Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обоснование, разработка и апробация экспрессного метода выявления специфических иммунных комплексов в крови больных клещевым энцефалитом

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Обоснование, разработка и апробация экспрессного метода выявления специфических иммунных комплексов в крови больных клещевым энцефалитом"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Николай Владимирович

ОБОСНОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ЭКСПРЕССНОГО

МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В КРОВИ БОЛЬНЫХ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ

(03.00.07 - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь - 1997

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЕРМСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ

Научный руководитель кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

1. доктор медицинских наук, профессор P.A., Пшеничнов

2. доктор медицинских наук, профессор И.Ф. Елысин

Ведущая организация: НПО «БИОМЕД» г.Пермь

заседании диссертационного совета института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Академии наук России (614000, г.Пермь, ул. Ленина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН (г.Пермь, ул. Голева 13).

Р.З.Кузяев

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета канд.биол.наук, ст. научный сотрудник

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы

Для здравоохранения Российской Федерации клещевой энцефалит является важной проблемой краевой патологии многих регионов, где наблюдается весьма высокая заболеваемость.

Пермская область представляет собой крупнейший очаг этой инфекции. Заболеваемость по области значительно превышает уровень заболеваемости по Российской Федерации. В отдельные годы относительный показатель заболеваемости по области превышал в 4-7 раз республиканский.

Полиморфизм клинических синдромов клещевого энцефалита и нередкая встречаемость в его природных очагах, лихорадочных заболеваний с другой этиологией в весенне-летнее время, затрудняю г проведение дифференциальной диагностики клещевого энцефалита.

Серодиагностика относится к ретроспективным методам и в силу недостаточной чувствительности диагноз удается подтвердить не более чем в 40% случаев (А.В.Зотов, 1973; А.Н.Волкова, 1991; Н.Н.Воробьева, Г.М.Волегова, 1992).

Широкое проэпидемичивание населения от 4,9 до 48,8% в различных климато-географичсских подзонах области (Р.З.Кузяев. 1968), а также профилактическое введение гамма-глобулина лицам, отмечавшим укус зараженных вирусом клещей, создают условия для образования иммунных комплексов из проникшего вируса и антител в ранние сроки, после инфицирования.

Это обстоятельство требует внедрения в широкую практик}' новых приемов лабораторно-диагностических исследований.

Образование И К является одним из этапов формировашш противовирусного иммунитета, а их выявление в крови заболевших имеет диагностическое и прогностическое значение.

Большинство известных способов определения ИК позволяет изучить лишь их суммарный уровень, без учета антигенной специфичности (В.В.Хозннский, Б.Ф.Семенов, 1977;А.И.Воробьева, 1979).

Роль ИК при клещевом энцефалите изучена мало, диагностическая ценность не исследована.

Цель исследования.

Разработка экспрессного метода обнаружения специфических иммунных комплексов в крови больных и его применение в клинико-лабораторной диагностике клещевого энцефалита.

Задачи исследования.

1. Разработать методику выявления специфических иммунных комплексов в эксперименте с использованием эритроцитарного иммуносорбента и метода флюоресцирующих антител (МФА).

2. Изучить возможность обнарз'жешш специфических ИК в крови больных клещевым энцефалитом разработанным методом в условиях практической лаборатории в ранмие сроки заболевания.

3. Изучить клинико-иммунологические особенности образования специфических ИК людей при заболевании клещевым энцефалитом.

4. Определить класс-принадлежность антител в специфических ИК у больных клещевым энцефалитом и выявить их взаимосвязь с образованием иммуноглобулинов в динамике заболевания и показать диагностическую и прогностическую значимость.

5. Исследовать особенности иммунного ответа у лиц, с укусами вирус-содержащих клещей, путем определения вирусного антигена, специфических ИК, класс-принадлежности антител и розегкообразующей активности лимфоцитов.

Научная новизна.

1.Впервые установлена возможность концентрации специфических ИК на ЭИС при клещевом энцефалите.

2. Разработана новая модификация МФА для выявления специфических ИК в крови людей с манифестным и бессимптомным течением клещевого энцефалита.

3. Установлены закономерности формирования специфических ИК в крови больных клещевым энцефалитом в динамике инфекционного процесса.

4. Изучена класс-принадлежность антител в составе ИК и их взаимосвязь с образованием иммуноглобулинов в сыворотке крови больных клещевым энцефалитом и лиц, покусанных вируссодержащими клещами.

Практическая ценность и внедрение в практику.

