Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Характеристика вирулентного потенциала клинических изолятов энтерококков, выделенных от животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Характеристика вирулентного потенциала клинических изолятов энтерококков, выделенных от животных"

На правах рукописи

ПОШВИНА ДАРЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ЭНТЕРОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

16 СЕН 7015

Уфа -2015

005562163

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный университет».

Научный руководитель: Сычева Мария Викторовна,

кандидат биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный университет», заведующая кафедрой микробиологии и заразных болезней.

Официальные оппоненты: Сергей Николаевич Золотухин,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы.

Олег Юрьевич Черных,

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный работник сельского хозяйства РФ, директор ГБУ Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория».

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образова-

тельное учреждение высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».

Защита диссертации состоится 9 октября 2015 года в 10й0 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу: 450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34, ауд. 325/2. Тел./факс: +7 (347) 228-08-98.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет» http://www.bsau.ru, а с авторефератом в сети Интернет на официальном сайте Министерства образования и науки Российской Федерации http://www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук, профессор —М.Г.Гиниятуллин

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Микроорганизмы рода Enterococcus - облигатные представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта млекопитающих (Soheili S. et al., 2014). В то же время энтерококки, являясь потенциально-патогенными бактериями (Yuen G.J., Ausubel F.M., 2014), играют важную роль в этиологии и патогенезе ряда заболеваний животных: маститов (Madsen P.S. et al., 1974; Keis S. et al., 2003), инфекций мочевыводящих путей (Шуляк Б.Ф., 2003; Pomba С. et al., 2010), септических состояний и эндокардитов (Ятусевич А.И., Андросик Н.Н., 2001).

Современные методы исследования микроорганизмов позволили обнаружить различные факторы патогенности энтерококков, способствующие развитию инфекционного процесса. К таким факторам можно отнести поверхностные белки, участвующие в процессах адгезии и инвазии; экскрети-руемые белки и токсины, обеспечивающие повреждение тканей хозяина; белки, обуславливающие устойчивость к антибиотикам и иммунитету хозяина, а также факторы, индуцирующие воспаление (Su Y.A. et al., 1991; Lowe A.M. et al., 1995; An F.Y. et al., 1999; Nilsen T. et al., 2003). Данные генетические элементы, называемые «островами» патогенности, могут содержать различный набор генов патогенности, включая гены устойчивости к антибиотикам (Бондаренко В.М., 2001). Присутствуя в биоценозе, бактерии рода Enterococcus взаимодействуют с другими видами условно-патогенных микроорганизмов и представителей нормальной микрофлоры животных и могут передавать мобильные элементы генома с генами патогенности от одного штамма другому (Hammerum A.M., 2012).

Проблема патогенности энтерококков связана также с выраженной приобретённой и природной резистентностью данной группы микроорганизмов к широкому спектру антибактериальных препаратов. Устойчивость энтерококков, выделенных от животных, к противомикробным препаратам является серьёзным поводом для беспокойства, поскольку нерациональное использование антибиотиков, а также применение их в сельском хозяйстве в качестве пищевых добавок для стимуляции роста (например, ампициллин, гентами-цин, авопарцин), создает условия для формирования резервуара резистентных штаммов Enterococcus sp. в организме животных (Teuber М., 2001). Доказано, что резистентные к антимикробным препаратам энтерококки могут передаваться человеку от домашних животных в результате тесного контакта (Simjee S. et al., 2002; Guardabassi L. et al., 2004), а также при употреблении контаминированных продуктов животного происхождения (Hammad A.M. et al., 2014).

В последнее время в работах ряда авторов показана важная роль перси-стентного потенциала микроорганизмов в патогенезе многих инфекционных заболеваний (Валышев А.В., Валышева И.В., 2006; Гульнева М.Ю. и др., 2011; Потехина Л.П. и др., 2012), однако отсутствуют данные о распростра-

нённости факторов персистенции среди бактерий рода Еыегососсш, выделенных от животных при патологии.

Не разработаны микробиологические критерии прогноза развития энте-рококковой инфекции у животных.

Учитывая возрастающее клиническое значение энтерококков как возбудителей распространённых, и, зачастую, достаточно тяжело протекающих инфекций животных, представляется актуальным изучение комплекса биологических характеристик клинических изолятов ЕЫегососсиэ эр. и разработка микробиологических критериев прогнозирования развития энтерококковой инфекции.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение видового состава и биологических свойств клинических изолятов энтерококков, выделенных от животных, на фено- и генотипическом уровне.

Для реализации поставленной цели были определены и решены следующие задачи:

1. Изучить видовой состав и персистентные свойства энтерококков, выделенных из клинического материала от животных.

2. Охарактеризовать биологические свойства бактерий рода Ешегососсиз на фенотипическом уровне и дать генетическую характеристику вирулентного потенциала и антибиотикорезистентности.

3. Определить информативные биологические свойства ЕШегососсиз хр. и разработать микробиологические критерии прогнозирования развития заболевания.

Научная новизна исследований. Проведён сравнительный анализ видового разнообразия энтерококков, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях животных. Показано, что доминирующим видом явился Е./аесаШ, изолированный из клинического материала преимущественно в монокультуре.

Охарактеризован широкий спектр биологических свойств энтерококков, выделенных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, включающий факторы патогенности, персистенции и антибиотикорезистентности, на фенотипическом уровне и с использованием молекулярно-генетических исследований.

Установлена широкая распространённость факторов персистенции у изученных штаммов энтерококков, показано, что их выраженность зависит от видовой принадлежности и биотопа выделения, при этом у штаммов, выделенных из секрета молочных желез при мастите, выше антилизоцимная и антикарнозиновая активности, у штаммов, выделенных из гнойного экссудата - способность к образованию биоплёнок.

