиологии СРБ предполагают, что эта группа бактерий может принимать участие в образовании вторичных л сульфидов в экосистемах, характеризующихся высоким содержанием S04 несмотря на окисленные и кислые условия среды. Хотя отдельные сообщения о присутствии значительной популяции СРБ в окисленных зонах хвостохранилищ добычи металлов (Fortin et al., 1996; 2000) были известны из литературы, их активность, распространение и разнообразие оставались малоизученными. Современные методы молекулярной экологии, позволяют достоверно описать микробное сообщество, включая культивируемые и некультивируемые микроорганизмы, осуществляющие диссимиляторное восстановление сульфатов.

Исследование образования сульфидов в условиях повышенной концентрации ионов металлов, отличных от железа, имеет большое прикладное значение для создания современных биотехнологий очистки от металлов. Существенный недостаток наших знаний в области устойчивости СРБ к катионам тяжелых металлов ограничивает их использование в биотехнологиях (Johnson, 2000; Sani et al. 2001; Vails, de Lorenzo, 2002). К моменту начала наших исследований СРБ, способные развиваться в условиях концентраций, превышающих сотню мг/л ионов Cu(II) и других металлов, были неизвестны. Существовало мнение, что СРБ не могут играть значительной роли в образовании сульфидов, отличных от железа, в силу высокой токсичности ионов металлов для микроорганизмов (Davidson et al., 1962; Ehrlich, 1996).

Так как сульфаты обладают значительно большей растворимостью и составляют большой резервуар в природе, то внимание исследователей, изучающих процессы микробной сульфатредукции, было в основном направлено на исследование восстановления растворимых сульфатов. Однако некоторые экосистемы могут содержать большие количества нерастворимых сульфатов/сульфитов. Следует отметить, что здесь и далее мы используем химическую классификацию, следуя которой, нерастворимыми называют соединения, если их количество, переходящее в раствор, составляет менее 0.01 г вещества на 100 г воды. Примером являются сульфаты бария в морских осадках (особенно в зонах гидротерм и холодных сипов), сульфаты радия, распространенные в отходах урановых рудников, или сульфиты кальция, которые образуются в больших количествах в промышленности при улавливании S02 и часто захораниваются вместе с бытовыми отходами. Возможность участия СРБ в восстановлении нерастворимых сульфатов/сульфитов не получила детального рассмотрения. Однако, учитывая масштабы образования этих соединений, их возможное восстановление может вносить вклад в потоки серы в природе.

4. Выделить СРБ устойчивые к катионам металлов, изучить их физиологию, возможные механизмы устойчивости к металлам и реакции осаждения металлов.

Впервые проведены комплексные исследования процессов микробной сульфатредукции в различных экосистемах, содержащих отходы добычи и переработки металлов. Эти исследования включали: 1) измерение скорости процесса с радиоактивной меткой; 2) изучение состава стабильных изотопов серы окисленных и восстановленных соединений; 3) аналитическое определение форм серы и других соединений; 4) определение численности культивируемых и некультивируемых СРБ традиционными и молекулярно-экологическими методами; 5) выделение чистых культур СРБ. Различными методами впервые показано, что вторичные сульфиды могут образовываться за счет деятельности СРБ не только в зоне вторичного сульфидного обогащения, характеризующейся анаэробными условиями, но и в окисленной зоне коры выветривания сульфидных месторождений и экосистем, связанных с хранением отходов добычи и переработки металлов. Охарактеризовано филогенетическое разнообразие СРБ в отходах добычи и переработки металлов. Впервые выделены в чистую культуру и охарактеризованы СРБ устойчивые к ионам двухвалентной меди и шестивалентного хрома. Показано, что устойчивость к меди у СРБ может определяться двумя механизмами - образованием сульфидов меди и активным энергозависимым транспортом меди из клетки.

Последовательности, родственные генам рсоА и pcoR были ПЦР-амплифицированы из изолятов СРБ, устойчивых к меди. Выделение штаммов СРБ, способных к росту при высоких концентрациях меди позволило впервые провести исследование образования сульфидов меди с использованием методов рентгено-фазового и рентгено-флуоресцентного анализов и продемонстрировать возможность образования кристаллических сульфидов меди - ковеллита, халькоцита и халькопирита чистыми культурами СРБ.

Впервые показана способность использовать ханнебахит (CaS03) в качестве конечного акцептора электронов, и исследованы закономерности восстановления других нерастворимых соединений серы чистыми культурами СРБ.

Практическая значимость работы. Обнаруженные закономерности протекания процесса микробной сульфатредукции в прибрежных осадках могут быть использованы для моделирования антропогенного влияния на мелководные шельфовые зоны Мирового океана, и в частности, для прогнозирования гидрохимической ситуации на северо-западном шельфе Черного моря.

Штаммы СРБ толерантные к ионам металлов могут быть использованы для изучения механизмов устойчивости и создания на их основе новых технологий осаждения меди, хрома и других металлов. Преимуществом биогенного осаждения в виде сульфидов является их низкая (по сравнению с образующимися при химической очистке гидроксидами) растворимость и возможность использования традиционных методов гидрометаллургии для извлечения металлов. Возможность переработки отходов сульфидов металлов, образуемых в схемах очистки сточных вод, основанных на сульфатредукции, приобретает особое значение с введением в ряде Европейских стран законодательства, запрещающего образование твердых отходов (например, гидроксидов металлов) при очистке сточных вод (van Houten et al., 2006). Определение основных кристаллических фаз сульфидов меди, образуемых чистыми культурами СРБ, может быть использовано при разработке методов рециклирования меди, осажденной в сульфатредукционных условиях. Важной особенностью некоторых из устойчивых изолятов является их активный рост на дисахаридах и полимерах, которые могут быть использованы как альтернативный субстрат спиртам (этанолу и метанолу), используемым в настоящее время в ряде промышленных схем для технологий осаждения металлов СРБ. Сведения о механизмах, определяющих устойчивость к меди у Desulfovibrio spp. и Desulfomicrobium sp. BL, могут быть использованы в дальнейшем при конструировании генно-инженерно модифицированных СРБ, устойчивых к меди.

Полученные выводы и закономерности восстановления ханнебахита (СаБОз) СРБ и образования нерастворимых продуктов важны в процессе менеджмента отходов предприятий, сжигающих ископаемое топливо и улавливающих SO2 на скрубберах. Нерастворимые отходы промышленности, содержащие ханнебахит, могут быть использованы для контроля парниковых газов в местах захоронения бытовых и промышленных отходов (через переключение конечных этапов разложения органического вещества с метаногенеза на сульфатредукцию) и в качестве субстрата роста для СРБ при осаждении металлов в системах с низким содержанием SO42".

Отдельные этапы работы были поддержаны проектами Департамента Образования США (Title IV), ИНТАС (01-2333), ИНТАС (01-0737), 6-й Рамочной программой (BioMineE contract 500329), ФАО РФ (РНП 2.1.1.7338).

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на Российских и международных конференциях, включая: Международное рабочее совещание SCOPE/UNEP «Биогеохимические циклы углерода и серы в озерах и водохранилищах» (Иркутск, 1988), 9-й и 17-й Международные симпозиумы по биогеохимии окружающей среды (Москва, 1989; Джексон Хол, США, 2005), Съезд Британского геологического общества (Ноттингем, Великобритания, 2001), III-е Международное совещание «Геохимия биосферы» (Новороссийск 2001), Международные симпозиумы по биогидрометаллургии (Оуро Прето, Бразилия, 2001; Афины, Греция, 2003), 1 и 2-ю Международные конференции по Арктической микробиологии (Рованиеми, Финляндия, 2004; Инсбрук, Австрия, 2006), 1-ю Международную конференцию по экологической, промышленной и прикладной микробиологии (Бадахос, Испания, 2005), 105-й съезд Американского микробиологического общества (Атланта, США, 2005), 11-й Симпозиум по Экологии Микроорганизмов (Вена, Австрия, 2006).

Место проведения работы. Результаты исследований, представленные в диссертации, были получены автором за время работы в лабораториях биогеохимии ИБФМ АН СССР (1982-1985), микробной биогеохимии ИНМИ АН СССР (1985-1987), группе рудной микробиологии ИНМИ АН АрмССР (1988-1991), Томском государственном университете (1992 - 2006). Отдельные этапы работ были проведены в Институте биотехнологии и биоинженерии, Технологического университета Тампере и на Кафедре микробиологии университета штата Огайо.