Разработан экспрессный метод определения специфических ИК в крови больных клещевым энцефалитом. Обосновано применение метода в ранней иммунодиагностике клещевого энцефалита. Показана значимость метода при расшифровке результатов у больных со стабильными тшрами антител и особенно серонегативных форм этой инфекции.

Предлагаемый метод прост, высокочувствителен и специфичен. Позволяет провести исследование за 3-4 часа. Метод экономичен, удобен. Одновременно можно провести исследование 15-20 проб крови. Лабораторный диагноз может быть поставлен по первой пробе крови, что сокращает срок диагностики на 10-15 дней.

Разработанный метод апробирован и используется в работе вирусологической лаборатории Пермского областного центра ГСЭН (Акт внедрения от 25 июля 1997 г.).

Полученные материалы о закономерностях формирования специфических ИК в крови больных клещевым энцефалитом в динамике инфекционного процесса используются при преподавании медицинской микробиологии в теме "Клещевой энцефалит" на кафедре микробиологии Пермской государственной медицинской академии (Акт о внедрении 18 мая 1996 г.).

Подготовлены методические рекомендации по выявлению специфических ИК при клещевом энцефалите МФА с использованием ЭИС.

Основные положения, выносимые в защиту (перенес).

1. Оригинальный способ выявления специфических ИК в крови больных клещевым энцефалитом с использованием ЭИС и МФА.

2. МФА с концентрацией ИК на ЭИС как диагностический тест при клещевом энцефалите в сравнении с другими способами иммунодиагностики.

Закономерности формирования специфических ИК при манифестном и бессимптомном течении клещевого энцефалита в динамике инфекционного процесса.

4. Прогностическая значимость выявления специфических ИК и ценность комплексного исследования крови у лиц, покусанных вируссодержа-щимн клещами.

Апробация работы.

Работа выполнена на кафедре микробиологии ПГМА и вирусологической лаборатории Пермского областного центра ГСЭН и является частью комплексной темы по изучению клещевого энцефалита на Западном Урале (Ы госрегистращш темы 0190005864).

Материалы работы доложены на итоговых научных студенческих конференциях Пермского Государственного медицинского института в 1990 и 1991 г.г. На иммунологической конференции 111 МИ 1994 г., на научно-практической конференции научно-производственного объединения "Биомед" в 1994 г. и на научных сессиях ГТГМИ в 1996., 1997 г. г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения и выводов.

Библиографический указатель включает ссылки на работы 201 отечественного и 58 зарубежных авторов.

Работа иллюстрирована 1 фото, 24 таблицами и 1 рисунком.

Основное содержание работы.

Материалы и методы.

В опытах использованы: антиген вируса клещевого энцефалита (коммерческий препарат Томского НИИВС для РТГА с титром 1:640).

Лошадиный гамма-глобулин против вируса клещевого энцефалита (коммерческий препарат Томского НИИВС с титром 1:25000).

Человеческий иммуноглобулин, содержащий антитела против вируса клещевого энцефалита, 2 серий с титрами 1:20 и 1:80 (коммерческий препарат Пермского наупю-ггроизведствеиного объединения "Биомед").

Эритроцигарный иммуносорбенг-стандартизированный препарат (Пермского научно-произведствешгого объединения "Биомед;'), представляющий формалинизированные бараньи эритроциты, на которых посредст-

вом бидиазотированного бснзидина адсорбирован лошадиный противоэнце-фалитный гамма-глобулин.

ЛАТ против вируса клещевого энцефалита и ЛАТ против вируса гриппа производства Свердловского НИИВИ.

ЛАТ против иммуноглобулинов человека поливалентные и моноспецифические против иммуноглобулинов класса М, G, А, производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (г. Москва).

Плазма (17 проб от 10 больных) п сыворотка крови больных клещевым энцефалитом и лиц с укусами вируссодержащих клещей (511 проб от 318 больных).

В исследованиях использованы методы:

- реакция геммаглютинации;

- МФА (Г.И. Стародубцева, Т.Г.Пархоменко, 1974г.);

- выявление вирусного антигена;

- иммунологические - РТГА (J.Casals, L.Broun, 1954г.); РНГА (Р.Д.Марголин, З.Н.Кондрашова, 1966г.); РНИР(Л.П.Быкова,1986г); иммунофлюоресцентный анализ (О.В.Наволокин, Л.С.Субботина, 1986г.).

- статистические - обработка результатов исследований проведена параметрическим методом вариационной статистики при помощи критерия Стьюдента(И.П.Аышарина, А.А Воробьева, 1962г.).

