Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обоснование, конструирование и стандартизация индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Обоснование, конструирование и стандартизация индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам"

На правах рукописи

""оиьиОЗ?

Цветкова Ирина Андреевна

Обоснование, конструирование и стандартизация

индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам

03.00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ш 2007

Саша -Петербург 2007

003060037

Работа выполнена в Научно-исследовательском Центре Фармакотерапии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Поляк Марк Соломонович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Кафтырева Лидия Алексеевна

доктор биологических наук, профессор Витовская Галина Ароновна

Ведущая организация: Государственная Санкт-Петербургская

Медицинская Академия им И И Мечникова

Зашита диссертации состоится » 2007 г в ча-

сов на заседании диссертационного совета К 208 088 01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» по адресу 197376, г Санкт-Петербург, ул Профессора Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

Автореферат разослан » Р 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,/ кандидат биологических наук Караваева Анна

Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Энтерококковые инфекции относятся к числу не только распространенных, но и, зачастую, достаточно тяжелых [Gil-more М S et al, 2002] Как известно, именно энтерококки входят в число наиболее частых возбудителей септических заболеваний, прежде всего эндокардита [Nováis С et al, 2005] Число заболеваний, вызванных представителями рода Enterococcus увеличивается из года в год [Bonten М J et al, 2001, Facklam R R , Elliot J A , 1995] Энтерококки располагают широкой вариабельностью факторов антибиотикорезистентности, что создает серьезные проблемы для выбора эффективных противомикробных препаратов [Flint А С et al, 2001, Ueda Y et al, 2005] Проблема антибиотикорезистентности энтерококков в России изучена мало Отдельные работы говорят о том, что она существует [Сидоренко С В ,2003] Однако данные исследования не касаются вопросов методологии, а опираются на существующие методические подходы Доминирующем в мировой практике является диск-диффузионный метод определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам Однако его нельзя считать оптимальным по информативности [NCCLS, 2003, Поляк М С , 2003] Кроме того, говорить о достаточной стандартности метода дисков в России сложно [Поляк М С и соавт ,2004] Стандартизация данного метода определения чувствитель ности микроорганизмов к антибиотикам ведется, но она имеет в основе регламентацию техники исследования и повышение требований к компонентам анализа [NCCLS, 2003] Это справедливо, но, как представляется, недостаточно Развитие данного направления предполагает понимание самого процесса зонообразования при диффузии антибиотика из диска в гель Из аналитической микробиологии известно, что зависимость между концентрацией ПЛС (противомикробное лекарственное средство) и диаметром зоны является линейной на определенном участке кривой зависимости «доза-эффект» [Митницкий и соавт, 1982] Данный момент применительно к индикаторным дискам практически не изучался и не учитывается при конструировании и стандартизации самих дисков с антибиотиками.

Цели и задачи исследования

1 Сравнительное изучение чувствительности энтерококков, возбудителей патологии человека, к антимикробным препаратам, опираясь на основные наиболее информативные методические подходы с использованием применяемых в мировой практике питательных сред

2 Стандартизация определения чувствительности энтерококков к проти-вомикробным препаратам, особенно «методом дисков», на основе изучения процесса зонообразования, поскольку данный метод определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является доминирующим в мировой и отечественной практике

Сказанное определило основной круг задач

- изучить и сравнить результаты определения чувствительности энтерококков к антибиотическим препаратам диск-диффузионным методом и методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах, '

\

- изучить процессы диффузии основных препаратов, активных в отношении энтерококков, из индикаторных дисков в гель (питательную среду) и сопоставить их с ростом культуры энтерококков и образованием зоны подавления роста,

- изучить закономерности зонообразования при диффузии антибиотиков в питательную среду в зависимости от концентрации препаратов и их влияния на стандартность исследования,

- определить возможность использования контрольных значений диаметров зон подавления роста энтерококков при диффузии антибиотиков из дисков в среду АГВ (агар Гивенталя-Ведьминой)

- предложить контрольные значения диаметров зон подавления роста гентамицина 120 мкг/диск и стрептомицина 300 мкг/диск для референс-штамма Е faecalis АТСС 29212 для среды АГВ,

- разработать схему получения и оценки качественных показателей дисков с гентамицином и стрептомицином для определения чувствительности энтерококков к этим антибиотикам

Научная новизна исследования. Определена чувствительность 185 штаммов энтерококков, выделенных от больных детей к бензилпеницил-лину, ампициллину, ванкомицину, гентамицину, сгрептомицину с использованием нескольких методов и питательных сред Показана чувствительность данных культур к нескольким новым препаратам, в том числе лине-золиду и антибиотикам фторхинолонового ряда (левофлоксацину, гатиф-локсацину и спарфлоксацину) Изучена сравнительная чувствительность (устойчивость) энтерококков к аминогликозидным антибиотикам

Впервые изучен процесс зонообразования при диффузии антимикробных соединений из дисков в засеянную энтерококками питательную среду Изучена и показана динамика проникновения ампициллина, ванко-мицина и гентамицина из дисков в питательную среду, засеянную энтерококками Концентрация препаратов в геле сопоставлена с фазами роста тест-культур, которые использовались при изучении процесса диффузии ампициллина, ванкомицина и гентамицина в среду АГВ

Теоретическая и практическая значимость. Показано, что большое количество культур энтерококков резистентно к наиболее применяемым бета-лактамным антибиотикам, а также к аминогликозидам В то же время пока для Санкт-Петербурга не типично распространение ванкоми-цинрезистентности энтерококков, что делает этот гликопептид важным препаратом для терапии энтерококковых заболеваний В этом отношении отечественная практика серьезно отличается от за рубежной

Впервые показана динамика перехода антибиотиков из индикаторных дисков в питательную среду, многообразие и сложность процесса установления градиента концентрации в геле Выявлено, что зависимость между концентрацией антибиотика и величиной (диаметром) зоны подавления роста энтерококков имеет линейный характер в ограниченных пределах Показано, что для микроорганизмов различных таксономических групп и для культур одного вида зависимос1ь между концентрацией антибиотика и диаметром зон подавления роста не идентична (не параллельна)

Разработан способ получения индикаторных дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и методика контроля их качества, которые включены в нормативно-техническую документацию, одобренную Министерством здравоохранения РФ (регистрационное удостоверение № ФС 01260093/0296-04 от 30 августа 2004 года, изменение №2 ТУ 99398-001-39484474-2000, утверждены в 2004 году) и опытный промышленный регламент № 1 Диски внедрены в производство и широкую клиническую (лабораторную) практику

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Определение чувствительности энтерококков к антибиотикам выявило штаммы, устойчивые к пенициллинам, аминогликозидам, фторхинолонам

2 В процессе зонообразования при диффузии антибиотиков из дисков в питательную среду на микробы воздействует постоянно меняющаяся концентрация противомикробного лекарственною средства

3 Прямая (линейная) зависимость между концентрацией антибиотика при его диффузии из диска и диаметром зоны подавления роста энтерококка лимитирована и может существенно отличаться при действии антибиотика на различные штаммы, что делает возможной ошибочную интерпретацию результатов тестирования при пограничных значениях диаметров зон подавления роста микроба

4 Контрольные значения диаметров зон подавления роста референс-штамма энтерококка при диффузии гентамицина и стрептомицина из дисков в среду АГВ

5 Способ получения индикаторных дисков с гентамицином 120 мкг и стрептомицином 300 мкг, а также порядок контроля их качества в процессе производства

Апробация работы: Материалы работы были апробированы на научной конференции и VIII съезде итало-российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине» (Санкт-Петербург - 2002), научной конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе Клинико-лабораторное обеспечение» (Москва, 2003), на заседании Санкт-Петербургского общества микробиологов (Санкт-Петербург - 2005), на научно-практической конференции «Вакцинология 2006 (Москва, 2006)

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ Личный вклад автора: Все экспериментальные исследования, обработка полученных данных выполнена автором

Структура и объем диссертации: Работа изложена на 160 страницах, содержит 15 таблиц и 47 рисунков Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы, который включает 151 наименование на русском и английском языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и меюды исследования

Для выполнения данной работы отобрано 185 штаммов энтерококков, выделенных от больных детей В качестве контрольного штамма взят Е faecalis АТСС 29212 Источником выделения культур служили кал, моча, отделяемое со слизистой оболочки зева, гнойное отделяемое из очагов поражения кожи Посев исследуемого материала (мочи, гнойного отделяемого с очагов поражения кожи и отделяемого со слизистой оболочки зева) осуществляли в соответствии с приказом Министерства Здравоохранения СССР № 535 Посев кала осуществляли в соответствии с Методическими указаниями по микробиологической диагностики заболеваний, вызванных энтеробактериями Посев всех образцов исследуемого материала производили также на среду с азидом натрия, являющуюся селективной для выделения энтерококков Идентификацию энтерококков проводили в соответствии с современными требованиями к установлению видовой принадлежности этих бактерий [Приказ Министерства Здравоохранения СССР № 535, Facklam R R et al, 1995, Gilmore M S et al, 2002] В результате проведенных тестов по идентификации культур было определено, что 45 из них принадлежат к Е faecium, остальные - к Е faecalis