Автор искренне признателен коллегам и соавторам Д. Бэнксу, М. Б. Вайнштейну, Дж. Виллиамс, Г. И. Гоготовой, Е. В. Дейнеко, А. X. Каксонен, К. Карлстрем, А. Ю. Леин, Э. Б. Линдстрему, Ю. М. Миллеру, Б. Б. Намсараеву, Д. Никомрат, В. П. Парначеву, Н. В. Пименову, И. И. Русанову,

К. Сасаки, Д. А. Старынину, В. А. Шакола, Е. А. Филипенко, Б. Френгстаду, Д. Хобману, С. К. Юсупову, а также студентам и аспирантам кафедр Физиологии растений и биотехнологии и Экологического менеджмента Томского государственного университета А. Герасимчук, А. Демянчук, А. Давыдову, Д. Ивасенко, А. Казаченок, С. Курочкиной, Т. Рычковой, О. Сухановой и Ю. Франк совместно с которыми были получены результаты этого исследования.

Автор благодарит Группу Норильский Никель за предоставленную возможность и помощь в отборе проб.

Основные защищаемые положения.

4. В природных экосистемах существуют СРБ, устойчивые к высокому содержанию ионов меди (II) и хрома (VI). Сульфатредукторы, растущие при высокой концентрации ионов Си , способны образовывать сульфиды меди: ковеллит, халькоцит и халькопирит.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карначук, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

2. В отходах добычи и производства металлов и связанных с ними экосистемах происходит образование аутигенных вторичных сульфидов, что подтверждается изотопным составом серы восстановленных продуктов и окисленных субстратов. Максимальные доли пирита от суммарной восстановленной серы обнаружены в окисленных и слабо-окисленных осадках (Eh от +100 до +400 mV), характеризующихся слабокислыми условиями среды (рН 5.5 - 6.5) и низкими скоростями сульфатредукции.

3. Микробиологическими и молекулярно-биологическими методами показано, что разнообразное сообщество СРБ присутствует в экосистемах отходов горнодобывающих и металлургических предприятий. В сообществе доминируют СРБ родов Desulfobulbus и Desulfovibrio, осуществляющие неполное окисление органических субстратов. Культивирование в условиях низких рН среды выявляет большое количество спорообразующих форм, осуществляющих диссимиляторное восстановление сульфатов: Desulfosporosinus spp., Desulfotomaculum spp. и Clostridium spp. Представители родов Desulfovibrio и Desulfosporosinus обладают селективными преимуществами при культивировании в условиях повышенных концентраций металлов. В низкотемпературных экосистемах значительную часть сообщества составляют психрофильные/психроактивные Desulfotalea-Desulfofustis.

5. Выделена чистая культура Desulfomicrobium sp. 63, являющаяся наиболее устойчивой из изученных ранее штаммов, к высоким концентрациям шестивалентного хрома в среде [до 105 мг/л Сгб+]. Процесс осаждения хрома под действием штамма 63 протекает наиболее эффективно при низких концентрациях Сгб+ не превышающих 17.5 мг/л при использовании этанола в качестве субстрата роста.

6. Впервые показана способность чистых культур СРБ использовать нерастворимые сульфаты (англезит, барит) и сульфит (ханнебахит) в качестве терминальных акцепторов электронов для окисления органических соединений. Вероятный механизм использования малорастворимых соединений заключается в транспорте доступных анионов SO4" и SO3" в клетки бактерий химическое равновесие и приводит к выделению новой партии анионов в раствор.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Геологическая роль сульфатредуцирующих бактерий, прежде всего, связана с образуемым ими конечным продуктом восстановления сульфата, химически высокореакционным сероводородом. В седиментационных условиях микробная сульфатредукция является основным источником диагенетического пирита (Иванов, 1983; Ehrlich, 1995). В мелководных прибрежных осадках внутренних и окраинных морей Мирового океана нами измерены высокие скорости микробной сульфатредукции и образования аутигенного пирита (Karnachuk and Ivanov, 1992). Интенсивность пиритообразования была максимальной в биотопах, характеризующихся относительно невысокой скоростью суммарной сульфатредукции и условиями переходными от слабо-восстановленных к слабо-окисленным. Наши наблюдения хорошо согласуются с механизмом образования пирита по полисульфидному механизму (Berner 1970, 1984). Присутствие окислителей играет важную роль в преобразовании моносульфидов железа в пирит (Rickard and Morse, 2005). В слабоокисленных условиях наиболее вероятно присутствие частично окисленных форм серы, таких как полисульфиды, являющихся основным агентом, приводящим к преобразованию кислоторастворимых сульфидов в пирит. Подтверждением накопления окисленных продуктов, происходящих из сульфатредукционного сероводорода в изученных нами экосистемах, является накопление радиоактивной серы во фракции тиосульфата. Кроме того, присутствие окислителей приводит к быстрому окислению метастабильных моносульфидов железа и увеличению доли пирита в общем пуле сульфидов.

Экстремально высокие скорости сульфатредукции в прибрежных морских осадках являются следствием значительного антропогенного стресса, что было продемонстрировано нами на примере северо-западного шельфа Черного моря. В период наших исследований в 1987 году экосистема шельфа получала максимальное количество органических загрязнителей и биогенов со стоком рек Дуная, Днестра и Днепра. Резкое увеличение содержания органического вещества привело к максимальному развитию процессов микробного восстановления сульфата, сопровождавшемуся выходом сероводорода в воду, снижением концентрации кислорода и гибелью бентосных животных. Измеренные нами наибольшие скорости сульфатредукции в верхних горизонтах осадков приустьевых районов, резкое снижение концентрации сульфата и формирование системы близкой к замкнутой по сульфату в слое осадков 0-2 см, подтверждают вывод об активизации микробной сульфатредукции в небольшой период времени, предшествовавший проведению исследований. Следствием быстрого развития сульфатредукции на шельфе был чрезвычайно высокий эффект изотопного фракционирования стабильных изотопов серы. Разница между серой остаточного сульфата и восстановленной серы сульфидов достигала 76.6%.

Тогда как геохимическая роль сульфатредуцирующих бактерий в морских экосистемах не вызывает сомнения, возможность их участия в геологических процессах в зонах гипергенеза месторождений сульфидных металлов оставалась недоказанной. Отходы металлургической и, особенно, добывающей промышленности составляют иногда до 90 % от исходной руды, размещаются на хранение в природных экосистемах и занимают большие территории. Окислительные процессы, происходящие в них, представляют постоянный источник загрязнения ионами металлов и сульфатом окружающей среды. Наши исследования продемонстрировали, что наряду с биологическими процессами окисления сульфидных руд и образованием вторичных гидроксидов и гидроксисульфатов железа, в отходах добычи и производства металлов происходит образование вторичных сульфидов. Анализ стабильных изотопов окисленных и восстановленных соединений серы подтверждает образование аутигенных сульфидов. Тот факт, что сульфатредукционное облегчение восстановленных продуктов серы наблюдали на фоне высоких концентраций первичных сульфидов, а биологическое утяжеление сульфатов при большом количестве SO4 *, образуемого при окислении сульфидов, также свидетельствует о том, что бактериальный сульфидогенез является значимым процессом и исследованных экосистемах. Процесс образования аутигенных сульфидов металлов не лимитируется окисленными и кислыми условиями среды и низкими температурами. Наши исследования показывают, что процессы окисления сульфидных руд и образования вторичных сульфидов могут быть не разделены пространственно.

Культивирование, FISH анализ, PCR-DGGE анализ и секвенирование последовательностей генов 16S рРНК показывают, что разнообразное сообщество, способное осуществлять диссимиляторное восстановление сульфатов, существует в экосистемах богатых сульфидами. В экосистемах двух изученных, географически удаленных регионов, Норильского промышленного комплекса и Кольского полуострова доминировали группы СРБ с неполным окислением субстратов. Desulfovibrio spp., и Desulfobulbus spp. доминировали как среди культивируемых, так и организмов, определяемых молекулярными методами. Психрофильные Desulfofustis spp. были важной группой в бореальных экосистемах. В условиях кислой рН среды преобладали спорообразующие формы Desulfosporosinus spp., Desulfotomaculum spp. и Clostridium spp. Desulfovibrio spp. и Desulfosporosinus spp. являются важными группами в условиях повышенной концентрации металлов. Выделение чистой культуры Clostridium sp. КА, способного к диссимиляторной редукции SO4" и образующего удаленную группу внутри рода Clostridium, а также родственных ему филотипов в накопительных культурах, выращенных у условиях высокой концентрации металлов, свидетельствует о присутствии новых форм СРБ в экосистемах отходов добычи металлов.