Проведёнными молекулярно-генетическими исследованиями установлено наличие генетических детерминант патогенности и резистентности к антибиотикам, а также факторов патогенности у всех штаммов Е. /авсаНя, выделенных из гнойного экссудата и экскрета из половых органов самок; тогда

как штаммы поп-/аесаШ видов, выделенные из секрета молочных желез, характеризовались только протеолитической активностью и наличием генов, кодирующих устойчивость к низким концентрациям ванкомицина, аминог-ликозидам.

Проведена сравнительная оценка биологических свойств энтерококков, выделенных при разном течении энтерококковой инфекции, и разработан алгоритм прогнозирования развития инфекционного процесса.

Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют теоретические представления о биологических свойствах бактерий рода Еп!егососсш, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях животных.

Определён спектр антибиотикочувствительности клинических изолятов энтерококков. Полученные данные могут способствовать оптимизации подбора препарата для эмпирической терапии инфекционных заболеваний энтерококковой этиологии.

Практическая ценность работы определяется возможностью прогнозирования затяжного (хронического) течения энтерококковых инфекций с помощью разработанного алгоритма.

Методология и методы исследования.

При проведении исследований и изложении материала были применены общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, микробиологические, молекулярно-генетические. Использование перечисленных методов и статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность полученных результатов.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Качественные и количественные характеристики биологических свойств бактерий рода ЕЫегососсиз зависят от биотопа выделения и видовой принадлежности штамма.

2. Клинические изоляты энтерококков, вызывающих острое и затяжное (хроническое) течение инфекционно-воспалительного заболевания, обладают определённой совокупностью биологических свойств, на основании которых можно прогнозировать характер течения инфекционного процесса.

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Биологические свойства условно-патогенной и нормальной микрофлоры организма животных в норме и при патологии» (№ государственной регистрации 0120.1450283).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на: IV Международной научно-практической конференции «Проблемы устойчивости биоресурсов: теория и практика» в секции «Диагностика, профилактика и лечение незаразных, инфекционных и инвазионных бо-

лезней животных» (Оренбург, 2013); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, д.в.н., профессора Х.В. Аюпова «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014); VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014); II Всероссийской молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2014); ежегодной областной научно-практической конференции «Молодые ученые Оренбуржья -науке XXI века» (Оренбург, 2014); расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 14 от 15 мая 2015 года).

Материалы диссертации представлены на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ и отмечены дипломом П степени (Краснодар, 2013). Работа удостоена премии Правительства РФ для поддержки талантливой молодежи (2013). Фрагменты работы были представлены на областном конкурсе научно-исследовательских работ и отмечены премией Губернатора Оренбургской области для талантливой молодежи (2014).

Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в девяти печатных работах, из них пять - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 119 страницах компьютерной верстки, содержит 6 таблиц и 16 рисунков. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка сокращений, библиографического списка, который включает 226 наименований, в том числе 162 работы иностранных авторов.

2 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили 200 штаммов микроорганизмов, из них 172 штамма Enterococcus sp., выделенные от животных при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях: 61 штамм - из экскрета половых органов самок (коров, собак и кошек), больных острым и хроническим эндометритом; 7 - из секрета молочных желёз при маститах коров, 104 - из гнойного экссудата при абсцессах мягких тканей (острое и хроническое течение) и отитах кошек и собак; 16 штаммов Staphylococcus sp., 5 культур Pseudomonas sp., 3 штамма Pantoea sp. и 4 изолята Kluyvera sp.

Штаммы были выделены из клинического материала, полученного от продуктивных животных, принадлежащих учебному хозяйству Покровского сельскохозяйственного колледжа - филиал ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»; СПК колхоз «Урал» Оренбургского района, Оренбургской области, и от мелких домашних животных, поступавших на лечение в ветеринарные клиники г. Оренбурга: «Кот и Пёс», «Вет-доктор», «Зоосфера».

Отбор клинического материала (экскрет из половых органов самок, секрет молочных желёз, гнойный экссудат) осуществляли стерильным тампоном, который затем помещали в пробирки с транспортной средой Эймса (F.L. Medical s. г. 1., Италия). Выделение микроорганизмов проводили классическим бактериологическим методом (Биргер М.О., 1982).

Штаммы энтерококков идентифицировали с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием известных праймеров (Jackson C.R. et al., 2004). Синтез праймеров осуществлён компанией «СИН-TOJI» (г. Москва). Для постановки ПЦР бактериальные лизаты получали с помощью реагента «ДНК-Экспресс» (Литех, Россия). Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Продукты амплификации генов анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном агарозном геле (1-2%), окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров применяли GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Микроорганизмы сопутствующей микрофлоры идентифицировали с использованием тест-систем «СТАФИ-тест 16», «ЭНТЕРО-тест 24» («Lachema», Чехия).

Гемолитическую и желатиназную активности энтерококков определяли по методу М.О. Биргера (1982). Активность протеазы выявляли по убыли альбумина после инкубации с исследуемыми штаммами биуретовым методом (Нетрусов А.И. и др., 2005). Изучение антилизоцимной (АЛА) и анти-карнозиновой (АКрА) активностей энтерококков осуществляли по методикам О.В. Бухарина с соавт. (1997, 1999) фотометрическим методом. Образование биоплёнок энтерококками оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах (O'Toole G. et al., 2000). Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП) была определена диско-диффузионным методом (МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»).