Результаты и обсувдения.

Экспериментальные обоснования возможности выявления специфических ИК МФА с использованием ЭИС при клещевом энцефалите.

Экспериментальные исследования проведены в следующих направлениях:

1. Конструирование специфических ИК in vitro из антигена вируса клещевого энцефалита и различных серий специфического гамма-глобулина.

Найдены оптимальные условия их образования в зависимости от количественных соотношений компонентов, от экспозиции и от температурного режима. Об образовании ИК судили по падению титра антигена по РГА и падению титра гамма-глобулина по данным РТГА.

2. Концентрация ИК на эритроцитарном иммуносорбенге при различных экспозициях в условиях +4 'С и возможность их выявления МФА.

Критерием степешг адсорбции ИК на ЭИС являлось свечение эритроцитов после окраски ЛАТ против иммуноглобулинов человека при хороших контролях.

В процессе экспериментов была изучена скорость образования ИК при трех температурных режимах (при +4°С, +20иС, +37°С) в смесях из равных объемов антигена вируса клещевого энцефалита и специфического гамма-глобулина. Оба компонента были в различных разведениях (антиген от 1:10 до 1:640), лошадиный гамма-глобулин от 1:100 до 1:25000, человеческий низкотитровый гамма-глобулин не разведенный, а серия гама-глобулинов с титром 1:80 в разведении 1:2. Смеси выдерживали 20 мин, 40 мин, 1 час. Критерием степени образования ИК являлось падение титров компонентов в РГА и РТГА.

Установлено, что ИК образуется уже через 20 мин независимо от температурного режима. В смесях, включавших низштитровый гамма-глобулин остается не связанным часть антигена, а при использовании высокотитрового лошадиного гамма-глобулина часть его остается избыточной.

В результате постановки кинетических реакций были выбраны оптимальные соотношения компонентов для образования ИК (антиген вируса в рабочем разведении 1:40, лошадиный гамма-глобулин 1:800, человеческий гамма-глобулин с титром 1:20 - не разведенный, а с титром 1:80 - разведение 1:2).

Вторым этапом экспериментов явилось изучение возможности адсорбции ИК на эритроцитарном пммуносорбенте. Для этой цели брали 0,5% взвесь ЭИС, к ней добавляли равный объем ИК (антиген вируса+гамма-глобулин). Смеси выдерживали при +4°С - 20 мин, 40 мин, 1 час при частом встряхивании. После чего смеси центрифугировали при 3000 об/мин. Осадок эритроцитов дважды отмывали ЗФР с рН 7,2-7,4. Из осадка эритроцитов готовили мазки, не фиксировали, а после высушивали^ окрашивали JIAT против иммуноглобулшюв человека по общепринятой методике. Препараты изучали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ Р-3. Результаты оценивали по четырехкрестной системе и характеру свечения эритроцитов. Наблюдали свечение - либо всей поверхности эритроцитов, либо по ободку. Просматривали не менее 20 полей зрения. Положительным считали свечение не менее 5 клеток в поле зрения и интенсивности свечения не менее двух плюсов.

В качестве контролей брали : 1-ЭИС не окрашенный, 2-ЭИС, окрашенный JIAT против иммуноглобулинов человека, 3-ЭИС + антиген вируса клещевого энцефалита - окрашен ЛАТ против вируса клещевого энцефалита.

Супернатанг после первого центрифугирования смесей исследовали на наличие остаточного антигена в РГА и остаточных антител в РТГА.

Установлено, что ИК адсорбируются на ЭИС уже через 20 мин. В препаратах из смесей антигена и высокотитровых иммуноглобулинов было получено яркое свечение на 3-4 плюса, а с низкотитровым иммуноглобулином свечение было менее интенсивно - на 2 плюса.

Таким образом, в эксперименте было доказано, что ИК из антигена вируса и специфичных к нему антител хорошо адсорбируются на ЭИС и могут быть обнаружены МФА при окраске ЛАТ против иммуноглобулинов человека.

Выявление специфических ИК в крови больных клетевым энцефалитом МФА с использованием ЭИС.

Полученные экспериментальные данные послужили основанием для обнаружения специфических РЖ в крови больных клещевым энцефалитом.

МФА с использованием ЭИС.

Результаты исследования крови больных предлагаемым методом сопоставлялись с результатами серологических реакций (РТГА, ИФА).

Было показано, что ИК можно выявлять как в плазме, так и в нативной сыворотке крови.