Роль сульфатредуцирующих бактерий в осаждении сульфидов металлов, отличных от железа, оставалось невыясненной, в силу предположения о том, что высокая концентрация тяжелых металлов препятствует развитию СРБ (Ehrlich, 1995). Выделение изолятов, устойчивых к меди и другим металлам, позволило нам изучить образование сульфидов меди чистыми культурами СРБ. Ренгено-фазовый и рентегно-флуоресцентный анализ показали наличие халькоцита, ковеллита и халькопирита в осадках, образуемых устойчивыми изолятами.

Филогенетический анализ показал, что большинство чистых культур СРБ, устойчивых к меди попадали в один кластер внутри рода Desulfovibrio. Из осадков ветланда Норильской промышленной зоны был выделен устойчивый к меди Desulfomcrobium sp. BL. Последовательности ДНК, родственные рсо-опреону Е coli, кодирующему устойчивость к меди, были ПЦР-амплифицированы из всех толерантных изолятов. Отсутствие последовательностей системы гомеостаза меди (cus, сие, сор), в полностью секвенированных геномах Desulfovibrio vulgaris (Coombs and Barkay, 2005) и Desulfovibrio desulfuricans, кодирование рсо-оперона на внегеномной ДНК энтеробактерий (Williams et al., 1993; Brown et al., 1995), возможный перенос системы рсо в другие почвенные бактерии (Trajanovska et al., 1997) позволяет предположить возможность горизонтального переноса генов в эволюции устойчивости к меди у СРБ.

Наши исследования показывают, что возможным источником аутигенного образования сульфидов металлов могут быть не только растворимые сульфаты, но и нерастворимые сульфаты бария, свинца и сульфит кальция. Ханнебахит, СаБОз0.5 Н2О наряду с гипсом является распространенным отходом производства, образующимся при улавливании SO2 в дымовом газе. Широко распространена практика улавливания двуокиси серы на фильтрах-скруберрах с образованием осадка, содержащего избыток извести, гипса и сульфита кальция. Существует практика захоронения подобных отходов совместно с бытовыми твердыми отходами, а также на поверхности хвостохранилищ в местах выработки руд.

Наряду с мобилизацией окисленной серы важным геохимическим последствием восстановления ее нерастворимых соединений является высвобождение связанных катионов. В случае малорастворимого сульфита кальция и гипса ионы Са , высвобождающиеся при использовании серосодержащего аниона, могут связываться в осадок карбоната кальция СаСОз, реагируя с С02, образуемым бактериями в процессе окисления органических доноров электрона. Образование кальцитов в процессе сульфатредукции в предшествующие геологические эпохи хорошо документировано на примере месторождений серы и нефтяных месторождений с карбонатными коллекторами (Иванов, 1964). Последне данные о процессе карбонатообразования, протекающего в современных седиментационных системах, предполагают его комплексную природу, связанную с деятельностью сообщества микроорганизмов, включая и СРБ. В наших экспериментах мы подтвердили возможность образования кальцита чистыми культурами СРБ без участия других групп микроорганизмов с использованием современных методов анализа кристаллической фазы осадка.

Анализ наших и литературных данных предполагает, что СРБ могут играть важную роль в цикле бария. Основным результатом активности сульфатредкуторов является высвобождение Ba(II) из нерастворимых форм. Микробная сульфатредукция в восстановленных нижних слоях осадков рассматривается как наиболее вероятный механизм мобилизации катионов бария из осадков, обнаруженный Й. Грейнертом с соавт. (Greinert et al., 2002) в зоне холодных метановых сипов в заливе Дерюгина (Охотское море).

Наши исследования показывают, что сульфатредуцирующие прокариоты играют важную геологическую роль не только в современных морских осадках, но и в отходах добывающей и перерабатывающей металлы промышленности, содержащих высокие концентрации вторичных сульфатов. Микробное восстановление сульфатов может протекать в окисленных условиях среды, и эти условия способствуют образованию химически более стабильного сульфида железа, пирита. Высокие концентрации ионов металлов не лимитируют образование аутогенных сульфидов тяжелых металлов и в природных экосистемах существуют сульфатредукторы, способные осуществлять их осаждение. Образование вторичных сульфидов имеет большое значение как в процессах естественного снижения высокой концентрации ионов металлов, так и в различных биотехнологиях очистки отходов и сточных вод от металлов. В процессах биоремедиации возможным субстратом могут служить нерастворимые соединения окисленной серы, образуемые как отходы других технологических процессов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карначук, Ольга Викторовна, Томск

1. Вайнштейн М.Б., Намсараев Б.Б., Самаркин В.А., Леин А.Ю. Современные процессы восстановления сульфатов в осадках Индийского океана // Геохимия диагенеза осадков Индийского океана. М.: АН СССР, Ин-т Океанологии, 1985. С. 45-53.

2. Волков И.И., Розанов А.Г. Цикл серы в океане. Часть I, Резервуары и потоки серы // Глобальный биогеохимический цикл серы и влияние на него деятельности человека. СКОПЕ / Ред. Иванов М.В., Френей Дж. Р. М.: Наука, 1983. С. 302-375.

3. Глинка Н.Л. Общая химия. Ленинград. Химия, 1981. 720 с.

4. Гриненко В.А., Гриненко Л.Н. Геохимия изотопов серы // М.: Наука. 1974.

5. Гриненко В.А., Иванов М.В. Основные реакции глобального биогеохимического цикла серы // Глобальный биогеохимический цикл серы и влияние на него деятельности человека / Ред. Иванов М.В., Френей Дж.Р. М.: Наука. 1983. С. 12-28.

6. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие // Микробиология. 1999. Т. 68. Вып. 5. С. 579-599.

7. Иванов М.В. Применение изотопов для изучения процесса редукции сульфатов в озере Беловодь // Микробиология. 1956. Т. 25. Вып. 3. С. 305-309.

8. Иванов М.В. Роль микроорганизмов в генезисе месторождений самородной серы. М. Наука, 1964. 368с.

9. Иванов М.В. Распространение и геохимическая деятельность бактерий в осадках океана // Химия океана. М.: Наука, 1979, С. 312349.

10. Иванов М.В., Леин А.Ю., Беляев С.С. и др. Геохимическая деятельность сульфатредуцирующих бактерий в донных отложениях северо-западной части Индийского океана // Геохимия. 1980. N 8. С. 1238-1249.

11. Иванов М.В., Леин А.Ю., Карначук О.В. Новые доказательства биогенной природы сероводорода в Черном море // Геохимия. 1992. N8. С. 1186-1194.

12. Иванов М.В., Леин А.Ю., Кашпарова Е.В. Интенсивность образования и диагентического преобразования восстановленных соединений серы в осадках Тихого океана // Биогеохимия диагенеза осадков океана. М: Наука, 1976. С. 179-186.

13. Иванов М.В., Каравайко Г.И. Геологическая микробиология // Микробиология. 2004. Т.73. С. 581-597.

14. Карначук О.В. Влияние шестивалентного хрома на образование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями // Микробиология. 1995. Т.64. N 3. С. 315-319.

15. Карначук О.В., Максимова Н.М., Романенко И.В., Ванина Ю.Н. Мобилизация ортофосфата в подземных водах палеогеновых отложений Обь-Томского междуречья. Труды II совещания

16. Экология пойм Сибирских рек и Арктики». 22-26 ноябр. 2000г. Томск: SST, 2000. С. 154-160.

17. Карначук О.В., Намсараев Б.Б. Иванов М.В. Современные процессы восстановления сульфатов в осадках бухты Кратерной // Биология моря. 1989. N3, С. 59-65.

18. Карначук О.В., Намсараев Б.Б., Иванов М.В., Борзенков И.А. Процесс бактериальной сульфатредукции и его роль в разложении органического вещества в осадках прибрежных районов Японского моря // Микробиология. 1990, Т. 59. Вып. 1. С. 140-147.

19. Карначук О.В., Парначев В.П. Биогеохимическая характеристика водной толщи озера Шира / Вопросы географии Сибири. Вып.24. Томск: Изд-во ТГУ, 2001. С. 172-182.