Для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам методом серийных разведений использовали следующие питательные среды агар и бульон Мюллера-Хинтон (производства фирмы Becton Dickinson), бульон Мюллера-Хинтон с добавлением катионов Са2<" и Mg2+, агар Мюллера-Хинтон с добавлением 1 % глюкозы, агар и бульон из сердечно-мозговой вытяжки (производства фирмы HiMedia) Чувствительность энтерококков к антибиотикам определяли по методике, предложенной NCCLS (CLSI) и МУК 4 2 2004 Чувствительность исследуемых микроорганизмов к бензилпенициллину, ампициллину, ванкомицину, генгамици-ну, стрептомицину, ципрофлоксацину, спарфлоксацину, левофлоксацину и гатифлоксацину определяли при помощи стандартных дисков (производства НИЦФ) на среде АГВ (производства НПО «Махачкала») и агаре Мюллера-Хинтон (производства фирмы Becton Dickinson) параллельно При изучении процесса зонообразования были изготовлены стандартные диски с такими антибиотиками как 1 бензилпенициллин и ампициллин с концентрациями антибиотика в диске 2,5, 3,75, 5,0, 7,5, 10,0, 15,0, 20,0 и 30,0 мкг, 2 ванкомицин с концентрациями антибиотика в диске 5,0, 7,5, 10,0, 15,0, 20,0, 30,0,45,0, 60,0 и 90,0 мкг, 3 гентамицин с концентрациями антибиотика в диске 30,0, 45,0, 60,0, 90,0, 120,0, 240,0 мкг,

4 стрептомицин с концентрациями антибиотика в диске 125,0, 150,0, 225,0, 300,0, 450,0 мкг, 5 спарфлоксацин, ципрофлоксацин, левофлокса-цин и гатифлоксацин с концентрациями ПЛС в диске 1,25, 2,5, 3,75, 5,0, 7,5,10,0 и 20,0 мкг Диски были изготовлены по методике, принятой в НИЦФ В исследование взяты тест-культуры Enterococcus faecalis АТСС 29212, Е faecalis 101, Е faecalis 136, Е faecalis 12, Е faecalis 92 в посевной дозе 5x10й КОЕ/мл в количестве 1 мл взвеси в 20 мл среды, S aureus 209Р,

5 aureus АТСС 25923 в посевной дозе 5x108 в количестве 1 мл на поверх-

[гость среды Полученные результаты использовали для построения кривых зависимости «доза-эффект»

Для изучения диффузии ампициллина, из дисков в питательную среду были взяты стандартные диски с содержанием ампициллина 10 мкг/диск, тест-штамм Е faecalis 101, для изучения диффузии ванкомицина из дисков в питательную среду - стандартные диски с содержанием ванкомицина 30 мкг/диск, тест-штамм Е faecahs 136, для изучения диффузии гентами-цина - стандартные диски с содержанием гентамицина 120 мкг/диск, тест-штамм Е faecahs 12 Диски изготовлены в соответствии с ТУ 9398 - 001 -39484474 - 2000 Во всех случаях была использована среда АГВ (производства НПО «Махачкала»), в качестве контроля - агар Мюллера-Хинтон (Becton Dickinson) Микробиологическим методом определяли содержание антибиотика в блоке геля, взятого на различном расстояние от края диска, в пересчете на 100 мг по стандартной кривой (ГФ XI, выпуск 2)

Был изучен рост трех штаммов Е faecalis 12, 101 и 136 на среде АГВ Посев был аналогичен тому, который производят при определении чувствительности энтерококков к антибиотикам согласно МУК 4 2 2004 Готовили инокулюм по стандарту мутности 5 ЕД (5хЮ8КОЕ/мл), который разводили физиологическим раствором в 10 раз Полученную взвесь в количестве 1 мл наносили на поверхность среды АГВ Инкубировали посевы при 35°С Далее каждый час, включая 24 часа, отбирали столбик агара с засеянной культурой, который гомогенизировали в физиологическом растворе хлорида натрия (с последующими необходимыми разведениями в нем же) и делали высев на 5% кровяной агар в количестве 0,1 мл полученной взвеси Через 24 часа инкубации подсчитывали количество колоний, выросших на кровяном агаре Полученные данные отображали графически

Статистическая обработка полученных значений проведена по общепринятой методике (Ашмарин И П , Воробьев А А 1962)

Результаты исследования и их обсуждение

При определении чувствительности 186 штаммов энтерококков к (3-лактамным антибиотикам был выявлен 41 штамм устойчивый к бензилпе-нициллину и 38 штаммов устойчивых к ампициллину Как видно из полученных данных, число культур энтерококков, устойчивых к Р-лактамам, достаточно велико Эго подтверждает положение о том, что в последнее время все чаще встречаются штаммы энтерококков, устойчивые к пени-циллинам [Diekema D J et а), 2004] Кроме того, 3 из 10 устойчивых к бен-зилпенициллину штамма были чувствительны к ампициллину Это указывает на отсутствие строгой перекрестной резистентности, что согласуется с данными некоторых зарубежных авторов [Cercenado Е et al, 1996, Fack-lam R R et al, 1995] Результаты определения чувствительности энтерококков к р-лактамным антибиотикам методом серийных разведений показали, что для данного исследования могут быть использованы агар и бульон Мюллера-Хинтон Сравнительный анализ МПК (минимальная подавляющая концентрация), полученный в настоящих исследованиях на бульоне Мюллера-Хинтон с катионами и без них показал, что добавление ка-

тионов Са2+ и не влияет на эти показатели для штаммов энтерококка Важно отметить, что были получены сопоставимые результаты при определении чувствительности энтерококков к бензилпенициллину и ампициллину методом серийных разведений и диск-диффузионным методом Результаты определения чувствительности ЭЕ1теро кокков к ванкомицину показали, что среди 186 штаммов не было ни одного устойчивого к данному гликопептиду Полученный результат совпадает с утверждением о том, что проблемы ванкомицинрезистентных энтерококков в России пока не существует [Сидоренко и соавт, 2003], хотя с момента предшествующих публикаций прошло определенное время Поскольку за рубежом этот вопрос стоит достаточно остро, можно предположить, что ванкомицин в России по очевидным экономическим причинам используется реже, чем в ряде других стран Был апробирован ряд сред для определения чувствительности энтерококков к ванкомицину методом серийных разведении Полученные данные подтвердили положение зарубежных авторов (в частности рекомендации Комитета ТМССЬБ, ныне 1СЬ8) о том, что для проведения данного анализа оптимальными являются сердечно-мозговой агар и бульон Мюллера-Хинтон, но не агар Мюллера-Хинтон Кроме того, в ходе исследований добавление 1% глюкозы к агару Мюллера-Хинтон, с целью обогащения среды, не повлияло на результат Значения МПК, полученные на агаре Мюплера-Хинтон с глюкозой и без нее, не отличались друг от друга В то же время они не совпали с данными, полученными методом серийных разведений на сердечно-мозговом агаре и в бульоне Мюллера-Хинтон, а также не были адекватны диаметрам зон задержки роста энтерококков, определенных диск-диффузионным методом Однако следует отметить, что по рекомендациям Комитета ИССЬБ для определения МПК следует использовать бульон Мюллера-Хинтон оттитрованный по катионам, также как для пенициллинов Проведенные настоящие исследования показали, что добавление катионов не меняет значений МПК и, видимо, не является строго обязательным Интересные данные были получены в опытах с аминогликозидными антибиотиками Распространено мнение о том, что к гентамицину и другим аминогликозидам (исключая стрептомицин) существует перекрестная резистентность [ХЫтоге М Б е1 а1, 2002, Ьейл! А Е1 а1, 2000] и поэтому достаточно определять уровень резистентности энтерококков только к гентамицину и стрептомицину В настоящих исследованиях определение чувствительности 186 штаммов энтерококков к гентамицину и стрептомицину методом дисков и методом серийных разведений показало, что достаточно большое их количество было высокоустойчиво к исследуемым аминогликозидным антибиотикам 25 к гентамицину и 47 к стрептомицину Кроме того, были получены данные, которые не вполне согласуются с существующим мнением о перекрестной резистентности к аминогликозидам второго поколения В наибольшей степени это подтвердилось в опытах с амикацином Так 4 штамма энтерококка, высокорезистентных к гентамицину, были чувствительны к амика-цину, а у 17 культур, устойчивых к гентамицину, значения МПК амикаци-на были значительно меньше, чем МПК гентамицина Эти данные заслу-

живают внимания, поскольку важны для дальнейшей оценки возможности потенцирующего действия аминогликозидов, в том числе амикацина Определение чувствительности энтерококков к аминогликозидам методом серийных разведений с использованием разных питательных сред подтвердило целесообразность применения для этой цели сердечно-мозгового агара или бульона, а также агара Мюллера-Хинтон При определении МПК в бульоне Мюллера-Хинтон были получены данные, несопоставимые с МПК на вышеперечисленных средах, кроме того, они не коррелировали с диаметрами зон задержки роста энтерококков, определенными диск-диффузионным методом

Проведено изучение диск-диффузионным методом чувствительности энтерококков к ряду препаратов фторхинолоновой группы ципроф-локсацину, левофлоксацину, гатифлоксацину, спарфлоксацину В доступной отечественной литературе данных о чувствительности энтерококков к трем последним препаратам обнаружено не было В результате было выявлено, что большее количество штаммов энтерококков промежуточны по чувствительное!и к фторхинолонам Некоторые данные чувствительности энтерококков к антибиотикам, полученные диск-диффузионным методом приведены в таблице 1

Таблица 1

Результаты определения чувствительности энтерококков

к антибиотикам диск-диффузионным методом на среде АГВ

Антибиотик Колтество нпаммов

Чувсгеигелы шх Промежуточных по чувствительности Устойчивых

бензилпеницшшп I 145 - 41

ампициллин 148 - 38

ванкомицин 180 6 -

линезолиц 179 7 -

стрептомицин 139 - 47

гентамицин 160 1 25

ципрофлоксацин 46 116 24

спарфлоксапин 71 89 26

гагафлоксацин 88 73 25

леюфлокеаиин 65 99 22

*-чувствительность условная,определенная дисками с высоким содержанием аминогликозидов, и расчитанная только на потенцирующее действие в сочетание с основными антибиотиками

В ходе первой части исследований было отмечено, что в зависимости от условий эксперимента (в данном случае от состава питательной среды) могут быть получены весьма различные результаты тестирования чувствительности энтерококков к антибиотикам Такие же результаты получены зарубежными исследователями Объяснить этот факт ингибирую-щим действием какого-либо компонента питательной среды невозможно В доступной литературе очевидного объяснения также не найдено Одной из причин такого положения могло быть недостаточное понимание того, как идет процесс зонообразования при диффузии антибиотиков в пита-

тельную среду, и н о кул иро ванную энтерококками. Некоторые вопросы являлись предметом изучения в настоящей работе.

Был впервые изучен процесс зонообразования при диффузии антимикробных соединений из дисков в засеянную энтерококками питательную среду. Объектом исследования были наиболее значимые лекарственные средства, применяемые для терапии знтеракокковых заболеваний (бензилпенициллин, ампициллин, ванкомицин, гентамицин и стрептомицин), а также некоторые препараты, чья терапевтическая перспективность является в настоящее время предметом для обсуждения (ципрофлоксацин, спарфлоксацин, гатифлоксацин и левофлоксацин). Было показано, что величина зоны подавления роста энтерококка при диффузии антибиотика в питательную среду зависит от концентрации антимикробного вещества в диске, что закономерно. Однако данная зависимость оказалась пропорциональна, линейна только в определенном, ограниченном диапазоне концентраций. При изучении данного вопроса при использовании дисков с бензилпенициллином и ампициллином, прямая зависимости между размером зон подавления роста тест-культуры энтерококка и концентрацией антибиотика в диске отмечена в сравнительно узких пределах от 5 до 20 мкг/диск (рис. 1). Линейная зависимость при использовании дисков с ван-комииином также прослежена, но при концентрации данного антибиотика в диске в пределах от 15 до 60 мкг/диск (рис.1). При использовании дисков с гентамицином кривая «доза-эффект» была линейна при концентрациях антибиотика в диске от 45 до ¡20 мкг/диск (рис.2). В опытах с дисками со стрептомицином кривая «доза-эффект» была линейна в пределах концентраций от 125 до 300 мкг/диск (рис.2).

«

культура Е.ГаесаИз 101, В -бензилпенициллина.

С - ванкомицина, культура Е^аесаНк 136

культура ЕТаесаПэ АТСС 29212,

Рис. 2. Кривая зависимости «доза эффект»: А - гентамицина, культура ЕТаесаИз 12, В - стрептомицина, культура Е^аесаНз 92

В опытах со фторхинолонами линейная зависимость прослеживалась в диапазоне концентраций от 2,5 до 10 мкг/диск. Угол наклона выпрямленного участка кривых «доза-эффект» перечисленных антибиотиков имел сходные характеристики и был близок к оптимальному, т.е. разрыв между диаметрами зон подавления роста при двукратном увеличении концентраций колебался в пределах 1,5-4,0 мм (рис.3-5). При увеличении концентраций антибиотика во всех вариантах наблюдали увеличение угла наклона кривой зависимости «доза-эффект», и, наоборот, при уменьшении концентраций антибиотика наблюдали уменьшение угла наклона кривой зависимости, соответственно с увеличением разницы диаметров зон подавления роста микроба. В результате, при больших концентрациях препаратов в дисках диаметр зон менялся незначительно, не адекватно кратности увеличения концентрации антибиотика, а при малых концентрациях антибиотика возрастал также непропорционально. В таких случаях возможность ошибки при интерпретации результатов существенно увеличивается. Исследования, проведенные дополнительно со штаммами стафилококка в опытах со спарфлоксацином, левофлоксацином и гатифлокса-цином показали, что данный эффект является универсальным и не зависит от принадлежности бактерий к той или иной таксономической группе, также как к одному виду (рис. 3-5), Важно отметить, что полученные кривые зависимости «доза-зффект» не были параллельны друг другу, угол наклона кривых был различен.

Рис. 3. Кривая зависимости «доза-зффект» Рис. 4. Кривая зависимости

спарфлоксацина, А - культура Е. faecal is «доза-эффект» гзтифлоксацина,

А ТСС 29212, В - S.aureus 209Р, А - культура Е. faecal is АТСС 29212,

С - S.aureus АТСС 25923 В - S.aureus 209Р

I Г ; {¡¡¡К *

20.fr-

е

Рис. 5. Кривая зависимости «доза-эффект» левофлоксацина, А - культура Е.ГаесаПз АТСС 29212, В - 5.аигеи$ 209Р

1 '

-1

и н

У;

■■ •» * А Га Й V 4* «и

Данный факт дает основание для обсуждения проблемы возможности стандартизации дисков с единственной для всех микроорганизмов концентрацией, Показано, что эти

закономерности не связаны с питательными средами, они выявлены как на среде АГВ, так и на агаре М юл л ера- X и н то н, Опираясь на полученные данные, можно было предположить, что концентрация антибиотика в геле при диффузии его из дисков - величина, которая меняется во времени, а также, что концентрация в определенный промежуток времени может быть недостаточной для образования зоны. В связи с этим была поставлена задача изучить диффузию некоторых антибиотиков из дисков в питательную среду, засеянную энтерококками. Для выполнения данной задачи были изготовлены стандартные диски с ампициллином (10 мкг/диск), ванко-мицином (30 мкг/диск) и гентамицином (120 мкг/диск), а также предложена методика исследования. Изучали концентрацию каждого исследуемого антибиотика па определенном расстоянии от края диска, который накладывали на незасеянный агар. Результаты исследования показали, что процесс проникновения ампициллина, ваикомицина и гентамицина в гель имел разную динамику. При проникновении ампициллина из диска в питательную среду (рис. 6) сначала происходило постепенное увеличение концентраций антибиотика (в течение 2-4 часов), далее значительная часть препарата постепенно снижалась в течение 19-20 часов, после чего концентрация стабилизировалась на достигнутом уровне (максимальное время наблюдения - 24 часа). Динамика процесса проникновения ваикомицина из диска в среду была в первые часы схожа с динамикой проникновения ампициллина в среду, но была более растянута во времени. Наибольшую концентрацию антибиотика наблюдали через 12 часов. Данная концентрация ваикомицина стабилизировалась ¡¡а определенный период времени с последующем снижением (рис. 7). В опытах с дисками, пропитанными гентамицином, наблюдали постепенное увеличение концентрации антибиотика в геле (вне зависимости от расстояния от края диска) и стабилизацию достигнутых концентраций (максимальное время наблюдения - 24 часа). Следует отметить, что процесс проникновения гентамицина из диска в среду проходил немного быстрее, чем процесс проникновения ваикомицина в среду. Максимальную концентрацию данного аминоглико-з и дно го антибиотика наблюдали через 8 часов (рис 8). Следует отметить, что четкую видимую зону вокруг дисков с ампициллином, ванкомицином,

гентамицином можно было наблюдать через 15-17 часов инкубации, что было адекватно времени образования газона (рис. 6-8)

КОС* 10 3 на/нл

1га«

9ХЛ

«а>

Рис 6 Сопоставление параметров зонообразования при диффузии в гель ампициллина и росте Е &еса1|5 101 1 - диаметр зоны на расстоянии 5 мм от края диска

2- Диаметр зоны на расстоянии 7,5 мм от края диска

3- Диаметр зоны на расстоянии 10 мм от края диска

4- Диаметр зоны на расстоянии 12 мм от края диска

5- Кривая роста тест-культуры Е faecaIlS 101

6- Образование зоны

Рис 7 Сопоставление параметров зонообразования при диффузии в гель ванкомицина и росте Е Гаесайв 136

1- диаметр зоны на расстоянии 5 мм от края диска

2- Диаметр зоны на расстоянии 7,5 мм о г края диска

3- Диаметр зоны на расстоянии 10 мм от края диска

4- Кривая роста тест-культуры Е Саесайя 136

5- Образование зоны

Рис 8 Сопоставление параметров зонообразования при диффузии в гель гентамицина и росте Е РаесаЙБ 12 1 - диаметр зоны на расстоянии 5 мм от края диска

2- Диаметр зоны на расстоянии 7,5 мм от края диска

3- Диаметр зоны на расстоянии 10 мм от края диска

4- Кривая роста тест-культуры -—: Е ГаесаЬя 12

5- Образование зоны

Анализ этой части исследования подтвердил, что в геле концентрация препарата, диффундирующего из диска, величина переменная, что на микроорганизм, которым инокулирована поверхность питательной среды, в различные промежутки времени действуют существенно отличающиеся друг от друга концентрации антибиотика, которые на разном расстоянии

от края диска различны, порой значительно И все это происходит именно в тот период, когда формируется зона Следует заметить, что все это делает «метод дисков» принципиально отличным от метода серийных разведений, хотя данные, полученные с помощью последнего (МПК), являются фундаментом для интерпретации результатов, полученных «методом дисков» Очевидно, что возникший в этой связи вопрос, насколько изменение концентрации в дисках или в геле (допущено, что первое может моделировать второе) влияет на зонообразование, закономерен и позволяет не только ответить положительно, но и в определенной степени, объяснить и характер кривых зависимости «концентрация - диаметр зоны», и те некоторые разночтения, которые существуют при трактовке данных, получаемых разными методами определения чувствительности - методом серийных разведений и диск-диффузионным методом Если МПК антибиотика для двух разных культур совпадают, но кривые зависимости имеют разный наклон или разные «выпрямленные» участки, то при пограничных значениях так называемых табличных данных результаты при сравнении чувствительности будут носить случайный характер

Следующим шагом в исследованиях было сопоставление полученных характеристик диффузии антибиотиков из дисков в питательную среду с ростом популяций энтерококка на поверхности агара, а также с визуально очевидным образованием зоны подавления роста микроорганизма Исследовали рост тех тест-штаммов энтерококка, которые были использованы в опытах при изучении диффузии ампициллина, ванкомицина и ген-тамицина в гель (рис 6-8) Как показали результаты эксперимента, кривые роста изученных популяций энтерококков на среде АГВ были достаточно традиционны для роста популяции бактерий Наблюдали все его типичные фазы Однако следует подчеркнуть, что стационарная фаза и лаг-фаза имели достаточно продолжительный период времени (7-9 часов), а это, безусловно, влияет на процесс зонообразования Значительная продолжительность первых двух фаз роста популяций лишний раз подтверждает высказанное выше предположение, что процесс зонообразования происходит при постоянно меняющихся условиях Нет стабильного (как в случае использования метода серийных разведений) воздействия антибиотика на традиционно меняющуюся популяцию энтерококка Из этого следует, что какое-либо изменение условий эксперимента — состава и качества питательной среды, величины инокулюма, физиологической активности клеток, качества дисков, нарушение техники и условий проведения анализа может привести к радикальным изменениям при определении чувствительности энтерококка к антибиотикам Совпадение времени образования видимой глазом зоны подавления роста энтерококков и времени образования газона логично, так как визуальное выявление зоны без образовавшегося газона невозможно Но данный период составляет 15-17 часов, когда происходит процесс зонообразования и установление градиента концентраций антибактериального вещества, диффундирующего из диска в питательную среду Поэтому можно предположить, что процесс образования зоны носит поэтапный характер В исследованиях, проведенных по

диффузии ампициллина, ванкомицина и гентамицина в гель данное предположение допустимо

При анализе результатов определения чувствительности, полученных диск-диффузионньгм методом на среде АГВ и среде Мюллера-Хинтон была отмечена тенденция к большим диаметрам зон на отечественной среде, в особенности при минимальных МПК (0,25-0,5 мкг/мл) Данная тенденция выявлялась четко на примере с бензилпенициллином и ампициллином Для штаммов энтерококков, МПК бензилпенициллина которых составляли 0,25-0,5 мкг/мл, диаметр зон подавления роста культ>р на среде Мюллера-Хинтон был максимально 28 мм, на среде АГВ диаметр зон подавления роста этих штаммов составлял максимально 35 мм Для культур энтерококков, МПК ампициллина которых составляли 0,5 мкг/мл, диаметр зон подавления роста данных культур на среде Мюллера-Хинтон был максимально 33 мм, а на среде АГВ - 35 мм В опытах с ванкомици-ном тенденция к увеличению диаметров зон на среде АГВ была особенно заметна для штаммов, МПК которых граничили с промежуточными (2-4 мкг/мл) В опытах с аминогликозидными антибиотиками, как с гентами-цином, так и со стрептомицином, тенденция к большим зонам на среде АГВ имела место, но была не сголь отчетлива, как в опытах с ванкомици-ном или р-лактамными антибиотиками Сравнительный анализ распределения штаммов энтерококков по чувствительности к ципрофлоксацину и спарфлоксацину на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтон показал, что разница в диаметрах зон подавления роста, полученных на этих двух средах, была минимальна

Следует отметить, что при сравнительном анализе результатов, полученных методом серийных разведений и диск-диффузионным методом, «значительные ошибки» наблюдались в опытах со спарфлоксацином как на среде АГВ, так и на агаре Мюллера-Хинтон Кроме того, в опытах с данным антибиотиком было выявлено множество так называемых «малых» выпадающих значений Следовательно, разработка и уточнение Ьгсакрои^я спарфлоксацина для энтерококков является очевидной задачей В опытах с ципрофлоксацином «серьезные» выпадающие значения отсутствовали, но были выявлены «малые» ошибки 3 на агаре Мюллера-Хинтон и 1 на среде АГВ В проведенных исследованиях с Р-лактамными (бензилпенициллин и ампициллин) и аминогликозидными (гентамицин и стрептомицин) антибиотиками «серьезных» выпадающих значений не наблюдали При сравнительном анализе результатов, полученных методом серийных разведений и диск-диффузионным методом в исследованиях с ванкомицином, «значительные» ошибки отсутствовали Однако было определено 6 «малых» ошибок на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтон Эти исследования показали, что среда АГВ может быть использована для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам В то же время было отмечено, что результаты, полученные на двух основных питательных средах, могут быть различны, а это, при пограничных значениях диаметров зон, способно привести к противоречивым показателям Этот вопрос требовал уточнения для проведения исследований, являющихся ис-

ходными при конструировании дисков с гснтамицином (120 мкг/диск) и стрептомицином (300 мкг/диск) с использованием всех отечественных компонентов, как для изготовления дисков, так и их анализа

Предложена технология изготовления дисков с гентамицином 120 мкг/диск и стрептомицином 300 мкг/диск, которая обеспечивает необходимые контрольные показатели подавления роста энтерококка Размеры зон при этом располагались на кривой зависимости «доза-эффект», где эта зависимость носила линейный характер Исследования, выполненные в 2002-2006 годах по оценки действия индикаторных дисков с гентамицином 120 мкг и стрептомицином 300 мкг на референс-культуру Е faecalis АТСС 29212, проведенные на среде АГВ и агаре Мюллера-Хинтон, позволили предложить контрольные значения диаметров зон подавления роста данного референс-инамма для среды АГВ Эксперименты показывают, что диаметры зон референс-штамма Е faecalis АТСС 29212 как на среде АГВ, так и на агаре Мюллера-Хинтон, близки Однако, как уже обсуждалось выше, существует тенденция к большим зонам на среде АГВ Так, наибольший размер зоны подавления роста референс-штамма гентамицином на среде АГВ составлял 21 мм, на агаре Мюллера-Хинтон такой размер зоны отмечен не был В то же время на среде Мюллера-Хинтон в 11 из 210 случаях наблюдался размер зоны 14 мм, но данного диаметра на среде АГВ обнаружено не было, они были большими На основании статистической обработки полученных данных были предложены контрольные значения диаметров зон подавления роста референс-штамма Е faecalis АТСС 29212 гентамицином 120 на среде АГВ в пределах 15-22 мм При анализе данных о размерах зон подавления роста референс-штамма Е faecalis АТСС 29212 стрептомицином также отмечена тенденция к большим зонам на среде АГВ Наибольший диаметр зоны подавления роста референс-штамма на среде АГВ составлял 21 мм Данный размер зоны остутствовал на среде Мюллера-Хинтон И наоборот, меньший размер зоны подавления роста 12 мм, который наблюдали на агаре Мюллера-Хинтон, отсутствовал на среде АГВ На основании статистической обработки полученных результатов были предложены контрольные значения зон подавления роста референс-штамма Е faecalis АТСС 29212 стрептомицином на среде АГВ в пределах 13-19 мм Способ получения индикаторных дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и методика контроля их качества включены в нормативно-техническую документацию, одобренную Министерством здравоохранения РФ (регистрационное удостоверение № ФС 01260093/0296-04 от 30 августа 2004 года, изменение №2 ТУ 99398-001-39484474 -2000, утверждены в 2004 году) и опытный промышленный регламент № 1

Полученные данные в ряде случаев подтвердили известную информацию, в основном зарубежную Другие полученные результаты могут считаться ранее неизвестными Это в основном касается особенностей процессов, определяющих золообразование при диффузии антибиотиков из дисков в засеянную энтерококками питательную среду При всей очевидной важности они ранее не были объектом изучения Как те, так и дру-

гие результаты исследований могут быть использованы в медицинской практике, и особенно при уточнении требований к стандартизации определения чувствительности энтерококков к антибиотикам, что, по существующим требованиям, предполагает многоцентровые исследования

Выводы

1 При изучении чувствительности энтерококков, выделенных из биосубстратов больных детей, к антимикробным лекарственным средствам показано, что к бензилпенициллину и ампициллину устойчиво 20-22% штаммов, к фторхинолоновым препаратам (ципрофлоксацину, гатиф-локсацину, спарфлоксацину, левофлоксацину) устойчиво от 12 до 14% штаммов, при значительном количестве (до 60%) промежуточных по чувствительности микроор! анизмов Не обнаружены энтерококки, устойчивые к ванкомицину и линезолиду

2 Чувствительность энтерококков к антибиотикам аминогликозидной группы варьирует в широких пределах К гентамицину чувствительно (условно) 86% культур, но 13% - высокорезистентно, к стрептомицину чувствительно (условно) 75% культур, высокорезистентно - 25% Строгая перекрестная устойчивость энтерококков к гентамицину, тоб-рамицину и амикацину отсутствует

3 При изучении диффузии ампициллина, ванкомицина и гетамицина из диска в питательную среду выявлено три варианта динамики содержания препаратов в питательной среде вокруг дисков концентрация в течение определенного промежутка времени достигает максимума, а затем постепенно снижается, после чего стабилизируется на достигнутом уровне (ампициллин), концентрация достигает наибольшей величины, сохраняется на этом уровне несколько часов, а затем снижается (ван-комицин), концентрация, достигнув максимума, остается стабильной (гентамицин) В период формирования зоны подавления роста энтерококка наибольшая концентрация антибиотиков в геле отмечена на минимальном расстоянии от диска, наименьшую - у края зоны При использовании диск-диффузионного метода, антибиотик воздействует на тестируемый микроорганизм в меняющихся концентрациях, как во времени, так и в разных участках геля по отношению к диску

4 Линейная (прямая) зависимость между концентрацией противомикроб-ного препарата в диске при его диффузии в питательную среду и диаметром зоны подавления роста энтерококка ограничена Показано, что для микроорганизмов различных таксономических групп и, даже, для представителей микроорганизмов одного вида, кривые зависимости между концентрацией антибиотика в диске и размером зоны подавления роста микроба могут отличаться друг от друга как по наклону (быть не параллельными), так и по конфигурации С учетом перманентно меняющейся концентрации в геле диффундирующего из диска антимикробного препарата это делает возможным получение недостоверных и несравнимых данных о чувствительности энтерококков к ан-

тибиотикам при пограничных значениях величин диаметров зон подавления роста микроба

5 Сравнением чувствительности энтерококков к бензилпенициллину, ампициллину, ванкомицину, гентамицину, стрептомицину, ципрофлокса-цину и спарфлоксацину, определенной диск-диффузионным методом с использованием среды АГВ и плотной среды Мюллера-Хинтон показано, что в обоих случаях величины диаметров зон подавления роста близки Однако на среде АГВ диаметры зон, как правило, были на 1-3 мм большими, чем на агаризованной среде Мюллсра-Хинтои

6 На основании многократного повторного изучения чувствительности референс-штамма Е faecahs АТСС 29212 к стрептомицину и гентамицину, определенной диск-диффузионным методом с использованием дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и среды АГВ, предложены следующие контрольные значения диаметров зон подавления роста микроба на среде АГВ 14-22 мм для диска со стрептомицином, 15-22 мм для диска с гентамицином

7. Разработан способ получения индикаторных дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и методика контроля их качества, которые включены в нормативно-техническую документацию, одобренную Министерством здравоохранения РФ (регистрационное удостоверение № ФС 01260093/0296-04 от 30 августа 2004 года, изменение №2 ТУ 99398-001-39484474 -2000, утверждены в 2004 году) и опытный промышленный регламент № 1 Диски внедрены в производство и широкую клиническую (лабораторную) практику

Список работ, опубликованный по теме диссертации

1 Чувствительность энтерококков к антибиотикам, определенная методом серийных разведений и дисков // Научная конференция и VIII съезд итало-российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине", Санкт-Петербург - 2002 С 406-407

2 Сравнительная чувствительность энтерококков к некоторым антибиотикам, определенная методом серийных разведений и дисков // Материалы научно - практической конференции «Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе Клинико-лабораторное обеспечение инфектологии», Москва -2003 С 177-178

3 Сравнительная чувствительность энтерококков к аминогликозидным антибиотикам, определенная различными методами // Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им И И Мечникова - 2004 № 2 - С 95-99

4 Стандартизация контрольных исследований при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам диск-диффузионным методом с использованием отечественных питательных сред // Проблемы стандартизации в Здравоохранении - 2004 № 4 - С 2530 (в соавторстве)

5 Процесс зонообразования как фактор стандартизации определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диск-диффузионным ме-

тодом // Клиническая лабораторная диагностика, Москва - 2005 № 9 -С 28 (в соавторстве)

6 Стандартизация некоторых дисков с противобактериальными антибиотиками // Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им И И Мечникова - 2006 № 1 - С 142 -145 (в соавторстве)

7 Сравнение среды АГВ и агара Мюллера-Хинтон при определении чувствительности энтерококков к некоторым антибиотикам диск-диффузионным методом // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва -2006 -С 100-101

8 Некоторые факторы, влияющие на результативность диск-диффузионного метода определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам // Клиническая лабораторная диагностика - 2007 №5 (принята к печати)

I

Подписано в печать 24 04 07 г Печать ротапринт Бумага офсет Формат 60x84 1/16 Объем 1,25 п л Тираж! 00 экз Заказ № 325

Отпечатано в типографии ИОВ РАО 191180, Санкт-Петербург, наб р Фонтанки, 78

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цветкова, Ирина Андреевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 .Энтерококки, их характеристика и роль в патологии

1.2. Чувствительность энтерококков к антимикробным лекарственным средствам

1.3. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и их стандартизация

1.4. Особенности определения чувствительности энтерококков к противомикробным лекарственным средствам

1.5. Конструирование индикаторных дисков и их стандартизация. Зонообразование, как основа диск-диффузионного метода. Критерии контрольных величин и зон подавления роста

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Собственные исследования

3.1. Результаты определения чувствительности энтерококков к антимикробным препаратам

3.2. Изучение процесса зонообразования при диффузии антимикробных соединений из дисков в засеянную энтерококками питательную среду. Перспектива дальнейшей стандартизации диск-диффузионного метода

3.3. Конструирование индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антимикробным препаратам

Глава 4. Обсуждение результатов 1.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обоснование, конструирование и стандартизация индикаторных дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам"

Энтерококки в настоящее время относятся к числу частых возбудителей госпитальных инфекций и ряда тяжелых заболеваний, в том числе септического эндокардита [100]. Если, в 1984 году эти микроорганизмы были возбудителями госпитальной инфекции только в 2 % случаев, то к 1992 году эта цифра возросла до 10 % [34]. В настоящее время широкое распространение энтерококков как возбудителей инфекций зачастую связано с применением антибиотиков, в том числе цефалоспоринов II и III поколения [57,74,]. Особую тревогу вызвало появление и распространение за рубежом ванкомицинрезистентных штаммов E.faecium, так как в настоящее, время не предложены препараты или схемы антибактериальной терапии, полностью эффективные при лечении таких инфекций [34,41,43]. Энтерококки по сравнению с многими другими микрорганизма-ми отличаются низкой чувствительностью к большому числу антибиотиков [29,73,88,130]. Это определяется конститутивной природой устойчивости и наличием ряда механизмов вторичной резистентности энтерококков к противо-микробным препаратам [46, 70, 86, 94, 113,144]. В силу этого, начиная с середины 80-х годов энтерококковые инфекции стали в большинстве своём трудноизлечимы антибиотиками. Эти инфекции тревожат медицинскую общественность в связи с появлением «полирезистентных» энтерококков [57,58,68,70,80,88].

Важной задачей микробиологических лабораторий клинических учреждений является определение чувствительности энтерококков к антибактериальным препаратам [9,16,18,20]. В мировой практике для этой цели достаточно часто используют метод диффузии антимикробного вещества из дисков-в ино-' кулированную питательную среду, т.е. диск-диффузионный метод [20,107,142]. В нашей стране этот метод является не просто доминирующим, а практически основным [9,16,18,20,30]. Однако простота диск - диффузионного метода является кажущейся. Правильность проведения исследования и учета полученных результатов зависит от многих факторов: состава и качества питательной среды, стандартных дисков, температурного режима и времени инкубации, свойств антимикробного вещества, чувствительности микроорганизма к исследуемому антибиотику и целого ряда других, в том числе недостаточно изученных факто ров [18,20]. В отечественной практике возникают сомнения в стандартности исследований ещё и потому, что при трактовке результатов используют табличные значения контрольных диаметров зон подавления роста, установленные 20 лет назад или повторяющие показатели, предложенные NCCLS [107], что.не совсем корректно, так как российские исследователи в основном для определения чувствительности используют среду АГВ [18,23,30], которая существенно отличается по составу от среды Мюллера - Хинтон, применяемой за рубежом [21]. В связи со всем сказанным выше, выбор метода дисков для определения чувствительности энтерококков к антибиотикам нельзя назвать полностью обоснованным. Более трудоемкий, но более точный - метод серийных разведений, при котором определяется минимальная подавляющая концентрация антибиотика (МГПС), обеспечивающая прекращение репродукции возбудителя, в большинстве случаев, отходит на второй план [16,19,106]. Известно, что энтерококки относятся к таким микроорганизмам, которые при определении их чувствительности к антибиотикам могут давать ошибочную информацию. Например in vitro они могут быть чувствительны к цефалоспоринам, аминоглико-зидам, макролидам, хотя фактически энтерококки к этим антибиотикам резистентны [57,65,68,144]. Следует также отметить, что исследований в этой об' • * ласти немного и они не носят углубленного характера. Определенное влияние на результаты оказывает методология исследования [16,106,107,144].

Так как энтерококки могут быть возбудителями эндокардита, менингита, неонатального и интра-абдоминального сепсиса, пневмонии, перитонита, раневой и ожоговой инфекции - заболеваний, когда жизнь человека находится в большой опасности, наиболее необходимым представляется правильный выбор антибактериальной терапии [41,47,53,70]. Для этого необходима точная информация о чувствительности возбудителя к антибиотикам. Многочисленные «исключения», несовпадение чувствительности энтерококков к ряду антибиотиков in vivo говорят о том, что вопросы стандартизации методов определения" чувствительности (устойчивости) энтерококков заслуживают дальнейшего изучения, в том числе путем изучения закономерностей зонообразования при диффузии антибиотиков из дисков, тех условий, которые влияют на размер зоны подавления роста. Эти вопросы до сих пор остались не в поле зрения микробиологов.

При выполнении настоящей работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить и сравнить результаты определения чувствительности энтерококков к антибиотическим препаратам диск-диффузионным методом и методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.

2. Изучить процессы диффузии основных препаратов, активных в отношении энтерококков, из индикаторных дисков в гель (питательную среду) и сопоставить их с ростом культуры энтерококков и образованием зоны подавления роста. • '

3. Изучить закономерности зонообразования при диффузии антибиотиков в питательную среду в зависимости от концентрации препаратов и их влияния на стандартность исследования.

4. Определить возможность использования контрольных значений диаметров зон подавления роста энтерококков при диффузии антибиотиков из дисков в среду АГВ.

5. Предложить контрольные значения диаметров зон подавления роста ген-тамицина 120 мкг/диск и стрептомицина 300 мкг/диск для референс-штамма E.faecalis АТСС-29212 для среды АГВ.

6. Разработать схему получения и оценки качественных показателей дисков с гентамицином и стрептомицином для определения чувствительности энтерококков к этим антибиотикам. 7

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Цветкова, Ирина Андреевна

Выводы

1. При изучении чувствительности энтерококков, выделенных из биосуб- . стратов больных детей, к антимикробным лекарственным средствам показано, что к бензилпенициллину и ампициллину устойчиво 20-22% штаммов, к фторхинолоновым препаратам (ципрофлоксацину, гатифлоксацину, спарфлоксацину, левофлоксацину) устойчиво от 12 до 14% штаммов, при значительном количестве (до 60%) промежуточных по чувствительности микроорганизмов. Не обнаружены энтерококки, устойчивые к ванкомицину и линезолиду.

2. Чувствительность энтерококков к антибиотикам аминогликозидной группы варьирует в широких пределах. К гентамицину чувствительно (условно) 86% культур, но 13% - высокорезистентно, к стрептомицину чувствительно (условно) 75% культур, высокорезистентно - 25%. Строгая перекрестная устойчивость энтерококков к гентамицину, тобрамицину и ами-кацину отсутствует. ' .

3. При изучении диффузии ампициллина, ванкомицина и гентамицина из диска в питательную среду выявлено три варианта динамики содержания препаратов в питательной среде вокруг дисков: концентрация в течение определенного промежутка времени достигает максимума, а затем постепенно снижается, после чего стабилизируется на достигнутом уровне (ампициллин), концентрация достигает наибольшей величины, сохраняется на этом уровне несколько часов, а затем снижается (ванкомицин), концентрация, достигнув максимума, остается стабильной (гентамицин). В период формирования зоны подавления роста энтерококка наибольшая концентрация антибиотиков в геле отмечена на минимальном расстоянии от диска, наименьшую - у края зоны. При использовании диск-диффузионного метода, антибиотик воздействует на тестируемый микроорганизм в меняющихся концентрациях, как во времени, так и в разных участках геля по отношению к диску.

4. Линейная (прямая) зависимость между концентрацией противомикробного препарата в диске при его диффузии в питательную среду и диаметром зоны подавления роста энтерококка ограничена. Показано, что для микроорганизмов различных таксономических групп и, даже, для представителей микроорганизмов одного вида, кривые зависимости между концентрацией антибиотика в диске и размером зоны подавления роста микроба могут отличаться друг от друга как по наклону (быть не параллельными), так и.по конфигурации. С учетом перманентно меняющейся концентрации в геле диффундирующего из диска антимикробного препарата это делает возможным получение недостоверных и несравнимых данных о чувствительности энтерококков к антибиотикам при пограничных значениях величин диаметров зон подавления роста микроба.

5. Сравнением чувствительности энтерококков к бензил пенициллину, ампициллину, ванкомицину, гентамицину, стрептомицину, ципрофлоксацину и спарфлоксацину, определенной диск-диффузионным методом с использованием среды АГВ и плотной среды Мюллера-Хинтон показано, что в обоих случаях величины диаметров зон подавления роста близки. Однако на среде АГВ диаметры зон, как правило, были на 1-3 мм большими, чем на агаризованной среде Мюллера-Хинтон.

6. На основании многократного повторного изучения чувствительности ре-ференс-штамма E.faecalis АТСС 29212 к стрептомицину и гентамицину, определенной диск-диффузионным методом с использованием дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и среды АГВ, предложены следующие контрольные значения диаметров зон подавления роста микроба на среде АГВ: 14-22 мм для диска со стрептомицином, 15-22 мм для диска с гентамицином.

7. Разработан способ получения индикаторных дисков со стрептомицином 300 мкг и гентамицином 120 мкг и методика контроля их качества, которые включены в нормативно-техническую документацию, одобренную Министерством здравоохранения РФ (регистрационное удостоверение №

ФС 01260093/0296-04 от 30 августа 2004 года, изменение №2 ТУ 99398001-39484474 -2000, утверждены в 2004 году) и экспериментально-промышленный регламент № 1. Диски внедрены в производство и широкую клиническую (лабораторную) практику.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветкова, Ирина Андреевна, Санкт-Петербург

1. Азанчевская С.В. Разработка метода определения чувствительности дрожжеподобных грибов рода Кандида .к флуконазолу с использованием индикаторных дисков // Вестник Санкт-Петербургской Академии им. И. И. Мечникова. 2004. №2. - С. 99-103.

2. Азанчевская С.В., Цветкова И.А., Поляк М.С. Стандартизация некоторых дисков с противобактериальными антибиотиками // Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И.И. Мечникова. 2006. № 1. - С. 142 - 145.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А; Статистические методы в микробиологических исследованиях. М., 1962.-180 с.

4. Бойцов А.Г., Иванов В.П., Ластовка О.Н., Порин А.А. Введение в клиническую микробиологию. СПб., 1999. - 152 с.

5. Гучев И.А. Современные препараты в лечении инфекций, вызванных ок-сациллинустойчивыми стафилококками и энтерококками // Инфекции и антимикробная терапия. 2005. №2. - С. 253 - 258.

6. ГФ XI СССР. Вып.2. М.: Медицина, 1990. - 400 с.

7. Диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами. ДИ-ПЛС-50-01, ТУ 9398 001 - 39484474 - 00, 2000. - 28 с.

8. Иванов В.П., Постовит В.А., Бойцов А.Г., Гранстрем К.О. Клиническая и лабораторная диагностика инфекционного процесса. СПб., 1996. - 102 с.

9. Методы бактериологического исследования в клинической микробиологии. Методические рекомендации. М., 1983. - 39 с.

10. Митницкий А.Б., Фрадкова Т.А., Поляк М.С. Математическая модель зонообразования при диффузии полиеновых антибиотиков в зараженный гель//Антибиотики. 1980. №6. - С. 449-453.

11. Митницкий А.Б., Фрадкова Т.А., Поляк М.С. Математическая модель зонообразования с учетом инактивации полиеновых антибиотиков, диффундирующих в зараженный гель // Антибиотики. 1981. №9. - С. 676-679.

12. Митницкий А.Б., Фрадкова Т.А., Поляк М.С. Размер зоны подавления роста тест культуры при диффузии полиеновых антибиотиков в зараженный гель как функция времени // Антибиотики. - 1982. №6. - С. 422-424.

13. Определение биологической активности полиеновых антибиотиков. Методические указания. JL, 1979. - С. 4 -11.

14. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания.-М., 2004. 76 с.

15. Поляк М.С. Основы антибиотикотерапии. СПб.: Анатолия, 2003. - 56 с.

16. Поляк М.С. Определение чувствительности микроорганизмов к противо-микробным препаратам "методом дисков": Лекции по фармакотера-пии.1997.-№1(6). - 20 с.

17. Поляк М.С. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений: Лекции по фармакотерапии. -2000. №10.-17 с.

18. Поляк М.С. Теория и практика определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам диск-диффузионным методом // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №1. - С. 25-32.

19. Поляк М.С., Азанчевская С.В., Цветкова И.А. Процесс зонообразования как фактор стандартизации определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам диск-диффузионным методом // Клин. лаб. диагностика.-2005. №9. G. 28.

20. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. СПб.: Анатолия, 2003. 148 с.

21. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии^ Под ред. JI.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. М.: Боргес, 2002. 384 с.

22. Приказ № 535 Министерства здравоохранения СССР от 22 апреля 1985 г. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

23. Работнова И.Л., Иванова И.И. Рост и развитие микробных культур // Успехи микробиологии. -1971. вып.7. - С. 67-107.

24. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности, определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. № 4. - С. 348-354.

25. Сидоренко С.В. Клиническое значение антибиотикорезистентности грам-положительных микроорганизмов // Consilium Medicum. 2003. № 2. - С. 89.

26. Сидоренко С.В., Резван С.П;, Грудинина С.А., Кротова Л.А., Стерхова Г.В. Результаты многоцентрового исследования антибиотикочувствитель-ности энтерококков // Антибиотики и химиотерапия. 1998. №9. - С. 9-18.

27. Современные методы клинической микробиологии. / Под ред. Л.С. Страчунского, Р.С. Козлова. Смоленск, 2003.- 348 с.

28. Страчунский Л.С., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничные MRSA -новая проблема антибиотикорезистентности // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005. №1. - С. 32-46!

29. Энтерококки. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории: Руководство / А.В. Дехнич / Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Агат-Мед, 2003.-т. 4.-С. 367-380.

30. Adrews J.M. Determination of minimum inhibitory concentrations // J. Antimicrob. Chemother.- 2001.-Vol. 48.-P. 5-16.

31. Adrews J.M. BSAC standardized disc susceptibility testing method // J. Antimicrob. Chemother. 2001-Vol. 48 - P. 16-27.

32. Andrews F. and Horder T. A study of streptococci pathogenic for man // Lancet. 1906.-Vol. 2: - P. 708-713.

33. Amin E., Lund В., Tjerlund A. et al. Mechanisms of resistance to imipenem in imipenem resistant, ampicillin sensitive Enterococcus faecium // APMIS. -2001. -Vol. 109-P. 791-796.

34. Bonilla H.F., Zervos M.J., Lyons M.J. et al. Colonisation with vancomycin-resistant Enterococcus faecium: comparison of a long-term care unit with an acute-care hospital. Infect. Control // Hosp. Epidemiol. 1997. - Vol. 18 - P. 333-339.

35. Bonilla H.F., Zervos M.J., Kauffman C.A. Long-term survival of vancomycin-resistant Enterococcus faecium on a contaminated surface infect // Control Hosp. Epidemiol. 1996. - Vol. 17. - P. 770-771.

36. Bonten M.J., Hayden M.K., Nathan C. et al. Epidemiology of colonization patients and environment with vancomycin-resistant enterococci // Lancet. -1996.-Vol. 348.-P. 1615-1619.

37. Bonten M.J., Hayden M.K., Nathan C. et al. Stability Vancomycin-resistant enterococcal genotypes isolated from long-term colonized patients // Infect. Dis. 1998.-Vol. 177.-P. 378-382.

38. Bonten M.J., Willems R.J., Weinstein R.A. Vancomycin resistant Enterococci: why are they here, and where do they come from? // Lancet. Infect. Dis. -200L -Vol.1. -P. 314-325.

39. Boyle J.F., Soumakis S.A., Rendo A. et al. Epidemiologic analysis and genotypic characterization of nosocomial outbreak of vancomycin resistant enterococci // Clin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31. - P. 1280-1285.

40. Centers for Diasease Control and Prevention. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) Systems Report, data summary from January 1992 through June 2003, issued August 2003 // Jnfect Control. 2003. - Vol. 31. -P. 481-498.

41. Collins M.D., Jones D., Farrow A.E. et al. Enterococcus avium nov rev.,comb, nov.; E.gallinarum comb. nov. and E.malodoratus sp. nov. // Syst.Bacteriol. 1984. -Vol. 34.-P. 220-223. •

42. Cooper K.E. Theory of antibiotic inhibition zones , in agar media // Nature. -1955.-Vol. 176.-P. 510-511.

43. Cooper K.E. Theory of antibiotic inhibition zones // Analytical microbiology/ -1963. Vol. 1-P. 1-85.

44. Cooper K.E., Gillepsie W. The influence of temperature on streptomycin inhibition zones in agar cultures // Gen.Microbiol. 1952. - Vol. 7. - P. 1-7.

45. Cooper K.E., Linton A. U. The. importance of the temperature during the early hours of incubation of agar plates in assays // Gen.Microbiol. 1952. - Vol. 7. P. 8-13.

46. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. 1999. - Vol. 284. - P. 1318-1322.

47. Diekema D.J., BootsMiller B.J.', Vaughn Т.Е. et al. Antimicrobial resistance trends and outbreak frequency in United States hospitals // Clin. Infect Dis. -2004.-Vol. 38.-P. 78-85.

48. Donabedian S.M., Chow J.W., Shlaes D.M. et al. DNA hybridization and contour- clamed homogeneoselektric field electrophoresis for identification of enterococci to the species level // J.Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 141145.

49. Donskey C.J., Chowdhry Т.К., Hecker M.T. et al. Effect of antibiotic therapy.on the density of vancomycin-resistant enterococci in the stool of colonizedpatients//N. Engl. J. Med. 2000. - Vol. 343.- P. 1925-1932.

50. Draghi D.C., Sheehan D.J., Hogan P., Sahm D.F. In Vitro Activity of Linezolid

51. Against Key Gram-Positive Organisms Isolated in the United States: Results of the

52. ADER 2004 Surveillance Program // Antimicrob. Ag. Chem. 2005.- Vol. 49.1. P. 5024-5032.

53. Eliopoulus G.M., Eliopoulus C.T. Antibiotic combinations: should they be tested? // Clin. Mikrobioi. Rev. 1988. - Vol. 1. - P. 139-156.

54. Eliopoulus G.M., Moellering R.C. Antimicrobial combinations. 1996. Р.ЗЗО-. 396. In V. Lorian. Antibiotics in Labotory Medicine, 4th ed. The Williams and Wilkins Co, Baltimore.

55. El Nakeeb M.A., Yosef R.T. Influence of varions agars on the inhibition zones produced by antibiotics. Indian J. Pharm., 1970. - Vol.32. - P. 6-9.

56. Facklam R.R, Elliot J.A., Identification, classification, fnd clinicalrelevance of catalase negative, gram - positive cocci, excluding the streptococci and enterococci//Clin. Microbiol. Rev.-1995. - Vol. 8.- P. 479-495.

57. Facklam R.R., Sahm D.F. Enterococcus. 1995, p. 308-314. In P.R. Murray, E.F. • Baron, M.A. Ptaller et ol. Manual of Clinical Microbiology, 6th. ed. ASM. Press. Washington.

58. Felmingham D., Wilson A.P.R., Quintana A.I. et al. Enterococcus species in urinary tract infection // Clin. Infect. Dis. 1992.- Vol. 15. - P. 295-301.

59. Fontan a R., Ligozzi M., Pittaluga F., Satta G. Intrinsic penicillin resistance in enterococci // Microbiol. Drug. Res. 1996. - Vol. 2. - P. 209-213.

60. Fridkin S.K., Gaynes R.P. Antimicrobial resistanse in intensive care units // Clin. Chest. Med. 1999. - Vol. 20. - P. 303-316.

61. Gilmore M.S., Coburn P.S., Nallapareddy S.R., Murray B.E. Enterococcal virulence, p. 301-354. In M.S. Gilmore (ed.), The enterococci: pathogenesis, molecular biology, and antibiotic resistance. 2002. American Society for Microbiology, Washington D.C.

62. Gold H.S. Vancomycin resistant enterococci: mechanisms and clinical observations//Clin. Infect Dis. - 2001.-Vol. 33.-P. 210-219.

63. Gonzales R.D., Schreckenberger P.C., Graham M.B. et al. Infections due to vancomycin resistant Enterococcus faecium resistant to linezolid // Lancet. -2001.-Vol. 357.-P. 1179.

64. Goossens H., Habes D., Rossi R. European survey of vancomycin resistant Enterococci in at-risk hospitals wards and in vitro susceptibility testing of ramoplanin against these isolates // Antimicrob. Ag. Chem. - 2003. - Vol. 51. -P. 5-12.

65. Graninger W., Ragette R. Nosocomial bacterimia due to Enterococcus faecalis without endocarditis // Infect. Dis. 1992. - Vol. 57. - P. 49-57.

66. Hachem R., Raad I. Failure of oral antimicrobial agents in eradicating gastrointestinal colonization with vancomycin-resistant Enterococci // Infect. Contr. Hosp. Epiedimeol. 2002. - Vol. 23. - P. 43-44. .

67. Hall L.M.C., Duke В., Urwin'G, et al. Epidemiology of Enterococcus faecalis urinary tract infection in a teaching hospital in London, United Kingdom //Clin Infect. Dis.- 1992.-Vol. 30.-P. 1953-1957.

68. Handwerger S.B., Raucher В., Altrac D. et al. Nosocomial outbreak due to Enterococcus faecium highly resistant to vancomycin, penicillin, and gentamicin //Clin. Infect. Dis.- 1993.-Vol. 16.-P. 750-755. .

69. Hanrahan J., Hoyen C., Rice L.B. Geographic distribution of a large mobile element that transfers- ampicillin and vancomycin resistancte between Enterococcus faecium strains // Antimicrob, Ag. Chem. 2000. - Vol. 44. - P. 1349-1351.

70. Harwick H.J., Halmanson G.M., Guze L.B. In vitro activity of ampicillin or vancomycin combined with gentamicin or streptomycin against enterococci // Antimicrob. Ag. Chem. 1973. - Vol. 4. - P. 383-390.

71. Harwood V.J., Brovynell M., Perusek W. et al. Vancomycin resistant Enterococcus spp. Isolated from Wastewater and Chiken feces in the United States // Appl.Environ.Microbiol. - 2001. - Vol. 67. - P. 4930 -4933.

72. Herrero I.A., Issa N.C.; Patel R. Nosocomial spread of linezolid resistant, vancomycin - resistant Enterococcus faecium // N.Engl. J. Med. - 2002. - Vol. 346.-P. 867-869.

73. Hewitt W. Microbiological Assay. An Introduction into Quantitative Principles and Evalution, Academic Press. New York San Francisco - London, 1977. -542 p.

74. Ingerman M., Pitsakis P.G., Rosenbrg A. et al. Beta-lactamase production in experimental endocarditis due to aminoglycoside-resistant Streptococcus faecalis // Infect. Dis. 1987. - Vol. 155. - P. 1226-1229.

75. Jones R.N., Sader H.S., Erwin M.E. Emerging multiply resistant enterococci among clinical isolates: 1. Prevalence data from 97 medical center surveillance . study in the United States // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1995. - Vol. 21. -P. 85-93.

76. Johnston P.B., Litzow M.R., Elliot M.A. et al. Colonization with vancomycin-resistant Enterococcus correlates with poor outcome in patients undergoing allogeneic blood and marrow transplants // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 786.

77. Lautenbach E., Bilker W.B., Brennan P.J. Enterococcal bacteremia: risk factors for vancomycin resistance and predictors of mortality // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 1999. - Vol. 20. - P. 318-323.

78. Leclercq A.P., Derlot E., Weber M. et al. Transferable vancomycin and teicoplanin resistance in Enterococcus faecium // Antimicrob. Ag. Chem. -1989.-Vol. 33.-P. 10-15.

79. Lefort A., Arthur M.:, Garry L. et al. Bacericidial activity of gentamicin against

80. Enterococcus faecalis in vitro and in vivo // Antimicrob. Ag. Chem. 2000. -Vol. 44. - P. 2077-2080.

81. Ligozzi M., Pittaluga F., Fontana R. Modification of penicillin -binding protein 5 associated with high-level ampicillin resistance in Enterococcus faecium // Antimicrob. Ag. Chem. 1996. - Vol. 40. - P. 354-357.

82. Lim J.A., Kwon A.R., Kim S.K. et al. Prevalence of resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin antibiotics in gram-positive cocci isolated in a Korean hospitals // Antimicrob. Ag. Chem. 2002. - Vol. 49. -P. 489-495.

83. Linden P.K, Pasculle A.W., Manez R. et al. Differences in outcomes for patients with bacteremia due to vancomycin-resistant Enterococcus faecium or vancomycin-sensitive E. faecium // Clin. Infect. Dis. -1996. Vol 22. - P. 663670.

84. Lucas G.M., Lechtzin N., Puryear D.W. et al. Vancomycin-resistant and vancomycin-susceptible enterococcal bacteremia: comparison. of clinical features and outcomes // Clin. Infect. Dis. 1998. - Vol. 26. - P. 1127-1133.

85. Mandell G.L. Enigmatic enterococcal endocarditis // Ann. Intern. Med. 1984. -Vol. 100.-P. 904-909.

86. Matsumoto Т., Muratani Т., Okuda К. et al. No resional spread of vancomycin resistant enterococci with vanA or vanB in Kitakyusyu, Japan // Infect. Chemother. - 2004. - Vol. 10. - P. 331-334.

87. Megran D.W. Enterococcal endocarditis // Clin. Infect. Dis. 1992. - Vol. 15. -P. 63-71.

88. Mekonen E.T., Noskin G.A., Hacek D.M., Peterson L.R. Successful treatment of persistent bacteremia due to vancomycin-resistant, ampicillin-resistant Enterococcus faecium // Microbiol. Drug. Res. 1995. - Vol 1. - P. 249-253.

89. Monteclavo M.A., Lencastre H., Carraher M. et al. Natural history of colonization with vancomycin-resistant Enterococcus faecium // Infect. Contr. Hosp. Epiedimeol.-1995.- Vol 16.- P. 680-685.

90. Monteclavo M.A., Hprowitz H., Gedris C. et al. Outbreak of vancomycin-, ampicillin-, and aminoglycoside- resistant Enterococcus faecium bacteremia in an adult oncology unit // J. Antimicrob. Chemoter. 1994. - Vol 38. - P. 1363. •

91. NCCLS. Development of In Vitro Susceptibility Testing Criteria and Quality. Control Parameters; Approved Guideline Second Edition. M23-A2. - 2003.

92. NCCLS. Disk Diffusion. Supplemental Tables. Ml 00 S13. -2003.

93. NCCLS. Methods for dilution Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-6th Edition. M7-A6. 2003.

94. NCCLS. Performance Standarts for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard 8th Edition. M2-A8. - 2003.

95. NCCLS. Reference.method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard. NCCLS document M27-A2. 2002.

96. Neely A.N., Matley M.P. Survival of enterococci and staphylococci on hospital fabrics and plastic // J.Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 724-726.

97. Noskin G.A., Bednarz P., Surlano T. et al. Persistent contamination of fabric-covered furniture by vancomycin-resistant enterococci: implications for upholstery selection in hospitals // Infect. Control. 2000. - Vol. 28. - P. 311313.

98. Noskin G.A., Stosor V., Cooper I. et ol. Recovery of vancomycin-resistant enterococci on fingertips and environmental surfaces // Infect. Control Hosp. Epidemiol.- 1995.-Vol. 16.-P. 577-581.

99. Novais C., Sousa J.C., Coque T.M. et al. Molecular Characterization of Glycopeptide Resistance Enterococcus faecium Isolates from Portuguese Hospitals // Antimicrob. Ag. Chem. - 2005. - Vol. 49. - P. 3073-3079.

100. Ono S., Muratani Т., Matsumoto Т. Mechanisms of resistance to imipenem and ampicillin in Enterococcus faecalis // Antimicrob. Ag. Chem. 2005. - Vol. 49. - P. 2954-2958.

101. Orla-Jensen S. The lactic acid bacteria // Mem. Acad. Roy. Sci. Danemark. Sect. Sci. Ser. 2. -1919. Vol. 5.-P. 81-197.

102. Orloff S.L., Busch M.N., Olyael A.j. et al. Vancomycin-resistant Enterococcus in liver transplant patients // Surg. 1999. - Vol. 177. - P. 418422.

103. Pai M.P., Rodvold K.A., Schreckenberger P.C. et al. Risk factors associated with the development of infection with linezolid and vancomycin - resistant Enterococcus faecium // Clin. Infect Dis. - 2002. - Vol. 186. - P. 1603-1607.

104. Pancey G., Ashcraft D., Patel N. In vitro of daptomycin plus rifampin against Enterococcus faecium resistant to both linezolid and vancomycin // Antimicrob. Ag. Chem. 2005. - Vol. 49. - P; 5234-5238.

105. Papanicolaou G.A., Meyers B.R.,. Meyers R. et al. Nosocomial infections vancomycin-resistant Enterococcus faecium in liver transplant recipients: risk factors for acquisition and mortality // Clin. Infect. Dis. 1996. - Vol. 23. - P. 760-766. '

106. Poeta P., Costa D., Rodrigues J. et al. Study of faecalis colonization by van A containing Enterococcus strains in healthy humans, pets, poultry and wild animals in Portugal // Antimicrob. Ag. Chem. - 2005. - Vol. 2. - P. 278 -280.

107. Poole Т.Н., Hume M.E., Campbell L.D. et al. Vancomycin resistant Enterococcus faecium Strains Isolated from Community Wastewater from a

108. Semiclosed Agri-Food System in Texas // Antimicrob. Ag. Chem. 2005. - Vol. 49. - P. 4382-4385.

109. Raad I., Costeron W., Sabharwal U. et al. Ultrastructural analysis of . indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement // Infect. Diaseas. 1993. - Vol. 168. -P. 400-407.

110. Raad I.I., Hanna H.A.,' Boktour M. et al. Vancomycin-resistant Enterococcus faecium: Catheter Colonization, esp Gene, and decreased Susceptibility to Antibiotics in Biofilm // J. Antimicrob. Chemoter. 2005. - Vol. 49. - P, 50465050.

111. Rahal J.J. Antibiotic combinations: the clinical relevance of synergy and antagonism//Medicine. 1978.-Vol. 57. - P. 179-195. .

112. Raybak M.T. The eficacy and safety of daptomycin: first in a new class of • antibiotics for Gram-positive bacteria // Clin. Microbiol. Infect. 2006. - Vol. 1 -P. 24-32.

113. Rice L.B., Bellais S., Carias L. et al. Impact of specific pbp5 mutations on expression of P-lactam resistance in Enterococcus faecium // Antimicrob. Ag. Chem. 2004. - Vol. 48. - P. 3028-3032.

114. Richards M.J., Edwards J. R., Culver D.H. et al. Nosocomial infections in combined medical-surgical intensive care units in the United States // Infect. Control. Hosp. Epiedimeol. 2000. - Vol. 21.-P. 510-515.

115. Ruoff K.F., de la.Maza L., Murtagh M.J. et al. Spesias identities of enterococci isolated from clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28.-P. 435-437.

116. Schleifer K.N., and Kilpper-Balz. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. // Syst. Bacteriol. -1984.-Vol 34.-P. 31-34.

117. Schwank S., Blaser J. Once- versus thrice daily netilmicin combined with amoxicillin, penicillin, or vancomycin against Enterococcus faecalis in .pharmacodynamic in vitro model // Antimicrob. Ag.Chem. 1996. - Vol. 40. -P.225 8-2261.

118. Shepard B.D.,Gilmore M.S. Antibiotic -resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance // Microbes. Infect. 2002. -Vol. 4.-P. 215-224.

119. Sherman J.M. and H.U. Wing. An unnoted hemolytic Streptococcus associated with milk products // Dairy Sci. 1935. - Vol 18: - P. 656-660.

120. Sherman J.M. and H.U. Wing. Streptococcus durans // Dairy Sci. 1937. -Vol. 20.-P. 165-167.

121. Sherman J.M. The enterococci and related streptococci //Bacterid. 1938. -Vol. 35.-P. 81-93.

122. Shida Toshiro, Komagata Kazua, Mitsugi Koji. Reduction of lag time in bacterial growth. Effect of inoculum size and nutrients // Gen.Microbiol. 1975. - Vol. 21.-P. 75-86.

123. Singer D.A., Jochimsen E.M., Gielerak P. et al. Pseudo-outbreak of Enterococcus durans infections and colonizations associated wich introduction of an automated identification system software update // J. Clin. Microbiol. -1996.-Vol. 34.-P. 2685-2687.

124. Smith D.L., Dushoff J., Perencevich E. N. et al. Persistent colonization and the spread of antibiotic resistance in nosocomial pathogens: resistance is a regional problem // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. - P. 3709-3714.

125. Tendolkar P.M., Baghdayan A.S., Gilmore M.S et al. enterococcal surface protein, Esp, enhances biofilm formation by Enterococcus faecalis // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6032-6039.

126. Tenorio A.R., Badri S.M., Sahgal N.B. et al. Effectiveness of gloves in the prevention of hand carriage of vancomycin-resistant Enterococcus species by health care workers after patient care // Clin. Infect. Dis. 2001. - Vol. 32. - P. 826-829.

127. The Enterococci: Pathogenesis, Molecular Biology, and Antibiotik Resistance Edited by Michael S. Gilmore et al. Washington: ASM Press, 2002. -670 p.

128. Van Bambere F., van Laethem Y., Courvalin P. et al. Glycopeptide antibiotics: from conventional molecules to new derivatives // Drugs. 2004. - Vol. 64. - P. 913-936.

129. Vandepitte J., Engbaek K., Piot P. et al. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. World Health Organization, 1991. — 121 p.

130. Ueda Y., Kanazawa K., Eguchi K. et al. In vitro and in vivo antibacterial activities of SM 216601, a new broad - spectrum parenteral carbapenem // Antimicrob. Ag. Chem. - 2005. - Vol. 49. - P. 4391-4396.

131. Yorgensen Y. et al. Antibacterial Susceptibility Test: Dilution and Disk Diffusion methods. In Manual of Clinical Microbiology 7th Ed. Ed. P. Murray: ASM Press, 1999.-p. 1526-1543.

132. Yosef R.T., El Nakeeb M.A., El - Marsi M.H. Binding of antibiotics to agar and its relation to the inhibition zone // Acta Pharm. Suecica. - 1967. - Vol. 4. -P. 253-260.

133. Watanakunakorn C., Burkert T. Infective endocarditis at a large community teaching hospital, 1980-1990 // Medicine. 1993. - Vol. 72. - P. 90-102.

134. Wells C.L., Juni B.A., Cameron S.В. et al. Stool carriage, clinical isolation, and mortality during an. outbreak of vancomycin-resistant enterococci. in hospitalized medical and/or surgical patients // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol.' 21.-P. 45-50.

135. Willems R.J.L., Top M., van Santen et al. Global spread of vancomycin -resistant Enterococcus faecium from distinct Nosocomial genetic complex // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - P. 821-828.

136. Zervos M.J., Dembinski S., Mikesell T. et al. Heterogeneity of plasmids determining high-level resistance to gentamicin in clinical isolates of Streptococcus faecalis // Antimicorb Ag. Chem. 1986. - Vol. 30. - P. 78-85.

137. Zervos M.J., Terpenninung M.S., Schaberg D.R. et al. High-level aminoglycoside- resistant enterococci: colonization of nursing home and acute care hospital patients //Arch. Jntern. Med. 1987. - Vol. 147. - P. 1591-1594.