Методика была достаточно проста. К 0,5% взвеси ЭИС добавляли равный объем сыворотки крови (по 0,1), смеси выдерживали 20 мин при +4 С и частом встряхивании (4-5 раз). После чего эритроциты отмывались 2 раза ЗФР. К осадку эритроцитов добавляли 0,2 мл ЗФР и из них готовили мазки, которые после высушивания окрашивали JIAT против иммуноглобулинов человека. Мазки просматривали в люминесцентном .микроскопе.

В течение пяти весенне-летних сезонов было исследовано 511 проб крови от 318 больных клещевым энцефалитом. Из них в 150 пробах были обнаружены ИК, что составляет 29,3%.

Представляло интерес изучить время появления и длительность обнаружения специфических ИК. Этот вопрос был изучен у 218 больных в динамике инфекционного процесса. Результаты представлены в табл.1.

Таблица 1. Частота выявления в крови специфических ИК и иммуноглобулинов против вируса клещевого энцефалита в динамике инфекционного процесса.

Период заболевания МФА РТГА ИФА i

исследовано проб из них ИК исследовано проб из них РТГА исследовано проб из них ИФА;

абс. М + т абс. М+ m абс м ; + 111 !

Начата 218 86 39,4 203 83 40.8 122 66 54.0 |

заболева- + 3.3 +3,4 + 4,5 !

ния !

Реконва- 218 44 20.1 203 103 50.7 122 69 56,5 >

лесценция +2,7 +3,5 + 4,4 ■

Из таблицы видно, что ИК чаще обнаруживались в начале заболевания, тогда как иммуноглобулины наоборот, нарастали в динамике заболевания. Из 218 проб крови, взятых в первые дни от начала заболевания, ИК обнаружены в 86 пробах, что составляет 39,4%. В период реконвалесценция ИК были обнаружены в 44 пробах - 20,1%. Иммуноглобулины РТГА в первых пробах крови были выявлены в 40,8% случаев, а в период реконвалесценции в 50,7% проб. ИФА показал аналогичные результаты. Иммуноглобулины выявлялись чаще в период реконвалесценции.

В зависимости от титра антител в крови больных, последние были разделены на 3 группы. Первая группа имела тенденцию к нарастанию антител, вторая имела стабильные титры и третья группа - серонегативные болысые. Результаты этого анализа представлены в табл. 2. Из таблицы видно, что первая группа проб крови от больных с нарастанием титра антител в динамике заболевания включала 52 образца. В 50% проб крови, взятых в начале заболевания, обнаружены специфические ИК. В период реконвалесценции ИК выявлены только в 17,3% проб.

Таблица 2. Частота выявления специфических ИК из образцов крови больных клещевым энцефалитом в сопоставлении с результатами обнаружения иммуноглобулинов в динамике инфекционного процесса.

Нарастание титра Р Стабильные титры Р Серонегативные ответы Р

Период заболевания иссле дов. проб из них с ИК исле дов. проб из них с ИК Иссле Дован. Проб из них с ИК

Абс. М+т абс. М+т абс. М+т

Начало заболевания 52 26 50,0+6,9 <0,0 [ 59 35 59,3+ 6,3 <0,01 92 31 33,6+4,9 <0,01

Реконвалес-ценция 52 9 17,3+5,2 59 17 28,8+5,8 92 12 13,0+3,5

Всего 104 35 33,6+4,6 118 52 44,0+4,9 184 43 23,3+3,1

Вторая группа проб крови была взята от больных со стабильными титрами антител. В I пробах крови в 59,3% обнаружены ИК, а во II пробах ИК обнаруживались в два раза реже.

Третья группа включала больных у которых диагноз "клещевой энцефалит" был установлен только на основании клинических признаков, в крови этих больных не были выявлены специфические к вирусу антитела. Однако, в I пробах крови этих больных у 33,6% были обнаружены специфические ИК. Во П пробах частота обнаружения ИК была значительно реже и составляла 13%.

Таким образом, установлено, что ИК чаще выявлялись в ранние сроки от начала заболевания во всех трех группах. ВI и II группах в 1 пробах крови ИК обнаружены почти с одинаковой частотой. В период рсконвалесцен-ции в I группе больных ИК выявлены в два раза реже, чем у больных со стабильными титрами антител. По видимом)', нарастание титра антител ведет к более быстрой элиминации вируса из кровеносного русла.