20. Карначук О.В., Пименов Н.В., Юсупов С.К., Франк Ю.А. Пухакка Я.А., Иванов М.В. Распределение, разнообразие и активность сульфатредуцирующих бактерий в водной толще озера Гек-Гель, Азербайджан//Микробиология. 2006. N 1. С. 1-9.

21. Кузнецов С.И., Иванов М.В., Ляликова Н.Н. Введение в геологическую микробиологию. М. Изд-во Академии наук СССР, 1962.239 с.

22. Леин А. Ю. Аутигенное карбонатообразование в океане // Литология и полезные ископаемые. 2004. N 1. С. 3-35.

23. Надсон Г.А. Микроорганизмы как геологические деятели. СПб. Тип-я Т. П. Сайкина, 1903. 98с.

24. Намсараев Б.Б., Лухиойо М., Бейота М., Миравет М.Е., Мицкевич И.Н., Карначук О.В., Иванов М.В. Участие микроорганизмов в деструкции органического вещества в донных осадках залива Батабано (Куба) // Микробиология. 1990. Т. 59. Вып. 5. С. 903-911.

25. Новиков Ю.В., Ласточкина К.О., Болдина З.Н. Методы исследования качества воды водоемов. М. Медицина, 1990. 105с.

26. Пикута Е.В., Жилина Т.Н., Заварзин Г.А., Кострикина Н.А., Осипов Г.А. Рейни Ф.А. Desulfonatronum lacustre gen. nov ., sp. nov. новая алкалофильная сульфатвосстанавливающая бактерия, использующая этанол//Микробиология. 1998. Т. 67. С. 123-131.

27. Пименов Н.В., Русанов И.И., Карначук О.В., Рогозин Д.Ю., Брянцева И.А., Лунина О.Н., Юсупов С.К., Парначев В.В., Иванов М.В. Микробные процессы циклов углерода и серы в озере Шира (Хакасия) //Микробиология. 2003. Т. 72. N2. С. 259-267.

28. Пушева М.А., Питрюк А.В., Берестовская Ю.Ю. Особенности метаболизма экстремально алкалофильных сульфатредуцирующих бактерий // Микробиология. 1999. Т. 68. N 5. С. 657-663.

29. Сазонова И. В. Результаты изучения пластовой микрофлоры нефтяных месторождений Куйбышевской области // Труды Ин-та микробиологии. АН СССР, 1961. Вып. 9. «Геологическая деятельность микроорганизмов».

30. Унифицированные методы анализа вод / Ред. Лурье Ю.Ю. М: Химия, 1973. 195с.

31. Френей Дж., Уильяме Ч. Круговорот серы в почве // Глобальный биогеохимический цикл серы и влияние на него деятельности человека / Ред. Иванов М.В., Френей Дж.Р. М.: Наука, 1983. С. 114153.

32. Abd-el-Malek Y., Rizk S.G. Bacterial sulfate reduction and the development of alkalinity. II Laboratory experiments with soils // J. Appl. Bacteriol. 1963. V. 26. P. 14-19.

33. Akasaka H., Izawa Т., Ueki K., Ueki A. Phylogeny of numerically abundant culturable anaerobic bacteria associated with degradatioin of rice plant residue in Japanese paddy field soil // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. V. 43. P. 149-161.

34. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389-3402.

35. Amann, R.I., Stahl, D.A. Dual staining of natural bacterioplankton with 4',6-diamino-2-phenylindole and fluorescent oligonucleotide probes targeting kingdom-level 16S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2158-2163.

36. Baas-Becking, L.G.M., Moore, D. Biogenic sulfides // Econ. Geol. V. 56. P. 259-272.

37. Baldi F., Pepi M., Burrini D., Kniewald G., Scali D., Lanciotti E. Dissolution of barium from barite in sewage sludges and cultures of Desulfovibrio desulfuricans II Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 42. P. 2398-2404.

38. Banks D., Parnachev V.P., Frengstad В., Holden W., Karnachuk O.V., Vedernikov A.A. The evolution of alkaline, saline ground- and surface waters in the southern Siberian steppes // Appl. Geochem. 2004. V. 19. P. 1905-1926.

39. Bartlett R.J., James B.R. Behavior of chromium in soils: III. Oxidation // J. Environ. Qual. 1979. V. 8. P. 31-35.

40. Barton L.L., Plunkett R.M., Thomson В. M. Reduction of metals and nonessential elements by anaerobes // Biochemistry and physiology of anaerobic bacteria / Eds. Ljungdahl L.G. et al. New York: Springer-Verlag, 2003. P. 220-235.

41. Basso 0., Caumette P., Magot M. Desulfovibrio putealis sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium isolated from a deep subsurface aquifer // IJSEM. 2005. V. 55. P. 101-104.

42. Bastin E.S. A hypothesis of bacterial influence in the genesis of certain sulfide ores //J. Geol. 1926. V. 34. P. 773-792.

43. Bechtel A., Pervaz M., Puttmann W. Role of organic matter and sulphate-reducing bacteria for metal sulphide precipitation in the Bahloul Formation at the Bou Grine Zn/Pb deposit (Tunisia) // Chemical Geology. 1998. V. 144. P. 1-21.

44. Bender C. L., Cooksey D. A. Molecular cloning copper resistance genes from Pseudomonas syringae pv. Tomato II J. Bacteriol. 1987. V. 165. P. 470-474.

45. Benner S.G., Blowes D.W., Ptacek C.J. A full-scale porous reactive wall fro prevention of acid mine drainage // Ground water monitoring and remediation, fall vol. 17(4). P. 99-107.

46. Berner R.A. Iron sulfides formed from aqueous solution at low temperatures and atmospheric pressure // J. Geol. 1964. V. 72. P. 293-306.

47. Berner R.A. Sedimentary pyrite formation // Am. J. Sci. 1970. V. 268. P. 1-23.

48. Berner R.A. Bural of organic carbon and pyrite sulfur in the modern ocean: Its geochemical and environmental significance // Am. J. Sci. 1982. V. 278. P. 451-473.

49. Berner R.A. Sedimentary pyrite formation: an update // Geochim. Cosmochim. Acta. 1984. V. 48. P. 605-615.

50. Blodau Ch. A review of acidity generation and consumption in acidic coal mine lakes and their watersheds // Sci. Total Environ. V. 369. P. 307-332.

51. Blowes D.W., Ptacek C.J., Benner S.G., McRae C.W.T., Puis R.W. Treatment of dissolved metals and nutrients using permeable reactive barriers//J. Contamin. Hydrol. 2002. V. 45. P. 120-135.

52. Blowes D.W., Ptacek C.J., Weisener C.G. The geochemistry of acid mine drainage // Treatise on Geochemistry. V. 9. P. 149-204.

53. Boetius A., Ravenschlag K., Schubert C.J., Rickert D., Widdel F., Giesecke A., Amann R., Jorgensen B.B., Witte U., Pfannkuche О. A marine microbial comsortium apperentely mediating anaerobic oxidation of methane // Nature. 2000. V. 407. P. 623-626.

54. Bohrmann G., Greinert J., Suess E., Torres M. Authigenic carbonates from the Cascada subduction zone and their relation to gas hydrate stability // Geology. 1998. V. 26. P. 647-650.

55. Bolliger Ch., Schroth M.H., Bernasconi S.M., Kleikemper J., Zeyer J.

56. Sulfur isotope fractionation during microbial sulfate reduction by toluene-degrading bacteria // Geochim. Cosmochim. Acta 2001. V. 65. P. 32893298

57. Bolze C.E., Malone P.G., Smith M.J. Microbial mobilization of barite // Chem. Geol. 1974. V. 13. P. 141-146.

58. Brown N.L., Barrett S.R., Camakaris J., Lee B.T.O., Rouch D.A. Molecular genetics and transport analysis of the copper resistance determinant (pco) from Escherichia coli plasmid pRJ1004 // Mol. Microbiol. 1995. V. 17. P. 1153-1166.

59. Canfield D.E., Thamdrup B. The production of 34S-depleted sulfide during bacterial disproportionation of elemental sulfur // Science. 1994. V. 266. P. 1973-1975.

60. Cha J.-S., Cooksey D.A. Copper resistance in Psedwnonas syringae mediated by periplasmic and membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8915-8919.