При помощи ПЦР-анализа у клинических изолятов определяли гены, кодирующие синтез известных факторов патогенности: цитолизины - cylA, су IB, cylM, cylbL, cylLs, желатиназа - gelE, сериновая протеаза - sprE, гиалу-ронидаза - hyl, поверхностные белки, участвующие в адгезии - asa, поверхностные белки-иммуносупрессоры — esp (Semedo Т. et al., 2003; Vankerckho-ven V. et al., 2004; Reviriego C. et al., 2005), а также гены резистентности к

аминогликозидам (Vakulenko S. et al., 2003); тетрациклинам (Olsvik B. et al., 1995; Bertrand S. et al., 2005) и гликопептидам (Dutka-Malen S. et al., 1995).

Результаты исследований обработаны статистически с помощью программ «Биостатистика» и Microsoft Office Excel 2007. Регрессионное уравнение было рассчитано в программе «STATISTICA 10». Схема исследования представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Общая схема исследования

2.2 Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведённого исследования было установлено, что в 86% случаев бактерии рода Enterococcus выделялись в монокультуре и только в 14%— в ассоциациях микроорганизмов. Во всех ассоциациях энтерококки были представлены культурами E.faecalis, которые выделяли совместно с представителями рода Staphylococcus (S. intermedius, S. schleiferi), псевдомонадами, а также с Pantoea agglomerans и Kluyvera ascorbata.

Видовой спектр энтерококков, изолированных из клинического материала, отличался разнообразием. Тем не менее, доминирующее положение занимали культуры вида E.faecalis (79,1%). В 5,2% случаев клинические изоляты были представлены видами Е. faecium, в 4,6% - Е. casseliflavus и в 4% - Е. flavescens. В единичных случаях высевали Е. avium (2,4%), Е. hirae (1,8%), Е. durans (2,9%) (в соответствии с рисунком 2). Среди клинических

изолятов, выделенных из экскрета половых органов самок, подавляющее большинство культур относились к виду E.faecalis (79%). В единичных случаях выделялись Е. faecium (6,5%), Е. avium (6,5%) и Е. durans (8%).

* E.faecalis sE.faecitim i S! я. hirae

8: Е. avium в* Я. durans ig»!? ШБ. casseliflavus Wr = E. flavescens

\_79%

Рисунок 2 - Видовой спектр клинических изолятов энтерококков

Видовой состав энтерококков, изолированных из гнойного экссудата, был разнообразным и включал в себя штаммы E. faecalis (84,6%), Е. flavescens (6,7%), E. casseliflavus (3,8%) и Е. faecium (4,9%). Изоляты, из секрета молочных желез были представлены двумя видами: Е. casseliflavus (57%) и Е. hirae (43%), что согласуется с исследованиями, проведёнными ранее (Jiménez E. et al., 2013), в которых было показано, что этиологическими агентами маститов являются микроорганизмы видов Е. casseliflavus, Е. hirae, Е. faecium и Е. durans.

Таким образом, видовой состав энтерококков - возбудителей инфекци-онно-воспалительных заболеваний животных характеризовался значительным разнообразием, однако доминирующим видом являлся Е. faecalis.

Выживанию бактерий в макроорганизме способствует их адаптация к факторам защиты хозяина (Бухарин О.В., 1999), поэтому на следующем этапе работы нами была предпринята попытка охарактеризовать факторы перси-стенции энтерококков, в том числе антикарнозиновую активность. Способность деградировать карнозин была присуща 100% культур энтерококков. Диапазон экспрессии признака составил от 0,62±0,056 до 3,00±0,073 мг/мл. Больше половины (65,1±7,26%) клинических изолятов энтерококков обладали высоким уровнем антикарнозинового признака. Средний уровень АКрА регистрировался в 32,5±7,14% случаев. Только в 2,3±2,28% случаев выявлен низкий уровень выраженности признака. Наиболее высоким уровнем АКрА характеризовались штаммы Е. casseliflavus - 2,40±0,140 мг/мл, Е. faecium -2,36±0,490 мг/мл и Е. hirae - 2,30±0,119 мг/мл (в соответствии с рисунком 3).

E. casseliflaviis Kfaecium E. hirae E. flavescens E.faecalis E. avium E. durons

Рисунок 3 - Выраженность антикарнозиновой активности у клинических изолятов энтерококков

Выраженность АКрА у культур E.faecalis составила 2,16±0,110 мг/мл. Низкий уровень антикарнозиновой активности отмечен у штаммов E. durons - 1,41±0,065 мг/мл.

Величина антикарнозиновой активности у клинических изолятов энтерококков зависела от биотопа выделения и нарастала в ряду: экскрет из половых органов самок (2,05±0,005 мг/мл) - гнойный экссудат (2,22±0,01 мг/мл) — секрет молочных желёз при мастите (2,40-0,002 мг/мл) (р<0,001).

Другим механизмом гуморальной противоинфекционной защиты макроорганизма является продукция лизоцима, а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим определяется как антилизоцимная активность (АЛА) (Бухарин О.В. и др., 1984). Изучение антилизоцимной активности Enterococcus sp. показало, что данный признак встречался у 100% клинических изолятов. Уровень выраженности антилизоцимного признака характеризовался межвидовой вариабельностью. Наиболее высокими значениями антилизоцимного признака обладали культуры E. durons, E. casseliflavus и Е. avium - 1,86±0,112, 1,72±0,001 и 1,70±0,015 мкг/мл, соответственно. Выраженность АЛА у клинических изолятов других видов была следующей: у E.faecalis - 1,63±0,040 мкг/мл; у E.faecium - 1,65±0,070 мкг/мл. Экспрессия антилизоцимной активности у штаммов E. hirae составила в среднем 1,61±0,015 мкг/мл. Наиболее низкими показателями АЛА характеризовались культуры Е. flavescens 1,33±0,019 мкг/мл.

Антилизоцимная активность клинических изолятов энтерококков зависела от источника выделения: у Enterococcus sp., изолированных из секрета молочных желез, среднее значение признака было максимальным 1,68±0,006 мкг/мл (р<0,05); у бактерий, выделенных из экскрета половых органов самок и гнойного экссудата, АЛА составляла 1,64±0,007 и 1,62±0,006 мкг/мл, соот-

ветственно. Уместно предположить, что впервые обнаруженная нами анти-карнозиновая активность энтерококков в совокупности с антилизоцимным признаком, способствуют длительному переживанию данных бактерий в организме животных.

В последнее время внимание многих исследователей привлечено к изучению микроорганизмов, объединённых в биоплёнки, поскольку формирование биоплёнок в очаге воспаления ведет к хронизации инфекционного процесса и сопровождается неудовлетворительными результатами антибиотико-терапии (Costerton W. et al, 2003). Учитывая вышеизложенное, нами было принято решение изучить способность к плёнкообразованию у клинических изолятов Enterococcus sp.

Проведённые исследования показали, что 70,0+3,49% культур энтерококков на абиотической поверхности формируют биоплёнки. Данным свойством обладали виды E.faecalis, Е. avium, Е. flavescens. У 30,0±3,49% штаммов способности к образованию биоплёнок не выявлено.

Выраженность признака у штаммов, изолированных из гнойного экссудата (коэффициент биоплёнкообразования (КБ) 1,3±0,03), была достоверно выше в сравнении с культурами, выделенными из экскрета половых органов самок (1,2±0,04) (р<0,05). Энтерококки, изолированные из секрета молочных желез, не обладали способностью формировать биоплёнки (КБ 1,1±0,07).

Кроме того, выявлена межвидовая вариабельность признака. Наиболее высокие значения коэффициента биоплёнкообразования (1,4±0,03) были отмечены у культур Е. durans. Средние значения КБ штаммов Е. faecalis составили 1,3±0,02. Клинические изоляты E.faecium, Е. hirae, Е. casseliflavus не образовывали статические биоплёнки в лунках полистироловых планшетов — КБ составил 1,1±0,07, 1,1±0,05, 1,1±0,07, соответственно (в соответствии с рисунком 4).

1,4 +

E.fhecalis E.foecium Е.casseliflavus E.Jlavescens E.hirae E.durans E.avium

Рисунок 4 - Коэффициенты биоплёнкообразования клинических изолятов

Enterococcus sp.

Из литературных данных известно, что способность энтерококков формировать биоплёнки связана с наличием гена, кодирующего белки клеточной стенки, ответственные за уклонение от иммунных сил макроорганизма (esp) (Van Wamel W.J. et al., 2007). При анализе популяции энтерококков было установлено, что 60,0±6,27% штаммов Е. faecalis, выделенных из экскрета половых органов самок, и 58,0±4,83% культур Е. faecalis, выделенных из гнойного экссудата, обладали геном esp.

Корреляционный анализ показал наличие достоверной (р<0,001) высокой положительной связи (г=0,632) между наличием гена esp и способностью клинических изолятов энтерококков формировать биоплёнки. Эти данные согласуются с другими исследованиями (Distel J.W. et al., 2002; Di Rosa R. et al., 2006), в которых было показано, что клинические изоляты энтерококков, содержащие ген esp, образуют более выраженные биоплёнки по сравнению с елр-отрицательными штаммами.

На следующем этапе исследования были изучены факторы патогенности микроорганизмов рода Enterococcus на уровне фено- и генотипа.

Пусковым механизмом инфекционного процесса является адгезия. В результате исследования, было установлено, что ген, отвечающий за синтез поверхностного белка-адгезина (asa), содержали 60,0±6,27% штаммов Е. faecalis, выделенных из экскрета половых органов самок, и 57,7±4,83% культур Е. faecalis, выделенных из гнойного экссудата.

Микробные ферменты способствуют инвазии бактерий и помогают им противостоять защитным реакциям организма. У бактерий рода Enterococcus известны такие ферменты «агрессии» как желатиназа, сериновая потеаза, гиалуронидаза. На фенотипическом уровне желатиназная активность была выявлена только у штаммов Е. faecalis, выделенных из экскретов половых органов и гнойного экссудата, причём 16,2±2,80% культур обладали высоким уровнем рассматриваемого признака. У штаммов, изолированных из секрета молочных желез, желатиназная активность отсутствовала.

При количественном определении протеолитической активности было установлено, что все изученные виды энтерококков обладали данным фактором патогенности. Штаммы, выделенные из гнойного экссудата и экскрета половых органов самок, характеризовались высокой активностью протеаз (0,25±0,010 мг-мл/мин и 0,20±0,012 мг-мл/мин, соответственно). Минимальный уровень признака среди всех изученных культур был отмечен у клинических изолятов из секрета молочных желез, среднее значение протеолитической активности которых составило 0,15±0,001 мг-мл/мин (р<0,05). Все штаммы с высоким уровнем признака были выделены из клинического материала от собак. Установлено, что наиболее выраженным уровнем протеолитической активности обладали культуры Е. faecalis - 0,24±0,010 мг-мл/мин.

Гены, обуславливающие протеолитическую активность (gelE и sprE), обнаружены в одинаковом проценте (40,0±6,27%) только у штаммов Е. faecalis, выделенных из экскрета половых органов самок. Данные генети-

ческие детерминанты оказались распространёнными среди штаммов Е. faecalis, изолированных из гнойного экссудата: ген gelE содержали 46,2±4,88% культур, ген sprE - 57,7±4,84% изолятов. Вероятно, широкая распространённость генетических детерминант протеолитических ферментов (gelE и sprE) среди культур энтерококков, выделенных из гнойного экссудата, необходима микроорганизмам для инвазии и инактивации факторов врождённого и приобретённого иммунитета.

Ген, ответственный за продукцию гйалуронидазы, среди клинических изолятов энтерококков, выделенных при инфекционно-воспалительных заболеваниях, не выявлен.

Известно, что существенный вклад в вирулентность энтерококков вносит цитолизин- цитолитический токсин белковой природы, обладающий также свойствами бактериоцина и способностью инициировать гемолиз эритроцитов (Van Tyne D. et al., 2013). При анализе цитолитической активности энтерококков установлено, что способностью разрушать эритроциты обладали только культуры Е. faecalis. Выявлено, что р-гемолитической активностью чаще характеризовались клинические изоляты, выделенные из гнойного экссудата (45,4±4,88%), чем из экскрета половых органов самок -8,3±3,53%. У штаммов энтерококков, изолированных из секрета молочных желез, гемолитическая активность не выявлена.

Комплекс генов, кодирующих синтез цитолизина, выявлен у штаммов Е. faecalis, выделенных из гнойного экссудата и экскрета половых органов самок (в соответствии с рисунком 5).

:":■ CylA (активация цитолизина)

V CylB (транспорт цитолизина)

-СуШ

(посттрансляиионная модификация цитолизина) в CylLL (структурная субъадиннца цитолизина)

■ CylLS (структурная субъедниица цитолизина)

экскрет половых органов гнойный экссудат самок

Рисунок 5 - Распространённость генов, кодирующих синтез цитолизина, в популяции клинических изолятов энтерококков

Ген, отвечающий за активацию цитолизина (cylA), выявлен в 42,3±4,84% случаев у штаммов, выделенных из гнойного экссудата, реже данный ген содержали энтерококки, изолированные из экскрета половых органов самок (26,6±5,65%). Примерно в одинаковом проценте случаев культуры, выделенные из гнойного экссудата и экскрета половых органов самок, содержали гены, ответственные за транспорт цитолизина (cylB), посттрансляционную модификацию (cylM), синтез структурной субъединицы (cylLL) - 46,2±4,88% и 40,0±б,27%, соответственно. В то же время, ген, кодирующий синтез структурной субъединицы cylLs, выявлен у 13,3±4,34% штаммов, изолированных, из экскрета половых органов самок и лишь у 3,8±1,88% изолятов, выделенных из гнойного экссудата. Среди культур, выделенных из секрета молочных желез, штаммов, содержащих гены, отвечающие за синтез цитолизина, выявлено не было.

Известно, что факторы патогенности энтерококков могут быть вовлечены в патогенез инфекционного процесса по-разному, то есть экспрессия вирулентности может меняться от одного типа инфекции к другому (Красная Ю.В. и др., 2014). Так, культуры E.faecalis, изолированные из половых органов, характеризовались широкой распространённостью генов Су1-оперона, что, вероятно, определяет их способность колонизировать биотоп за счёт бактериоциногенной активности. Успешной колонизации урогенитального тракта энтерококками также способствует широкая распространённость гена, кодирующего адгезины.

Другим важным моментом является факт обнаружения факторов патогенности только у бактерий вида Е. faecalis. Хотя есть свидетельства, что в настоящее время 38-75% энтерококковых инфекций вызываются бактериями Е. faecium (Willems R.J. et al., 2011), культуры E. faecalis традиционно считаются более патогенными, что нашло подтверждение и в нашей работе.

Среди культур non-faecalis видов не было обнаружено факторов патогенности на фено- и генотипическом уровне, за исключением протеолитиче-ской активности, однако этиологическая причастность штаммов этих видов энтерококков к возникновению и течению инфекционно-воспалительных заболеваний не вызывает сомнений и подтверждается высокими показателями микробной обсеменённости.

Проблема патогенности энтерококков неотделима от их антибиотикоре-зистентности. Это связано как с наличием детерминант патогенности и устойчивости к антибиотикам в одних и тех же носителях генетической информации, так и с резистентностью возбудителя к проводимым терапевтическим мероприятиям. Поэтому на следующем этапе нашего исследования была охарактеризована резистентность энтерококков к антибактериальным препаратам.

Установлено, что большинство штаммов Е. faecalis, выделенных из экскрета половых органов самок, характеризовалось выраженной резистентностью к цефтриаксону (92,0±3,47%), линезолиду (83,0±4,80%), тетрациклину

(83,0±4,80%), энрофлоксацину (75,0±5,54%), ванкомицину (67,0±6,02%) и ципрофлоксацину (58,0±6,31%). К норфлоксацину определена умеренная резистентность в 50,0±6,40% случаев.

Уровень чувствительности клинических изолятов Е. /аесаНз к аминогли-козидам (стрептомицин и гентамицин) варьировал от 75,0±5,54% до 91,0±3,66% (в соответствии с рисунком 6).

Рисунок 6 - Устойчивость к АБП клинических изолятов Е. /аесаШ, выделенных из экскрета половых органов самок

В ходе исследований установлено, что 83,0±4,80% изолятов Е. /аесаШ, выделенных из экскретов половых органов самок, обладали множественной лекарственной резистентностью (устойчивы к 3 и более классам антибактериальных препаратов).

Среди культур Е. /аесаНэ, выделенных из гнойного экссудата, выявлен высокий процент резистентных к цефтриаксону, линезолиду и тетрациклину штаммов: 95,0±2,13%, 91,0±2,80% и 91,0±2,80%, соответственно. Значительная часть культур проявляла устойчивость к энрофлоксацину (64,0±4,70%). Процент ванкомицинрезистентных изолятов составил 59,0±4,82%. Умеренно-резистентные и резистентные к ципрофлоксацину штаммы встречались в одинаковом количестве случаев (по 43,0±4,85%). К стрептомицину резистентность была определена в 13,0±3,29% случаев, к гентамицину - в 4,5=2,03%. Доля умеренно-резистентных к норфлоксацину изолятов составила 41,0±4,82% (в соответствии с рисунком 7).

В результате исследования антибиотикорезистентности штаммов Е./аесаШ, выделенных из гнойного экссудата, у 91,0±2,80% изолятов обнаружена полирезистентность.

Рисунок 7 - Устойчивость к АБГТ клинических изолятов Е. faecalis, выделенных из гнойного экссудата

Определение чувствительности к антибиотикам других выделенных представителей рода Enterococcus (Е. faecium, Е. casseliflavus, Е. flavescens, Е. hirae, Е. durons) выявило высокую частоту резистентности к цефтриаксону (78,0±6,90%) (в соответствии с рисунком 8).

Рисунок 8 - Антибиотикорезистентность non-faecalis видов (Е. faecium, Е. casseliflavus, Е. flavescens, Е. hirae, Е. durons, Е. avium)

Культуры поп-/аесаИз видов проявляли устойчивость к линезолиду и эн-рофлоксацину в одинаковом проценте случаев (44,0±8,27%). Умеренная резистентность была определена к ципрофлоксацину в 33,0±7,83% случаев, норфлоксацину - в 22,0±6,90% случаев, энрофлоксацину - в 55,0±8,29% случаев. Количество резистентных и чувствительных к тетрациклину изолятов было одинаковым и составило 44,0±8,27%. Большая часть (78,0±6,90%) энтерококков редких видов не проявляла резистентности к ванкомицину. Устойчивости к аминогликозидам не обнаружено.

Все клинические изоляты энтерококков продемонстрировали 100% чувствительность к ампициллину.

Анализ генетических детерминант антибиотикорезистентности показал, что гены резистентности к аминогликозидам содержит подавляющее большинство культур Епгегососсиз &р. Гены ?е/М и (устойчивость к тетрацик-линам) определены у 75,0±5,54% и 25,0±3,46% культур Е. /аесаШ, выделенных из экскрета половых органов самок, соответственно (в соответствии с

рисунком 9). %

100

Гены резистентности к ) тетрациклином

Гены резистентности к. гликотгептидам

Гены резистентности к а.ниногликозидап

Примечание. Гены кодируют: /е/1 - резистентность к тетрациклину, 1е1М - резистентность к тетрациклину и миноциклину, уапА - резистентность к ванкомицину и тейкопланину, уапС-1 - резистентность к низким концентрациям ванкомицина, аас(6')-1е-арИ(2")-1а - высокий уровень резистентности к гентамицину, арЪ(3)-Ша и апг(4')-1а - резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина).

Рисунок 9 - Наличие генов антибиотикорезистентности у штаммов Е. /аесаНз, выделенных из экскрета половых органов самок

Процент гликопептидрезистентных изолятов составил 50,0±6,40% (vanA) и 33,0±6,02% (уапС-1); гены \>апВ и мапС-2/3 среди штаммов Е./аесаПя не обнаружены. Ген, кодирующий высокий уровень резистентности к гентамицину, содержали 58,0±6,31% штаммов Е. /аесаШ, выделенных из экскрета половых органов самок. Гены арИ(3')-Ша и аы(4')-1а, кодирующие резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина), выявлялись в 42,0±6,31% и 17,0±4,80% случаев, соответственно.

Ген ¡елМ (резистентность к тетрациклину и миноциклину) определен у 86,0±4,44% изолятов Е. /аесаШ из гнойного экссудата (в соответствии с рисунком 10).

Примечание. Гены кодируют: /е/7. - резистентность к тетрациклину, - резистентность к тетрациклину и миноциклину, уапА - резистентность к ванкомицину и тейкопланину, уапС-1 - резистентность к низким концентрациям ванкомицина, аас(6')-1е-арк(2")-1а - высокий уровень резистентности к гентамицину, арИ(3')-Ша и аШ(4')-1а — резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина).

Рисунок 10 - Наличие генов антибиотикорезистентности у штаммов Е. /аесаП.ч, выделенных из гнойного экссудата

Ген, кодирующий резистентность к ванкомицину и тейкопланину (уапЛ), содержали 45,0±4,87% штаммов; гены уапВ и уапС-2/3 среди штаммов Е. j>ЪесаШ, выделенных из гнойного экссудата не выявлены. Штаммы Е./аесаШ содержали ген, кодирующий высокий уровень резистентности к гентамицину, в 82,0±3,76% случаев. Генетические детерминанты, опреде-

ляющие резистентность к аминогликозидам (кроме гентамицина), обнаружены у 45,0±4,87% штаммов E.faecalis, изолированных из гнойного экссудата.

Среди клинических изолятов non-faecalis видов ген tetM, кодирующий резистентность к тетрациклинам, определен у 25,0±7,21% изолятов. Генетические детерминанты, определяющие резистентность к низким концентрациям ванкомицина (vanC-2/З), содержали 11,0±2,07% штаммов Е. durons и 22,0±4,61% штаммов Е.flavescens. Ген aph(3')-IIIa, кодирующий устойчивость к аминогликозидам (кроме гентамицина), обнаружен в 25,0±7,21% случаев среди культур Е. casseliflavus и Е. avium.

Корреляционный анализ фено- и генотипических данных резистентности изолятов энтерококков к тетрациклину показал наличие достоверной (р<0,001) высокой положительной связи (г=0,903) между наличием генов резистентности и фенотипическим проявлением признака. Также у исследуемых культур энтерококков выявлена средняя прямая взаимосвязь (г=0,555) между наличием генов резистентности к гликопептидам и их экспрессией (р<0,001).

Проведённые исследования показали, что разные виды энтерококков имеют существенные отличия в спектре антибиотикорезистентности. При инфекционно-воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта, а также при абсцессах и отитах в подавляющем большинстве случаев выделяли полирезистентные штаммы Е. faecalis. У клинических изолятов Е. faecalis спектр резистентности к антибактериальным препаратам был более широким по сравнению с культурами non-faecalis видов. На фенотипическом уровне культуры Е. faecalis характеризовались резистентностью к ванкомицину, ли-незолиду, тетрациклину и цефтриаксону: На генотипическом уровне для большинства штаммов Е. faecalis была определена резистентность к аминогликозидам, гликопептидам и тетрациклинам.

Из всех изученных антибиотиков наибольшую активность в отношении Enterococcus sp. показал ампициллин, являющийся препаратом выбора. Из других антибиотиков, потенциально эффективных при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных энтерококками, можно рассматривать гентамицин и стрептомицин.

В последние годы наблюдается изменение характера течения инфекций в сторону увеличения доли затяжных и хронических форм. Это способствует формированию осложнённых форм заболеваний, приводящих к снижению продуктивности и «инвалидизации» животных. Перспективным направлением в клинической микробиологии является применение для прогнозирования развития заболевания математического моделирования, основанного на анализе биологических свойств микроорганизмов, имеющих высокую диагностическую ценность.

Поэтому на следующем этапе нашей работы была предпринята попытка построить модель прогноза длительности течения инфекционно-воспалительных заболеваний энтерококковой этиологии.

Для решения этой задачи были использованы данные микробиологических исследований и анализа историй болезней 124 животных с инфекцион-но-воспалительными заболеваниями энтерококковой этиологии. По результатам микробиологического обследования и данным ретроспективного анализа историй болезней животных штаммы энтерококков были разделены на две группы: 56 культур Enterococcus sp., выделенные от животных с абсцессами и эндометритами, характеризующиеся острым течением, сформировали первую группу, и 68 штаммов энтерококков, изолированных от продуктивных и домашних животных с хроническим (затяжным) течением энтерококковой инфекции (абсцессы, эндометриты), составили вторую группу сравнения.

В качестве биологических характеристик энтерококков были использованы данные сравнительного анализа частоты встречаемости факторов вирулентности (желатиназной, гемолитической и протеолитической активностей, генетических детерминант вирулентности), антибиотикорезистентности и данные средних уровней выраженности факторов персистенции (антилизо-цимной, антикарнозиновой активностей и биоплёнкообразования).

Сравнительный анализ распространённости и выраженности изученных биологических характеристик энтерококков, выделенных при разных формах течения заболевания, позволил выделить 7 наиболее значимых признаков, которые составили главную информативную комбинацию. Такими признаками оказались следующие: гены Су/-оперона (cylL¿, cylA, cylB, cylM), ген, ответственный за продукцию белка-адгезина (asá), ген, кодирующий синтез белка клеточной стенки, ответственного за уклонение от иммунных сил макроорганизма (esp) и антикарнозиновая активность (АКрА). В результате регрессионного анализа, проведённого с помощью программы «STATTSTTCA 10», были отобраны 4 наиболее значимых признака: гены, кодирующие структурную субъединицу цитолизина (cylL¡), белок-адгезин (asa), белок клеточной стенки, ответственный за уклонение от иммунных сил макроорганизма (esp), и антикарнозиновая активность (АКрА).

Конечным этапом математической обработки явилось регрессионное уравнение, позволяющее прогнозировать высокую вероятность развития затяжного (хронического) течения заболевания.

Биологические свойства энтерококков с учётом их качественной и количественной характеристики дифференцировали в условных и абсолютных единицах. Гены, кодирующие структурную субъединицу цитолизина (cylL£), белок-адгезин (asa) и белок клеточной стенки, ответственный за уклонение от иммунных сил макроорганизма (esp) - определялись как качественные признаки. Их наличие оценивалось в 1 условную единицу, а отсутствие этих признаков обозначалось как 0 условных единиц. Антикарнозиновая активность (АКрА) - этот количественный показатель был оценен в абсолютных единицах — мг/мл.

Для прогнозирования затяжного (хронического) течения процесса биологические показатели исследуемого штамма энтерококков в абсолютных и условных единицах вводили в формулу для расчета регрессионного уравнения:

Y = -0,094+0,466A7+0,377X2+0,291A3-0,02X4,

где Y- регрессионное уравнение, характеризующее продолжительность течения заболевания;

XI - ген, кодирующий структурную субъединицу цитолизина,

Х2 - ген, кодирующий белок-адгезин;

ХЗ - ген, кодирующий белок клеточной стенки, ответственный за уклонение от иммунных сил макроорганизма;

Х4 - антикарнозиновая активность, мг/мл.

Оценка результата проводилась путем сравнения полученной величины регрессионного уравнения с диапазоном величин, характерных для острого и затяжного (хронического) течения заболевания соответственно: если Y < 0,5 - характеризовали как затяжное (хроническое) течение заболевания, если Y > 0,5 - острое течение заболевания.

При проведении ретроспективного анализа установлено, что эффективность данного уравнения составляла 95%.

Таким образом, проведённый анализ позволил вычленить из биопрофиля энтерококков ряд фено- и генотипических признаков, по которым штаммы, вызывающие острое и хроническое (затяжное) течение заболевания, достоверно различались. Выявленные закономерности позволили рассчитать регрессионное уравнение, основанное на биологических свойствах возбудителя, позволяющее с высокой эффективностью прогнозировать характер течения энтерококковой инфекции у животных.

Подводя итог проделанной работе, следует заключить, что качественные и количественные характеристики биологических свойств бактерий рода Еп-terococcus зависят от биотопа выделения и видовой принадлежности штамма. Клинические изоляты энтерококков, вызывающих острое и затяжное (хроническое) течение инфекционно-воспалительного заболевания, обладают определённой совокупностью биологических свойств, на основании которых можно прогнозировать характер течения инфекционного процесса.

3 ВЫВОДЫ

1. Установлено видовое разнообразие бактерий рода Enterococcus, выделенных из разных биотопов тела животного при инфекционно-воспалительных заболеваниях. Доминирующим явился вид E.faecalis, значительно реже выделялись Е. faecium, Е. casseliflavus, Е. avium, Е. hirae.

2. Выявлено, что все выделенные энтерококки характеризовались способностью к инактивации карнозина и лизоцима с высокими значениями признаков. С использованием молекулярно-генетических исследований уста-

новлено, что способность 70% клинических изолятов к образованию биоплёнок связана с наличием у них гена еэр.

3. Изучение факторов патогенности у разных видов энтерококков выявило их наличие только у Е. /аесаНя. Штаммы, выделенные из экскрета половых органов самок и гнойного экссудата, характеризовались наличием изученных факторов патогенности на фенотипическом и генотипическом уровнях, причем преимущественно набором генетических детерминант патогенности обладали культуры, изолированные из гнойного экссудата. Штаммы, выделенные из секрета молочных желез, характеризовались только про-теолитической активностью.

4. В популяции клинических изолятов Е./аесаНз широко распространена антибиотикорезистентность, причем у 91% штаммов, выделенных из гнойного экссудата, обнаружена полирезистентность. Среди поп-/аесаИз видов значительно реже регистрируются антибиотикорезистентные штаммы и генетические детерминанты, определяющие устойчивость к антибиотикам.

5. При проведении сравнительного анализа 25 биологических свойств штаммов энтерококков, выделенных при разных формах течения инфекционного процесса, определены четыре наиболее информативных признака: гены, кодирующие структурную субъединицу цитолизина, белок-адгезин, белок клеточной стенки, ответственный за уклонение от иммунных сил макроорганизма, антикарнозиновая активность, позволяющие прогнозировать течение инфекционного процесса.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рассчитанное нами регрессионное уравнение может быть использовано для прогнозирования хронического (затяжного) течения инфекционных заболеваний энтерококковой этиологии у животных.

При терапии больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями энтерококковой этиологии в качестве препарата выбора предлагаем ампициллин. Из других антибиотиков, потенциально эффективных при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных энтерококками, рекомендуем использовать гентамицин и стрептомицин; вызванных поп-/аесаШ видами энтерококков - ванкомицин и норфлоксацин.

Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе, при проведении лекционных и лабораторно-практических занятий по курсу «Ветеринарная микробиология и микология».

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биологическое разнообразие энтерококков, выделенных от животных, в норме и при патологии / Н.Е. Щепитова, Д.В. Пошвина,

B.И. Сорокин, М.В. Сычева Н Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2013. - № 4(43). - С. 243-245.

2. Сычева, М.В. Цитолитическая активность энтерококков, выделенных от животных / М.В. Сычева, Д.В. Пошвина, Н.Е. Щепитова // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство». - Уфа. - 2014. - С. 124-127.

3. Пошвина, Д.В. Видовая характеристика и протеолнтическая активность энтерококков / Д.В. Пошвина, М.В. Сычёва // Вестник ветеринарии. - 2014. - № 69. - С. 40-43.

4. Пошвина, Д.В. Распространение генетических детерминант вирулентности среди клинических изолятов энтерококков, выделенных от животных / Д.В. Пошвина, М.В. Сычёва // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014». - 2014. - Т.2. - С. 464-465.

5. Пошвина, Д.В. Антибиотикорезистентность клинических изолятов бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных / Д.В. Пошвина, М.В. Сычёва // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный журнал]. - 2014. - № 3. URL: http://www.elmag.uran.ru.

6. Пошвина, Д.В. Характеристика вирулентного потенциала клинических изолятов энтерококков, выделенных от животных / Д.В. Пошвина // Материалы ежегодной областной научно-практической конференции «Молодые ученые Оренбуржья - науке XXI века». - Оренбург: Издательский центр ОГАУ,2014.-С. 229-231.

7. Пошвина, Д.В. Образование биоплёнок клиническими изоля-тами энтерококков / Д.В. Пошвина // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. — 2015. - №1 (51). - С. 75-76.

8. Видовая характеристика и факторы персистенции энтерококков, выделенных от животных в норме и при патологии / Д.В. Пошвина, Н.Е. Щепитова, Т.М. Уткина и др. // Ветеринария. - 2015. - №6. -

C. 26-30.

9. Пошвина, Д.В. Прогнозирование характера течения энтеро-кокковой инфекции с использованием математической модели / Д.В. Пошвина, М.В. Сычёва, О.Л. Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2015. - №4 (54). — С. 94-96.

Пошвина Дарья Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ЭНТЕРОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 06.08.2015. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Заказ № 7877. Тираж 100 экз.

Издательский центр ОГАУ 460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18. Тел.: (3532) 77-61-43

Отпечатано в Издательском центре ОГАУ