Чрезвычайно важным нам представляется факт обнаружения ИК у больных с иммунологической безответностью (по серодиагностике). Оказалось, что в начале заболевания у 33% были выявлены ИК. Следовательно, у больных этой группы можно получить дополнительную информацию об антигенном стимуле. Предлагаемый тест является почти единственным из иммунологических методов (за исключением РНИР) при диагностике "серонегативного клещевого энцефалита".

Доказана специфичность МФА как постоянными контролями, так и исследованиями 59 проб крови от 37 больных с другими заболеваниями. ИК определялись с параллельным определением иммуноглобулинов к вирусу клещевого энцефалита в РТГА и ИФА.

ИК были выявлены в 4 пробах крови, из них в двух пробах были найдены иммуноглобулины. У одного больного был поставлен клинический диагноз - болезнь Лайма. Считаем, что в этом случае могла быть микстннфек-ция, т.к. и болезнь Лайма и клещевой энцефалит имеют единого переносчика.

Следовательно, только у 1 больного ИК были обнаружены в 1 пробе крови, а иммуноглобулины не найдены.

Из полученных данных видно, что клинический диагноз у ряда больных не точен, т.к. серологическими методами и МФА у части больных не был подтвержден клещевой энцефалит.

Полученные нами расхождения МФА не превышают расхождений при использовании серодиагностики и не снимают ценности поиска ИК, как дополнительного метода ранней диагностики.

Специфичность МФА, в нашей модификации, была проверена параллельной окраской препаратов от 76 больных клещевым энцефалитом ЛАТ против иммуноглобулинов человека и ЛАТ против вируса гриппа. Только в одном препарате, окрашенном ЛАТ против вируса гриппа было найдено свечение на 2+.

Считаем, что это единичное расхождение в пределах ошибки метода, так как известно, что специфичность МФА в значительной степени зависит от активности ЛАТ.

Клшшко-нммунологнческие особенности образования ИК у больных клещевым энцефалитом.

Учитывая, что специфические ИК у больных клещевым энцефалитом обнаруживались впервые, представляло интерес изучить некоторые особенности частоты образования их в зависимости от возраста, пола, клинической формы заболевания, роли профилактического введения гамма-глобулина.

Были отобраны близкие по численности группы взрослых и детей (53 и 43 соответственно). При исследовании парных проб крови от этих больных статистически достоверной разницы в частоте обнаружения ИК не получено. Найдена большая разница в длительности инкубационного периода. Если у взрослых в среднем он составлял 11,4 дня, то у детей - 5,8 дня.

Введение гамма-глобулина с целью профилактики удлиняло период инкубации у детей до 7,3 дня. У взрослых этот показатель почти не менялся, что можно объяснить тем, что взрослым, как правило, вводится низкотитро-вый препарат.

Результаты этих исследований приведены в табл. 3.

Из таблицы видно, что у детей, получивших гамма-глобулин, ИК обнаружены два раза чаще, чем у детей, не получавших эгот препарат.

У взрослых разница в выявлении ИК у лиц, получавших и не получавших этот препарат, статистически недостоверна.

Представляло интерес определить частоту обнаружения ИК в зависимости от пола больных. Проведен анализ результатов обследования 102 мужчин и 82 женщин. Статистически достоверной разницы в частоте выявления не получено.

Сопоставлены результаты исследования крови от 39 больных с менин-геалъной и от 40 больных с лихорадочной формами заболевания. Статистически достоверной разницы в частоте обнаружения ИК ire получено.

Роль ИК в патогенезе вирусных инфекций в большей части зависит от класс-принадлежности антител, входящих в ИК (Sliiwers I., Daniels I.. 1979; Notkins, 1971). В нашей работе представилась возможность изучить этот вопрос при клещевом энцефалите.

Для этой цели от 72 больных было исследовано 111 проб крови. Из каждого образца готовили по 4 препарата. Первый го них окрашивали поливалентными ЛАТ против иммуноглобулинов человека. Остальные 3 препарата окрашивали моноспецифическими ЛАТ против иммуноглобулинов класса М, G, А. При исследовашпг 1 проб крови из 72 в 28 были обнаружены ИК. Из них иммуноглобулины класса М - б, M+G -11, G - 9, А -1.

Из 39 проб крови, взятых в период реконвалесценции, ИК были в 6. Из них ИК с тшупоглобу'линами класса М - 1, M+G - 2, G - 3.

Эти исследования показали, что с первых дней от начала заболевания в состав ИК входят оба класса антител (M+G). По видимому", часть больных имела иммуноглобулины класса G до заболевания, проживая в очагах клещевого энцефалита.