61. Chambers L.A., Trudinger P.A., Smith J.M. Fractionation of sulphur isotopes by continuous cultures of Desulfovibrio desulfuricans II Canad. J. Microbiol. 1975. V. 21. N 10. P. 1602-1607.

62. Chan C.S., De Stasio G., Welch S.A., Girasole M., Frazer B.H., Nesterova M.V., Fakra S., Banfiled J.F. Microbial polysaccharides template assembly of nanocrystal fibers // Science. 2004. V. 303. P. 1656-1658.

63. Chang I.S., Shin P.K., Kim B.H. Biological treatment of acid mine drainage under sulphate-reducing conditions with solid waste materials as substrate // Wat. Res. 2000. V. 34. P. 1269-1277.

64. Chapelle F.H., Lovley D.R. Competitive exclusion of sulfate reduction by Fe (IH)-reducing bacteria: a mechanism for producing discrete zones of high-iron ground water // Ground Water. 1992. V. 30. P. 29-36.

65. Chin K-J., Hahn D., Hengstmann U., Liesack W., Janssen P.H. Characterization and identification of numerically abundant culturable bacteria from the anoxic bulk soil of rice paddy microcosms // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5042-5049.

66. Christensen В., Laake M., Lien T. Treatment of acid mine water by sulfate- reducing bacteria: results from a bench scale experiment // Wat. Res. 1996. V.30. P. 1617-1624.

67. Cline J.D. Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters//Limnol. Oceanogr. 1969. V. 14. P. 454-458.

68. Coombs J.M., Barkay T. New findings on evolution of metal homeostasis genes: evidence from comparative genome analysis of Bacteria and Archaea//Appl. Environ. Microbiol. V. 71. P. 7083-7091.

69. Cowling S. J., Gardner M. J., Hunt D. Т. E. Removal of heavy metals from sewage by sulphide precipitation: thermodynamic calculation and tests on a pilot scale anaerobic reactor // Environ. Sci. Technol. 1992. V. 13. P. 281-291.

70. Cypionka H. Solute transport and cell energetics // Sulfate-Reducing Bacteria / Ed. Barton L.L. New York: Plenum Press, 1995. P. 151-184.

71. Cypionka H. Oxygen respiration by desulfovibrio species // Annu. Rev. Microbiol. 2000. V. 54. P. 827-848.

72. Davidson C.F. The origin of some strata-bound sulfide ore deposits // Econ.Geol. 1962a. V. 57. P. 265-274.

73. Davidson C.F. Further remarks on biogenic sulfides // Econ. Geol. 1962b. V. 57. P. 1134-1157.

74. DeLong E.F. Resolving a methane mystery //Nature. 2000. V. 407. P. 577579.

75. Dvorak D.H., Hedin R.S., Edenborn H.M., Mclntyre P.E. Treatment of metal-contaminated water using bacterial sulfate reduction: results from pilot-scale reactors // Biotechnol. Bioeng. 1992. V. 40. P. 609-616.

76. Eger P., Lapakko K. Nickel and copper removal from mine drainage by a natural wetland// Mine Drainage and Surface Mine Reclamation IC9183, Bureau of Mines, US Department of the Interior, Pittsburgh, PA. 1988. V. l.P. 301-309.

77. Ehrlich H. L. Geomicrobiology. New York. Marcel Dekker, 1995.

78. Fortin D., Davis В., Beveridge T.J. Role of Thiobacillus and sulfatereducing bacteria in iron biocycling in oxic and acidic mine tailings // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. V. 21. P. 11-24.

79. Fortin D., Roy M., Rioux J., Thibault P. Occurrence of sulfate-reducing bacteria under a wide range of physico-chemical conditions in Au and Cu-Zn mine tailings // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 33. P. 197-208.

80. Frund C., Cohen Y. Diurnal cycles of sulfate reduction under oxic conditions in cyanobacterial mats // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 70-77.

81. Fude L., Harris В., Urrutia M. M., Beveridge T. J. Reduction of Cr (VI) by a consortium of sulfate-reducing bacteria (SRB-III) // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. P. 1525

82. Garcia Jr. 0., Bigham J. M., Tuovinen О. H. Oxidation of galena by Thiobacillus ferrooxidans and Thiobacillus thiooxidans II Can. J. Microbiol. 1995. V. 41. P. 508-514.

83. Garrity G.M., Bell J.A., Lilburn T.G. Taxonomic outline of the prokaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition., Release 5.O., New York: Springer-Verlag,. DOI: 10.1007ftergeysoutline200405.

84. Glombitza F. Treatment of acid lignite mine flooding water by means of microbial sulfate reduction // Waste Manag. 2001. V. 21. P. 197-203.

85. Goldhaber M.B., Kaplan I.R. The sulfur cycle // The Sea, marine chemistry, V. 5 / Ed. Goldberg E.D. New York: Wiley, 1974, P. 569-655.

86. Grabowski A., Nercessian O, Fayolle F., Blanchet D., Jeanthon Ch. Microbial diversity in production waters of a low-temperature biodegraded oil reservoir//FEMS Microbiol. Ecol. 2005. V. 54. P. 427-443.

87. Habicht К. S. and Canfield D. E. Isotope fractionation by sulfate-reducing natural populations and the isotopic composition of sulfide in marine sediments // Geology. 2001. V. 29. P. 555-558.

88. Hammack R.W., Edenborn H. M., Dvorak D. H. Treatment of water from an open-pit copper mine using biogenic sulfide and limestone: a feasibility study // Wat. Res. 1994. V. 28. P. 2321-2329.

89. Hao Y., Dick W.A. Potential inhibition of acid formation in pyritic environments using calcium sulfite byproduct // Environ. Sci. Technol. 2000. V. 34. P. 2288-2292.

90. Hard B.C., Friedrich S., Babel W. Bioremediation of acid mine water using facultatively methylotrophic metal-tolerant sulfate-reducing bacteria // Microbiol. Res. 1997. V. 152. P. 65-73.

91. Hardy KG Purification of bacterial plasmids // Plasmids: a practical approach / Ed. Hardy K.G. Oxford: IRL Press, 1987. P. 1-6.

92. Heywood B.R., Bazylinski D.A., Garratt-Reed A., Mann S., Frankel R.B. Controlled biosynthesis of greigite (Fe3S4) in magnetotactic bacteria // Naturwissenschaften. 1999. 77 S. 536-538.

93. Hippe H., Vainshtein М., Gogotova G.I., Stackebrandt E. Reclassification of Desulfobacterium macestii as Desulfomicrobium macestii comb.nov. // IJSEM. 2003. V. 53. P. 1127-1130.

94. Howarth R.W. Pyrite: Its rapid formation in a salt marsh and itsimportance in to ecosystem metabolism // Science. 1979. V. 203. P. 49-51.

95. Howarth R.W., Giblin A.E. Sulfate reduction in the salt marshes at Sapelo Island, Georgia // Limnol. Oceanogr. 1983. V. 28. P. 70-82.

96. Howarth R.W., Merkel S. Pyrite formation and the measurement of sulfate reduction in salt marsh sediments // Limnol. Oceanogr. 1984. V.29. P. 598-608.

97. Howarth R.W., Teal J.M. Sulfate reduction in a New England salt marsh // Limnol. Oceanogr. 1979. V. 24. P. 999-1013.

98. Hristova K.R., Май M., Zheng D., Aminov R.I., Mackie R.I., Gaskins H.R., Raskin L. Desulfotomaculum genus- and subgenus-specific 16S rRNA hybridization probes for environmental studies // Environ. Microbiol. 2000. V. 2. P. 143-159.

99. Huisman J.L., Schouten G., Schultz C. Biologically produced sulphide for purification of process streams, effluent treatment and recovery of metals in the metal and mining industry// Hydrometallurgy. 2006. V. 83 P. 106113.

100. Ingvorsen K., Zehnder A. J. В., Jorgensen В. B. Kinetics of sulfate and acetate uptake by Desulfobacter postgatei II Appl. Environ. Microbiol. 1984. V.47. P. 403-408.

101. Isaksen M.F., Teske A. Desulforhopalus vacuolatus gen nov., sp. nov., a new moderately psychrophilic sulfate-reducing bacterium. with gas vacuoles isolated from a temperature estuary // Arch.Microbiol. 1996. V. 166. P. 160-168.

102. Itoh Т., Suzuki К., Sanchez P.C., Nakase Т. Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1157-1163.

103. Jalali K., Baldwin S. The role of sulphate reducing bacteria in copper removal from aqueous sulphate solutions // Wat. Res. 2000. V.34. P. 797806.

104. Jones H.E., Trudinger P.A., Chambers L.A., Pylotis N.A. Metal accumulation with particular reference to dissimilatory sulphate-reducing bacteria // Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie. 1976. 16. S. 425-435.

105. Jonkers H.M., Koh I.O., Behrend P., Muyzer G., de Beer D. Aerobic organic carbon mineralization by sulfate-reducing bacteria in the oxygen-saturated photic zone of a hypersaline microbial mat // Microb Ecol. 2005 V. 49. P. 291-300.

106. Johnson B. Biological removal of sulfurous compounds from inorganic wastewaters // Environmental technologies to treat sulfur pollution: principles and engineering / Ed. Lens P.N.L., Hulshoff L. London: IWA Publishing, 2000. P. 175-205.

107. Johnson D.B., Hallberg K.B. Acid mine drainage remediation options: a review// Sci. Total Environ. 2005. V. 338. P. 3-14.

108. Jorgensen B.B. The sulfur cycle of a coastal marine sediments (Limfjoden, Denmark) // Limnol. Oceanogr. 1977. V. 22. P. 814-832.

109. Jorgensen B.B. Mineralization of organic matter in the sea bed the role of sulfate reduction // Nature. 1982. V. 296. P. 643-645.

110. Jorgensen B.B. A thiosulfate shunt in the sulfur cycle of marine sediments // Science. 1990. V. 249. P. 152-154.

111. Jorgensen B.B., Bak F. Pathways and microbiology of thiosulfate transformations and sulfate reduction in a marine sediment (Kattegat, Denmark) // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 847-856.

112. Kaksonen A.H., Spring S., Schumann P., Kroppenstedt R.M. Puhakka J.A. Desulfovirgula thermocuniculi gen nov., sp. nov., a thermophilic sulfate-reducer isolated from a geothermal undergroundnmine in Japan. IJSM (in press)

113. Kalin M., Cairns J., McCready R. Ecological engineering methods for acid-mine drainage treatment of coal wastes // Resour. Conserv. Recycl. 1991. V. 5. P. 265-275.

114. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Tuovinen O.H. Growth of sulfate-reducing bacteria with solid-phase electron acceptors // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 482-486.

115. Karnachuk O.V., Kurochkina S.Y., Nicomrat D., Frank Yu.A., Ivasenko D.A., Phyllipenko E.A, Tuovinen O.H. Copper resistance in Desulfovibrio strain R2 // Antonie van Leeuwenhoek. 2003. V. 83. P. 99-106.

116. Kaplan I.R., Rittenberg S.C. Microbiological fractionation of sulphur isotopes // J. Gen. Microbiol. 1964. V. 34. P. 195-212.

117. Katsutaka N. Biological metal removal from mine drainage // Inf. Circ. N9183 Bur. Mines. US Dept. Interior. 1988. P. 274-278.

118. Koizumi Y., Kojima H., Fukui M. Potential sulfur metabolisms and associated bacteria within anoxic surface sediment from saline meromictic Lake Kaiike (Japan) // FEMS Microbiol. Ecol. V. 52. 2005. P. 297-305.

119. Krekeler D., Sigalevich P., Teske A., Cypionka H., Cohen Y. A sulfate-reducing bacterium from the oxic layer of a microbial mat from Solar Lake (Sinai), Desulfovibrio oxyclinae sp.nov. // Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 369-375.

120. Kusel K., Roth U., Trinkwalter Т., Peiffer S. Effect of pH on the anaerobic microbial cycling of sulfur in mining-impacted freshwater lake sediments Environmental and Experimental Botany // 2001. V. 46. P. 213-223.

121. Labrenz M., Banfield J. F. Sulfate-reducing bacteria-dominated biofilms that precipitate ZnS in a subsurface circumneutral-pH mine drainage system // Microb. Ecol. 2004. V. 47. P. 205 217.

122. Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Eds. Stackebrandt E. Goodfellow M. New York : John Wiley and Sons, 1991. P. 115-175.

123. Lennie A.R., Redfern S.A.T., Schofield P.F., Vaughan D.J. Synthesis and Rietveld crystal structure refinement of mackinawite, tetragonal FeS // Mineral. Mag. 1995. V. 59. P. 677-683.

124. Lloyd J. Microbial reduction of metals and radionuclides // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27. P. 411-425.

125. Loubinoux J., Bronowicki J.-P., Pereira I. A. C., Mougenel J.-L., Le Faou A. E. Sulfate-reducing bacteria in human feces and their association with inflammatory bowel diseases // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 40. P. 107-112.

126. Lovley D. R. Microbial Fe (III) reduction in subsurface environments. FEMS Microbiol. Rev. 1997. V.20. P. 305-313.

127. Lovley D. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) Reduction // Advances in Microbial Physiology. 2004. V. 49. P. 219-286.

128. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V.193. P. 265-275.

129. Ludwig R.D., McGregor R.G., Blowes D.W., Benner S.G., Mountjoy К. A pearmeable reactive barrier for treatment of dissolved metals // Ground Water. 2002. V. 40. P. 59-66.

130. Luther G.I. III. Pyrite synthesis via polysulphide compounds // Geochim. Cosmochim. Acta. 1991. V. 55. P. 2839-2849.

131. MacCready R. G. L., Bland C. J., Gonzales D. E. Preliminary studies on the chemical, physical and biological stability of (Ba,Ra)SC>4 precipitates // Hydrometry. 1980. V.5. P. 109-116.

132. Mandal A.K., Cheung W.D., Arguello J.M. Characterization of a thermophilic P-type Ag+/Cu+-ATPase from the extremophile Archaeoglobus fulgidus //J. Biol. Chem. 2002. V.277. P. 7201-7208.

133. Mann S., Sparks N.H.C., Frankel R.B., Bazylinski D.A., Jannascch H.W. Biomineralization of ferrimegnetic greigite (Fe3S4) and iron pyrite in a magnetotactic bacterium //Nature. 1990. V. 343. P. 258-261.

134. Marschall C., Frenzel P., Cypionka H. Influence of oxygen on sulfate reduction and growth of sulfate-reducing bacteria // Arch.Microbiol. 1993. V. 159. P. 168-173.

135. Matsui G.Y., Ringelberg D.B., Lovell C.R. Sulfate-reducing bacteria in tubes constructed by the marine infaunal polychaete Diopatra cuprea II Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 7053-7065.

136. Mellano M.A., Cooksey D.A. Nucleotide sequence and organization of copper resistance genes from Pseudomonas syringae pv. Tomato И J. Bacterid. 1988. V. 170. P. 2879-2883.

137. Michel C., Brugna M., Aubert C., Bernadac A., Bruschi M. Enzymatic reduction of chromate: comparative studies using sulfate-reducing bacteria. Key role of polyheme cytochromes с and hydrogenases // Appl.

138. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 55. P. 95-100.

139. Miller L. P. Stimulation of hydrogen sulfide productioin by sulfate reducing bacteria // Boyce Thompson Inst. Contr. 1949. V. 15. P. 467-474.

140. Miller L. P. Formation of metal sulphides through the activities of sulphate-reducing bacteria // Contr. Boyce Thomson Inst. 1950. V. 16. P. 85-89.

141. Moore T.S., Murray R.W., kurtz A.C., Schrag D.P. Anaerobic methane oxidation and the formation of dolomite // Earth and Planetary Science Letters. 2004. V. 30. P. 141-154.

142. Nakagawa Т., Hanada S., Maruyama A., Marumo K., Urabe Т., Fukui M. Destribution and diversity of thermophilic sulfate-reducing bacteria within a Cu-Pb-Zn mine (Toyoha, Japan)//FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 41. P. 199-209.

143. Nakagawa Т., Nakagawa S., Inagaki F., Takai K., Horikoshi K. Phylogenetic diversity of sulfate-reducing prokaryotes in active deep-sea hydrothermal vent chimney structures // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 232. P. 145-152.

144. Nakagawa Т., Sato S., Yamomoto Y., Fukui M. Successive changes in community structure of an ethylbenzene-degrading sulfate-reducing consortium //Water Research. 2002. V. 36. P. 2813-2823.