Особый интерес в этой части исследовашш заняли результаты применения моноспецифических ЛАТ в тех образцах крови, которые дали отрицательные результаты при окраске поливалентными ЛАТ.

Таблица 3. Длительность инкубационного периода и частота обнаружения ИК в зависимости от профилактического введения противоэнцфалитного гамма-глобулина.

Введение гамма-глобулина Дети Взрослые

кол-во обследуе мых доит-ть инкуба ции ИК Р кол-во обследуемых ДЛИТ-ТЬ инкубации ИК Р

абсол. М+т абсол. М+т .

вводился 22 7,5 13 59,0+10,4 <0,01 13 10,4 7 53,8+13,8

не вводился 21 4 6 28,5+9,8 40 11,7 19 47,5+7,8 >0,05

Так, из 111 исследованных проб крови, 77 не дали свечения при окраске поливалентными ЛАТ, но при окраске моноспецифическими ЛАТ в 7-ми образцах были обнаружены ИК. Состав их был также разнообразен.

Эти данные подтверждают положение о том, что моноспецпфические ЛАТ обладают большой авидностью (Soner R., 1986).

Проведенные исследования показали, что ИК гетерогенны в зависимости от состава иммуноглобулинов в крови больных.

Применение моноспецифических ЛАТ повышает чувствительность метода и позволяет отличить иммунную прослоГшу от свежего инфекционного процесса у больных.

Некоторые особенности иммунного ответа у лиц, постсанных Birpycco-держаищми клещами.

Впервые проведено комплексное исследование сывороток крови лиц, с укусами вируссодержащих клещей на наличие вирусного антигена, специфических ИК МФА с использованием ЭИС и определение класс-принадлежности антител в сыворотке крови этих лиц в РИГА с использованием редуцента иммуноглобулинов класса М. Результаты представлены в табл.4.

Таблица 4. Частота выявления вирусного антигена, ИК и иммуноглобулинов у лиц, с укусами вируссодержащих клещей.

Выявляемые Исследовано Положительные результаты '

объекты проб крови абсолюта. М± га, % ;

Антиген вируса 44 9 20,4+ 6,0 '

Специфические ИК 44 12 27,7+ 6.7 :

Иммуноглобулин М 44 23 52,3+ 7,5

Иммуноглобулин G 44 __ э m 11,3+4,7

Как видаю из таблицы, при исследовании крови от 44 человек МФА, у 9 был обнаружен антиген вируса клещевого энцефалита, у 12 ИК. В 9 пробах совпадали результаты обнаружения этих компонентов.

Иммуноглобулины класса М - у 23 человек, класса С - у 5. Следовательно, только серодиагностика в 52,3% выявила иммуноглобулины класса М, а комплексное обследование в 70,4% показало на наличие свежего антигенного стимула (вирус+ИК+^М- у 4 больных; вирус+ИК - у 5 больных; IgM - у 19 больных; ИК - 3 больных. Итого 31 больной, что составляет 70,4%). Обнаружение класс-принадлежности антител в сыворотках крови обследуемых лиц позволяет косвенно судить и о класс-принадлежности антител вИК.

Комплексное обследование расширяет представление о наличии антигенного стимула, позволяет прогнозировать возможность заболевания и рекомендовать организацию диспансерного наблюдения за лицами с такими показателями до 40 дней.

Установлено, что МФА с предварительной конъюгацией на ЭИС как вирусного антигена, так и ИК может применяться в самые ранние сроки после укуса клеща-вирусоносителя.

Наряду с изучением вирусемии и гуморального иммунного ответа представляет интерес определение реакции клеточного звена иммунитета у лиц, с укусами вируссодержащих клещей. Одной из наиболее простых и доступных методик исследования специфического активирования иммунокомпетентных клеток является реакция непрямого иммунного розеткообразования - РНИР (Л.П.Быкова, 1986 г.).

Диагностическая ценность РНИР при клещевоом энцефалите показана работами Л.П.Быковой (1986г.).

Представляло интерес изучить скорость иммунного ответа у лиц с укусами вируссодержащих клешей с применением этой методики, было обследовано 75 человек. Кровь этих людей исследовалась в РНИР на наличие клеточного иммунного ответа и в РНГА с использованием редуцента иммуноглобулинов класса М для определения наличия и класс-принадлежности антител. Результаты этих исследований представлены в табл.5.

Таблица 5. Характеристика клеточного и гуморального иммунного ответа в первые дни после инфицирования вирусом клещевого энцефалита у лиц, _ покусанных вируссодержащими клещами. _

Методы Обследо- Кол-во положительных Р

исследования вано результатов

людей абсол. М+т

РНИР 75 27 36,0+ 3,5

РНГА 75 10 13,3+3,9 <0,01

Из таблицы видно, что при исследовании 75 проб крови специфическое иммунное розегкообразованяе выявлено у 27 человек, что составляет 36,0%. тогда как иммуноглобулины обнаружены у 10 человек (13,3%).

От 28 человек исследованы парные пробы крови. Первая проба взята в 1-2 день после укуса клеща, а вторая через 6-7 дней после первой. Сыворотки крови этих людей исследовались в РНИР и в РНГА с определением класс-принадлежности антител.

Результаты исследований представлены на рис. 1, из которого видно, что в первые дни после укуса у 9 человек из 28 обследуемых РНИР была положительна, чго составляет 32,1%.

Иммуноглобулины класса М были выявлены в РНГА у 4-х человек (14,2%). Через 7-8 дней у этих же лиц РНИР была положительна в 35,7%, а иммуноглобулины класса М выявлялись еще реже (10,8%).

Иммуноглобулины класса в, независимо от сроков взятая крови, выявлены в 10,8%. Следовательно, эти лица относятся к иммунной прослойке.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том. что РНИР может применяться для выявления клеточного иммунного ответа в ранние сроки после укуса клещем и использоваться как прогностический тест.

1-2 дни после укуса клещами

6-7 дни после укуса клещами

Рис. 1. Частота розеткообразования и антителообразования у лиц, покусанных вируссодержащнмц клещами в динамике.

Заключение.

Вопрос обнаружения специфических ИК у больных клещевым энцефалитом изучен нами впервые. ..

В эксперименте были сконструированы ИК из антигена вируса клещевого энцефалита и специфического гамма-глобулина. Применен метод концентрации ИК на эритроцитарном иммунносорбенте и использован МФА для индикации и идентификации ИК. .

Исследованы сыворотки крови больных клещевым энцефалитом на содержание специфических ИК и иммуноглобулинов.

Показано, что ИК чаще выявлялись в ранние сроки от начата заболевания. У 1/3 больных с ''серонегативными клещевым энцефалитом" найдены ИК, что позволяет подтвердить диагноз.

Изучены некоторые клшшко-иммунологические особенности у больных детей и взрослых. Показано более частое выявление ИК у детей, получавших гамма-глобулин с профилактической целью.

Изучена класс-принадлежность антител в составе ИК у больных клещевым энцефалитом.

Проведено комплексное обследование лиц, покусанных вируссодержащими клещами на наличие ИК, вирусного антигена, класс-принадлежность антител в сыворотках крови. Показано время иммунного ответа на клеточном уровне у лиц, покусанных клещами.

Выводы.

1. Разработан метод обнаружения специфических ИК при "клещевом энцефалите, включающий концентрацию их на сенсибишзированных эритроцитах (ЭИС) и последующее выявление методом флюоресцирующих антител при окраске шоминесцирующими антителами против иммуноглобулинов человека. \ ; ? '

2. Впервые показана возможность'применения разработанного теста для обнаружения иммунных комплексов в плазме, либо нативной сыворотке крови больных клещевым энцефалитом. Подтверждена специфичность предлагаемого метода при исследован™ сывороток крови больных с другими заболеваниями.

3. Установлено, что обнаружение иммунных комплексов является ранним диагностическим тестом и имеет важное значение при расшифровке диагноза у больных со стабильными титрами антител и серонештивной группе.

4. Определение класс-принадлежности антител в ИК при использовании моноспецифических ЛАТ позволяет отличить свежее заболевание клещевым энцефалитом от иммунной прослойки и повышает эффективность предлагаемого теста.

5. Показана возможность выявления специфических ИК у лиц, покусанных вируссодержащими клещами, в первые дни после инфицирования.

6. Доказана необходимость комплексного обследования лиц, покусанных вируссодержащими клещами, на наличие ИК, вирусного антигена МФА с использованием ЭИС, определение класс-принадлежности антител в сыворотке крови и изучение раннего клеточного ответа, что дает возможность прогнозировать заболевание и рекомендовать диспансерное наблюдение.

7. Предлагаемый метод обнаружения специфических иммунных комплексов прост для выполнения, экономичен, не опасен для исследователя, высокочувствителен и специфичен. Может применяться в любой вирусологической лаборатории, как ранни! диагностический дополнительный тест.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Характеристика иммунного розеткообразования у людей, инфицированных вирусом клещевого энцефалита// Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояни-ях//Тезисы доклада к XI научной конференции.-Челябинск.-1992.-С.56.-(соавт. Р.З.Кузяев, Л.П.Ббцкова, Н. АПеньковская).

2. Разработка новой методики обнаружения ИК при клещевом энцефалите// Загрязнение окружающей среды, проблемы токсикологии и эпидемиоло-пш//Тезисы доклада на международной конференции.-Москва-Пермь.-11-19 мая 1993.-С.196.-(соавт.Р.З.Кузяев, В.М.Мннаева и Л.Ф.Корзухина).

3. Экспериментальная разработка метода выявления специфических иммунных комплексов в РНИФ с использованием эритрошггарного антительного диагиостикума при клещевом энцефалитс//Сборник научных трудов "Вирусные инфекции'".-Екатер1шбург.-1993.-С.174-179.-(в соавторстве с Р.З.Кузяевым).

4. Ранняя иммунодиагностика клещевого энцефалита путем выявления ИК в РНИФ// Иммунопрофилактика, иммунодиагностика и иммунокоррек-ция//Сборник научных трудов врачей Урала, Сибири и Дальнего Востока.-Омск.-1994.-С.7-Ю.-(соавт. Р.З.Кузяев, В.М.Минаева и Г.Г.Хамлидулина).

5. Класс-принадлежность иммуноглобулинов в специфических ИК у больных клещевым энцефататом//Актуальные проблемы теоретической н прикладной иммунолопт.-Пермь.-1994.-С.10-12.-(в соавторстве с Р.З.Кузяевым, Е.В.Кудреватых и Т.Г.Пархоменко).

6. Использование эритроцитарного иммуносорбента при изучении клещевого энцефалита// Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии.-Пермь.-1994.-С. 10-12.-(в соавторстве с Р.З.Кузяевым, Т.Г.Пархоменко и Е. А Душкиным ).

7. Аиатиз результатов выявления специфических иммунных комплексов в крови больных клещевым энцефалитом с помощью метода флуоресцирующих антител (Васильев Н.В., Кузяев Р.З., Наумова Л.М.//Актуальные проблемы современной вирусологии// Сборник научных трудов.-Екатеринбург. -1995.-С.339-343).

8. Диагностическое значение обнаружения специфических ИК при клещевом энцефалите// Тезисы докладов научной сессии 1996 Пермской государственной медицинской Академии.-Пермь.-1996,-

С.68-69.-(соавт. Р.З.Кузяев, Е.В. Кудреватых).

9. Иммунологические аспекты бессимптомного течения клещевого энцефалита// Тезисы докладов научной сессии 1996 Пермской государственной медицинской Академии.-Пермь.-1996.-С.68-69.-(соавт. Р.З.Кузяев, Л.К. Яро-шенко, Л.П.Е&йкова и Е.В. Кудреватых).

10. Диагностическая значимость выявления специфических ИК у больных клещевым энцефалитом// Приоритетные проблемы инфекционной и неинфекционной патологии.-Материалы межрегиональной научно-практической конференции.-Пермь.-1996.-С.84-88.-(соавт. Р.З.Кузяев, Е.В.Кудреватых, Л.К.Ярошенко и Т.Г.Пархоменко).

11. Антигенспецифические методы исследования в ранней диагностике и эпидемиологическом надзоре за клещевым энцефалитом (Кузяев Р.З., Яро-шенко Л.К., Быкова Л.П., Душкин Е.А., Васильев Н.В. и др. // Ин-форм.бюллет. Госкомсанэпиднадзора РФ "Здоровье населения и среда оби-тания".-М.-1996.-М 12.-е. 13-14.).

12. Особенности формирования специфических иммунных комплексов при клещевом энцефалите (Васильев Н.В., Кузяев Р.З., Кудреватых Е.В., Яро-шенко Л.К.//Научная сессия 1997 года Пермской государственной медицинской академии: тез. докл.-Пермь.-1997.~с.83)

13. Совершенствование ранней иммунодиагностики клещевого энцефалита (Кузяев Р.З., Ярошенко Л.К., Быкова Л.П., Душкин Е.А,, Васильев Н.В.//Факторы клеточн. и гумор. иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: тез. докл. XIII Российской научной конференции.-Челябинск.-1997.-с.82).

Подписано в печать 4.12.97. Формат 60х84'/16. _Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз._

Техническая редакция "Пермского медицинского журнала" 614000, Пермь, ул. Большевистская, 85