145. Neal A.L., Techkarnjanaruk S., McCready D., Peyton B.M., Greesey G.G. Iron sulfides and sulfur species produced at hematite surface in the pre sence of sulfate-reducing bacteria // Geochim.Cosmochim.Acta. 2001. V. 65. N2. P. 223-235.

146. Neretin L. N., Bottcher M. E., Grinenko V. A. (2003) Sulfur isotope geochemistry of the Black Sea water column // Chem. Geol. 2003. V. 200. P. 59-69.

147. Nevin K.P., Finneran K.T., Lovley D.R. Microorganisms associated with uranium bioremediation in a high-salinity subsurface sediment // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 3672-3675.

148. Nieto J.J., Ventosa A., Montero C.G., Ruiz-Berraquero F. Toxicity of heavy metals to Archaebacterial Halococci // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 11. P. 116-120.

149. O'Flaherty V., Mahony Th., O'Kennedy R., Colleran E. Effect of pH on growth and sulphide toxicity threshholds of a range of methanogenic, syntrophic and sulphate-reducing bacteria // Process Biochemistry. 1998. V. 33. P. 555-569.

150. Oremland R.S. The biogeochemistry of methanogenic bacteria // Biology of Anaerobic Microorganisms / Ed. Zehnder A.J.B. New York: John Wiley & Sons, 1988. P. 405-447.

151. Oremland R.S., Polcin S. Methanogenesis and Sulfate Reduction: Competitive and Noncompetitive Substrates in Estuarine Sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 44. P. 1270-1276.

152. Orphan V.J., House C.H., Hinrichs K.-U., McKeegan K.D., DeLong E.F. Methane-consuming Archaea revealed by directely coupled isotopic and phylogenetic analysis //Science. 2001. V. 293. P. 484-487.

153. Pacha J., Galimska-Stypa R. Odaziatywanie zwiazkow troj-i szesciowartosciowego chromu na wybrane bakteria Gram(-) i Gram(+) //Acta biol. siles. Ecotoksykol.chromu. 1988. V. 9. P. 24-29.

154. Peckmann J., Reimer A., Luth U., Luth C., Hansen B.T., Heincke C., Hoefs J., Reitner J. Methane-derived carbonates and authigenic pyrite from the northwestern Black Sea // Mar. Geol. 2001. V.177. P. 129-150.

155. Plough H., Kiihl M. Buchholz-Cleven B. Jorgensen В. B. Anoxic aggregates—an ephemeral phenomenon in the pelagic environment // Aquatic Microbial Ecology. 1997. V. 13. P. 285-294.

156. Postfai M., Buseck P.R., Bazylinski D.A., Frankel R.B. Iron sulfides from magnetotactic bacteria: structure, composition, and phase transitions // American Mineralogist. 1998. V. 83. P. 1469-1481.

157. Postgate J.R. The sulphate-reducing bacteria. Cambridge, England: Cambridge University Press. 1984.

158. Pyzik A.J., Sommer S.E. Sedimentory iron monosulfides: kinetics and mechanism of formation // Geochim. Cosmochim. Acta, 1981. V. 45. P. 687-698.

159. Ravenschlag К., Sahm К., Knoblauch Ch., Jorgensen B.B., Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine arctic sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3592-3602.

160. Rees С. E. A steady-state model for sulphur isotope fractionation in bacterial reduction processes // Geochim. Cosmochim. Acta. 1973. V. 37. P. 1141-1162.

161. Reeburgh W.S. Anaerobic methane oxidation: Rate depth distribution in Skan Bay sediments // Earth Planet. Sci. Lett. 1980. V. 47. P. 345-352.

162. Rensing Ch., Grass G. Escherichia coli mechanisms of copper homeostasis in a changing environment // FEMS Microbiol. Rev. 2003. V. 27. P. 197-213.

163. Rickard D. The microbiological formation of iron sulphides // Stockholm Contributions in Geology. 1969. V. 20. P. 49-66.

164. Rickard D. Kinetics and mechanism of pyrite formation at low temperatures//Am. J. Sci. 1975. V. 275. P. 636-652.

165. Rickard D. Kinetics of pyrite formation by the H2S oxidation of iron (II) monosulfide in aqueous solutions between 25 and 125 degrees C: the rate equation// Geochim. Cosmochim. Acta. 1997. V. 61. P. 115- 134.

166. Rickard D., Luther G.W., 1997. Kinetics of pyrite formation by the H2S oxidation of iron(II) monosulfide in aqueous solutions between 25 and 125 degrees C: the mechanism // Geochim. Cosmochim. Acta. 1997. V. 61. P. 135-147.

167. Rickard D., Morse J.W. Acid volatile sulfide (AVS) //Marine Chemistry. 2005. V. 97. P. 141-197.

168. Robinson J.A., Tiedje J.M. Competition between sulfate-reducing and methanogenis bacteria for H2 under resting and growing conditions // Arch. Microbiol. 1984. V. 137. P. 26-32.

169. Romer R., Schwartz W. Geomikrobiologische untersuchungen V. Verwertung von sulfatmineralien und schwermetall-toleranz bei desulfurizierern // Z. Allg. Microbiol. 1965. V. 5. P. 122-135.

170. Rowley M. V., Warkentin D. D., Sicotte V. Site demonstration of biosulfide process at the former Britannia Mine // Proceedings of the Fourth International Conference on Acid Rock Drainage, Vancouver, ВС, Canada. 1997.

171. Sahm K., Knoblauch Ch., Amann R. Phyliogenetic affiliation and quantification of psychrophilic sulfate-reducing isolates in marine arctic sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3976-3981.

172. Sambrook J. Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

173. Sani R.K., Peyton B.M., Brown L.T. Copper-induced inhibition of growth of Desulfovibrio desulfuricans G20: assessment of its toxicity and correlation with those of zinc and lead // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 4765-4772.

174. Sass A. M., Eschemann A., Kuhl M., Thar R., Sass H., Cypionka H. Growth and chemosensory behavior of sulfate-reducing bacteria in oxygen- sulfide gradient // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. V. 40. P. 47-54.

175. Sass H., Overmann J., Rutters H., Babenzien H.D., Cypionka H. Desulfosporomusa polytropa gen. nov., sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium from sediments of an oligotrophic lake // Arch Microbiol. 2004. V. 182. P. 204-211.

176. Sass A., Rutters H., Cypionka H., Sass H. Desulfobulbus mediterraneus sp. nov., a sulfate-reducing bacterium growing on mono- and disaccharides//Arch. Microbiol. 2002. V.177. P. 468-474.

177. Schidlowski M. Evolution of the sulphur cycle in the Precambrian // Evolution of the global biogeochemical sulfur cycle / Ed. Ivanov M.V. Moscow: Nauka, 1989. P. 13-21.

178. Schonheit P., Kristjansson J.K., Thauer R.K. Kinetic mechanism for the ability of sulfate reducers to outcompete methanogens for hydrogen and acetate //Arch.Microbiol. 1982. V. 132. P. 285-288.

179. Shen Y., Buick R. The antiquity of microbial sulfate reduction // Earth-Science Reviews. 2004. V. 64. P. 243-277.

180. Shen Y., Buick R., Canfield D. E. Isotopic evidence for microbial sulphate reduction in the early Archaean era // Nature. 2001. V.410. P.77-81.

181. Siebenthal C.E. Origin of the lead and zink deposits of the Joplin region // U.S. Geological Survey Bulletin. 1915. V. 606. 283 p.

182. Skyring G. W. Sulfate reduction in coastal ecosystems // Geomicrobiol. J. 1987. V. 5. P.295-374.

183. Skyring G.W., Lupton F.S. Anaerobic microbial processes in peritidal and subtidal sediments of Hamelin Pool (Shark Bay, Western Australia) // Annual Report, Baas Becking Geomicrobiological Laboratory. 1984. P. 312.

184. Solioz M., Stoyanov J. V. Copper homeostasis in Enterococcus hirae II FEMS Microbiol. Rev. 2003. V.27. P. 183-195.

185. Clostridium psychrophilum sp. nov. and reclassification of Clostridium laramiense as Clostridium estertheticum subsp. laramiense subsp. nov. // IJSEM. 2003. V. 53. P. 1019-1029.

186. Stahl D.A., Fishbain S., Klein M., Baker B.J., Wagner M. Origins and diversification of sulfate-respiring microorganisms // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. V. 81. P. 189-195.

187. Stetter K.O. Archaeoglobus fulgidus gen.nov.,sp.nov., a new taxon of extremely thermophilic Archaebacteria // Syst.Appl.Microbiol. 1988. V. 10. P. 172-173.

188. Stetter K., Lauerer G., Thomm M., Neuner A. Isolation of extremely thermophilic sulfate reducers: evidence for a novel branch of archaebacteria// Science. 1987. V. 236. P. 822-824.

189. Tebo В. M., Obraztsova A.Ya. Sulfate-reducing bacterium grows with Cr (VI), U (VI), Mn (IV) and Fe (III) as electron acceptors // FEMS Microbiol. Lett. 1998. V.162. P. 193-198.

190. Temple K. L., LeRoux N. Syngenesis of sulfide ores: Desorption of absorbed metal ions and their precipitation as sulfides // Econ. Geol. 1964. V. 59. P. 647-655.

191. Thiel V., Peckmann J., Richnow H. H., Luth U., Reitner J., Michaelis W. Molecular signals for anaerobic methane oxidation in Black Sea seep carbonates and microbial mat // Mar. Chem. 2001. V. 73. P. 91-112.

192. Thode H. G. (1991) Sulphur isotopes in nature and the environment: An overview // Stable Isotopes in the Assessment of Natural andAnthropogenic Sulphur in the Environment / Ed. Krouse H. R. Grinenko V.A. John Wiley & Sons Ltd , 1991. P. 1-26.

193. Thode H.G., Kleerekoper H., McElcheran D. Isotope fractionation in the bacterial reduction of sulphate //Research. 1951. V. 4. P. 581-582.

194. Thode-Anderson S., Jorgensen B.B. Sulfate reduction and the formation of 35S-labeled FeS, FeS2, and So in coastal marine sediments // Limnol. Oceanogr. 1989. V. 34. N5. P. 793-806.

195. Thomsen T.R., Finster K., Ramsing N.B. Biogeochemical and molecular signatures of anaerobic methane oxidation in a marine sediment // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1646-1656.

196. Trajanovska S., Britz M. L., Bhave M. Detection of heavy metal ion resistance genes in Gram-positive and Gram-negative bacteria isolated from a lead-contaminated site // Biodegradation. 1997. V.8. P. 113-124.

197. Treude Т., Niggemann J., Kallmeyer J., Wintersteller P., Schubert C.J., Boetius A., Jorgensen B.B. Anaerobic oxidation of methane and sulfate reduction along the Chilean continental margin // Geochim. Cosmochim. Acta. 2005. V. 69. P. 2767-2779.

198. Trinkerl M., Breunig A., Schauder R., Konig H. Desulfovibrio termitidis sp. nov., a carbohydrate-degrading sulfate-reducing bacterium from the hindgut of a termite // System. Appl. Microbiol. 1990. V.13. P. 372-377.

199. Vails M., de Lorenzo V. Exploiting the genetic and biochemical capacities of bacteria for the remediation of heavy metal pollution // FEMS Microbiol. Rev. 2002. V. 26. P. 327-338.

200. Vaughan D.J., Ridout M.S. Mossbauer studies of some sulfide minerals // J. Inorg. Chem. 1971. V. 33. P. 741-746.

201. Wadham J.L., Bottrell S., Tranter M., Raiswell R. Stable isotope evidence for microbial sulphate reduction at the bed of a polythermal high Arctic glacier//Earth and Planetary Sci. Lett. 2004. V. 219. P. 341-355.

202. Wagner M., Loy A., klein M., Lee N., Ramsing N.B., Stahl D.A., Friedrich M.W. Functional marker genes for identification of sulfate-reducing prokaryotes //Methods in Enzimology. 2005. V. 397, P. 469-489.

203. Wagner M.A., Roger J., Flax J.L., Brusseau G.A., Stahl D.A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration //J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 2975-2982.

204. Ward D.M., Winfrey M.R. Interaction between methanogenic and sulfate-reducing bacteria in sediments // Advances in aquatic microbiology. V. 4. London: Academic Press Inc., 1985. P. 141-179.

205. Warren J.K. Evaporites, brines and base metals: low-temperature ore emplacement controlling by evaporite diagenesis // Aus. J. Earth Sci. 2000. V. 47. P. 179-208.

206. Webb J. S., McGinness S., Lappin-Scott H. M. Metal removal by sulphate-reducing bacteria from natural and constructed wetlands // J. Appl. Microbiol. 1998. V.84. P. 240-248.

207. Werne J. P., Lyons T. W., Hollander D. J., Formolo M. J., Damste J. S. S. Reduced sulfur in euxinic sediments of the Cariaco Basin: sulfur isotope constraints on organic sulfur formation // Chem. Geol. 2003. V. 195. P. 159-179.

208. White C., Sayer J.A., Gadd G.M. Microbial solubilization and immobilization of toxic metals: key biogeochemical processes for treatment of contamination // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 20. P. 503516.

209. Widdel, F. Microbiology and ecology of sulfate- and sulfur-reducing bacteria // Biology of Anaerobic Microorganisms / Ed. Zehnder A.J.B. New York: John Wiley & Sons, 1988. P. 469-585.

210. Wielinga В., Lucy J. K., Moore J. N., Seastone O. F., Gannon J. E. Microbiological and geochemical characterization of fluvially deposited sulfidic mine tailings // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P .15481555.

211. Wijsman J.W.M., Middelburg J.J., Herman P.M.J., Bottcher M.E., Heip C.H.R. Sulfur and iron speciation in surface sediments along the northwestern margin of the Black Sea // Marine Chemistry. 2001. V. 74. P. 261-278.

212. Wilkin R.T., Barnes H.L. Pyrite formation by reactions of iron monosulfides with dissolved inorganic and organic sulfur species // Geochim. Cosmochim. Acta. 1996. V. 60. P. 4167-4179.

213. Williams J. R., Morgan A. G., Rouch D. A., Brown N. L, Lee В. Т. O. Copper-resistant enteric bacteria from United Kingdom and Australian piggeries//Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 2531-2537.

214. Winfrey M.R., Ward D.M. Substrates for sulfate reduction and methane production in intertidal sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 45. P. 193-199.

215. Winogradsky, S. Uber Schwefelbacterien. Botanische Zeitung // 1887. XLV. S. 489-507.

216. Wolters M., Van der Gaast S.J., Rickard D. The structure of disordered mackinawite // American Mineralogist. 2003. V. 88. P. 2007-2015.

217. Wortmann U. G., Bernasconi S. M., Bottcher M. E. (2001) Hypersulfidic deep biosphere indicates extreme sulfur isotope fractionation during single-step microbial sulfate reduction // Geology. 2001. V. 29. P. 647650.

218. Yoon J-H., Kang S-S., Lee K-C., Kho Y. H. Choi S.H., Kang К. H., Park Y-H. Bacillus jeotgali sp. nov., isolated from jeotgal, Korean traditional fermented seafood // IJSEM. 2001. V. 51. P. 1087-1092.

219. Younger P.L., Jayaweera A., Elliot A., Wood R., Amos P., Daugherty A.J. et al., Passive treatment of acidic mine waters in subsurface-flow systems: exploring RAPS and permeable reactive barriers // Land Contam. Reclam. 2003. V. 11. P. 127-35.

220. Zaitsev Y.P., 1993. Impacts of eutrophication on the Black Sea fauna // Anonymous, Fisheries Council for the Mediterranean. Studies and Reviews, Rome: FAO, 1993. P. 63-86.

221. Zhilina T. N., Zavarzin G. A., Rainey F. A., Pikuta E. V., Osipov G. A., Kostrikina N. A. Desulfonatrovibrio hydrogenovorans gen. nov., sp. nov., an alkaliphilic sulfate-reducing bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. P. 144-149.

222. ZoBell С. E. Organic geochemistry of sulphur // Organic Geochemistry / Ed. Berger I. A. New York: Macmillan. 1963. P. 543-578.

223. Zverlov V., Klein M., Lucker S., Friedrich M. W., Kellermann J., Stahl D. A, Loy A., Wagner M. Lateral gene transfer of dissimilatory (bi)sulfite reductase revisited // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 2203-2208.

Информация о работе

Карначук, Ольга Викторовна
доктора биологических наук
Томск, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Образование и растворение серосодержащих минералов сульфатредуцирующими бактериями - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы