Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту

Ермоленко, Елена Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту"

Ш - I (

294 ¡■ьС"

На правах рукописи

Ермоленко Елена Игоревна

МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ: ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ НА ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, МАКРООРГАНИЗМ И ЕГО МИКРОБИОТУ

03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Суворов Александр Николаевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Королюк Александр Михайлович доктор медицинских наук, профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «(М».!Я^2009 г. в «// » часов на заседании диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12 С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан «/<£.»...(/.____2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Бурова Л.А.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Еще в начале XX века российский ученый И.И. Мечников впервые начал активно пропагандировать использование молочнокислых бактерий (lactic acid bacteria, LAB) в лечебно-профилактических целях. Он создал предпосылки для формирования нового научного направления, включающего изучение межмикробного антагонизма и оценку влияния LAB на организм хозяина, сформулировал основные постулаты для зарождающейся в наши дни научной дисциплины «пробиотической микробиологии» [Нынь И.В.и Королюк A.M., 2008]. Несмотря на длительное и достаточно успешное использование пробиотических пищевых продуктов и препаратов, их активное, но часто бесконтрольное применение в последние десятилетия привело к возникновению ряда серьезных проблем. Среди них можно указать: низкую эффективность действия некоторых препаратов, угнетение собственной микрофлоры хозяина, развитие инфекционной патологии при введении пробиотиков ослабленным больным [Lebenthal Е., Lebenthal Y., 2003; Land М.Н. ct al., 2005]. Становится очевидным, что для увеличения эффективности лечебно-профилактического использования и предотвращения развития побочных эффектов LAB должны вводиться с учетом индивидуальных характеристик пациента и по назначению врача. Именно поэтому в настоящий момент как никогда остро встал вопрос о необходимости серьезных комплексных научных исследований особенностей действия молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микробиоту.

К числу LAB относят два рода бактерий, явившихся предметом настоящего исследования, Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.. [Axelsson L., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Эти микроорганизмы представляют особый научный и практический интерес, так как являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных, широко распространены во внешней среде, входят в состав многих пробиотических препаратов и продуктов. Извест но, что энтерококки и лактобациллы могут оказывать разностороннее влияние на биохимические, физиологические, нейрогуморальные и иммунные процессы в организмах человека и животных [Шендеров Б.А., 2005; Goldin B.R. and Gorbach S.L., 1984; Maldonado G. et al., 2007; Preter V. et al., 2007]. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кисло], холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [Gibson G.R. et al., 1995; Доронин А.Ф.и Шендеров Б.А., 2002]. Некоторые штаммы энтерококков и лактобацилл способны продуцировать в окружающую среду такие продукты, как перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции, конкурировать с патогенными микроорганизмами за пищевые субстраты и сайты прикрепления к

клеткам [Reid G.. 2004; Salminen S. et al., 2004]. Основным требованием, предъявляемым к пробиотическим штаммам LAB, является наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам [Reíd G.. 2008]. Это позволяет использовать пробиотики для усиления или коррекции эффектов антибиотиков, а в ряде случаев -как их альтернативу. На основании большого числа клинических наблюдений можно полагать, что пробиотики практически незаменимы при терапии дисбиотических состояний, болезни Крона, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Ткаченко Е.И. и Успенский Ю.П., 2006]. Кроме того, LAB активно используются при терапии сахарного диабета, аллергических заболеваний [Prescott S. and Bjórkstén В., 2009], ишемической болезни сердца, коррекции нарушений липидного и минерального обменов [Гриневич В.Б. и др., 2004]. Наряду с пероральным введением молочнокислых бактерий целесообразно их местное использование при вагинитах, тонзиллитах и стоматитах [Reíd G. et al., 2004; Elmer G.W., 2001; Maldonado G. et al., 2007].

Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении LAB, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, какое действие они оказывают на отдельные ткани, состояние отдельных систем и макроорганизм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных. Возможность соматической патологии пациента и особенности собственной микрофлоры хозяина делают необходимым индивидуальный подбор пробио-тиков. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий и их паспортизацию. В связи с этим, разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур, а также изучение особенностей их действия в системах in vitro и in vivo, являются актуальной проблемой современной микробиологии.

Целью настоящей работы является изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии максимально эффективного использования пробиотических штаммов LAB для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных стрептококками и другими патогенными микроорганизмами.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать комплекс методических подходов для исследования влияния LAB на патогенные микроорганизмы, нормальную микрофлору и макроорганизм.

2. Провести сравнительное исследование антагонистической активности культур LAB в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, грибов родов Candida и Cryptococcus, а также вирусов простого герпеса.

3. Исследовать геномы LAB, обладающих антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов, на наличие известных генов бактериоциногенности.

4. Изучить влияние антимикробных пептидов, продуцируемых LAB, а также искусственно синтезированных аналогов бактериоцинов на рост и морфофизиологические особенности патогенных микроорганизмов.

5. Провести анализ экспрессии генов бактериоциногенности LAB и исследовать влияние специфических пептидных индукторов на антибактериальную активность молочнокислых бактерий.

6. Исследовать в модельных условиях воздействие штаммов LAB и аутопробиотических энтерококков на клинические симптомы, метаболические процессы, иммунитет и микро-биоту кишечника лабораторных животных при дисбиозе, вызванном приемом антибиотиков, а также при терапии урогенитальных инфекций.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Предложен комплекс методов (микробиологических, биохимических, генетических, иммунологических, гистологических, электронно-микроскопических) для разностороннего изучения воздействия LAB на макроорганизм и заселяющую его микрофлору.

Проведено сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников. Благодаря введению нового количественного показателя удалось охарактеризовать степень антагонистической активности различных штаммов энтерококков и лактобацилл в отношении широкого круга индикаторных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, а также грибов рода Candida и Cryptococcus). Впервые выявлена способность метаболитов лактобацилл и энтерококков угнетать рост микоплазм и репродукцию вирусов простого герпеса в системе in vitro.

Разработаны новые модели экспериментального дисбиоза и бактериального вагинита. При их использовании впервые установлены особенности влияния различных культур LAB на клинические симптомы, микробиоту, показатели иммунитета, тонкие морфологические изменения в тканях животных.

Впервые исследована степень влияния пробиотических штаммов, в частности, молочнокислых бактерий, на метаболические процессы, происходящие в разных отделах желудочно-кишечного тракта.

Впервые на биологической модели доказана эффективность использования инди-генных (аутопробиотических) энтерококков для коррекции дисбиозов у животных.

Впервые выявлено действие искусственно синтезированного энтероцина В и его аналога на грамотрицательные бактерии, проявляющееся в ингибировании роста Е. coli и повреждении их цитоплазматических мембран.

Выявлены штаммовые особенности действия метаболитов энтерококков и лактоба-цилл на морфологию S. pyogenes.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Теоретическое значение работы заключается в том, что диссертантом предложен новый подход для исследования влияния LAB на организм млекопитающих и их микрофлору. В результате удалось значительно дополнить имеющиеся представления об особенностях распространения молочнокислых бактерий в организме и возможности колонизации ими слизистых оболочек урогенитального и желудочно-кишечного трактов.

Установлено, что воздействие пробиотиков на организм сопровождается существенными сдвигами, как в сторону стимуляции, так и в сторону ингибирования реакций иммунной системы, а также пристеночного и просветного пищеварения на разных уровнях желудочно-кишечного тракта. Характер влияния вводимых пробиотических культур зависит от их индивидуальных особенностей, а также от наличия или отсутствия инфекционной патологии. Эти данные имеют большое значение для понимания сложного комплекса взаимодействий макроорганизма и его микробиоты, а также выбора пробиотика в зависимости от клинического диагноза и этиологии заболевания.

Полученные результаты важны для развития медицинской, а также ветеринарной микробиологии, открывают перспективы широкого практического использования и дальнейшего изучения LAB.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Прикладными аспектами исследования являются разработанные на основе экспериментальных данных: 1) метод двухслойного агара с количественной и качественной оценкой антимикробной активности молочнокислых бактерий in vitro\ 2) комплексный подход в исследования прямого и опосредованного антимикробного действия in vivo, с учетом влияния LAB на патогенные микроорганизмы, микробиоту хозяина, метаболизм и иммунную систему макроорганизма.

В ходе сравнительного исследования клинических изолятов из урогенитального тракта выбран и идентифицирован новый штамм LAB, L. fennentum Z, предложенный для использования в составе пробиотических препаратов или пищевых продуктов [Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08]. Его отличительной особенностью является избирательное действие в отношении патогенных микроорганизмов, отсутствие влияния на другие LAB, в частности Е. faecium L3. При исследовании антимикробног о эффек та эти молочнокислые бактерии выступают, как синергисты и могут быть рассмотрены в качестве компонентов нового симбиотического препарата.

Исследование влияния аутопробиотических энтерококков на организм животных при дисбиозе кишечника может рассматриваться как предварительный экспериментальный этап перед комплексным исследованием перспектив применения в клинической практике собственной микрофлоры.

Результаты исследований могут быть использованы при клиническом назначении пробиотиков с целью защиты и профилактики заболеваний инфекционной природы. Применение пробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, изложено в методических рекомендациях, утвержденных методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины».

Модифицированный метод двухслойного агара применяется в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И. Мечникова для изучения микробного антагонизма, на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины».

Результаты диссертационного исследования используются при чтении лекций и проведения практических занятий по микробиологии на медицинском факультете Санкт-Петербургского Государственного университета.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. При назначении пробиотиков, в состав которых входят молочнокислые бактерии, целесообразно учитывать спектр их антимикробной активности, а также особенности их влияния на иммунную систему и метаболические процессы.

2. Предложенные модели экспериментальных дисбиозов и вагинитов, позволяют изучать особенности действия штаммов пробиотиков на макроорганизм и его микрофлору на фоне развития указанных патологических процессов.

3. Новый подход в оценке степени влияния пробиотических бактерий на метаболические процессы в разных отделах желудочно-кишечного тракта расширяет существующие научные представления о роли микробиоты в процессе пищеварения.

4. Модифицированный метод двухслойного агара позволяет проводить количественную оценку антагонистической активности LAB к широкому спектру микроорганизмов и выявлять возможные морфофункциональные изменения индикаторных культур.

5. Созданию симбиотических и комбинированных микробных препаратов должны предшествовать эксперименты, направленные на выявление степени антагонистической активности компонентов консорциумов по отношению друг к другу и к патогенным микроорганизмам при совместном и раздельном культивировании.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 270 страницах и включает: введение, обзор литературы материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы и приложение. Текст диссертации иллюстрирован 77 рисунками и 50 таблицами. Список литературы включает 379 источников, из них 132 отечественных и 247 зарубежных.

Основная часть работы выполнена в отделе молекулярной микробиологии (НИИЭМ СЗО РАМН). Антимикотическая активность LAB исследована автором на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова. Электронная микроскопия и синтез пептидов проведены в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства. (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Ветеринарные исследования проведены в животноводческих хозяйствах Ленинградской области (ЗАО « Предпортовый» и ЗАО ПЗ «Гражданский»).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, из них 23 статьи (9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ), 37 тезисов. Материалы диссертационной работы изложены также в отдельных главах трех книг и в 3 методических пособиях.

Диссертация апробирована на заседании отдела молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН 8 июня 2009 года.

Результаты диссертационной работы были доложены на VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика», Санкт-Петербург, 2000 г, Всероссийской научной конференции, посвящен-

ной 103-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г; I Съезде микологов, Москва, 2002 г; научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российскою общества по инфекционным болезням, Санкт-Петербург, 2002 г; конференции «Пробиотиче-ские микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» Москва, 2002 г; первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва

2003 г; VI Российском съезде врачей инфекционистов, Санкт-Петербург, 2003 г; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Prague, Czech Republic, 2004; научно-практической конференции по медицинской микологии (7-е Кашкинские чтения), Санкт-Петербург, 2004 г; 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», Санкт-Петербург,

2004 г; Международном научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Санкт-Петербург, 2005 г; The XVI Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Palm Cove, Australia, 2005; 7-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме Санкт-Петербург, 2005 г; Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006 г; заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в НИИ им. Пастера, Санкт-Петербург, 2006 г: IX съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007 г; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; 10-м Юбилейном Славяно-Балтийского научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2008», Санкт-Петербург, 2008 г; VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия A.M. Уголевым мембранного пищеварения, Санкт-Петербург 2008 г; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Кишинев, Молдова, 2008 г; The XVII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Porto Heli, Greece, 2008; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», СПб. 2008 г; Международной конференции «Probiotics for the 3rd Millennium» High Tatras, Slovakia, 2008; втором Санкт-Петербургском международном ЭкоФоруме-«Окружающая среда и здоровье человека» Санкт-Петербург, 2008 г;

20th European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2009; Helsinki , Finland, 2009; 8th BIO FORUM BIO EXPO JAPAN, Tokyo, 2009.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД ДИССЕРТАНТА

Основная часть исследований выполнена лично автором. Выделение антимикробных пептидов выполнялось при консультации, д.б.н., профессора В.Н. Кокрякова (НИИЭМ СЗО РАМН). Пептиды по предоставленной аминокислотной последовательности синтезированы д.б.н. А.А.Колобовым (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Электронная микроскопия ультратонких срезов с поверхности двухслойного агара стрептококков и эшерихий выполнена д.б.н., профессором О.В. Рыбальченко (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Исследование биохимической активности проведены совместно с д.б.н. Л.В.Громовой (НИИ Физиологии им. И.П. Павлова). Гистологические исследования проведены д.б.н., П.В. Пигарев-ским (НИИЭМ СЗО РАМН). Культивирование ВПГ и определение выполнено совместно с к.б.н. В.А. Фураевой (НИИ гриппа Северо-Западного отделения РАМН). Лечение послеродового эндометрита у коров проведено совместно с к.в.н. И.В. Марцинковской (Государственная академия ветеринарной медицины) в животноводческих хозяйствах Ленинградской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика штаммов антагонистов и индикаторных микроорганизмов

В качестве антагонистов использованы штаммы энтерококков и лактобацилл, выделенные из пробиотических препаратов, а также изолированные из урогенитального тракта и кишечника здоровых людей (Lactobacillus spp. 62, 64, 65 и E.faecium VI). Большая часть экспериментов проводилась с использованием 6 штаммов пробиотических молочнокислых бактерий: Enterococcus faecium L3 («Ламинолакт»), E.faecium L5, устойчивый к эритромицину дериват штамма L3, Е. faecium SF68 («Бифиформ»), Е. faecium М74 («Линекс»), Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ («Лактобактерин»), L. acidophilus Д № 75 и 76 («Витафлор»), L. aciophilus ЕР 317/402 («Наринэ») и L. fermentum Z (подана заявка на изобретение) в качестве антагонистов. В качестве контролей использовались пробиотические культуры Е. coli M17 и Saccharomyces boulardii П№ 011277, входящие в состав препаратов «Бификол» и «Энтерол», соответственно.

В качестве индикаторных культур использовали: 30 штаммов стрептококков, по 10 штаммов из серогрупп А (СГА), В (СГВ), С (СГС) и G (СШ); Enterococcus spp. V1-V28, Staphylococcus aureus АТСС 25923, S. aureus 209, Shl и Sh 2 (устойчивый к метициллину), Escherichia coli АТСС 25922, Е. coli 1-20, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Proteus mirabilis E, Klebsiella pneumoniae E, Listeria monocytogenes EGD, M. hominis 31.P ATCC15488, Candida albicans ATCC 855-653 и Cryptococcus neoformans E. Также в роли

индикаторных бактерий выступали 7 штаммов молочнокислых бактерии: Е. faecium L3, SF68, М74, L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8P-A3 и L. fennentum Z, использованные как антагонисты.

Для определения противовирусной активности супернатантов культур LAß. полученных из них пептидных экстрактов, а также синтетического энтероцина В и его аналога использовали штамм вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) «Ленинград».

Культуральные среды, условия роста и хранение культур микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов применяли жидкие и плотные питательные среды: ТНВ (Todd-Hewitt Broth, «Difco», США), В HI (Brain Heart Infusion Broth, «Gibco Diagnostics», США), MPC1, MPC4 («НИЦФ», Россия), MRS и колумбийский агар («Hime-dia», Индия) с добавлением (до 10% объема) нормальной лошадиной сыворотки, среду Мюллера-Хинтона («НИЦФ», Россия) триптозный агар («FERAK», Германия). Все бактериальные штаммы инкубировали в аэробных условиях при 37°С. Первичное выделение лактобацилл из проб, взятых из организма людей и животных, осуществляли при той же температуре в микроаэрофильных условиях (в микроанаэростатах с использованием газо-генерирующих пакетов для анаэробов «Becton Dickinson», США).

Методы исследования Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов, изолированных из объектов исследования, проводили по общепринятым методикам [Balows A., et al., 2005]. Исследование биохимических свойств энтерококков и лактобацилл осуществляли при помощи тест систем Lachema (Чехия), bioMerieux (Франция).

Анализ геномов энтерококков и лактобацилл в целях их видовой идентификации, а также выявления генов патогенности и генов, обеспечивающих продукцию бактериоци-нов, выполняли при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Экспрессию генов бактериоцинов в штамме Е. faecium L3, подтверждали, используя метод обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Исследование антимикробной активности культур антагонистов проводили методами штриховых посевов (ГОСТ, 2004), двухслойного агара с определением предложенного нами показателя МИКА (минимального ингибирующего количества антагониста) и с оценкой характера роста индикаторных культур. Кроме того, для изучения антагонистической активности LAB определяли количества жизнеспособных индикаторных микроорганизмов при их выращивании в присутствии молочнокислых бактерий в жидкой питательной среде.

Антимикробную актиъность супернатантов, пептидных экстрактов, полученных из них фракций пептидов, а также искусственно синтезированных пептидов определяли с

помощью метода радиальной диффузии [Lehrer R. I. et al., 1991], капельным и турбоди-метрическим методами.

Противовирусную активность супернатантов LAB и пептидов исследовали, заражая вирусом простого герпеса первого типа (ВПГ-1) культуру клеток Vero, с последующей количественной оценкой цитопатического действия (ЦПД). Наличие репродукции вирусов устанавливали при помощи иммуно-флюоресцентного метода (с поликлональной сывороткой против ВПГ-1).

Концентрацию молочной кислоты в супернатантах LAB определяли энзиматическим калориметрическим методом с использованием тест системы «Лактат-Витал» («Витал Диагностике», Санкт-Петербург, Россия).

Пептидный экстракт из супернатанта культуры Е. faecium L3 получали путем преципитации 70% сульфатом аммония, с последующей фильтрацией через мембрану Amicon РМ (10000 MW, США). Выделение и очистку низкомолекулярных катионных пептидных фракций культуры Е. faecium L3 выполняли путем гельфильтрации.

Анализ молекулярной массы пептидов, входящих в состав фракций, проводили с использованием SDS электрофореза и при помощи масспектрометрического анализа.

Синтез пептидов осуществляли с использованием автоматического синтезатора пептидов Applied Biosystems 430-А (США).

Содержание иммуноглобулинов А, М и G в сыворотке крови крыс и коров, а также слизи из урогенитального тракта и кишечника крыс определяли методом осаждения сульфатом цинка [Холод В.М., и др. 1988].

Функциональную активность СЗ компонента комплемента сыворотки крови крыс оценивали по результатам кинетической регистрации комплементзависимого гемолиза эритроцитов кролика в присутствии реагента RC3 [Jessen Т.Е. et al., 1983].

Экспрессию мРНК цитокинов (IL-lß, IL-8, IL-10, IL-18) и TLR2 рецепторов в тканях слизистой кишечника и влагалища лабораторных животных определяли методом ОТ-ПЦР.

Эксперименты на крысах проводили, используя штамм Е. faecium L5 (Е. faecium L3, несущий ген устойчивости к эритромицину), L. fermentum Z и аутопробиотические штаммы, выделенные из фекапиев здоровых крыс.

Оценку острой и подострой токсичности проводили на беспородных белых мышах и крысах Вистар обоих полов (массой 18-20 г и 200-250 г , соответственно), полученных из питомника «Рапполово РАМН».

Экспериментальный дисбиоз кишечника у крыс вызывали внутрижелудочным введением в течение 3-х дней ампициллина и метронидазола. Затем 5 дней животные получа-

ли молочнокислые закваски. На 8-ой день отбирали пробы химуса, слизи и эпителия для оценки активности фермента мальтазы. Взятие и исследование проб при изучении влияния пробиотиков на кишечное пищеварение осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [Егорова и др., 1987]. Биохимические показатели сыворотки крови крыс определяли при помощи биохимического анализатора Aeroset Toshiba (США).

Модель экспериментального вагинита создавали у овариоэктомированных крыс (самки породы Вистар, масса тела 180-200г), которых интравагинально заражали смесыо патогенных бактерий (Streptococcus agalactiae 219, Staphylococcus aureus LB и гемолитический штамм Escherichia coli IM). Для возобновления половых циклов крысам вводили 0,5 мкг эстрадиол-дипропионата.

Пробы маточного экссудата получали при помощи пластикового катетера, который также был использован для введения лечебных препаратов (молочнокислых заквасок или антибиотиков).

Электронная микроскопия тонких срезов колоний бактерий проведена по методике предложенной О.В. Рыбальченко [Рыбальченко О.В., 2006]

Электронная микроскопия срезов слизистых кишечника и гистологические исследования слизистых урогенитального и желудочно-кишечного тракта крыс были осуществлены по общепринятым методикам.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel и STATISTICA for Windows. Связь между категориями переменных анализировали с помощью t-критерия Стьюдента (сравнение средних величин в группах). Различия считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% (р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ LAB В СИСТЕМЕ IN VITRO 1. Антимикробная активность живых культур LAB Исследование антимикробного действия живых бактерий родов Lactobacillus и Еп-terococcus проводили методами штриховых посевов и предложенным нами вариантом метода двухслойного агара. Антимикотическая активность LAB и их способность влиять на рост друг друга изучались также при совместном культивировании этих микроорганизмов в жидкой среде.

1.1. Исследования методом штриховых посевов

Исследование антимикробного антагонизма LAB методом штриховых посевов было проведено с использованием среды (МРС4), предназначенной для культивирования молочнокислых бактерий. Поэтому в качестве индикаторных микроорганизмов был использован сравнительно узкий круг бактерий (стафилококки, эшерихии, клебсиеллы, лак-

тобациллы и энтерококки), а также грибы рода Candida, способные расти на этой среде. В результате проведенных экспериментов показано, что максимальной антагонистической активностью к использованным индикаторным культурам обладала культура L. plantarum 8Р-АЗ. Несколько меньшую способность ингибировать рост индикаторных культур проявляли L. acidophilus ЕР 317/402 и пробиотические энтерококки (р <0,05). В то же время, большинство клинических изолятов (55 из 65 штаммов Lactobacillus spp. и Е. faecium VI) не обладали антагонистической активностью к перечисленным выше индикаторным микроорганизмам (зоны задержки роста менее 3 мм). Исключение составляли 10 штаммов лактобацилл, выделенных из урогенитального тракта здоровых женщин. Эти бактерии ин-гибировали рост индикаторных культур, причем зоны задержки роста колебались в пределах 4-24 мм. Выраженной антагонистической активностью (с зонами задержки роста более 10 мм) обладали только бактерии, выделенные из пробиотиков: L. acidophilus ЕР 317/402, L. plantarum 8Р-АЗ, Е. faecium L3, Е. faecium М74, Е. faecium SF68, а также клинические изоляты лактобацилл Z, 62 и 65. Обращало на себя внимание то, что большинство культур LAB проявляли максимальную антагонистическую активность по отношению к эшерихиям и стафилококкам, зоны задержки роста которых колебались в пределах 24-35 мм и 12-25 мм, соответственно. Кроме того было отмечено отсутствие антимикотической активности LAB. Исключение составляла культура L. plantarum 8Р-АЗ, вызывающая образованию зон задержки роста грибов до 13 мм. В то же время, именно эта культура в отличие от других исследованных молочнокислых бактерий проявляла антагонистическую активность в отношении других штаммов лактобацилл и энтерококков, а также собственной культуры.

Метод штриховых посевов использовался лишь на первом этапе исследований, так как он позволяет изучать антимикробную активность лактобацилл и энтерококков только в отношении ограниченного числа индикаторных культур. При помощи этого метода было невозможно определить чувствительность стрептококков, псевдомонад и микоплазм к действию LAB, а также выявить статистически достоверные различия антагонистической активности, которые в ряде случаев при исследовании методом штриховых посевов были спорными.

1.2. Исследования методом двухслойного агара

Метод двухслойного агара был использован для изучения антимикробной активности тех культур, которые проявили выраженный антимикробный антагонизм при исследовании методом штриховых посевов. Преимущество предложенного нами варианта метода состоит, прежде всего, в возможности существенного расширения спектра индикаторных культур. Оказалось, что, изменяя состав верхнего слоя агара, можно исследовать антаго-

нистическую активность LAB ко многим микроорганизмам, неспособным расти на средах, в основном предназначенных для роста лактобацилл. В результате, впервые в качестве индикаторных культур были использованы криптококки, микоплазмы, стрептококки различных групп. Важно, также, что для сравнительного исследования антимикробной активности был предложен количественный показатель МИКА. Это позволило провести сопоставление антагонистической активности молочнокислых бактерий по степени выраженности этого эффекта («силе»). Для сравнительного анализа были введены дополнительные количественные критерии, позволившие разделить индикаторные культуры на: 1 ) чувствительные (0-2,5 lg КОЕ/мл), 2) умеренно устойчивые (>2,5 <4,5 lg КОЕ/мл) и 3) резистентные к действию антагонистов (>4,5 lg КОЕ/мл). Результаты сравнительного исследования антагонистической активности LAB по отношению к патогенным бактериям и грибам представлены в таблице1.

1.2.1. Антагонистическая активность LAB к стрептококкам и энтерококкам Большое внимание было уделено действию LAB на бактерии родов Streptococcus и Enterococciis. В результате исследований показано, что максимальный антн-стрептококковый эффект LAB проявляли по отношению к СГА и CXG, промежуточное положение по чувствительности занимали СГС и СГВ. МИКА молочнокислых бактерий по отношению к стрептококкам этих групп составили 1,19 lg КОЕ/мл; 2,35 lg КОЕ/мл, 2,66 lg КОЕ/мл и 4,15 lg КОЕ/мл, соответственно. В то же время, все энтерококки росли в присутствии большего количества колоний антагонистов (5,34 lg КОЕ/мл).

Наибольшую разницу в чувствительности к действию LAB удалось установить, анализируя особенности роста 10 штаммов S. pyogenes в присутствии различных молочнокислых бактерий. Показано, что все эти чувствительные к действию молочно-кислых бактерий штаммы СГА существенно отличались по степени восприимчивости к действию LAB. Так, штамм S. pyogenes 3 обладал более высокой устойчивостью к действию всех энтерококков и лактобацилл. В то же время, штаммы 1 и 9 можно отнести к более чувствительным индикаторным культурам. Остальные штаммы стрептококков не отличались по чувствительности к действию использованных в работе LAB (р < 0,1).

Существенное значение имели эксперименты, в ходе которых впервые были выявлены особенности влияния двух штаммов LAB на морфологию стрептококков группы А (рис.1). Пробиотический штамм E.faecium L3 вызывал нарушение морфогенеза фимбрпе-подобных структур на поверхности S. pyogenes и способствовал образованию удлиненных клеток (коккообацилярной формы).

Штамм L. fennentum Z только нарушал характер деления исследуемых стрептококков, вызывая их полиморфизм, образование кокковидных и палочковидных клсток. Это

дополняет наши представления о разнообразных механизмах действия LAB, доказывает высокую информативность электронно-микроскопического метода для изучения механизмов их действия.

Таким образом, полученные результаты предполагают использование пробиотиче-ских молочнокислых бактерий для профилактики и лечения инфекций верхних дыхательных путей и урогенитального тракта, вызванных СГА и СГС. По-видимому, эффективность лечебно-профилактических мер в этих случаях варьирует в зависимости от свойств культуры пробиотика и индивидуальной чувствительности возбудителя инфекционного заболевания к действию LAB.

Рис. 1. Влияние метаболитов культур E.faecium L3 и L. fermentum Z на ультраструктуру S. pyogenes 1 (16/49, серотип М4).

Электронная микроскопия, метод ультратонких срезов, увеличение 30000. S. pyogenes 1, выросшие на поверхности двухслойного агара в присутствии в нижнем слое E.faecium L3 (A), L. fermentum Z (Б) и без LAB (В).

Таблица 1

Антагонистическая активность (МИКА, lg КОЕ/мл) LAB в отношении патогенных микроорганизмов

Штаммы LAB L. monocytogenes EGD aureus ATCC 25923* S. pyogenes (n=10)** S. agalacliae (n=10)** Entero-coccus spp. (n=10)** E.coli ATCC 25922* P. aeruginosa ATCC 27853* P. mirabilis E Kl. pneumoniae E С. albicans ATCC 665-853

E.faecium L3 0,88±0,05 3,34±0.22 1,07+0,06 3,52±0.02 5,28 ± 0,03 2,34±0,16 0,88±0,67 6,3±0,36 2,03±0,-4 6,31±0,39

Ii. faecium SF68 1,21±0,09 3,89±0.19 1,21+0,06 4.41±0.12 6,24±0,26 2,89±0,19 1,89±0,95 4j0±0,24 2,89±0,15 >7

E. faecium M74 2,48±0,18 4д3±0,03 1,58±0,-11 4.31±0,13 5,05±-0,35 3,51 ±0,07 2.74±0.18 3^*0,13 2,04±0,12 >7

L.plantarían 8A-P3 0,5±0,03 2,5±0,02 0,88±0,12 3.66±0.02 4,17±0.23 1,33±0,08 0,54±0,12 0,25±0,15 2,33±0,14 3.61±0,18

L acidophilus EP 312/407 1,2±0,06 2,37±0,04 1,33±0,08 4,33±0. 22 5,01±0, 45 1,76±0,05 1,57±0,27 2,44+0,15 3.76±0.19 >6,5

L. acidophilus Д № 75 и 76 2,5±0,09 3.68±0.07 1,35*0,08 4,88±0,24 5,6+0, 41 2,26±0,09 1,26±0,06 i4±0,20 2,26+0,11 >7

L fermentum Z 1,88±0,04 3.53±0.08 1,12±0,08 4,12±0. 29 4,76±0, 32 2,50±0,07 2,50±0,13 3,83±0.23 3,53±0,21 5,17±0,31

Примечания: серым цветом выделены чувствительные культуры LAB ( МИКА <2,5 lg КОЕ/мл), подчеркнуты LAB с умеренной устойчивостью (2,5 <МИКА <4,5 lg КОЕ/мл), устойчивые бактерии не выделены цветом (МИКА > 4,5 lg КОЕ/мл ).

Использованы штаммы, рекомендованные для определения чувствительности к антибиотикам, соответствующие критериям определения чувствительности бактерий и грибов к антибиотикам Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) 2006 года; ** - приведены средние арифметические данные по результатам исследования 10 штаммов стрептококков и энтерококков.

1.2.2. Антагонистическая активность LAB к стафилококкам

Установлено, что исследованные штаммы LAB обладают неодинаковой способностью влиять на рост и жизнеспособность S. aureus. Наибольшей антагонистической активностью по отношению к этим бактериям обладали штаммы L. acidophilus ЕР 317/402, L. plantarum 8Р-АЗ и E.faecium L3. В меньшей степени ингибировали рост стафилококков штаммы Е. faecium SF68 и М74, L. acidophilus Д № 75 и 76, а также выделенные из влагалища штаммы лактобацилл Z и 62. Не обнаружено антистафилококкового эффекта культур E.faecium VI и Lactobacillus sp. 64. Показано, что большей чувствительностью обладали штаммы S. aurous 209 и SHI, несколько меньшей - S. aureus АТСС 25923 и SH2 (р< 0,05). Средние МИКА для перечисленных штаммов составляли 4,2; 3,5 и 3,271g К ОЕ/мл, соответственно. Интерес представляли наблюдения, касающиеся культуральных свойств S. aureus 209. Эти бактерии обладают ярко выраженной способностью вырабатывать золотистый пигмент. При воздействии субингибирующих концентраций (в 5-10 раз меньше МИКА) культур LAB, бактерии вырастали, однако пигментообразование не наблюдалось, в отличие от контрольных проб, в которых стафилококки не испытывали влияния молочнокислых бактерий (в нижний слой не были добавлены культуры антагонистов).

Несмотря на то, что вырабатываемый пигмент не рассматривается как фактор па-тогенности стафилококков, данный феномен показывает возможность выявления изменений физиологических свойств индикаторных микроорганизмов в результате воздействия метаболитов LAB, в ряде случаев важных с медицинской точки зрения.

1.2.3. Антагонистическая активность LAB к листериям

Используя метод двухслойного агара, были определены значения МИКА, характеризующие антилистериозную активность культур E.faecium SF68, L3 и М71, а также Lactobacillus spp. 8Р-АЗ, ЕР 317/402, Z, Д № 75 и 76. Все они проявили себя как высокоактивные антагонисты, показатели МИКА которых колебались в пределах 0,5-2,5 lg КОЕ/мл. Несколько менее активны были лактобациллы (р <0,01), в том числе L.fermentum Z.

1.2.4. Антагонистическая активность LAB к грамотрицательным бактериям

Исследованные молочнокислые бактерии обладали высокой антагонистической активностью по отношению к штаммам кишечных палочек. МИКА колебались в пределах 1,3 -3,0 lg КОЕ/мл. В то же время, действие клинических изолятов лактобацилл и энтерококков было менее эффективным (МИКА 4,8-5,0 lg КОЕ/мл). Аналогичные результаты были получены при исследовании штаммов эшерихий, выделенных от детей при колиэн-теритах (10 штаммов) и коров при послеродовых эндометритах (5 штаммов). Анализ чувствительности отдельных штаммов Е. соН к действию культур LAB не выявил статистиче-

ски достоверных штаммовых различий, что может быть связано со сходными механизмами действия молочнокислых бактерий на эшерихии.

Антагонистическая активность LAB к псевдомонадам и клебсиеллам исследовалась на примере типовых штаммов. Значения МИКА молочнокислых бактерий по отношению к клебсиеллам были несколько выше (средние значения этого показателя были выше, р < 0,05). Кроме того, было показано, что максимальной активностью обладали по два про-биотических штамма энтерококков (L3 и М74) и лактобацилл (Д 75 и 76, 8Р-АЗ).

Все остальные штаммы молочнокислых бактерий обладали промежуточной активностью, за исключением малоэффективно действующих клинических изолятов Lactobacillus spp. 62 и 64. Важно, что практически все культуры пробиотических лактобацилл и энтерококков ингибировали рост P. aeruginosa АТСС 27853. В количестве 0,5-2,5 lg КОЕ/мл. Культуры L. fennentum Z и 62 в отличие от других LAB демонстрировали промежуточную активность (МИКА 3,5 и 3,8 lg КОЕ/мл, соответственно). Остальные клинические изоляты ингибировали рост данной индикаторной культуры только при МИКА выше 5,8 lg КОП /мл.

Исследования антагонистической активности LAB по отношению к протеям проводили отдельно от других индикаторных культур, так как бактерии рода Proteus при росте могут распространяться по всей поверхности плотной среды, демонстрируя «ползучий» рост. Показано, что максимальный ингибирующий эффект вызывала культура L. plantarum 8Р-АЗ, L. acidophilus ЕР 317/1402, L. fennentum Z , L. acidophilus Д Ns 75 и 76, значительно в меньшей степени (только при МИКА >4,0 lg КОЕ/ мл, р <0,05) ингибировали рост протеев пробиотические энтерококки (SF68, L3 и М74).

Особый интерес представляла выявленная общая тенденция - способность влиять на культурапьные свойства Proteus sp.. При воздействии на эти бактерии LAB в субингп-бирующих концентрациях (в 10 -100 раз меньше МИКА) культура P. mirabilis утрачивала способность к ползучему росту.

1.2.5. Антагонистическая активность LAB к микоплазмам

Микоплазмы являются одними из самых медленно растущих и требовательных к условиям роста бактерий. Возможно, именно поэтому M. hominis 31.Р АТСС 15488 оказались самой чувствительной из использованных индикаторных культур. МИКА всех LAB характеризующие их антагонистическую активность в отношении микоплазм колебались в пределах 0-2 lg КОЕ/мл.

При использовании субингибирующих концентраций молочнокислых бактерий существенно изменялась морфология колоний. Они вырастали в виде мелких колоний, не образуя на поверхности среду скопления бактерий, напоминающих яичницу «глазунью».

1.2.6. Антагонистическая активность LAB в отношении грибов

Показано, что практически все исследованные культуры молочнокислых бактерий обладали низкой антимикотической активностью, за исключением L. planlarum 8Р-АЗ, L. acidophilus ЕР 317/402 и L. fermentum Z. Индикаторные штаммы грибов проявляли умеренную устойчивость к действию данных LAB (МИКА < 4,5 lg КОЕ/мл).

Обращало на себя внимание, что культура Cryptococcus neofonnans росла на поверхности двухслойного агара медленнее и оказывалась более чувствительной к действию антагонистов (р <0,05).

В то же время, было отмечено, что добавление в нижний слой агара субингибирующих (в 10 раз меньше МИКА) концентраций антагонистов приводило к изменению характера размножения грибов рода Candida. Они утрачивали способность образовывать псевдомицелий.

В этом разделе работы наряду с LAB была использована контрольная культура антагонистов Saccharomyces boulardii П № 011277. Данный пробиотический штамм грибов проявил существенно большую антимикотическую активность (р < 0,01). Его показатели МИКА составляли менее 2,0 lg КОЕ/мл.

1.2.7. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий друг к другу

Исследование способности LAB ингибировать рост друг друга позволяло изучать их влияния на микрофлору, в частности, взаимодействие с индигенными LAB в целях создания новых устойчивых консорциумов.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, более выраженный антагонизм в отношении энтерококков и лактобацилл, а также собственных культур проявляли штаммы L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus ЕР 317/402. Средние арифметические значения их показателей МИКА были 2,3 и 3,3 lg КОЕ/мл, соответственно.

Культура Z отличалась от других LAB сравнительно низкой антагонистической активностью ко всем лактобациллам и энтерококкам (средняя арифметическая МИКА составила 4,4 lg КОЕ/мл).

Таблица 2

Антагонистическая активность (МИКА, lg КОЕ/мл) штаммов LAB друг к другу

Антагонисты Индикаторные культуры

E. faecium L3 E. faecium SF68 /.. faecium M74 L. plantarum 8P-A3 L. acidophilus EP 312/407 L. fermentum Z

Е. faecium L3 4,34±0,7 2.88±0.5 0,88±0,054 6,03±0,32 4.5±0.23 5.5±0.282

Е. faecium SF68 2.89+0.15 2.89±0.15 0,89±0,045 5,39±0,27 4,89±0,25 3.84±0.20

Е. faecium М74 3.31 ±0.23 2.87±0.17 0,87±0,044 4,89±0,24 5,6±0,21 4.04 ±0.24

L. plantarum 8Р-АЗ 2,04±0,12 1,54±0,10 0,54±0,027 5,54±0,28 3.54+0. 177 0.54±0.027

L. acidophilus ЕР 312/407 2.37±0.42 1,37+0,22 2,37±0,12 7.37±0.37 5±0,30 3.54+0. 21

L. acidophilus Д № 75 и 76 3.91+0.23 3.45*0.17 2,45±0,12 5,59±0,27 5±0,25 3.45+0.17

L. fermentum Z 5,83±0,35 3.9+0.20 3.9+0.2 >6,9 4.45+0.22 5. 45+0.27

Примечания: серым цветом выделены чувствительные культуры LAB (МИКА <2,5 lg КОЕ/мл), подчеркнуты LAB с умеренной устойчивостью (2,5 <МИКА < 4,5 lg КОЕ/мл), устойчивые бактерии не выделены цветом (МИКА > 4,5 lg КОЕ/мл).

1.2.8. Антагонистическая активность консорциумов LAB

В данной работе был проведен сравнительный анализ антимикробной активности моно - и смешанных культур молочнокислых бактерий. Показано, что при совместном культивировании энтерококков и лактобацилл, в зависимости от использованных комбинаций штаммов, суммарная антагонистическая активность может снижаться, оставаться неизменной или увеличиваться по силе и спектру. Это доказывает необходимость подбора бактериальных культур для создания симбиотических пробиотических продуктов и препаратов. В качестве примера симбиотического консорциума с высокой антимикробной активностью предложена комбинация штаммов Е. faecium L3 и L. fermentum Z. Показано, что при совместном культивировании этих культур LAB суммарная антимикробная активность по отношению к стрептококкам групп А (рис. 2А) и В (рис. 2 Б); стафилококкам, листериям (Рис. 2 В) грамотрицательным бактериям и грибам (2Г) была больше, чем проявляли монокультуры антагонистов, или оставалась без изменений.

Как видно на рис. 2, штаммы антагонистов проявляли неодинаковую антимикробную активность. Как правило, более антагонистически активный штамм «компенсировал» не-

достаточную активность второго компонента консорциума. Примерами таких индикаторных культур могут быть штаммы S. pyogenes 5 и 7; S. agalactiae 11, 14 и 16; L. monocytogenes EGD\ S. aureus, SHI, Sh 2 и 209; а также Proteus sp. и грибы рода Candida. Более сильным антагонистом, как правило, являлся штамм энтерококков. Однако в последних трех случаях антагонистическая активность монокультуры L. fermentum Z была выше Е. fecium L3. Наличие взаимодополняющих спектров действия этих культур и увеличение антимикробной активности при их совместном культивировании, позволяет рассматривать эти молочнокислые бактерии как компоненты для создания нового пробиотического консорциума

1. 3. Исследование антимикробного действия LAB в жидкой среде

О симбиотических взаимоотношениях между L. fermentum Z и Е. faecium L3 косвенно свидетельствуют и результаты совместного культивирования этих культур вередах МРС1 и молоке, с последующим высевом проб на селективные среды. Доказано, что данные бактерии не ингибируют рост друг друга. В то же время, совместное культивирование энтерококков с L. plant a rum 8Р-АЗ и L. acidophilus ЕР 317/402 вызывало замедление динамики роста Е. faecium L3, существенное снижение их концентрации (более чем в 1000 раз) через 24 часа инкубации по сравнению с контрольными пробами (без лактобацилл) и при инкубировании с L. fermentum Z.

1. 4. Антимикробная активность супернатантов LAB Антибактериальная активность супернатантов всех лактобацилл, полученных при их культивировании в бульоне МРС1, была больше, чем у супернатантов энтерококков, выращенных на этой среде. Она проявлялась существенным замедлением скорости роста индикаторных культур (L. monocytogenes, S. agalactiae, S. pyogenes) в фазу адаптации. Различия в проявлении антибактериальной активности были обнаружены только при определении минимальных ингибирующих разведений супернатантов, что явилось новым критерием для сравнения близких по антимикробной активности культур антагонистов. Показано, что все исследованные LAB не продуцировали перекись водорода, не имели существенных различий в продукции молочной кислоты и интенсивности подкислении среды при культивировании.

1.5. Антимикробные факторы культур Е. faecium L3 и L. fermentum Z

Дальнейшие исследования антагонистически активных штаммов молочнокислых бактерий позволили нам выявить в геномах штаммов Е. faecium L3 и L. fermentum Z гены, обеспечивающие продукцию ранее описанных другими авторами энтероцинов А и В, а также лактоцина F, соответственно.

St.a. St.a. 209 St.a. Shi St.a.Sh2 L.m. 25922

□ -L3 ■ -Z H-L3+Z

Рис. 3. Антагонистическая активность (МИКА) консорциума и монокультур E.faeciwn L3

и L. fermentum Z к СГА (А) и СГВ (Б) стафилококкам, листериям (В), грамотрицательным

палочкам и грибам (Г)

Условные обозначения: 1, 3, 5, 7 и 9 - штаммы S. pyogenes, различных серотипов, М4 (1) или М49 (3, 5, 7 и 9); 11, 12, 14, 15 и 16 - штаммы S. agalactiae различных серотипов (58/59 1а, 59/59 lb, 10/84V, 13/63 III, 97/44 I ас); L.m. -Listeria monocytogenes EGD;

E. с. - E. coli ATCC25922; St. a. - S. aureus ATCC 25923, 209, SHI и Sh2; K.p. -Klebsiella pneumoniae ОШ; P.a. - Pseudomonas aeruginosa; Pr. m. - Proteus mirabilis E; C.a. -C. albicans ATCC 885-653. Примечание: *- p<0,05

В культуре Е. faecium L3 при помощи ОТ-ПЦР обнаружена экспрессия генов, обеспечивающих синтез специфического регуляторного феромона, самих энтероцинов и белков иммунитета. В супернатантах культуры энтерококков обнаружены пептиды. Последние были устойчивы к действию температуры, по величинам молекулярного веса соответствовали энтероцинам А и В, а также обладали характерной для рассматриваемых бактерио-цинов антилистериозной активностью [Moreno M.R.F. et al., 2003; deVuyst L. and Leroy F, 2007].

1.6. Влияние феромонов на антибактериальную активность энтерококков

Особенно важно, что антибактериальная активность Е. faecium L3 (в отличие от других энтерококков) существенно возрастала при его культивировании в бульоне BHI в присутствии специфического искусственно синтезированного феромона, способного по данным литературы стимулировать продукцию энтероцинов А и В. Аналогичный эффект был получен и с использованием синтетических более коротких дериватов данного регуляторного пептида (рис. 3). Это может быть связано с тем, что специфический феромон (Ent F) и его аналоги (EntFl и EntF2) стимулируют в штамме Е. faecium L3 экспрессию генов, обеспечивающих продукцию энтероцинов А и В.

a-c-t-l-p-g-l-p-a-s-a-l-v^ v ^ l-p-a-,-a-l-v-|_v_f s tv-p-s

ti i i I ■

c-l-l-f c-l-l-f c-l-l-f

Ñ N N

Ent F Ent F1 EntF2

Рис. 3. Аминокислотные последовательности феромона и его аналогов.

EntF- полный аналог естественного феромона, Ent F1 и Ent F2 - более короткие дериваты EntF. Молекулярная масса пептидов Ent F, EntFl и EntF2 составляла 2.7, 2.1 и 1.3 кДа, соответственно.

Кроме того, при исследовании супернатантов культуры Е. faecium L3 обнаружены дополнительно фракции антимикробных пептидов с молекулярной массой 1,5-2,2 кДа, которые также обладали антибактериальной активностью по отношению к листериям, однако в большей степени ингибировапи рост эшерихий.

1.7. Искусственно синтезированный энтероцин В и его аналоги

Для выяснения особенностей действия энтероцина В были синтезированы два пептида, последовательность одного из которых в точности соответствует зрелому (процес-сированному) энтероцину В, а второй представляет собой его укороченный дериват (В1). Аминокислотная последовательность этих пептидов представлена на рис. 4.

a-k-c- g-a-a-1 - a-g-g-l-f-g-l -p-k e-n-d-h-r-m-p-n-e-l-n-r-p-n-n-l-s-k-g-g-a-k-c-g-a-a-l-a-g-g-l-f-g-l-p-k

s g s g

S P S p

n-c-k-s-y-v-n-a-l-g-a-a-w-a-l n-i-k-s-y-v-n-a-l-g-a-a-w-a-l

B1 В

Рис. 4. Структура искусственно синтезированных энтероцина В и его аналога (В1). Молекулярная масса пептидов В и В1 составляла 5,5 кДа и 3,2 кДа, соответственно.

Обнаружена способность этих пептидов ингибировать рост грамположительных бактерий L. monocytogenes и S. pyogenes. Впервые выявлены особенности воздейст вия энтероцина В на Е. coli. Установлено, что рассматриваемый бактериоцин и его аналог в концентрации 2 мкг/мл вызывают образование зон задержки роста (10-15 мм) листерий, стрептококков и эшерихий, засеянных в виде газона на плотной питательной среде. Методом электронной микроскопии обнаружено повреждение цитоплазматической мембраны эшерихий, выращиваемых в присутствии данных пептидов. Это приводило к нарушению целостности бактериальных клеток и появлению множественных фрагментов цитоплазмы в межклеточном пространстве.

1.8. Исследование противовирусной активности LAB

Влияние супернатантов различных пробиотических культур на выраженность ЦПД вирусов оценивали, сравнивая количество измененных клеток при внесении потенциальных ингибиторов репродукции ВПГ-1 за 90 мин до инфицирования культуры клеток. Как показано на рис.5., вирусы одни или в присутствии супернатанта эшерихий вызывали существенное ЦПД с поражением 95-100% клеток. Добавление ацикловира полностью защищало клетки Vero от влияния ВПГ-1. Супернатанты энтерококков и лактобацилл в разведениях 1:5 ингибировапи ЦПД на 30 и 88 %. Супернатанты штаммов E.faecium L3 и L. plantarum 8Р-АЗ действовали в больших разведениях (до 20 раз), однако эффект уменьшался по мере снижения концентрации метаболитов этих бактерий. Наиболее выраженное антивирусное действие оказывали факторы, содержащиеся в супернатанте энтерококков. В данном случае при использовании максимальной нетоксичной концентрации препарата существенно (в 10-100 раз) повышалась максимальная инфекционная доза вируса. Также ингибировал репродукцию ВПГ-1 и пептидный экстракт, полученный из супернатанта культуры Е. faecium L3. Однако синтетический энтероцин В и его аналог В1 в относительно высоких концентрациях до 0,5 мг/мл не оказывал противовирусного эффекта.

Итак, результаты комплексного исследования антагонистической активности LAB по отношению к различным бактериям, а также грибам и вирусам выявили существенные различия в антимикробной активности культур лактобацилл и энтерококков в системе in

vitro. Штамм L. planatarum 8P-A3 проявлял максимальную антагонистическую активность к подавляющему большинству индикаторных микроорганизмов, однако в том числе и к самим молочнокислым бактериям. Несколько в меньшей степени была выражена способность ингибировать рост грамотрицательных и грамположительных бактерий у других пробиотических штаммов Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.

too-,' "............................................................ш=г=Ъ......

> 90 H

i 80 _ I

S 70 (■=! (П ■

j 60 \ h I

i SO- . I

40 ç ■ Щ

* j^.■ LJ. 1 Li 1 LBlU

Лцикловир E.faecium L3 L.ptantanim E.caliM17 Контроль SP-ЛЗ

|И1:05 □ 1:10 D1-2Ô1

Рис. 5. Влияние различных концентраций супернатантов пробиотических бактерий на репродукцию ВПГ-1

Условные обозначения: 1: 5, 1:10, 1: 20 - разведения супернатантов. *- р<0,05

Антимикробные свойства были выражены минимально у клинических изолятов лактобацилл и энтерококков, выделенных из урогенитального тракта и кишечника здоровых людей. Исключение составлял штамм L. fermentum Z, показатели антимикробной активности которого были сопоставимы с культурами, выделенными из пробиотических препаратов и продуктов. Одними из наиболее перспективных для дальнейшего изучения и практического использования в виде моно- и поликомпонентных пробиотических продуктов и препаратов оказались штаммы L. fermentum Z и Е. faecium L3. Отличительной особенностью этих культур является наличие высокой антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам и практически полное отсутствие ингиби-рующего эффекта при совместном росте с другими LAB. Для изучения механизмов их антимикробного действия особенно важным оказалось выявление генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов в этих штаммах.

II. ВЛИЯНИЕ LAB НА ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, МАКРООРГАНИЗМ И ЕГО МИКРОБИОТУ В СИСТЕМЕ IN VIVO Существенной частью проведенного исследования являлась оценка антимикробного действия LAB в системе in vivo. В данной работе эксперименты были проведены на здоровых мышах и крысах, а также на моделях кишечного дисбиоза и урогенитальных инфекций.

1. Влияние LAB на здоровых животных и их микрофлору

Исследования на здоровых животных были важны для выяснения особенностей действия LAB при их использовании в профилактических целях, а также рассмотрения возможностей длительного приема пробиотиков.

1.1. Исследование острой и подострой токсичности LAB

Подводя итоги выполненных испытаний на мышах и крысах острой и подострой токсичности живых культур L. fermentum Z, L. acidophilus Д № 75 и 76, Е. faeciwn L3 и L5, можно заключить, что 1) однократное введение (внутрибрюшинное, интравагиналыюе или пероральное) этих бактерий в количестве до 10 lg КОЕ/мл; 2) кратковременное (до 10 дней) и более продолжительное (14 и 35 дней) пероральное введение молочнокислых заквасок, содержащих 8 lg КОЕ/мл E.faecium L3, L5 и L. fermentum Z, не оказывает токсического воздействия на структуру и функцию основных органов и систем животных. Это соответствует требованиям, предъявляемым к пробиотическим штаммам бактерий.

1.2. Влияние внутрижелудочного введения E.faecium L5

Более детальное исследование влияния внутрижелудочного введения молочнокислой закваски, содержащей Е. faecium L5, а также использованных в качестве контроля молока, фосфатного буфера или молочной закваски на основе эшерихий, не выявило существенных различий в аппетите и массе тела животных в течение 14 дней наблюдений. В этих экспериментах также не были обнаружены существенные сдвиги в составе микро-биоты кишечника. В то же время были зарегистрированы более высокие показатели (р < 0,05) активности мальтазы эпителия тонкой кишки крыс, получавших эшерихии, по сравнению с животными, которым вводили молочнокислую закваску с энтерококками. Биохимические показатели сыворотки крови за период наблюдений практически не изменялись. Исключение составляли небольшое снижение уровня триглицеридов на фоне использования молочнокислых заквасок с энтерококками.

Статистически достоверных различий в уровне содержания иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) сыворотки крови и слизи кишечника крыс выявлено не было. На 14 день исследований выявлена большая активность СЗ фракции системы комплемента сыворотки крови животных, получавших пробиотические закваски, по сравнению контрольными группами. При этом, значения показателя Tjag, время до начала гемолиза, в группах крыс, которым внутрижелудочно вводили эшерихии и энтерококки (43± 13,1 си 45,8 ±6.9 с), были меньше (р<0,05), чем у интактных животных и получавших молоко (56,7± 15,5 с и 57,1 +17,8 с). При исследовании биоптатов слизистой кишечника крыс различных групп на 7 и 14 дни эксперимента не было обнаружено существенных различий уровнях экспрессии мРНК IL-ip, IL-8, IL-18 и TLR2 рецепторов. Однако выявлены, индивидуальные

особенности пробиотических бактерий при их введении здоровым крысам в течение 7 дней. Так штамм Е. faecium L5 в отличие от E.coli М17 вызывал экспрессию мРНК про-воспалительного цитокина IL-10.

1.2. Влияние интравагинального введения Е. faecium L5 Введение здоровым крысам и мышам во влагалище высоких концентраций Е. faecium L5 (до 10 lg КОЕ/мл) не изменяло состояние животных, не оказывало токсического действия на слизистую влагалища и матки животных. При гистологическом исследовании не было обнаружено признаков воспалительной реакции.

2. Экспериментальный дисбиоз Для изучения влияния LAB на макроорганизм и его микрофлору при развитии дис-биотических состояний была разработана модель дисбиоза кишечника, вызванного внут-рижелудочным введением антибактериальных препаратов (ампициллина и метронидазо-ла). В качестве пробиотиков были использованы генетически маркированный штамм Е. faecium L5, индигенные энтерококки, выделенные из кишечника здоровых крыс до антибактериального воздействия (аутопробиотики), и штамм L. fermentum Z. Отсутствие генов патогенности в геноме отобранных клонов индигенных Enterococcus spp. подтверждено при помощи ПЦР. Контрольным группам животных после воздействия антибиотиками вводили молоко. Наличие дисбиоза кишечника у крыс было подтверждено их клиническим состоянием (потеря аппетита, снижение веса, метеоризм, поносы и другими), а также результатами бактериологического анализа. Исследование фекалий крыс после воздействия антибиотиками выявило: снижение количества лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков, а также увеличение числа патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов рода Candida (рис. 6).

2.1. Коррекция дисбиза кишечника Е. faecium L5, индигенными энтерококками и L. fermentum Z У всех крыс, получавших молочнокислые закваски, отмечалось более быстрое, по сравнению с животными контрольных групп, восстановление аппетита, нормализация стула и увеличение массы тела. Бактериологические исследования фекалий крыс, после воздействия пробиотическими заквасками с Е. faecium L5, свидетельствовало о быстрой колонизации кишечника крыс генетически маркированными энтерококками. Это приводило к полной элиминации протея, клебсиелл, золотистых стафилококков и лактозонега-тивных или гемолитических эшерихий. Следует отметить, что при сравнении эффектов воздействии различных LAB на микрофлору кишечника крыс с дисбиозом выявлены существенные различия. Как видно на рис. 7., при введении молочнокислых заквасок с L. fermentum Z уменьшение числа клебсиелл происходило в меньшей степени, а при исполь-

зовании индигенных энтерококков - даже увеличивалось. В то же время, указанные культуры молочнокислых бактерий способствовали более активной элиминации протея из кишечника животных. 9 ■

1 ■

| | До воздействия антибиотиками Я После воздействия антибиотиками

Lb.

Bif.

Ent.

S. a. E.coli*

Pr.

Kl.

Candida SPP-

Рис. 6. Влияние антибиотиков на микрофлору кишечника здоровых крыс Условные обозначения: Lb. - Lactobacillus spp., Bif. - Bifidobacterium spp., Ent. - Enterococcus spp., S. a. - Staphylococcus aureus, Pr. - Proteus spp., Kl. - Klebsiella spp.. E. coli * - нетипичные эшерихии. *- p<0,05

Обращало на себя внимание то, что только культура E.faecium L5 вызывала снижение содержания эшерихий (в том числе и типичных). Культуры L. fennentum Z и индигенных Enterococcus spp. способствовали незначительному увеличению количества эшерихий в желудочно-кишечном тракте животных. Важно, что при введении животным молока происходило увеличение обсемененности желудочно-кишечного тракта крыс Klebsiella spp. и Е. coli, а также только незначительное уменьшение содержания протея. Кроме того, на фоне введения молочнокислых заквасок отмечено более быстрое, по сравнению с контрольными пробами, увеличение числа лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков в кишечнике животных (рис. 8). В большей степени этот эффект проявлялся при введении индигенных энтерококков. Молочнокислая закваска с L. fennentum Z не проявляла бифидо-и лактогенной активности, однако способствовала заселению кишечника крыс энтерококками быстрее, чем при введении животным молока или E.faecium L5. Таким образом, в серии экспериментов с введением различных молочнокислых заквасок крысам при дисбиозе кишечника впервые удалось выявить особенности антимикробного действия LAB в системе in vivo. Важно, что впервые в качестве аутопробиотиков было предложено использовать

не лактобациллы и бифидобактерии, [Шендеров Б.А., 2003], а непатогенные энтерококки, выделенные из кишечника хозяина.

1 н о

-2 -

-3 -

-4 J

Е. faecium L5 L. fermentum Z Enterococcus * ФБ

Молоко

■т

Qj-

□ E.coli. □ Proteus spp. Я Klebsiella spp.

Рис. 7. Изменения содержания грамотрицательных бактерий в микробиоте кишечника крыс с дисбиозом после воздействии различными молочнокислыми заквасками. Условные обозначения: ФБ - фосфатный буфер, Емегососсия * - индигенные энтерококки (аутопроботики). *- р<0,05

Е. faecium L5 L. fermentum Z Enterococcus* молоко ¡OLactobacillus spp. □ Biftdobactrium spp. ШEnterococcus spp. \

Рис. 8. Изменения содержания лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков в микробиоте кишечника крыс с дисбиозом после воздействии различными молочнокислыми заквасками.

Примечание: Enterococcus * - индигенные энтерококки (аутопробиотики).

2.2. Влияние LAB на метаболизм мальтозы в кишечнике

На примере животных, получавших терапию молочнокислой закваской, содержащей генетически маркированный штамм Е. faecium L5 (группа А), было исследовано влияние LAB на метаболизм. В качестве контрольных групп использовались интактные крысы

(группа К) и животные с дисбиозом, вызванном приемом антибиотиков, которые получали молоко (группа Б). Исследуя активность метаболических процессов, происходивших в слизи, химусе, эпителии разных участков тонкой и толстой кишки крыс с дисбиозом, нам удалось доказать участие энтерококков в углеводном обмене, в частности, ингибирование выработки мальтазы эпителиоцитами в проксимальных участках желудочно-кишечного тракта на фоне активного заселения этих участков тонкой кишки Е. faecium L5. В химусе была отмечена большая активность мальтазы в пробах, взятых из толстой и проксимальных отделов тонкой кишки крыс группы А, по сравнению с контрольной группой Б. Наиболее вероятно, что энтерококки, обладающие свойством ферментировать мальтозу, активно участвовали в ее расщеплении и за счет механизмов обратной связи ингибировали выработку соответствующего фермента эпителиальными клетками тонкой кишки (рис. 9.). Аналогичный эффект, как уже было отмечено, был получен нами и при исследовании здоровых крыс. В качестве отрицательного контроля была использована культура Е. coli Ml7, не ферментирующая мальтозу. Подобный эффект пробиотических культур ранее не был описан.

Химус Эпителий

nL 'lili

ill. ill II111 If II 111

12 пк TI T2 II Тл 12 пк TI Т2 П Тл

Н - К - группа интактных крыс ■ - Б - крысы с дисбиозом, получавшие молоко О - А - крысы с дисбиозом, получавшие молочнокислую закваску с E.fecium L5

Рис. 9. Активность мальтазы в эпителии слизистой оболочки и химуса кишечника крыс различных групп. Условные обозначения: 12 пк - двенадцатиперстная кишка, Т1 и Т2 -проксимальный и дистальный участки тощей кишки, П - подвздошная кишка, Тл - толстая кишка. *- р<0,05

2.3. Воздействие LAB на иммунную систему

На примере групп животных, получавших терапию молочнокислой закваской, содержащей генетически маркированный штамм Е. faecium L5, было исследовано влияние LAB на иммунную систему организма. К моменту окончания эксперимента (8 день исследований) содержание IgM, IgA и IgG, а также активность СЗ компонента комплемента сыворотки крови крыс с дисбиозом, получавших молочнокислую закваску с Е. faecium L5

или молоко, было практически одинаковыми. Также не было обнаружено статистически достоверных различий в содержании IgG и IgA в слизи кишечника различных групп животных. Однако в слизи толстой кишки крыс, получавших пробиотическую закваску, концентрация IgM была ниже, чем в пробах, взятых от животных, получавших молоко. При исследовании биоптатов слизистых толстой и тонкой кишки крыс не было выявлено существенных различий в экспрессии мРНК IL-ip, IL-18 и TLR2. Обращало на себя внимание то, что на 8 день эксперимента экспрессия мРНК IL-8 в биоптатах слизистой кишечника, была существенно выше у крыс контрольной группы, получавших молоко, у которых в отличие от опытной группы сохранялись клинико-лабораторные признаки дисбио-тического состояния. Возможно, обнаружение увеличения продукции хемоатрактанта IL-8, в дальнейшем могут быть рассмотрены как маркер для неблагоприятного развития дис-биотического процесса. Следует отметить, что у всех крыс, получавших закваску с энтерококками, в отличие от контрольной группы, была выявлена повышенная экспрессия mPHKIL-10.

3. Экспериментальный вагинит

Для выявления эффектов местного введения пробиотической закваски, содержащей энтерококки, создана модель экспериментального вагинита у крыс. Синхронизацию полового цикла овариоэктамированных животных достигали введением эстрадиола, вызывающего длительную фазу течки. В этот период крысы становились более чувствительными к развитию инфекции.

3.1. Воздействие различных LAB на мнкробиоту влагалища В настоящем исследовании продемонстрирована способность Е. faecium L5 ингиби-ровать рост СГВ, эшерихий и стафилококков (рис. 10) и препятствовать колонизации этими микроорганизмами урогенитального тракта крыс. Элиминация патогенных бактерий из влагалища животных происходила под воздействием молочнокислой закваски у всех крыс не позднее 4 и 5 дня наблюдений, в отличие от животных из контрольных групп, которые получали молоко.

Культура энтерококков, устойчивых к эритромицину, в первые дни введения закваски в отделяемом из влагалища крыс не обнаруживалась. Затем обсемененность слизистых энтерококками нарастала, что по времени совпадало с постепенным снижением содержания во влагалище крыс патогенных микроорганизмов и увеличением количества лактобацилл и бифидобактерий (рис. 11). Наблюдаемые эффекты можно объяснить адаптацией Е. faecium L5 к новым условиям существования. После элиминации возбудителей, чему прямо и косвенно способствовали пробиотические энтерококки, число последних увеличилось до 5,4 lg КОЕ/мл. Динамика процесса взаимодействия пробиотиков с рези-

дентными представителями микробиоты влагалища и патогенными микроорганизмами ранее не описывалась.

Дни Дм

• .Streptococcus, agalactiae 219 A.- Staphylococcus aures LB ■---- E. coli IM

Рис.10. Изменение показателей инфицированное™ патогенными бактериями влагалища крыс с экспериментальным вагинитом на фоне введения Е. faecium L5 и молока.

Дни

\-*-Е. faecium LS -Ш-Lactobacillus spp.

Рис.11. Количество Е. faecium L5 и Lactobacillus spp. в различные дни эксперимента.

3.2. Воздействие LAB на иммунную систему

Исследование иммунологических показателей крыс с экспериментальным вагинитом не выявило достоверных различий в уровне содержания иммуноглобулинов (IgM, IgA и IgG) и активности СЗ компонента комплемента сыворотки крови животных, которым per vaginum в течение 5 дней вводили молоко или молочнокислую закваску. В то же время, во влагалищной слизи крыс, получавших молочнокислую закваску с энтерококками.

были обнаружены меньшие, чем в контрольной группе, уровни содержания IgA и IgM. При исследовании биоптатов слизистой влагалища крыс не было выявлено различий в уровне экспрессии мРНК IL-ip и IL-18. Однако в опытной группе животных, получавших молочную закваску с энтерококками, при помощи ОТ-ПЦР была обнаружена более выраженная экспрессия мРНК IL-10, чем в контрольной группе.

Выявленные особенности иммуномодулирующего действия энтерококков на слизистую урогенитального тракта крыс коррелируют с результатами, полученными при внутрижелудочном введении культуры Е. faecium L5 здоровым животным и крысам с дисбиозом, вызванным приемом антибиотиков.

4. Послеродовой эндометрит у коров

Для оценки эффективности пробиотических препаратов при лечении острых послеродовых эндометритов крупного рогатого скота было организовано три группы животных, у которых наблюдались клинические признаки послеродовых урогенитапьных инфекций. Для лечения коров двух опытных групп были использованы молочнокислые закваски на основе Lactobacillus acidophilus Д № 75 и 76 или Е. faecium L3. Ежедневно на 1 или 2 дни после отела в течение 5 дней коровам внутриматочно вводили 100 мл закваски, содержащей 8,0 lg КОЕ/мл указанных LAB. Животных контрольной группы подвергали стандартному лечению: первые 3 дня внутриматочно вводили ихтиоловые палочки, затем с 5 дня до излечения антибиотики (тилозинокар или эндометромаг).

Как видно из результатов исследований, приведенных в таблице 3, использование молочнокислых заквасок оказалось более эффективным, чем стандартная терапия эндометрита ихтиолом и антибиотиками. Объяснением этому могут служить результаты бактериологических исследований проб маточного экссудата от животных, отобранных до начала их лечения. Показано, что основным этиологическим фактором развития эндометритов являлись эшерихии, стафилококки, протеи, псевдомонады, стрептококки, в отношении которых использованные культуры LAB в предыдущих сериях экспериментов проявляли выраженную антагонистическую активность. Лечение молочнокислыми заквасками, по-видимому, приводило к элиминации патогенных микроорганизмов. Доказательством этого являются результаты повторных выборочных бактериологических исследований. Так, например, после лечения в трех случаях наблюдалась элиминация эшерихий. Эффективность терапии эндометритов коров молочнокислыми заквасками, по-видимому, было связано, с подавлением патогенной и условно-патогенной микрофлоры вместе введения, а также стимуляцией регенерации эпителия слизистой оболочки матки. Нельзя исключить, что попадание в кровяное русло пробиотических лактобацилл и энтерококков через травмированную после родов поверхность слизистой оболочки матки приводило к дополни-

тельной активации иммунного ответа. Об этом свидетельствовали увеличение общего пула ^М и 12А.

Таблица 3

Результаты терапии послеродового эндометрита коров при лечении пробиотиче-скими заквасками, содержащими LAB и химиопрепаратами

Группы коров с послеродовым эндометритом Общее число животных Число выздоровевших животных Продолжительность лечения для выздоровевших животных (дни) Инволюция половых органов (дни)

L. acidophilus Д №75 и 76 10 9 5 24

Е. faecium L3 10 10 5 22

Ихтиол, тилозинокар (эндометромаг) 10 5 9 32-36

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертации проведено сравнительное исследование антимикробных свойств молочнокислых бактерий (энтерококков и лактобацилл) в системах in vitro и in vivo. Предложены новые методы определения антагонистической активности LAB к широкому спектру бактерий, грибам и ВПГ. Предложены принципиально новые модели для изучения влияния молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микрофлору. В работе прослеживаются особенности взаимодействия одних и тех же индикаторных бактерий (эшерихий, клебсиелл, протеев, стафилококков, стрептококков и энтерококков) и антагонистов (лактобацилл и энтерококков) в различных условиях. Эти условия не ограничиваются различными способами культивирования на питательных средах. Они дополняются наблюдениями за динамическими изменениями содержания этих бактерий в организме лабораторных животных (здоровых и с наличием патологии инфекционной природы). В результате работы предложена стратегия комплексного изучения биологических свойств культуры молочнокислых бактерий. Она включает в себя следующие необходимые этапы исследования LAB: 1) идентификацию (молекулярно- генетическую и на основании культурапьных и биохимических свойств); 2) определение безвредности для макроорганизма при различных способах введения; 3) исследование антимикробного спектра действия в системе in vitro и in vivo; 4) выявление особенностей воздействия на иммунитет и 5) изучение влияния на морфофункцио-нальные характеристики слизистых. Подробное исследование свойств пробиотических куль-

тур по предложенной схеме позволяет осуществлять их паспортизацию, а в дальнейшем индивидуальный подбор пробиотических препаратов с целью увеличения их эффективности при практическом использовании в медицине и ветеринарии.

Полученные результаты доказывают, что действие пробиотиков не сводится к простому заселению кишечника или урогенитального тракта, как это иногда представляется. Их влияние более сложно и многопланово. Оно включает конкуренцию с патогенной и условно-патогенной микрофлорой, стимуляцию роста резидентных представителей мик-робиоты, обеспечивающих колонизационную резистентность; взаимодействие с эпителием слизистых оболочек и мукозоассоциированной лимфоидной тканью (МАЛТ). Выявленные особенностей этих динамических процессов, зависящих от свойств отдельных культур молочнокислых бактерий или консорциумов, открывают новые перспективы для изучения свойств LAB с целью создания новых и усовершенствования уже имеющихся пробиотических пищевых продуктов и препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан алгоритм исследования свойств пробиотических культур, позволяющий подбирать штаммы молочнокислых бактерий с учетом особенностей их действия на микрофлору и макроорганизм в целях повышения эффективности их использования.

2. Сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников, позволило охарактеризовать степень их антагонистической активности в отношении широкого круга микроорганизмов.

3. Впервые выявлена противовирусная активность продуктов метаболизма лактобацилл и энтерококков в системе in vitro.

4. Доказана возможность увеличения антибактериальной активности бактериоциногенных молочнокислых бактерий при добавлении в культуральную среду специфических синтетических феромонов.

5. Впервые показано, что синтетический энтероцин В и его аналог ингибируют рост стрептококков группы В и эшерихий, а характер повреждения поверхностных структур последних позволяет предположить общий механизм действия этого бактериоцина на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

6. Установлено, что введение LAB крысам с дисбиозом кишечника способствует ускоренному восстановлению микробиоты, нормализации морфофункционапьных показателей слизистой желудочно-кишечного тракта, а также исчезновению клинических симптомов. Динамика и характер изменений указанных параметров зависит от особенностей штаммов молочнокислых бактерий.

7. Аутопробиотические энтерококки обладают выраженным лакто- и бифидогенным эффектом, однако ингибируют рост патогенных бактерий в меньшей степени, чем пробиоти-ческие лактобациллы и энтерококки.

8. Доказана способность молочнокислых бактерий, вводимых интравагинально при экспериментальном вагините у крыс, вызывать быструю элиминацию патогенных бактерий (эшерихий, стафилококков, стрептококков группы В) и предотвращать развитие местной воспалительной реакции.

9. Впервые показано, что внутриматочное введение коровам LAB эффективно устраняет симптомы послеродового эндометрита, вызывает элиминацию патогенных микроорганизмов и стимулирует системный иммунный ответ (выработку Ig M и IgA, увеличивает лизо-цимную активность сыворотки крови).

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи:

1. Ермоленко Е.И. Антимикробная терапия урогенитальных инфекций, вызванных ассоциацией условно-патогенных бактерий // Сб. «Проблемы оптимизации образа жизни и здоровья», СПб, Изд-во СПб ГМУ, 1995,- С. 62-63.

2. Ермоленко Е.И. Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная характеристика антагонистической активности лактобацилл// Журн. микробиол., 2004,- №5,-С. 94-98.

3. Ермоленко Е.И., Ждан-Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и

Lactobacillus plantarum in vitro// Проблемы медицинской микологии, 2004, том 6,- №2.-С. 49-54.

4. Ермоленко Е.И., Воейкова A.B., Протасов В.А., Левченко С.К.. Суворов А.Н.,Рукавишникова С.А. Влияние лактобактерий на рост Mycoplasma hominis in vitro// В Сб. «Современные направления в диагностике, лечении и профилактике заболеваний», СПб, 2004,- С. 337-341.

5. Воейкова A.B., ЕрмоленкоЕ.И., Протасов В.А., Левченко С.К., Суворов А.Н., Влияние лактобактерий на рост Mycoplasma hominis в системе in vitro// TERRA MEDICA nova.-2004.-№3(5).-С. 1-5.

6. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Гончаров С.Б., Кузьмин В.А., Суворов А.Н. Изучение антимикробного действия пробиотических энтерококков in vivoll Российский ветеринарный журнал (мелкие домашние и дикие животные), 2006.- №3.- С. 15-18.

7. Колоджиева В.В., Яфаев Р.Х., Ермоленко Е.И., Суворов А.Н. Энтерококковые инфекции урогенитапьного тракта в условиях стационара и поликлиники//Амбулаторная хирургия, 2006. - №3(23).- С. 34-38.

8. Ермоленко Д.К., Ермоленко Е.И., Исаков В.А. Применение пребиотика при антибио-тикотерапии больных с урогенитальным хламидиозом// Лечащий врач, 2006. - №9.-С. 86-87.

9. Ермоленко Е.И, Черныш А.Ю., Марцинковская И.В., Суворов А.Н., Тотолян A.A. Влияние пробиотических энтерококков на рост Streptococcus agalactiae // Журн. микробиол., 2007,- №5. - С.73-77.

10. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Кузьмин В.А. Пробиотические препараты для лечения послеродовых эндометритов крупного рогатого скота// Ветеринарная практика, 2007,- №2,- С. 56-59.

11. Ермоленко Е.И., Рыбальченко О.В. Антимикробное действие лактобацилл// Медицина XXI век. 2007- № 5 (6). - С. 41-48.

12. Yermolenko E., Suvorov A., Chernysh A., Aleshina G., Cvetkova E., Martsinkovskaya I., Totolyan A. Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci // Streptococci - New Insight into an Old Enemy. May 2006. - P. 363-366.

13. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Берлов M.H., Тотолян A.A., Суворов А.Н. Антагонистическая активность энтерококков в отношении Streptococcus pyogenesII Вестник Санкт-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина. 2008. - Вып. 1,- С. 18-25.

14. Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И., Грабовская К.Б., Климович Б.В., Суворов А.Н., Бондаренко В.М. Генетическая идентификация как метод для определения патогенных и симбионтных штаммов энтерококков// Журн. микробиол. 2008.-№ 5.- С.83-87.

15. Ермоленко Д.К, Ермоленко Е.И., Исаков В.А. Лактулозосодержащие пребиотики как средство профилактики дисбиоза кишечника при длительной антибиотикотерапии // Вестн.С.-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина 2008. - Вып. 4,- С. 109-118.

16. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Вершинин А.Е., Ермоленко Е.И., Колоджиева В.В., Грабовская К.Б., Климович Б.В. Различия по набору генов патогенности производственных и выделенных от больных штаммов энтерококков//Научно-практический журнал БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2008,- №4 (32).- С. 3-6.

17. Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08 штамм Lactobacillus fermentum Z, содержащий в геноме гены, обеспечивающие выделение лактоцина F.

18. Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Суворова М.А., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками // Вестн.С.-Петерб. ун-та. Cep.l 1, Медицина. 2009. - Вып. 1,- С.157-167.

19. Ермоленко Е.И., Фураева В.А., Ермоленко К.Д., Исаков В.А.Угнетение репродукции вирусов простого герпеса пробиотическими бактериями в системе in vitro// Вопросы вирусологии, 2009,- № 6,- С. 34-39.

20. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы. Обзор литера-туры//Вестн.С.-Петерб. ун-та. Сер. И, Медицина. 2009. - Вып. 3,- С. 184-201.

21. Симаненков В.И., Донец В.Н., Суворов А.Н., Ермоленко Е.И., Сундукова З.Р. Опыт экспериментального и доклинического изучения аутопробиотиков// Материалы Всероссийской конференции гастроэнтерологов юго-западного региона, 2009, Ростов - на - Дону, .25-27 апреля.- С. 83-87.

22. Бельтюков П.П., Абдурасулова И.Н., Тарасовой Е.А., Суворов А.Н., Захарова Е.Т., Соколов A.B., Карпенко М.Н., Ермоленко Е.И. Исследование влияния пробиотических эшерихий и энтерококков на иммунную систему здоровых крыс//Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова, 2009, Вып. 16,- № 2,- С. 54-58.

23. Ермоленко Е.И., Фураева В.А., Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Суворов. А.Н. Противо-герпетическая активность пробиотиков // Росс. журн. кож. и вен. бол. Прил.: Герпес., 2009. - №2. - С. 20-24.

Главы в книгах:

1. Ермоленко Е.И. Гефен Г.Е., Дмитриева E.H., Баранникова Т.А., Чуева М.Н. Некоторые особенности микробиоценоза влагалища у практически здоровых женщин в кн. «Клеточные сообщества»,- СПб, Изд-во СПбГМУ, 1998,- С.130-148.

2. Ермоленко Е.И. Модели для изучения антимикробной активности пробиотиков// Глава в монографии «Модели для изучения антимикробной активности пробиотиков» в книге «Дисбиоз кишечника» под ред. Ткаченко Е.И., Суворова А.Н. - СПб, Изд-во «Спец-Лит», 2007.-С. 144-148.

3. Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Ермоленко Е.И. Герпесвирусные и папилломавирусные инфекция Глава в книге «Инфекции передаваемые половым путем» под редакцией

Аковбяна В.А., Прохоренкова В.И., Е.В. Соколовского, Изд-во Медия Сфера, Москва, 2007.- С. 448-514.

Методические рекомендации:

1. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Кузьмин В.А., Ещенко И.Д. Применениепро-биотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой // Методические рекомендации.- Утверждены методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины», протокол №2 от 5 марта 2007, СПб, Изд-во СПбГАВМ, 2007. - С. 10.

2. Исаков В.А., Ермоленко Е.И., Ермоленко Д.К., Гончаров С.Б., Марцинковская И.В., Семенов А.Е. Герпесвирусные инфекции. Диагностика и лечение.- Сакнкт-Петербург-Великий Новгород, 2007,- 75 с.

3. Исаков В.А., Давидюк Д.С., Аспель Ю.В., Богданова Е.Ф. Ермоленко Е.И. Использование пробиотика лактофлор в клинической практике// Рекомендации для врачей.-Санкт-Петербург,- 2007,- 32 с.

Подписано в печать 23.10.2009г. Формат 60x84/16 П.л. 2.5 Уч.-изд.л. 2,5. Тир.100 экз. Отпечатано в типографии ООО «Турусел» 191186, Санкт-Петербург, ул. Миллионная д.1. Тел. 571-5474 Зак. № 13142 от 23.10.2009г.

íl - 45? §

2009257504

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Ермоленко, Елена Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о пробиотических лактобациллах и энтерококках

1.2. Антимикробное действие LAB 26 1.2.1 .Факторы неспецифического антимикробного действия LAB

1.2.2. Бактериоцины и бактериоциноподобные вещества LAB

1.2.3. Механизмы опосредованного действия LAB

1.2.3.1. Блокирование адгезии патогенных микроорганизмов и способность LAB к агрегации

1.2.3.2. Конкуренция за метаболиты

1.3. Иммуномодулирующее действие LAB

1.3.1. Влияние LAB на врожденный иммунитет

1.3.2. Влияние LAB на приобретенный иммунитет

1.3.3. Иммунологическая толерантность организма к собственным LAB

1.3.4. Индивидуальные особенности действия LAB на иммунную систему.

1.3.5. Влияние структурных компонентов и метаболитов LAB

1.3.6. Иммуномодулирующее действие LAB при профилактике и лечении воспалительных заболеваний у людей

1.4. Влияние LAB на морфофункциональные характеристики организма

1.4.1. Метаболический вклад LAB в поддержание гомеостаза

1.4.1.1. Эффекты, выявленные при профилактике и лечении заболеваний у людей

1.4.1.2. Эффекты, выявленные на экспериментальных моделях в системе in vivo 67 1.4.1.3 .Исследование биохимической активности LAB в системе in vitro

1.4.2. Действие LAB на моторику, проницаемость и регенераторные процессы в слизистой желудочно-кишечного тракта

1.5. Методы исследования действия LAB

1.5.1. Методы исследования свойств молочнокислых бактерий в системе in vitro

1.5.2. Методы исследования LAB в системе in vivo

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту"

Еще в начале XX века российский ученый И.И. Мечников впервые начал активно пропагандировать использование молочнокислых бактерий (lactic acid bacteria, LAB) в лечебно-профилактических целях. Он создал предпосылки для формирования нового научного направления, включающего изучение межмикробного антагонизма и оценку влияния LAB на организм хозяина, сформулировал основные постулаты для зарождающейся в наши дни научной дисциплины «пробиотической микробиологии» [Бондаренко В.М. и Королюк A.M., 2007; Нынь И.В., Королюк A.M., 2008]. Несмотря на длительное и достаточно успешное использование пробиотических пищевых продуктов и препаратов, их активное, но часто бесконтрольное применение в последние десятилетия привело к возникновению ряда серьезных проблем. Среди них можно указать: низкую эффективность действия некоторых препаратов, угнетение собственной микрофлоры хозяина, развитие инфекционной патологии при введении пробиотиков ослабленным больным [Lebenthal Е. and Lebenthal Y., 2003; Land M.II. et al., 2005]. Становится очевидным, что для увеличения эффективности лечебно-профилактического использования и предотвращения развития побочных эффектов LAB должны вводиться с учетом индивидуальных характеристик пациента и по назначению врача. Именно поэтому в настоящий момент как никогда остро встал вопрос о необходимости серьезных комплексных научных исследований особенностей действия молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микробиоту.

К числу LAB относят бактерии родов Lactobacillus и Enterococcus [Axelsson L., 2004; Salminen S. et al., 2004], явившихся предметом настоящего исследования. Они представляют особый научный и практический интерес, так как входят в состав нормальной микробиоты человека и животных [Петровская В.Г. и Марко О.П., 1976; Tannock G.V., 1997], широко распространены во внешней среде, являются составной частью многих пробиотических препаратов и продуктов. Известно, что энтерококки и лактобациллы могут оказывать разностороннее влияние на биохимические, физиологические, нейрогуморальные и иммунные процессы в организмах человека и животных [Шендеров Б.А., 2005; Goldin B.R. and Gorbach S.L., 1984; Maldonado G. et al., 2007; Preter V. et al., 2007]. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кислот, холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [Gibson G.R. et al., 1995; Доронин А.Ф., Шендеров Б.А., 2002]. Некоторые штаммы энтерококков и лактобацилл способны продуцировать в окружающую среду такие продукты, как перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции, конкурировать с патогенными микроорганизмами за сайты прикрепления к эпителиальным клеткам и пищевые субстраты [Reid G., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Основным требованием, предъявляемым к пробиотическим штаммам LAB, является наличие выраженной антимикробной активности [Reid G., 2008]. Это позволяет использовать пробиотики для усиления или коррекции эффектов антибиотиков, а в ряде случаев - как их альтернативу. На основании большого числа клинических наблюдений можно полагать, что пробиотики практически незаменимы при терапии дисбиотических состояний, болезни Крона, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Ткаченко Е.И. и Успенский Ю.П., 2006]. Кроме того, LAB активно используются при терапии сахарного диабета, аллергических заболеваний [Prescott S. and Bjórkstén В., 2009], ишемической болезни сердца, коррекции нарушений липидного и минерального обменов [Гриневич В.Б. и др., 2004]. Наряду с пероральным введением молочнокислых бактерий целесообразно их местное использование при вагинитах, тонзиллитах и стохматитах [Reíd G. et al., 2004; Elmer G.W., 2001; Maldonado G. et al., 2007].

Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении LAB, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, какое действие они оказывают на ткани, состояние отдельных систем и макроорганизм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных. Возможность соматической патологии пациента и особенности собственной микрофлоры хозяина делают необходимым индивидуальный подбор пробиотиков. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий и их паспортизацию. В связи с этим разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур, а также изучение особенностей-их действия в системах in vitro и in vivo, являются актуальной проблемой современной микробиологии.

Целью настоящей работы является изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии максимально эффективного использования пробиотических штаммов LAB дшь профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных стрептококками и другими патогенными микроорганизмами.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать комплекс методических подходов для исследования влияния LAB на пато генные микроорганизмы, нормальную микрофлору и макроорганизм.

2. Провести сравнительное исследование антагонистической активности культур LAB в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, грибов родов Candida и Ciyptococcus, а также вирусов простого герпеса.

6. Исследовать в модельных условиях воздействие штаммов LAB и аутопробиотических энтерококков на клинические симптомы, метаболические процессы, иммунитет и микробиоту кишечника лабораторных животных при дисбиозе, вызванном приемом антибиотиков, а также при терапии урогенитальных инфекций.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Предложен комплекс методов (микробиологических. биохимических, генетических, иммунологических, гистологических, электронно-микроскопических) для разностороннего изучения воздействия LAB на макроорганизм и заселяющую его микрофлору.

Проведено сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников. Благодаря введению нового количественного показателя удалось охарактеризовать степень антагонистической активности различных штаммов энтерококков и лактобацилл в отношении широкого круга индикаторных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных бактерий,- микоплазм, а также грибов рода Candida и Cryptococcus). Впервые выявлена способность метаболитов лактобацилл и энтерококков угнетать рост микоплазм и репродукцию вирусов простого герпеса в системе in vitro.

Впервые исследована степень влияния пробиотических штаммов, в частности молочнокислых бактерий, на метаболические процессы, происходящие в разных отделах желудочно-кишечного тракта.

Впервые на биологической модели доказана эффективность использования индигенных (аутопробиотических) энтерококков для коррекции дисбиозов у животных.

Выявлены штаммовые особенности действия метаболитов энтерококков и лактобацилл на морфологию S. pyogenes.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Прикладными аспектами исследования являются разработанные на основе экспериментальных данных: 1) метод двухслойного агара с количественной и качественной оценкой антимикробной активности молочнокислых бактерий in vitro-, 2) комплексный подход в исследования прямого и опосредованного антимикробного действия in vivo, с учетом влияния LAB на патогенные микроорганизмы, микробиоту хозяина, метаболизм и иммунную систему макроорганизма.

В ходе сравнительного исследования клинических изолятов из урогенитального тракта выбран и идентифицирован новый штамм LAB, L. fermentum Z, предложенный для использования в составе пробиотических препаратов или пищевых продуктов [Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08]. Его отличительной особенностью является избирательное действие в отношении патогенных микроорганизмов, отсутствие влияния на другие LAB, в частности Е. faeciam L3. При исследовании антимикробного эффекта эти молочнокислые бактерии выступают как синергисты и могут быть рассмотрены в качестве компонентов нового симбиотического препарата.

Исследование влияния аутопробиотических энтерококков на организм животных при дисбиозе кишечника может рассматриваться как предварительный экспериментальный этап перед комплексным исследованием перспектив применения в медицине компонентов собственной микрофлоры.

Результаты исследований могут быть использованы при клиническом назначении пробиотиков с целью лечения и профилактики заболеваний инфекционной природы. Применение пробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, изложено в методических рекомендациях, утвержденных методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины».

Модифицированный метод двухслойного агара применяется в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМП, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И. Мечникова для изучения микробного антагонизма, на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Предложенные модели экспериментальных дисбиозов и вагинитов позволяют изучать особенности действия штаммов пробиотиков на макроорганизм и его микрофлору на фоне развития указанных патологических процессов.

3. Созданию симбиотических и комбинированных микробных препаратов должны предшествовать эксперименты, направленные на выявление степени антагонистической активности компонентов консорциумов по отношению друг к другу и к патогенным микроорганизмам при совместном и раздельном культивировании.

4. Новый подход в оценке степени влияния пробиотических бактерий на метаболические процессы в разных отделах желудочно-кишечного тракта расширяет существующие научные представления о роли микробиоты в процессе пищеварения.

5. Модифицированный нами метод двухслойного агара позволяет проводить количественную оценку антагонистической активности LAB к широкому спектру микроорганизмов и выявлять возможные морфофункциональные изменения индикаторных культур.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ермоленко, Елена Игоревна

ВЫВОДЫ

4. Доказана возможность увеличения антибактериальной активиости бактериоциногенных молочнокислых' бактерий при добавлении в культуральную среду специфических синтетических феромонов.

5. Впервые показано, что синтетический энтероцин В и его аналог ингибируют рост стрептококков группы В и эшерихии, а характер повреждения поверхностных структур последних позволяет предположить общий механизм действия этого бактериоцина на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

6. Установлено, что введение LAB крысам с дисбиозом кишечника способствует ускоренному восстановлению микробиоты, нормализации морфофункциональных показателей слизистой желудочно-кишечного тракта, а также исчезновению клинических симптомов. Динамика и характер изменений указанных параметров зависит от особенностей штаммов молочнокислых бактерий.

7. Аутопробиотические энтерококки обладают выраженным лакто- и бифидогенным эффектом, однако ингибируют рост патогенных бактерий в меньшей степени, чем пробиотические лактобациллы и энтерококки.

9. Впервые показано, что внутриматочное введение коровам LAB эффективно устраняет симптомы послеродового эндометрита, вызывает элиминацию патогенных микроорганизмов и стимулирует системный иммунный ответ (выработку Ig М и IgA, увеличивает лизоцимную активность сыворотки крови).

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность академику А.А.Тотоляну и профессору А.Н. Суворову за помощь в организации исследовательского процесса и приобретении необходимого оборудования, а также за ценные замечания при обсуждении результатов диссертационной работы.

Выражаю благодарность всем коллегам отдела молекулярной микробиологии НИИ СЗО РАМН за доброжелательное отношение и создание в коллективе творческой атмосферы.

Благодарю всех, кто непосредственно помогал мне выполнить эту работу: к.б.н. С.Х. Ждан-Пушкину, д.б.н., профессора О.В. Рыбальченко (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА), д.б.н., профессора В.Н. Кокрякова (ПИИ ЭМ СЗО РАМН), д.б.н. A.A. Колобова (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА), д.б.н., П.В. Пигаревского (НИИ ЭМ СЗО РАМН), д.б.н. Л.В. Громову (НИИ Физиологии им. И.П. Павлова), к.б.н. В.А. Фураеву (НИИ гриппа Северо-Западного отделения РАМН), к.в.н. И.В. Марцинковскую (Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины), A.B. Воейкову (клиническая лаборатория больницы №2 Санкт-Петербрга), Г.Е. Гефена и Г.А. Зарх (межрайонная лабоартория №2 Санкт-Петербурга).

Настоящее исследование поддержано грантами 02-04-06927 и 03-04-49760 Российского Фонда Фундаментальных исследований и грантом Президента Российской Федерации НШ-2206.2003.4

ГЛАВА 5. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы в мире существенно возросло потребление пробиотических пищевых продуктов на основе LAB. Вместе с тем расширились и показания для использования пробиотических препаратов. В современной научной литературе описаны различные эффекты, оказываемые LAB: антимикробное и иммуномодулирующее действия, участие в процессах пищеварения, синтезе витаминов, стимуляции регенерации тканей и другие. Достигнуты большие лечебные успехи в применении молочнокислых бактерий при дисбиозах различной этиологии, кишечных и урогенитальных инфекциях, инфекционной патологии верхних дыхательных путей, метаболических нарушениях, а также при аллергических реакциях. К сожалению, активное использование LAB в практике происходило, как правило, на эмпирической основе, до накопления достаточного объема научных знаний, касающихся механизмов действия пробиотиков. Непонимание гаммы существующих рисков на введение хмолочнокислых бактерий пациентам с ослабленным иммунитетом приводило в ряде случаев к развитию инфекционной патологии [Белобородава Н.В., 2002; Apostolou et al., 2001; Lebenthal E. and Lebenthal Y., 2003; Salminen S. et al., 2004; Reid G., 2008]. Дополнительными сложностями, выявленными на фоне введения некоторых штаммов LAB, являются низкая их выживаемость в макроорганизме [Корниенко Е.А., 2007; Глушанова H.A. и Шендеров Б.А., 2005] и возможность формирования устойчивости патогенных микроорганизмов к действию пробиотиков [Rasch M. and Knöchel S. 1998; Gravesen A. et al., 2002]. Все эти проблемы связаны с использованием пробиотиков без учета их индивидуальных свойств, особенностей состояния макроорганизма, а главное, из-за недостаточного понимания механизмов действия молочнокислых бактерий. В настоящее время формируются противопоказания, требования, предъявляемые к пробиотическим пищевым продуктам и препаратам, в состав которых входят LAB. Инструкции к пробиотическим средствам постоянно пополняются новыми рекомендациями, основанными на результатах выявления новых эффектов, оказываемых этими бактериями.

В большей степени изучена антагонистическая активность молочнокислых бактерий в отношении различных микроорганизмов. Достаточно хорошо исследованы отдельные антимикробные факторы молочнокислых бактерий. Показано, что некоторые из них (перекись водорода, органические кислоты, лизоцим) не обладают специфичностью, другие, такие как бактериоцины, характеризуются избирательным антибактериальным действием.

В обзоре литературы настоящей диссертации представлен большой перечень микроорганизмов, рост которых в системе in vitro способны ингибировать молочнокислые бактерии. Спектр этих микроорганизмов велик. Он включает: 1) грамотрицательные бактерии (энтеробактерии, псевдомонады, спириллы, вибрионы); 2) грамположительные бактерии (стафилококки, стрептококки, клостридии, LAB); 3) грибы и простейшие.

Следует отметить, что представленный в обзоре анализ спектра антимикробной активности LAB основывался на результатах исследований, проводимых в различных лабораториях. В каждой из них, как правило, для выявления антагонизма молочнокислых бактерий использовали нестандартные методы и произвольно выбранные индикаторные штаммы. Эти обстоятельства существенно затрудняли сравнительный анализ полученных данных и позволяли в большинстве случаев оценивать антимикробную активность молочнокислых бактерий только качественно, без количественных характеристик. Тем не менее, не вызывает сомнений факт существования индивидуальной чувствительности бактерий и грибов к различным штаммам LAB. Очевидно, что она связана со скоростью роста и особенностями строения поверхностных структур индикаторных микроорганизмов. Нельзя исключить и существование отдельных механизмов формирования устойчивости к метаболитам LAB. По-видимому, в некоторых случаях они могут быть сходны с теми механизмами, что выявлены при исследовании бактерий, резистентных к антибиотикам [Навашин С.М. и Фомина И.П., 1982] и дефенсинам [Kraus D. and Peschel А., 2006].

Отсутствие стандартизации в исследованиях, количественной оценки степени антимикробной активности, использование сравнительно небольшого числа индикаторных микроорганизмов привело к тому, что до настоящего времени не удавалось выявить каких-либо строгих закономерностей в спектре антагонистической активности культур LAB в системе in vitro. В литературе имеются противоречивые данные о выраженности антагонистической активности по отношению к различным родам грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов. Также слабо изучены особенности влияния молочнокислых бактерий на характер роста индикаторных культур и экспрессию генов, обеспечивающих проявление патогенных свойств. В научной литературе существуют лишь единичные публикации на эту тему. Например, отмечено снижение токсигенности стафилококков при их культивировании в присутствии лактобацилл на плотной питательной среде [Salminen S. et al., 2004].

Эксперименты, выполненные в последние десять лет на биологических моделях, а также наблюдения, накопившиеся в результате использования пробиотических LAB в медицине и ветеринарии, позволили выявить различия в характере влияния отдельных штаммов молочнокислых бактерий на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме. Однако результаты этих исследований носят фрагментарный и малоубедительный характер. На возможности сравнительного анализа полученных данных также отрицательно сказывается отсутствие единых подходов и стандартных методов для изучения влияния LAB на макроорганизм.

Таким образом, разработка методологии сравнительного исследования антимикробной активности молочнокислых бактерий в системах in vitro и in vivo составляют актуальную проблему современной микробиологии, медицины и ветеринарии.

Целью настоящей работы являлось изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии, позволяющей по возможности максимально эффективно применять пробиотические штаммы LAB для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных рядом патогенных микроорганизмов. Изучение особенностей действия LAB проводилось на примере двух наиболее типичных представителей пробиотических бактерий: Enterococcus spp. и Lactobacillus spp. Выбор был продиктован широкой распространенностью энтерококков и лактобацилл в окружающей среде, а главное, тем, что они являются представителями резидентной микрофлоры и часто используются при создании пробиотических средств.

Именно поэтому в качестве антагонистов в работе были использованы штаммы энтерококков и лактобацилл, выделенные как из пробиотических препаратов, так и из полостей организма (урогенитального тракта и кишечника здоровых людей и животных). Изучение антимикробного действия живых молочнокислых бактерий, проводили двумя методами: рекомендованным ГОСТом методом штриховых посевов и предложенным нами вариантом метода двухслойного агара. Несмотря на удобство применения и простоту, метод штриховых посевов обладает существенными недостатками, так как позволяет изучать антимикробную активность LAB только в отношении ограниченного числа индикаторных культур и является полуколичественным. Поэтому данный метод можно рекомендовать лишь для начальных ориентировочных исследований. Преимущество предложенного нами варианта метода двухслойного агара состоит в возможности существенного расширения спектра индикаторных.культур. Так, впервые в качестве индикаторной культуры были использованы криптококки, микоплазмы, стрептококки групп С и G. Для сравнительного исследования антимикробной активности был предложен количественный показатель МИКА (минимальное ингибирующее количество антагониста), что позволило сопоставлять антагонистическую активность молочнокислых бактерий по выраженности этого эффекта («силе»).

Во всех вариантах постановки экспериментов in vitro влияние культур LAB на рост индикаторных микроорганизмов зависело от их количества, поскольку только при достижении определенных пороговых концентраций молочнокислых бактерий проявлялась их антимикробная активность. Объяснение этому явлению логично дать с позиций теории межклеточной сигнальной системы - «quorum sensing» [Risoen P.A. et al., 20004; Бондаренко B.M. и др., 2006]. В результате комплексного исследования антимикробной активности молочнокислых бактерий были выявлены общие закономерности в чувствительности различных групп индикаторных микроорганизмов. Примерами могут служить большая чувствительность стрептококков, особенно группы А, к действию LAB и выраженная устойчивость энтерококков и грибов к действию метаболитов молочнокислых бактерий.

Кроме того, в данной работе был проведен сравнительный анализ антимикробной активности моно- и смешанных культур молочнокислых бактерий. Показано, что при совместном культивировании энтерококков и лактобацилл, в зависимости от использованных комбинаций штаммов, суммарная антагонистическая активность может снижаться, оставаться неизменной либо увеличиваться по спектру и силе. Это указывает на важную роль взаимодействия антагонистов в условиях биоценоза и доказывает необходимость подбора бактериальных культур в интересах создания симбиотических пробиотических продуктов и препаратов. В качестве примера симбиотического консорциума с высокой антимикробной активностью предложена комбинация штаммов Е. faecium L3 и L. fermentum Z. Литературные данные, касающиеся суммарного антимикробного эффекта консорциумов в системе in vitro, немногочисленны.

Используя предложенные нами методы, оказалось возможным выявить штаммы LAB, обладающие выраженным изоантагонизмом и проявляющие способность ингибировать рост большинства исследованных культур, в том числе даже молочнокислые бактерии. Штаммы, проявляющие слабую активность в отношении LAB и выраженный антагонизм в отношении патогенных бактерий и грибов, представляли максимальный практический интерес и были отобраны для дальнейших исследований.

Характер активности LAB оценивали, исследуя их действие на культуральные и морфологические свойства индикаторных бактерий и грибов. Используя метод реплик, удалось показать, что при дозе антагониста в 10-100 и более раз, чем МИКА, действие антагониста приводит к гибели индикаторной культуры. Одновременно, были выявлены особенности роста и морфологии клеток исследуемых штаммов патогенных индикаторных микроорганизмов.' Изменения подобного рода были выявлены у стафилококков, протея и грибов рода Candida. Под влиянием молочнокислых бактерий утрачивалась подвижность протея, а также способность грибов рода Candida образовывать ростовые трубки и формировать псевдомицелий. Очевидно, что подобные изменения могут служить показателями снижения патогенных свойств рассматриваемых индикаторных бактерий и грибов. Эти факты должны привлечь внимание специалистов, изучающих экспрессию патогенных свойств микроорганизмов.

Большое внимание в данной работе было уделено действию LAB на бактерии родов Streptococcus и Enter ococcus. Выявлены штаммовые особенности в чувствительности энтерококков, стрептококков групп А, В, С и G к действию метаболитов молочнокислых бактерий. С медицинской точки зрения интерес представляет высокая восприимчивость к действию лактобацилл и энтерококков стрептококков группы А и несколько в меньшей степени - стрептококков других серогрупп. Полученные результаты предполагают возможность использования пробиотических молочнокислых бактерий для профилактики и лечения инфекций верхних дыхательных путей и урогенитального тракта, вызываемых стрептококками разных групп.

Фундаментальное значение имели эксперименты, в ходе которых впервые выявлены особенности влияния двух культур LAB на морфологию стрептококков группы А. Пробиотический штамм Е. faecium L3 вызывал нарушение морфогенеза фимбриеподобных структур на поверхности S. pyogenes, существенных для проявления патогенности, и способствовал образованию удлиненных клеток. Штамм L. fermentum Z также нарушал характер деления клеток данного микроба. Эти сведения, дополняют представления о многообразии механизмов действия LAB, доказывают высокую информативность электронно-микроскопического исследования для изучения механизмов их действия.

В данной работе исследования антимикробного эффекта LAB проводились с использованием ряда дополнительных методов: турбодиметрии, метода радиальной диффузии, совместного культивирования грибов и антагонистов в жидких и плотных питательных средах, а также культивирования вирусов в культуре перевиваемых клеток. Это расширило возможности для исследования влияния отдельных антимикробных факторов, позволило впервые выявить способность метаболитов и живых молочнокислых бактерий ингибировать репродукцию вируса простого герпеса и изучить особенности взаимодействия грибов с молочнокислыми бактериями в различных условиях культивирования.

Исследование отдельных антимикробных факторов, которые для удобства-анализа были разделены на факторы прямого и опосредованного действия, а также специфические и неспецифические, способствует выявлению наиболее важных из них в проявлении микробного антагонизма. Максимальное значение, как показано при рассмотрении данных литературы, в проявлении специфического действия LAB имеют бактериоцины. Эти преимущественно низкомолекулярные соединения пептидной природы, сравнительно хорошо изученные, охарактеризованные по химическому составу, молекулярной массе, генетическому детерминированию, спектру и механизмам действия.

Дальнейшие исследования антагонистически активных штаммов молочнокислых бактерий позволили нам выявить в их геноме гены, обеспечивающие продукцию ранее описанных другими авторами энтероцинов А и В i?, faecium L3 и лактоцина F у L. fermentum Z. В супернатантах культуры энтерококков обнаружены пептиды, по массе соответствующие энтероцинам А и В, ранее выделенным в других штаммах энтерококков [Moreno G. et al., 2003; deVuist L. and Leroy F., 2007]. В качестве доказательства продукции энтероцинов А и В культурой Е. faecium L3 следовало признать обнаружение экспрессии генов при помощи ОТ-ПЦР, обеспечивающих продукцию указанных энтероцинов, а также ее усиление в случае добавления специфических феромонов. Эти исследования имеют большое значение, так как позволили выявить еще один непатогенный штамм Е. faecium, способный продуцировать энтероцины А и В или оба энтероцина одномоментно. Высокая частота выделения из молочнокислых и других пищевых продуктов рассматриваемых бактериоциногенных энтерококков свидетельствует в пользу биологической целесообразности их присутствия в материале в качестве транзиторного или резидентного компонента микробиоты человека.

Дополнительные перспективы раскрываются и при использовании синтетических феромонов. Как показано в данной работе, добавление специфического пептида-индуктора и его более коротких аналогов в низких концентрациях в культуральную среду позволяет существенно увеличить антимикробные свойства энтерококков. Впервые показано, что синтетические аналоги феромона с более короткой аминокислотной последовательностью также могут эффективно индуцировать продукцию бактериоцинов. Описанный феномен весьма важен не только для изучения механизмов регуляции продукции антимикробных факторов, но и для разработки современных комплексных пробиотических биопрепаратов.

Помимо описанных энтероцинов А и В (с молекулярными массами 4,8 и 5,5кДа, соответственно), из супернатанта культуры энтерококка L3 были выделены дополнительные пептидные фракции с меньшими молекулярными массами (1,9-2,2 кДа), также обладающие антимикробной активностью. С большой вероятностью можно утверждать, что в данных фракциях пептидного экстракта присутствуют фрагменты энтероцинов А и В и/или ранее неидентифицированные бактериоцины с меньшей молекулярной массой.

Особенно большое значение приобрело изучение антибактериального действия синтетического энтероцина В и его аналога с измененной молекулярной структурой.

Выявлены способность этих пептидов, ингибировать рост L. monocythogenes и S. pyogenes, а также особенности их воздействия на Е. coli. Установлена способность этого энтероцина и его аналога вызывать образование зоны задержки роста эшерихий, засеянных газоном на плотную питательную среду. Методом электронной микроскопии показано, что данный бактериоцин повреждает цитоплазматическую мембрану эшерихий.

Существенной частью проведенного исследования явилась оценка антимикробного действия LAB в системе in vivo. Как правило, опосредованные антимикробные эффекты оказывают молочнокислые бактерии, конкурируя с другими микроорганизмами за сайты прикрепления к клеткам млекопшающих и питательные субстраты, а также оказывая влияния на иммунитет и метаболизм макроорганизма. Именно эти моменты позволяют предотвратить адгезию патогенных микробов на клетках слизистых оболочек, дальнейшее развитие процессов пенетрации и инвазии, а также ускоряют компенсаторные реакции организма в ответ на внешние воздействия.

В данной работе эксперименты были проведены на здоровых мышах и крысах, а также на моделях кишечного дисбиоза и урогенитальных инфекций. Исследования на здоровых животных были важны для выяснения механизмов действия LAB при их использовании в профилактических целях, а также для рассмотрения возможности длительного приема пробиотиков. Показано, что ежедневное введение молочнокислых бактерий в течение 14 и даже 42 дней не вызывало существенных изменений в биохимических показателях сыворотки крови животных, а также уровня иммуноглобулинов в слизи желудочно-кишечного тракта и сыворотке крови. Однако по мере введения пробиотических микроорганизмов (к 14 дню наблюдения) их количество в организме экспериментальных животных (здоровые крысы) постепенно возрастало, а уровень СЗ фракции комплемента в сыворотке крови увеличивался. При введении пробиотической закваски с энтерококками, в отличие от молочного продукта, содержащего эшерихии, дополнительно увеличивалась секреция IL-10, блокирующего развитие иммунных реакций по Th-1 пути. Эти проявления можно отнести к штаммовым особенностям Е. faecium L3, так как во всех случаях его введения животным отмечалось увеличение синтеза данного цитокина. Индивидуальные особенности штаммов энтерококков и лактобацилл, проявляющиеся в увеличении или уменьшении экспрессии IL-8, IL-6, IL-12 и IL-18, блокировании экспрессии TLR2, как уже было отмечено в обзоре, ранее выявляли и другие исследователи , и в этой части наши данные подтвердили ранее полученные результаты.

Значимым, на наш взгляд, является обнаружение мРНК хемоаттрактанта IL-8, привлекающего фагоциты и другие ИПК в зону воспаления. Повышенная экпрессия данного цитокина, имело место только в случае развития у крыс дисбиотических состояний без дальнейшего введения молочнокислых заквасок. Возможно, обнаружение подобных признаков воспаления может рассматриваться в качестве маркера неблагоприятного развития дисбиотического процесса.

Благодаря проведенному комплексному исследованию животных и использованию маркированного штамма энтерококков мы смогли проследить особенности обсеменения этой культурой разных отделов кишечника и влагалища на разных сроках эксперимента, а после вскрытия животных и бактериологического исследования их крови и внутренних органов - удостовериться в отсутствии транслокации этих бактерий. Исследуя активность метаболических процессов, происходивших в слизи, химусе, эпителии разных участков тонкой и толстой кишки здоровых крыс и крыс с дисбиозом, вызванном введением антибиотиков, нам удалось доказать участие энтерококков в метаболических процессах. Также доказано ингибирование выработки ферментов (мальтазы) эпителиоцитами в участках максимального скопления энтерококков. Наиболее вероятно, что культура Е. faecium L3, ферментирующая мальтозу, активно участвовала в расщеплении данного дисахарида и за счет механизмов обратной связи ингибировала выработку мальтазы эпительными клетками тонкой кишки.

Подобный эффект пробиотических культур ранее не был описан. Бактериологические исследования фекалий животных, участков тонкой и толстой кишки до и после воздействия пробиотическими заквасками свидетельствовали о быстрой колонизации кишечника крыс генетически маркированными энтерококками, что при дисбиозе приводило к полной элиминации протея, клебсиелл, золотистого стафилококка. Другие культуры, в частности аутопробиотики, вызывали более слабые изменения микробиоты, проявляющиеся лишь снижением числа патогенных бактерий. Кроме того, отмечено, по-видимому, компенсаторное увеличение числа собственных лактобацилл и бифидобактерий в кишечнике животных на фоне введения молочнокислых заквасок. В большей степени этот эффект проявлялся при использовании аутопробиотиков. Таким образом, в серии экспериментов с введением молочнокислых заквасок крысам при дисбиозе кишечника впервые удалось добиться выявления особенностей антимикробного действия LAB в системе in vivo. Особенно важно, что впервые было предложено использовать в качестве аутопробиотиков не лактобациллы и бифидобактерии, [Шендеров Б.А., 2003], а непатогенные энтерококки, выделенные из кишечника хозяина.

Аналогичные доказательства быстрого вытеснения патогенных микробов были получены и при экспериментальном вагините. Использование генетически маркированного штамма Е. faecium L5, как и в экспериментах на модели дисбиоза, позволило проследить динамику обсемененности различных тканей животных на фоне введения молочнокислых бактерий. Показано, что изначально патогенные микроорганизмы препятствовали колонизации слизистых культурой L5, затем, после увеличения числа энтерококков до 106 lg КОЕ/мл, происходило быстрое снижение концентрации патогенных бактерий или их элиминация. В рассматриваемый период, как правило, отмечалось увеличение числа бифидобактерий и лактобацилл. Этот динамический процесс взаимодействия пробиотиков с резидентными представителями микробиоты и патогенными микроорганизмами в организме хозяина ранее не описывался.

Полученные результаты исследования влияния LAB на макроорганизм и его микрофлору еще раз подтверждаю г, что действие пробиотиков не сводится к простому заселению кишечника или урогенитального тракта, как это нередко описывается или представляется. Их взаимовлияние более сложное и многоплановое. Оно включает конкурентные взаимоотношения с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами; взаимодействие с эпителием слизистых оболочек и MAJIT, а также сдвиги в иммунологической реактивности. Выявленные особенности этих динамических процессов, зависящие от штаммов вводимых LAB, открывают дальнейшие перспективы для изучения свойств этих бактерий с целыо создания новых и усовершенствования уже имеющихся пробиотических пищевых продуктов и препаратов.

Таким образом, в работе сформулирована проблема - «научное обоснование увеличения эффективности защитного и лечебного действия молочнокислых бактерий для борьбы с патогенными микроорганизмами и для коррекции вызываемых ими процессов и состояний» и предложено ее экспериментальное изучение и решение. В исследовании представлен и обоснован алгоритм комплексного исследования биологических свойств культур молочнокислых бактерий, включающий их выявление, идентификацию, определение биодоступности, биосовместимости, спектра антимикробного действия в системах in vitro и in vivo, особенностей иммуномодулирующего действия, а также влияния на морфофункциональные характеристики слизистого эпителия, временную колонизацию которых они могут осуществлять. Подробное изучение свойств пробиотических культур по предложенной схеме позволяет совершенствовать паспортизацию и индивидуальный подбор пробиотических препаратов с целью их рационального использования и увеличения эффективности при практическом использовании в медицине и ветеринарии.

Все пробиотические LAB до внедрения в практику должны быть охарактеризованы с учетом их иммуномодулирующей и метаболической активности, что желательно отражать в индивидуальных рекомендациях к использованию препаратов и в описании противопоказаний. Для дальнейших разработок и внедрения молочнокислых бактерий может быть рекомендована следующая рациональная схема двухэтапного комплексного исследования каждого из используемых пробиотических штаммов.

Первый этап включает изучение свойств пробиотического штамма перед его регистрацией, как элемент паспортизации. В этом случае кроме обязательных в настоящее время тестов для выявления антагонистической активности [ГОСТ, 2004], доказательств отсутствия токсичности, устойчивости к действию молочной кислоты, низкого pH, желчи, спермы и других биологических жидкостей [Шендеров Б.А. 2006; Бондаренко В.М. и др. 2007; Golbach S.L., 2000; Reíd G., 2008] предлагается проведение дополнительных исследований. К числу последних следует отнести: определение антагонистической активности в отношении стандартных референс культур, выявление особенностей влияния на иммунитет и метаболические функции макроорганизма.

Наконец, на втором этапе рекомендуется определение чувствительности патогенных микроорганизмов к различным пробиотическим препаратам с целью выбора наиболее эффективно действующего.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Ермоленко, Елена Игоревна, Санкт-Петербург

1. Анкирская A.C. Бактериальный вагиноз// Ж. акуш. и гинекол.- 1995.- №.- 6.- С. 13-16.

2. Афанасьев А.И. Этиопатогенетическая терапия коров, больных эндометритами. Автореферат . кандидата ветеринарных наук. Воронеж, 1983.- 17с.

3. Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В., Любимов Б.И., Рудаков А.Г., Верстакова О.Л. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. М., 2000. -.20 с.

4. Афанасьев А.И. Этиопатогенетическая терапия коров, больных эндометритами: Автореферат кандидата ветеринарных наук. Воронеж, 1983.- 17с.

5. Баринский И.Ф., Чепик С.Г. Инфекции, вызванные вирусами человека простого герпеса 1-го и 2-го типов (413 с) //Медицинская вирусология/ Под ред. РАМН Д.К. Львова, Москва: МИА, 2008.- 656 с.

6. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий.- М.: «Медицина», 2003.-136 с.

7. Белобородова Н.В. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином// Вестник РАМН.- 1999. -Т. 16, №7.- С.25-31.

8. Белобородова Н.В. Дискуссия о бактериемии сепсисе// Антибиотики и химиотерапия.- 2002.- №47-8.- С. 20-29.

9. Бельмер C.B. Антибиотик ассоциированный дисбактериоз кишечника// РМЖ.-2004,- № 12(3) 148 http://www.rmj.ru/articles.

10. Беляев И.М. Иммунная система слизистых// Иммунология,- 1997.- № 4.- С. 7-13.

11. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления//Журн/ микробиол,- 2003.-№ 3 .-С. 109-113.

12. Блинкова Л.П., Альтшуллер М.Л., Дорофеева Е.С., Горобец О.Б. Молекулярные основы продукции и действия бактериоцинов//Журн. микробиол.- 2007.- № 2,- С. 97-104.

13. Бондаренко B.M. Русакова Э.И. Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков// Журн. микробиол. 1998. - №5,- С.107-112.

14. Бондаренко В.М., Виноградов H.A., Малеев Антимикробная активность окиси азота и его роль в инфекционном процессе// Журн. микробиол.- 1999.- №5.- С. 61-67.

15. Бондаренко В.М. Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике, кишечных дисбактериозов.// Фарматека: Международный медицинский журнал. 2003. - № 7. - С. 56-63.

16. Бондаренко В.М., Воробьев A.A. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией// Журн. микробиол. 2004.- №1.- С.84-92.

17. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия// Эксперим. и клин, гастроэнтерол. -2004.-№3,- С. 83-87.

18. Бондаренко В.М., Вахитов Т.Я., Петров Л.Н. Перспективы состояния пробиотических препаратов на основе «чувства кворума» бактерий// Журн. микробиол. -2006.-№3. С. 105-113.

19. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиотические энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистичской инфекции.- Москва, 2007.- 30 с.

20. Борисенко К.К., Тоскин И.А., Кисина В.И. О значении колонизации мочеполовых органов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealytician// Проблемы ИПП. -1999.-№3. -С. 28-32.

21. Бойцов А.Г., Л.Ю. Нилова, Оришак Е.А. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстого кишечника: проблемы диагностики и коррекции// Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. 2008. - №3. - С. 120-123.

22. Брилис В. И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Адгезивные и гемагглютинационные свойства лактобацилл//Журн. микробиол.- 1982.- № 9.-С. 75-78.

23. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Методы изучения адгезивного процесса микроорганизмов// Лаб. Дело. -1987.- №4.- С. 210-212.

24. Бухарин О. В., Васильев Н. В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине.-Томск, 1974.- 183 с.

25. Бухарин О.В., Валышев A.B., Гильмутдинова Ф.Г., Гриценко В.А., Карташова В.Л., Кузьмин М.Д., Усвятцов В.Я., Черкасов C.B., Экология микроорганизмов человека,- Екатерининбург: Ж УрО РАН, 2006,- 479 с.

26. Волчков В.А. Краткое практическое руководство по биометрии для врачей. -СПб, 1998.-63 с.

27. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс// Журн. микробиол. 2005.- № 6. -С. 3-7.

28. Гаврилов Б.Н. Усовершенствование методов лечения при эндометритах у коров: Автореферат кандидата ветеринарных наук. Краснодар, 2005. - 22с.

29. Гавриш В.Г. Клинико-лабораторная диагностика и рациональные методы терапии субклинического эндометрита у коров: Автореферат доктора ветеринарных наук. -Воронеж, 1997 40с.

30. Глушанова H.A. Биологические свойства лактобацилл// Бюллетень сибирской медицины.-2003, Т.2, № 4.- С.50-57.

31. Глушанова, Н. А. Экспериментальное изучение колонизации кишечника гомопробиотиками// Сибирский медицинский журналнал. 2004. - Том 19, № 1. - С. 4351.

32. Глушанова H.A., О биологической и антагонистической активности «сухохо» и «жидкого» пробиотика «№ппе»//Бюллетень Восточно-Сибирского НЦ СО РАМН.-2005.- №1.- С. 130-133.

33. Глушанова H.A., Шендеров Б. А. заимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro// Журнал, микобиол. 2005.- №2.- С. 75-79.

34. Гончаров В.П. Карпов В.А. Профилактика и лечение гинекологических заболеваний коров.- М.: Росагропромиздат, 1991. 190с.

35. ГОСТ 24067-80 «Молоко. Метод определения перекиси водорода», переиздание июнь 1987, с изменением №1, утвержденным в январе 1986 г., ИУС 5-86

36. Грибова И.А. Гематологическая норма// Руководство по гематологии. М.: Медицина, 1979.-54 с.

37. Григорьева Т.Е. Лечение и профилактика эндометритов у коров.- Москва.: Росагропромиздат, 1988. 63с.

38. Гриневич В.Б., Сас Е.И., Захарченко М.М. . К.В. Системные эффекты коррекции микробиоценоза человека// Вестник Российской военно-медицинской академии. 2004. - № 2 . - С. 91-97.

39. Грудянов А.И., Дмитриева H.A., Фоменко Е.В. Применение пробиотиков в комплексном лечении воспалительных заболеваний пародонта.- М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2006.- 112с.

40. Далин М.Ф., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов. М.: Мир, 1985.- 43 с.

41. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению/ Под редакцией проф. Е.И.Ткаченко, проф. А.Н.Суворова.- СПб.: СпецЛит, 2007.- 238 с.

42. Дмитриева Н.Ф., Кудрина Е.С., Петров Г.И. Биоогические свойства бактериальных тейхоевых кислот// Журн. микробиол. 1982.- № 2.- С. 12-18.

43. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ, 2002.- 296 с.

44. Дорофейчук А.Г. Реомендации по определению показателей естественной резистентности птиц.- Ленинград, 1980.- С.5-7

45. Еганян P.A. Изучение влияния кисломолочного продукта «НАРИНЭ» на уровень холестерина сыворотки крови при гиперхолестеринемии// Лечащий врач. 1999. -№6.-С. 15-17.

46. Егоров Е. С., Баранова И.Н. Бактериоцины: образование, свойства, применение// Антибиотики и химиотерапия.- 1999,- № 6.- С. 33-40.

47. Егорова В.В., Питран Б.В., Джаиани H.H., Иезуитова H.H., Тимофеева Н.М., Цветкова В.В., Уголев A.M. Радиальное распределение пищеварительных ферментов в тонкой кишке// Доклады Академии наук СССР. -1987, Т. 293.- № 5. С.1235-1238.

48. Зинченко Е.В., Панин А.Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2000. -64 с.

49. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлинский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукци. Цитокинов клетками пейровых бляшек экспериментальных животных// Иммунология,- 2004- №5.-С.288-290.

50. Калинина Н.М. Заболевания иммунной системы. Диагностика и фрармакотерапия/Н.М. Калинина, С.А. Кетлинский, С.В. Оковитый, С.Н. Шуленин.- М.: Эксмо, 2008.- 496 с.

51. Калмыкова А.И. Пальчикова H.A., Богатова Н.П., Дружинина Ю.Г. Селятицкая В.Г. Системная реакция организма экспериментальных животных на длительный прием пробиотика// Бюллетень СО РАМН. 2005.-№ 3(117). - С. 97-101.

52. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины.- СПб: ООО «Издательство фолиант», 2008. 552 с.

53. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. Вчера, сегодня, завтра// Журнал акушерства и женских болезней. 1994. - № 2. - С. 32-35.

54. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете.- СПб.: «Наука», 2006.- 261с.

55. Кондракова O.A., Ещина A.C., Дмитриева Н.Ф., Брико Н.И., Бабин В.Н. Чувствительность бета-гемолитических стрептококков к антибиотикам и альтернативным препаратам// Антибиотики и химиотерапия.- 1998.- 43.- №7.- С. 26-30.

56. Корниенко Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков// Детские инфекции . 2007.- Том 6. - № 3 .- С. 63-68 .

57. Коршунов В.М., Кафарская, Л.И., Володин H.H., Тарабрина Н.П. Коррекция дисбиотических нарушений вагинальной микрофлоры с помощью препарата высокоадгезивных лактобактерий// Журн. микробиол.-1990.- №7.-С.17-19.

58. Коршунов В.М., Уртаева З.А., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vivo и in vitro с использованием гнотобиологической технологии// Журн. микробиол.- 1999.- №5.- С.12-11

59. Костюкевич О.И. Современные представления о микробиоценозе кишечника. Дисбактериоз и его коррекция// РМЖ. 2007. 2176.

60. Кремлев Е.П., Банакова Л.А. Лечение при микозном эндометрите//Ветеринария.-1979.-№5.- С. 45-46.

61. Кубась В.Г., Данилова О.П.,Чайка H.A. Кандидоз. Санкт-Петербург, 1997.- 52 с.

62. Кудлай М.Г., Лиходед В.Г. Бактериоциногения. Л, 1966.- с. 234.

63. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Тоом М.А. О способности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим// Журн. микробиол.- 1975.- №8.- С. 77-81.

64. Лобзин Ю.В., Макарова В.Г., Кровякова Е.Р. Дисбактериоз кишечника (клиника, диагностика, лечение): Руководство для врачей .СПб:000 «Изд-во Фолиант», 2003.-256 с.

65. Лыкова Е.А., Мурашова А.О., Бондаренко В.М. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунитета у детей с аллергическими дерматитами и их коррекция// Росс, педиатр, журн.- 2000. № 2.- С. 20-24.

66. Лясковский Т.М., Рыбалко С.Л., Подгорский B.C. Индукция интерферона молочнокислыми бактериями в экспериментах in vitro и in vivo// Микробиол. журн.-2005,- Т. 67, №2,- С. 81-87.

67. Мечников И.И. Этюды оптимизма М.: «Наука», 1988.- 328 с.

68. Миронов A.A., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. Методы электронной- микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. СПб.: Наука, 1994.400 с.

69. Михайлов И.Б., Корниенко Е.А. Применение про- и пребиотиков при дисбиозе кишечника у детей: Методическое пособие для врачей-педиатров.- СПб, 2004.- 18 с.

70. Михайлова JI.E., Кохреидзе H.A., Шамардина Н.М., Петров JI.H. Опыт использования препарата ВИТАФЛОР в лечении вульвовагинитов у детей.// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 1999. - №1, Т.З. - С. 118-119.

71. Мухина Ю.Г., Бельмер С.В., Т.В.Гасилина, Завалин П.А. Принципы лечения " язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей// Медикал маркет,- 1996.- № 20.1. С.34-35.

72. Навашин С. М., Фомина И. П. Рациональная антибиотикотерапия//М: Изд-во: «Медицина», 1982 .-496 с.I

73. Николаева Т.Н., Зорина В.В. Бондаренко В.М. Роль цитокинов в модудяции ■ иммунореактивности организма бактериями рода Lactobacillus!'1 Журн. микробиол.2004.-№4,- С. 101-106.

74. Нилова Л.Ю., Бойцов А.Г., Оришак Е.А. К вопросу о применении пробиотиков для коррекции дисбактериоза толстого кишечника// Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. 2008. - №3. - С. 154-157.

75. Нилова Л.Ю. Характерисика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника: Автореферат к.м.н., 2009.- с 24.

76. Нынь И.В., Королюк A.M. Настоящее и будующее пробиотической микробилогии// Известия Государственного технологичского института,- 2008- №3(29). -С. 70-74.

77. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003).

78. Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Осипов Г.А. Антибиотико-ассоциированная диарея// Экспер. и клин. Гастроэнтерол,- 2002. № 5.- С. 92-95.

79. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М.: Медгиз, 1955.- 436 с.

80. Петров Л.Н. Витафлор. Бактериальный препарат нового поколения для лечения и профилактики дисбиозов. М,- СПб.: Гер да, 2004. - 72 с.

81. Петров Л.Н. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Добрица В.П., Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритм выбора/ Биотехнология.- Спб.:ФГУ Гос НИИ ОЧБ, 2008.- 136 с.

82. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. -М: Медицина, 1976. 231 с.

83. Похиленко В.Д. Перелыгин В.В. Проботики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность// Химическая и биологическая безопасность.-2007.- №2-3 (32-33).- С. 20-41.

84. Правила доклинического исследования безопасности фармакологических средств. М., 1992.

85. Прозоровский С.В., Раковская И.В. Персистенция микоплазм в инфицированном организме: наблюдения, причины и механизмы, диагностика // Журн. микробиол. 1997. №4. С. 47-51.

86. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.Г., Демченко В.Е. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и её ошибки // Фармакология и токсикология. -1978 -№4.-С. 497-502.

87. Работнова И.Л., Позмогова И.П. Хемостатное культивирование и ингибирование микроорганизмов. М.: Наука, 1979. - 207 с.

88. Рищук С.В., Ильясов Ю.Ю., Гречанинова Т.А. Адгезия лактобактерий к клеткам буккального и вагиального эпителия// Вестник СПбГМА им. Мечникова,- 2004.- №4.- С. 191-193.1

89. Рокитский П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вьппейшая школа, 1973.329 с.

90. Рубцов В.И. Микрофлора при маститах и гинекологических заболеваниях укоров. Москва, 2004. - 5 с.

91. Руш К., Руш Ф. Микробиологическая терапия. М.: Арнебия, 2003. - 160 с.

92. Рыбальченко О.В. Электронно-микроскопическое исследование межклеточных взаимодействий микроорганизмов при антагонистическом характере взаимоотношений//Микробиология.- 2006. Т. 75, №4.- С. 550-555.

93. Рыбальченко О.В., Бондаренко ВМ., Вербицкая Н.Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на Klebsiella pneumoniae, Citrobacter jreundi и Proteus vulgaris //Журн. микробиол.-2006.-№7.- С. 8-11.

94. Симаненков В.И. Клинические аспекты диагностики и лечения дисбиоза кишечника в общетерапевтической практике. Учебно-методическое пособие. СПб., 2003. -36 с.

95. Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактериозы: теория и практика/ Под ред. Княжева В.А.- Н.Новгород: НГТУ, 1999.- 240 с.

96. Страчунский, J1. С., Белькова, А. В., Дехнич Ю. А. Внебольничные MRSA -новая проблема антибиотико-резистентности// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2005. Том 7.- № 1. - С. 32-46.

97. Суворов А.Н. Захаренко С.М., Алехина Г.Г. Энтерококки как пробиотики выбора// Клиническое питание. 2003.- №1. - С. 26-29.

98. Суворов А.Н., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В., Грабовская К.Б., Нежинская Г.И., Назаров П.Г. Опыт применения лактококков в терапии экспериментального вагиноза// Гастро Бюллетень.- 2004,- № 4,- С. 29-31.

99. Тартаковский И. С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика//Клиническая микробиология и антимикробная терапия.-2002,-Том 2.- №2- С.20-30.

100. Телешева Л. Ф., Долгушина В. Ф., Долгушин И. И. Механизмы противо-инфекционной защиты репродуктивного тракта женщин // Журн. микробиол. -1998. -№ 4. С. 85-90.

101. Тимофеева Н.М., Иезуитова H.H., Громова Л.В. Современные представления о всасывании моносахаридов, аминокислот и пептидов в тонкой кишке млекопитающих // Успехи физиол. Наук,- 2000.- Т. 31.-.№ 4.- С. 24-37.

102. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз, и интеллект человека.- СПб: СпецЛит, 2006.- 560 с.

103. Тотолян А.А, Суворов А.Н., Дмириев A.B. Стрептоокки группы В: клиника, лабораторная диагносика и лечение.- СПб.: «Наука», 2009.- 289 с.

104. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г., Поспелова В.В., Лагода И.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл// Журн. микробиол.-1989.-№2.-С.З-8.

105. Уголев A.M. Теория адекватного питания и трофология.- Спб: Наука, 1991.- 271 с.

106. Хавкин А.И. Роль микрофлоры в развитии иммунной системы пищеварительного тракта// Педиатрия.- 2008. №4,- С. 4-5.

107. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы//М.: ВИНИТИ, 2001. 224 с.

108. Халяпин Б. Д., Прокопьев A.A. Кинетический метод количественного определения комплемента// Иммунология.- 1986.- № 3. С.66-69

109. Холод В.М., Ермолаев Г.Ф. Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови методом осаждения сульфата цинка//Справочник по ветеринарной биохимии. -Минск: Ураджай, 1988,- С. 86-87.

110. Хорошилова Н.В. Имуномодулирующее и лечебное действие пробиотиков // Иммунология.-2006. №6. - С. 252-256.

111. Цой И.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К. Иммуно-стимулирующее действие лактобактерий на цито- токсичность естественных клеток-киллеров// Журн микробиол.- 1994,-№6.- С. 112-113.

112. Чахава О.В. Гнотобиология о микрофлоре организма хозяина и антибиотикотерапии// Антибиотики и медицинская биотехнология.- 1987.- TXXXII, №3,- 1987.-С. 170-179.

113. Шатаева JI. К., Хавинсон В. X., Ряднова И. Ю. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы).- Спб: Наука, 2003,- 224 с.

114. ИГендеров Б. А., Манвелова М.А. Способ получения аутопробиотика, содержащего живые бифидобактерии и лактобациллы// Авторское свидетельство CCCPN 1286212, А 61 К 35/74, 30.01.87.

115. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции//Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.1. Микрофлора животных и человека и ее функции. М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

116. Шендеров Б.А Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 3. Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ, 2001. -288 с.

117. Шендеров Б.А. Функциональное питание, криогенные банки микробиоценозов и их роль в сохранении и восстановлении здоровья //Вестник восстановительной медицины. -2003. -№1. С 29-31.

118. Шендеров Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики. Общие и избранные разделы проблемы// Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки.- 2005.- №2.- С. 23-26.

119. Яковлев В.П., Яковлев C.B. Рациональная антимикробная фармакотерапия: Руководство для практических врачей. М., 2003.- 1008 с.

120. Юнкерова В.И. и Григорьева С.Г. «Метематико-статистическая обработка данных медицинских исследований».- СПб.: ВМедА, 2002.- 266 с.

121. Ярилин A.A. Система цитокинов и принципы ее фукционированияв норме и при патологии//Иммунология.- 1997.- № 5, С.7-14.

122. Abee T., Klaenhammer Т. R., Letellier L. Kinetic studies of the action of lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus johnsonu that forms poration complexes in the cytoplasmic membrane// Appl Environ Microbiol.- 1994.- Vol. 60.- P.1006-1013.

123. Allison G. E., Fremaux C., Klaenhammer T. R. Expansion of bacteriocin activity and host range upon complementation of two peptides encoded within the lactacin F operon// J. Bacterid.- 1994,- Vol. 176.- P. 2235-2241.

124. Andreeva P., Dimitrov A. The probiotic Lactobacillus acidophilus — an alternative Treatment of bacterial vaginosis // Akush. Ginekol.(Sofia).- 2002,- № 41(6).- P. 29-31.

125. Apostolou E., Kirjavainen P.V., Saxelin M. Good adhesiion properties of probiotics: a potential risk for bacteriemia// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2001.- №.- 31.- P. 35-39

126. Arakawa K., Kawai Y., Fujitani K., Nishimura J., Kitazawa H. Bacteriocin production of probiotic Lactobacillus gasseri LA39 isolated from human feces in milk-based media// Animal Science Journal. 2008. - Vol. 79, Issue 5.- P. 634 - 640.

127. Ayebo A.D., Angelo I. A., Shahani K.M. Effect of ingesting Lactobacillus acidophilus milk upon fecal flora and enzyme activity in humans // Milchwiss.- 1980. Vol. 35. -P.730-733.

128. Ayger P., Joly J. Factors influencing germ tube production in Candida albicans!'/ Mycopathologia.- 1977.- Vol. 61,- №3.- P.183-186.

129. Axelsson L.T., Chung T.C., Dobrogosz W.J., Lindgren S.E. Production of a broad spectrum antimicrobial substance by Lactobacillus reuterill Microbial Ecology in Health and Disease.- 1989. № 2.- P. 131-136.

130. Axelsson L., Hoick A. The genes involved in production of and immunity to sakacin A, a bacteriocin from Lactobacillus sakei Lb706// Journal of Bacteriology.- 1995. № 177. -P. 2125-2137

131. Axelsson L. Lactic acid bacteria: Classification and physiology// Lactic acid bacteria: microbiological and ftmctional aspects/ 3rd rev. and exp. ed. Marcel Dekker, Inc., New York. 2004. - P. 1-66.

132. Baker D., Plotkin S.A. Enhancement of vaginal infection in mice byHerpes Simplex Virus type I// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1978.- Vol. 158. - -P. 131-134.

133. Banasaz M., Norin E., Holma R., Midtved T. Increased enterocite production in gnotobiotic rats monoassociated with Lactobacillus rhamnosus GG// Appl. Env. Microbial.- 2002.-Vol. 68. P. 3031-3034.

134. Barefoot SF, Klaenhammer TR. Purification and characterization of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lactacin B// Antimicrob. Agents Chemother. -1984. Vol.26.- №. 3.- P. 328-334.

135. Bengmark S., Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic floraII Gut. 1998,- Vol. 42,- №1.- P. 2-7.

136. Benyacub J., Czarnecki-Maudlen G.L., Cavardini C., Sauthier T., Anderson R.E., Schiffrin E., von der Weid T. Supplentation of food with Enterococcus faecium (SF68) stimulates immune functions in young dogs// J.Nutr.- 2003.- Vol. 133.- P. 1158-1162.

137. Bittencourt E., Suzart S. Occurrence of virulence-associated genes in clinical Enterococcus faecalis strains isolated in Londrina, Brazil// J. Med. Microbiol. 2004. -Vol. 53. - P.1069-1073.

138. Bergey's manual of Systematic Bacteriology. 1986. - Volume 2. - 1214 p.

139. Bittencourt E., Suzart S. Occurrence of virulence-associated genes in clinical Enterococcus faecalis strains isolated in Londrina, Brazil// J. Med. Microbiol. 2004. -Vol. 53.- P.1069-1073.

140. Blum S., Alvares S., Haller D. Intestinal microflora and the interaction with immunocompetent cells// Antonie van Leewenhoek. 1999. - Vol. 76,- P. 199-205.

141. Both M.C., Bogie C.P., Sahl H.-G., Siezen R.G., Halter K. L., Gilmore M.S. Structural analysis and proteolytic activation of Enterococcus faecalis cytolysin, a novel lantibiotic// Molecular Microbiol. 1996. - Vol. 21, Iss. 6. - P. 1175-1184.

142. Byczkowski J.Z., Gessner T. Biological role of superoxide ion-radical// Int. J. Biochem. 1998. Vol. 20. - P. 569-580.

143. Caetano J.A., Parames M.T., Babo M.J., Santos A., Ferreira A.B., Freitas A.A., Coelho M.R., Mateus A.M. Immunopharmacological effects of Saccharomyces boulardii in healthy human volunteers// Int. J. Immunopharmacol. 1986. -Vol. 8.- P. 245-259.

144. Casaus P., Nilsen T., Cintas L.M., Nes I.F., Hernandez P.E., Holo H. Enterocin B, a new bacteriocin from Enterococcus faecium T136 wich can act synergistically with enterocin All Microbiology. -1997. Vol.- 143.- P. 2287-2294.

145. Catteral R.D. Influence of gestogenic contraceptive pills on vaginal candidiasis// Br. J. Vener.Dis. 1978. - Vol. 47.- P. 45-47.

146. Characklis W.G., Marshall K.G. Biofilms: a basis for an interdisciplinary approach.-New York.- 1990. -P. 3-5

147. Chen H., Hoover D.G. Bacteriocins and their food applications// Compichensive rewiews in food science and food safety. 2003. - Vol. 2.- P. 82-100.

148. Choorpenning F.W. Immunologic effects of teichic acid and inanimate bacterial product in the environment: arewiew// OHIO j. Sci. 1982, Vol. 882. - № 31.- P.31-37.

149. Christensen H.R., Frokiaer H., Pestska J.J. Lactobacilli differently modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells// J. Immunol. 2002. Vol.168. - №1.- P. 171-178.

150. Chung T.C., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuterill Microbiology in health and diseases. 1989. - Vol. 2. -P. 137-144.

151. Cole C.B., Fuller R., Mallet A.K., Rowland I.R. The influence of the host on expression of intestinal microbial enzyme activities involved in metabolism of foreign compounds// J Appl Bacteriol. 1985. - Vol.59. - №.6. - P. 549-553.

152. Collins E. B. and Aramaki K. Production of hydrogen peroxide by Lactobacillus acidophilus //Journal of Dairy Science. 1980, № 63. - P. 353-357.

153. Cox C.R., Coburn P.S., Gilmore M.S Enterococcal cytolysin: a novel tho komponent peptide system that serves as a bacterial defense against eucaryotic and procaryotic cells// Curr Protein Pept Sci.- 2005,- Vol.- 6,- №1. P. 77- 84.

154. Cuozzo S. A., Castellano P., Sesma F. J.M., Graciela M., Vignolo R.R. Differential Roles of the Two-Component Peptides of Lactccin 705 in Antimicrobial Activity// Current microbiology.- 2003,- Vol. 46,- № 3.- P. 180-183.

155. Daher K., Selsted M.E., Lehrer R.I Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins// J. Virol. 1986.-Vol.60. - P. 1068-1074.

156. Dalet K., Briand C., Cenatiempo Y. and Héchard Y. The rpoN gene of Enterococcus faecalis directs sensitivity to subclass Ila bacteriocins // Current Microbiology, 2000, № 41. -P. 441-443.

157. De Petrino S.F., De Jorrat B.B., Meson O., Perdigón G. Protective ability of certain lactic acid bacteria against an infection with Candida albicans in a mouse immunosupression by corticoidII Food Agrie. Immunol. -1995. Vol. 7.- P. 365-373.

158. De Vuyst L., Leroy F. Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications// J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol.13. - P. 194-199.

159. Diep D.B., Axelsson L., Grefsli C., Nes I.F. The synthesis of the bacteriocin sakacin A, is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system// Microbiol.- 2000,- Vol. 146.- P. 2155-2160.

160. Drider D., Fimland G., Héchard Y., McMullen L.M., Prévost H. The Continuing Story of Class Ha Bacteriocins// Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006,- Vol. 70.- № 2,- P. 564-582.

161. Earashaw R. G. The antimicrobial action of lactic acid bacteria: natural food preservation systems/ Ed. Wood B. J. B: The lactic acid bacteria in health and disease.- Vol. 1. Chapman and Hall: London. 1992. - P. 211-232.

162. Eijsink V. G., Skeie M., Middelhoven P. H., Brurberg M. B. and Nes I. F. Comparative studies of class lia bacteriocins of lactic acid bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1998,- № 64. - P. 3275-3281.

163. Elmer G.W., Surawicz C.M., McFarland L.V. Biotherapeutic agents. A neglected modality for the treatment and prevention of selected intestinal and vaginal infections// JAMA, 1996.-Vol. 275. №11. - P.870-876.

164. Elmer G.W. Probiotics: «living drugs»//Amm. J. Health Syst. Pharm. 2001,- Vol. 58.-№12.-P. 1101-1109.

165. Ennahar S., Deschamps N. Anti-Listeria effect of enterocin A, produced by cheese-isolated Enterococcus faecium EFM01, relative to other bacteriocins from lactic acid bacteria // Journal of Applied Microbiology. 2000. - Vol. 88.- № 3.- P. 449-457.

166. Ericson K.L., Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and diseases//J.Nutr. 2000. - № 130(2).- P. 403-409.

167. FAO/WHO. Evalution of health and nutritional properties of probiotics in food .Cordoba, Argentina: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization.; 2001.-P.1-34.

168. Farias M.E., Farias R.N., Holgado R. Letters in Purification and N-terminal acid" sequence of enterocinCRL35, a pediocin-like bacteriocin produced by Enterococcus faecium CRL35//J. Applied Microbiology.- 1996.- Vol. 22.- P. 417-419.

169. Fimland G., Eijsink V. G. H., Nissen-Meyer J. Comparative studies of immunity proteins of pediocin-like bacteriocins //Microbiology, 2002.- Vol.148.- №3,- P. 661-3 670.

170. Fischetti R„ Novick R.P., Ferrettti J.J. Gram-positive pathogens// ASM Press.- 2002.-p. 736.

171. Fitzssimmons N., BerryD.R. Inhibition of Candida albicans by Lactobacillu acidophilus: evidence for the involvement of a peroxidase system// Microbios. 1994.-Vol. 34.- P. 125-13.

172. Flores R. Analytical biochemistry. 1978. - Vol.88. - P. 605-611.

173. Fremaux C. C., Klaenhammer T. R. Molecular analysis of the lactacin F operon// Appl. Environ. Microbiol. 1993.-Vol.59,- № 11.- P.3906-3915.

174. Fuller R. Probiotics in man and animals// J.Appl. Bacteriol. 1989, N66, P. 365-369.

175. Gaskins HR. The role of probiotics in paediatrics// Current Paediatrics, 1997.- Vol. 14, Issue 2,-P. 104-109.

176. Gibson GR, Roberfroid M. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics// J Nutr. 1995. - Vol.1256.- P. 1401-1412.

177. Gibson G.R. Human gut microbiology: the end of the food chain or the start of good health //Microbiology today. Vol 29. 2002.- P. 229-254.

178. Goldin B.R., Gorbach S.L. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity//Am J .Clin. Nutr.- 1984.-Vol.39.-№5 P.756-761.

179. Grangette C., Muller-Alouf H., Hols P., Goudercourt, D., Delcour, J., Turneer, M. & Mercenier, A. Enhanced mucosal delivery of antigen with cell wall mutants of lactic acid bacteria// Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 2731-2737.

180. Gravesen A., Axelsen A.-M., Silva J.M., Hansen T. B., Knochel S.Frequency of Bacteriocin Resistance Development and Associated Fitness Costs in Listeria monocytogenes //Appl. Envir. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - № 2.- P. 756 - 764.

181. Greene J.D., Klaenhammer T.R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells// Appl. Envir.Microbiol. 1994. - Vol. 60.- P.4487-4494.

182. Gutteridge, J.M.C., Stocks, J. Caeruloplasmin: physiological and pathological perspectrives// Cri. Rev. Clin. Lab. Sci. -1981. P. 257-329.

183. Haghighi H.R.,. Gong J., Gyles C.L., Hayes M.A., Sannei B., Parvizi P., Gisavi H., Chambers J.R., Sharif S. Modulation of antibody-mediated immune response by probiotics in chickens// Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - Vol.12.- №12. - P. 1387-1392.

184. Hampl H., Schlehofer J.R. Habermehl K.O. Differences in the morphology of herpes simplex virus infected cells. II Type specific virus membrane alterations of HSV-1 and HSV-2 infected cells// Med Microbiol Immunol., 1981,- Vol.169.- №3.- P. 209-223.

185. Harwig S., Chen N., Park A., Lehrer R. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leucocytes by continuosus acid-urea-polyacrilamide gel electrophoresis// Anal. Biochem., 1993,- Vol. 208.- P. 382-386.

186. Hauge, H. H., Mantzilas D., Eijsink, V.G.H., Nissen-Meyer J. Membrane-Mimicking Entities Induce Structuring of the Two-Peptide Bacteriocins Plantaricin E/F and Plantaricin J/K//J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181.- P. 740-747.

187. Havarstein L. S., Diep D. B., Nes I. F. A family of bacteriocin ABC transporters carry out proteolytic processing of their substrates concomitant with export// Molecular. Microbiology. 1995,- № 16.- P. 229-240.

188. Henderson B., Wilson M. Homo bacteriens and a network of surprises// J.Med. Microbiol.- 1996.- Vol. 45.- P. 393-394.

189. Hickey R. M., Twomey D. P., Ross R. P., Hill C. Potential of the enterocin regulatory system to control expression of heterologous genes in Enterococcus// Journal of Applied Microbiology. 2003. - № 95. - P. 390-397.

190. Hilton E., Isenberg H.D., Alperstein P., France K., Borenstein M.T. Ingestoin of yogurt containing Lactobacillus acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis // Annals of Internal Medicine. 1992,-Vol.116. - №5. - P.353-355.

191. HolmF. Gut Health and diet//World Food Ingredient.-2003.-P. 52-55.

192. Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P .H. A., Staley J. T„ Williams S. T.// Bergey's manual of determinative bacteriology. Regular, nonsporing Gram-positive rods/ 9th ed.: The Williams &Wilkins Co., 1994, Baltimore. P. 565-567.

193. Holzapfel W. H., Haberer P., Snel J., Schillinger U. and Huis in't Veld J. H. J. Overview of gut flora and probiotics// Journal of Food Microbiology. 1998. - № 41. - P. 85-101.

194. Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R., Bjorkroth J. and Schillinger U. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition// The American Journal of Clinical Nutrition, 2001. № 73, Suppl. 2. - P. 365S-373S.

195. Huycke M.M., Spiegel C.A., Gilmore M.S. Bacteremia caused by hemolytic, highlevel gentamicin-resistant Enterococcus faecalisll Antimicrob. Agents Chemother. 1991. -Vol.35.-№8. - P. 1626- 1629.

196. Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety//Am. J. Clin. Nutr. 2001.- Vol. 73,-№2.- Suppl.- P.465-470.

197. Isolauri E., Sutás Y., Kankaanpaa P., Arvilommi H., Salminen S. Probiotics: effects on immunity// Am J Clin Nutr. 2001. - Vol. 73, 2 suppl.- P.444 -450.

198. Jack R.W., Tagg I.R., Ray B. Bacteriocins of gram-positive bacteria//Microbiol. Rev. 1995. - Vol 59.- №. 2. - P. 171-200.

199. Jay J. M. Antimicrobial properties of diacetyl// Appl. Environ. Microbiol. 1982, № 44. - P. 525-532.

200. Jay J. M. Intrinsic and extrinsic parameters of food that affect microbial growth// Modern Food Microbiology: 3 Avi Book, New York, 1992. P. 38-62.

201. Jeavons H.S. Prevention and treatment of vulvovaginal cadidiasis using exogenous// J. Obstet. Gynecol. Neonatal. Nurs. 2003. - Vol.32.- №3- P.287-296.

202. Jessen T.E., Barkholt V., Welinder K.G. A simple alternative pathway for hemolytic assay of human complement component C3 using methylamine-treated plasma. // JimmunoLMethods, 1983. Vol.60.- № 1-2. - P.89-100.

203. Jijón H. Backer J., Diaz H., Yeung H., Thiel D., McKaigney C., De Simone C.,

204. Madsen K., DNA from probiotic bacteria modulates murine and human epithelial andimmune functions//Gastroenterology.-2004.- Vol. 126.-P. 1358-1373.i

205. Joerger M.C., Klaenhammer T.R, Characterization and purification of helveticin J and evidence for a chromosomally determined bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 481//J. Bacteriol. -1986. Vol. 167. - № 2. - P. 439-446.

206. Joosten H. M., Devreese M., Van Beeumen M., Nunez B. J., Marugg J. D. Purification and characterization of enterocin 4. a bacteriocin produced by Enterococcus faecalis INIA 4//Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62. - №11.- P. 4220^223.

207. Kaila M., Isolauri E., Arvilommmi H., Vesikari T. Viable versus inactivated lactobacillus strain GG in acute rotavirus diarrhea// Archives of Disease in Childhood.-1995,- Vol. 72,- №1.- P. 43-51.

208. Kalu D.N. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss// Bone Miner. -1991. Vol. 15,- №3.- P. 175-179.

209. Katla T., Naterstad K. Vancanneyt M., Swings J. and Axelsson L. Differences in susceptibility of Listeria monocytogenes strains to sakacin P, sakacin A, pediocin PA-1, and nisin // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - № 69. - P. 4431-4437.

210. Kaushic C., Zhou F., Murdin A.D. Wira C.R. Effects of estradiol and progesterone on susceptibility and early immune response to Chlamydia trachomatis infection in the female reproductive tract//Inf.Immun. 2000 Vol.68.-№7. - P. 4207-4216.

211. Kita E., Matsuura H., Kashiba S. A mouse model for the study of gonococcal genital infection//J.Infect. Dis. 1981. - Vol. 143.- P. 67-70.i

212. Klaenhammer T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria// FEMS Microbiol. Rew. 1993. - Vol.12. - P. 39-86.

213. Klebanoff S.J, Belding M.E. Virucidal activity of EbCVgenerating bacteria: requirement for peroxidase and a halide// J. Infect. Dis. 1974. -•'Vol.129.- №3.-P. 345-348.

214. Klebanoff J., Coombs R.W. Virucidal effect of Lactobacillus acidophilus on human immunodeficiency virus type 1: possible role in heterosexual transmission// J. Exp. Med. -1991.- Vol.174.- P. 289-292.

215. Klebanoff S.J., Watts D.H., Mehlin C., Headley C.M. Lactobacilli and vaginal host defense: activation of the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat, cytokine production, aNF-KB// J.Infect. dis. 1999. - Vol. 179.- P. 653-660.

216. Kleerbezem M., Quadri L.E., Kuipers O.P., Vos W.M. Qouorum sensing by peptide heromones and two-component signal-transduction systems in Gram-positive bacteria// Mol. Microbiol. 1997,-Vol. 24. - №5. - P.895-904.

217. Knox K.W., Wicken A.J. Immunological properties of teichoic acids// Bacteriol. Rev. 1973.-№37.-P. 215-257.

218. Komatsu S. Panes J., Mori N., Grisham M.B., Russel J.M., Granger D.N. Effect of intestinal stasis on 1CAM-1 expresssion: role enteric bacteria// Gastroenterology. 1997. -Vol 112. - P. 1018-1023.

219. Kos B., Suskovic J., Vukovic S., Simpraga M., Frece J., Matosic S. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92// Journal of Applied Microbiology. 2003. - Vol. - 94, Issue 6. - P. 981-987.

220. Kraus D., Peschel A. Molecular mechanisms of bacterialresistance to antimicrobial peptides//CTMI. 2006. - Vol. 306.-P. 231-250.

221. Kushak R.I., Winter H.S. Dietary Carbohydrates: Digestion and Absorption// Trends in Dietary Fats Research. /Ed. Landow M.V. 2005.- P. 1-30.

222. Lan J.-G., Cruicshank S.M., Singh J.C.I., Farrar M., Lodge J.P.A., Felsburg P.J., Carding S.R. Different cytokine response of primary colonic epithelial cells to commensal bacteria// World Gastroenterol. 2005. - Vol. 11. - № 22. - P. 3375-3384.

223. Land M.H., Rouster-Stevens K., Woods C.R., Cannon M.L., Cnota J., Shetty A.K. Lactobacillus sepsis assosiated with probiotic therapi//Pediatrics. 2005. - Vol. 111.- № 1,-P. 178-181.

224. Laukova A., Czikkova S. Antagonistic effect of enterocin CCM 4231 from Enterococcus faecium on «bryndza», a traditional Slovak dairy product from sheep milk// Microbiological Research. 2001.- Vol. 156, Issue l.-P. 31-34

225. Laukova, A.; Guba, P.; Nemcova, R. and Marekova, M. Inhibition of Samonella enterica serovar Dusseldorf by enterocin A in gnotobiotic Japanese quails// Vet. Med.-Czech. 2003. - Vol. 49. - P. 47-51.

226. Lebenthal E., Lebenthal Y. Пробиотики: концепция лечебного применения, ожидающая своего признания// Журн. микробиол. 2003,- № 4.- С.- 88-90.

227. Lehrer R.I., Daher K., Ganz Т., Selsted M.E. Direct inactivation of viruses by MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics from rabbit leucocytes// J. Virol/ 1985. - Vol. 56. -P. 5255-5265.

228. Lehrer R. I., Rosenman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensetive assays for endogenous antimicrobial polypeptides// Journal of immunological methods/ -1991.-Vol. 137.-P. 167-173.

229. Lilly D.M., Stilwell R.H. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms// Science. 1965,- Vol. 147.-P. 747-748.

230. Ling W.H., Korpela R., Mykkanen H., Salminen S. Lactobacillus strain GG and fiber supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive enzyme activities in healthy female subjects// J. Nutr. 1994. - Vol.124. - № 1. - P.18-23.

231. Lorea G., Torino M.J., Fot de Valdez G., Liungh A. Lactobacilli express cell surface proteins with mediate binding of immobilized collagen and fibronectin// FEMS Microbiol. Letters. 2002. - Vol. 206. - P. 31-37.

232. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin reagent// J. Biol. Chem. 1951,- Vol.193.- P. 265- 275.

233. Magnusson J., Schniirer J. Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound// Appl. Environ. Microbiol. -2001.-Vol. 67 P.1-5.

234. Majamaa H., Isolauri E., Saxelin M., Vesikari T. Lactic acid bacteria in the treatment of acute rotavirus gastroenteritis// J. Pediatr Gastroenterol Nutr. 1995.- Vol. 20. -№3. - P. 333-338.

235. Maldonado A., Ruiz-Barba J.L., Jimenez-Diaz R. Production of plantaricin NC8 by Lactobacillus plantarum NC8 is induced in the presence of different types of Gram- positive bacterin//Arch. Microbiol.- 2003.- Vol.1.- P.29-35.

236. Maldonado G. C., de Moreno de Blance A., Vinderola G., Bibas Bonet M.E. Perdigón G. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria// Clinical and Vaccine Immunology. 2007. - Vol. 14. - № 5, P. 484-492.

237. Mannual of clinical microbiology.// 5 th ed.: editor in chif BalowsA. Washington: D.C., 2004. 1364 p.

238. Maqueda M., Gálvez A., Martínez-Bueno M., Guerra I., Valdivia E. Neutralizing antibodies against the peptide antibiotic AS-48// Antimicrob. Agents Chemother. 1993. -Vol. 37. -№ 1. - P. 148-151.

239. Maqueda M., Galvez A., Bueno M. M., Sanchez-Barrena M. J., Gonzalez C., Albert A., Rico M., Valdivia E. Peptide AS-48: Prototype of a New Class of Cyclic Bacteriocins// Current Protein and Peptide Science. 2004.-Vol. 5. - № 5.- P.399-416.

240. Mardh P.A., Soltesz L.V. In vitro interactions between lactobacilli and other microorganisms occurring in the vaginal flora// Scand. J. Infect. Dis. 1983, Suppl. -Vol.40. - №3. -P.47-51.

241. Marekova M., Laukova A., de Vuist L., Skaugen M., Nes I.F. Partial characterization of bacteriocins produced by environmental strain Enterococcus faecium EK13// Journal of Applied Microbiology. 2003.-Vol. 94, Issue 3. - P. 523-530.

242. McFarland L. Epidemiology, risk factors and treatments for antibiotic associated diarrhea//Diagn.Dis. 1998. - Vol.16. - P.292-307.

243. McGroarty J.A. Probiotic use of Lactobacilli in the human urogenital tract//FEMS Immunol. Med. Microbial. -1993.-Vol.36. P.251-264.

244. Milling S.W.F., Cousins L., MacPherson G. How do dendritic cells interact with intestinal antigens?//Trends Immunol. 2005. - Vol. 26. - P. 349-352.

245. Moreno M.R. F., Callewaeri R., Devreesed B., Beeumen J. V., Vuysi L. De Vuysi Isolation and biochemical characterization of enterocins produced by enterococci from different sources// Journal of Applied Microbiology. 2003.- Vol.94.- P. 214-220.

246. Moreno M. R. F., Sarantinopoulos P., Tsakalidou, De Vuyst L. The role appplication of enterococci in food and health// Intern. Journal of Food Microbioloy. 2006. - Vol. 106, Is. l.-P. 1-24.

247. Morotomi M. Propertis of Lactobacillus caseli Shirota strain as probiotics// Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 1996. - Vol.5.- P.29-30.

248. Morovsky M., Pristas P., Javorsky P., Nes I.F., Holo II. Isolation and characterization of enterocin BC25 and occurrence of the entA gene among ruminal gram-positive cocci//Microbiol Res. 2001. - Vol.156.- № 2,- P.133-138.

249. M0rtvedt C. I., Nissen-Meyer J., Sletten K., Nes I. F. Purification and amino acid sequence of lactocin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus sake L45// Appl. Environ. Microbiol. -1991.- Vol. 57.- № 6. -P. 1829-1834.

250. Munson V.A., Byun R. Molecular analysis of the microflora associated with dental caries// J. Clin.Microbiol. 2004. - Vol. 42. - № 7.- P. 3023-3029.

251. Myllyluoma E., Ahonen A.M., Korpela R., Vapaatalo H., Kankuri E. Effects of multispecies probiotic combination on Helicobacter pylori infection in vitro//Clin Vaccine Immunol. 2008,- Vol.l5.-№ 9.- P. 1472-1482.

252. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2004. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Fourteenth informational supplement M100-S14. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa.

253. Nes I. F., Diep D. B., Holo H. Bacteriocin diversity in Streptococcus and Enterococcus II Journal of Bacteriology, 2007, Vol. 189.- № 4.- P. 1189-1198.

254. Ness R.B., Hiller S.L., Holly E.R., Soper D.E., Stamm C., Bass D.C., Sweet R.L., Rice P. Douching in relation to bacterial vaginosis, lactobacilli, and facultative bacteria in the vagina// Obstetr. Gynecology. 2002. Vol. 100. - № 4. - P. 765-772.

255. Nilsen T., Nes I. F., Holo H. An exported inducer peptide regulates bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC492// J. of Bacteriology. 1998.- № 180. - P. 1848-1854.

256. Nilsen T., Nes I. F. and Holo H. Enterolysin A, a cell wall-degrading bacteriocin from Enterococcus faecalis LMG 2333 // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - № 69. - P. 29752984.

257. Ocana VS, Nader-Macias ME Vaginal lactobacilli: self- and co-aggregating ability// Br J Biomed Sci. 2002. - Vol.59- №4. - P.l 83-90.

258. Ohashi T., Minamishima Y., Yokokura T., Mutai M. Induction of resistance in mice against murine cytomegalovirus by cellular components of Lactobacillus caseill. Biotherapy. 1989. - Vol. 1. - № 2.- P.89-95.

259. O'Keeffe T., Hill C. and Ross R. P. Characterization and heterologous expression of the genes encoding enterocin A production, immunity, and regulation in Enterococcus faecium DPC1146// Appl. Environ. Microbiol. 1999. - № 65. - P. 1506-1515.

260. Olivares M., Diaz-Ropero M.P., Sierra S., Lara-Viiilostada F., Fonolla J., Navas M., Rodriguez , Xaus J. Oral intake o£ Lactobacillus fermentum CECT5716 enhances the effects of influenza vaccination//Nutrition. 2007.- Vol. 23.- № 3.- P. 254-260.

261. Oscariz J.C., Pissabarro A.G. Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria//Int. Microbiol. 2001.- Vol. 4.- P. 13-19.

262. Otero M.C., Ocana V.S., Nader-Macias M.E. Bacterial surface characteristics applied to selection of probiotic microorganisms// Methods Mol. Biol. 2004.- Vol.268.- P.435 -440.

263. Parish M. E. and Davidson P. M. Methods for evaluation// Antimicrobials in Foods/ 2nd edition, ed.: Davidson P.M., Branen A.L., Mareel Dekker Inc., New York, 1993. P. 597-615.

264. Perdigon G., Vintini E., Medina M., Medici M. Study of the possible mechanisms involved in the mucosal immune system activation by Lactic Acid Bacteria// J. Dairy Sci. -1999.-Vol. 82.-P.l 108-1114.

265. Perdigon G., Fuller R., Ray a R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system// Curr. Issues Intest. Microbiol. 2001. - Vol. 2. - №1. - P. 27-42.

266. Perdigon G., Madonado G. C., Vinderola C.G., de Moreno A., Medici M., Bibas Bonet M.E. Immunomodulation of mucosal immune response by probiotics// Curr.Trends Immunol. 2005.- № 6,- P. 69-85.

267. Podolak R. K., Zays Z. E., Kastner C. L. and Fung D. Y. C. Inhibition of Listeria monocytogenes and Escherichia coli 0157:H7 on beef by application of organic acids // Journal of Food Protection.- 1996. № 59. - P. 370-373.

268. Prescott S., Björksten B. Probiotics for the prevention or treatment of allergic diseases// Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2009. - Vol. 120, Issue 2. - P. 255-262.

269. Preter V., Raemen H., Cloetens L., Houben E., Rutgeerts, Verbeke K. Effect of dietary intervention with different pre- and probiotics on intestinal bacterial enzyme activities// Eur. J. Clin.Nutr. 2007. - Vol. 10. - P.1038-1046.

270. Rambaud J.- C., Buts J.-P., Corthier G., Flourie B. Gut microflora Digestive physiology and pathology, 2006/ John Libbey Eurotex, Paris 247 p.

271. Rasch M. and Knöchel S. Variations in tolerance of Listeria monocytogenes to nisin, pediocin PA-1 and bavaricin A// Lett Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 27. - P. 275-278.

272. Ravin H.A. An improved colorimetric enzymatic assay for caeruloplasmin// J. Lab. Clin. Med. 1961.- Vol. 58,- P. 161-168.

273. Reid G., Tieszer C., Lam D. Influence of Lactobacilli on the adhesion of Staphylococcus aureus and Candida albicans to fibers and epithelial cells// J.Ind.Microbiol.-1995.- Vol.15. №3. - P. 248-53.

274. Reid G., Bruce A.W. Urogenital infections in women: can probiotics help?//. Postgraduate Medical Journal. 2003.-Vol.79. - №34. - P. 428-432.

275. Reid G. Probiotic Lactobacilli for urogenital health in women// J Clin Gastroenterol. -2008.- Vol.42., Suppl 3, Pt 2. P. 234-236.

276. Richardson D. Probiotics and product innovation// Nutr. Food Sci. 1996. -№ 4. -P. 27-33.

277. Rinne M., Kalliomaki M., Arylommi H., Salmines S., Isolauri E. Effect of probiotics and breastfelling on the Lactobacillus/ Enterococcus microbiota and humoral immune responses/ J. Pediatr. 2005,- Vol. 147.- №2,- P. 143-146.

278. Risoen P.A. Brurberg M.V.B., Eijsink V.G, Nes I.F. Functional analysis of promoters involved in quorum sensing-based regulation of bacteriocin production in Lactobacillus!! Mol.Microbiol.- 2000.- Vol. 37.- P. 619-628

279. Rolfe R.D. Interactions among microorganisms of the indigenous intestinal flora and their influence on the host// Rev Infect Dis. 1984.-Vol.6.- Suppl 1.- P.73-79.

280. Rosenthal K.S., Killius J., Hodnichak C.M., Venetta T.M., Gyurgyik L., Janiga K. Mild acidic pH inhibition of the major pathway of herpes simplex virus entry into HEp-2 cells// J. Gen. Virol. 1989. - Vol.70. - №4. -P. 857-867.

281. Roy P. H. Dissemination of antibiotic resistance// Med. Sci. 1997,- Vol. 13,- P. 927933.

282. Saarela M., Crittenden L., Salminen S., Mattila-Sandholm T. Gut bacteria and Health foods-the European perspective// International J. Food Microbiology. 2002. - Vol.78. - P. 99-117.

283. Sakayori Y, Muramatsu M, Hanada S, Kamagata Y, Kawamoto S, Shima J. Characterization of Enterococcus faecium mutants resistant to mundticin KS, a class Ila bacteriocin // Microbiology. 2003,- Vol.149.- № 10,- P. 2901-2918.

284. Sambrook J. Fritsch F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual// Gold Spring Harbor Laboratory Press/ 2 Ed., 1989. Vol. 2. - P. 1418-1419.

285. Sarous S., Dalet K., Hechard Y. Involvement of the mpo operon in resistance to class Ha bacteriocins in Listeria monocytogenes// FEMS Microbiology Letters. 2004.-Vol. 238, Issue 1.- №1,- P. 37-41.

286. Sessen T.E., Barkholt V., Welinder K.G. A simple alternative pathway for hemolytic assay of human complement component C3 using methylamine-treated plasma// J. Immunol. Methods. 1983. - Vol. 60. - № 1-2. - P. 89-100.

287. Shagger H., von Jagow G. Tricine dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa// Analytical biochemistry. -1987.-Vol. 166.-P. 368-379.

288. Shima J., Kawamoto S., Mori K., Choi S. H., Doi K., Ohmomo S., Ogata S. Isolation and characterization of enterocin SE-K4 produced by thermophilic enterococci. Enterococcus faecalis K-4// Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. - Vol. 65. - P. 247-253.

289. Silva C. R., Rey M.R., Nader-Maclas M.E. Structural and ultrastructural studies of the urinary tract of mice inoculated with Lactobacillus fermentum// BJU International. 2003.-Vol. 91, Issue 9. - P. 878-886.

290. Singh K. V., Qin X., Weinstock G. M., Murray B. E. Generation and testing of mutants of Enterococcus faecaliy in a mouse peritonitis model// J. Infect. Dis. 1998. -Vol.178.-P.1416-1420.

291. Sonneburg J.L., Chen C.T.L., Gordon J.I Genomic and metabolic Studies of the impact of probiotics on a model gut symbiont and host// PLoSBiology. 2006. - Vol. 4. -Issue 12. - P. 2213-2226.

292. Strompfova V., Laukova A., Ouvehand A. Lactobacilli and enterococci potential probiotics for dogs// Folia microbiol. - 2004. - Vol.49. - P. 2003-2007.

293. Strompfova V., Laukova A., Simonova M., Marcinakova M. Occurrence of the structural enterocin A, P, B, L50B genes in enterococci of different originII Vet Microbiol. -2008. Vol. 132. - №.3-4. -P. 293-301.

294. Tannock G. W. Normal microbiota of the gastrointestinal tract of rodents. In Mackie R. I., White B. A., Isaacson R. E., ed.: Gastrointestinal microbiology. Chapman and Hall, London, United Kingdom, 1997. P. 187-215.

295. Tarnberg M., Jakobsson T., Jonasson J., Forsum U. Identification of randomly selected colonies of lactobacilli from normal vaginal fluid by pyrosequencing of the 16 SrDNA variable VI and V3 regions//APMIS. 2002. -Vol 110. - P. 802-810.

296. Taylor-Robinson D., Bebear C. Antibiotic susceptibilities of Mycoplasmas and treatment of micoplasmal infection// Jornal of Antimicrobial Chemotherapy. -1997. Vol. 40.-№5.-P. 622-630.

297. Tichaczek P.S.,Vogel R. F., Hammes W.P. Cloning and sequencing of cur A encoding curvacin A, the bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus LTH1174//Archives of Microbiology .- 1993,- Vol. 160. №4. - P. 279-283.

298. Tlaskalova-Hogenova H., Tuckova L., Mestecky J. , Kolinska J., Rossmann P., Stepankova R., Kozakova H., Hudcovic T., Hrncir T., L. Frolova M. Kverka Interaction of

299. Mucosal Microbiota with the Innate Immune System// Scandinavian Journal of Immunology. 2005. - Vol. 62, Issue sl.-P.106-113.

300. Traub W. H., Leonhaid B. Comparative susceptibility of clinical group A, B, C, F, and G beta-hemolytic streptococcal isolates to 24 antimicrobial drugs// Chemotherapy.- 1997. -№43. -P. 10-20.

301. Vaughan E.E., Daly C., Fitzgerald G.F. Identification and characterization of helveticin V-1829, a bacteriocin produced by Lactobacillus helveticus 1829// J. Appl. Bacteriol. .1992. - Vol. 73. - №4,- P. 299-308.

302. Vielfort K., Sjolinder H., Roos S., Jonsson H., Aro H. Adherence of clinically isolated lactobacilli to human cervical cells in competition with Neisseria gonorr hoeae/l Microbes and Infection. 2008. - Vol. 10, Issues 12-13 .- P. 1325-1334.

303. Vinderola G., Perdigon G., Duarte J., Farnoworth E., Matar C. Effect of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity// Cytokine.- 2006. Vol. 36,- № 5-6.- P. 254-260.

304. Venema K., Haverkort R.E., Abee T., Haandrikman A.J., Leenhouts K.J., de Leij L., Venema G., Kok J. Mode of action of LciA, the lactococcin A immunity protein// Mol. Microbiol. 1994. - Vol. 14. - №3. - P.521-532.

305. Vuist L., Neysens P. The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions// Trends in food Science technology. -2005. Vol. 16., Issue 1-3:43-56.

306. Wachsman M.V., Farias M.E., Takeda E., Sesma F., de Ruiz Holgado A.P., de Torres R.A., Coto C.E.Antiviral activity of enterocin CRL35 aginst herpesviruses// J. Antimicrobial agents . 1999.- Vol. 12,- P. 293-299.

307. Wachsman M.B., Castilla V., Holgado A.P., Torres R.A., Sesma F„ Coto C.E. Enterocin CRL35 inhibits late stages of HSV-1 and HSV-2 replication// Antiviral Res. -2003.- Vol. 58.-№1.- P. 17-24:

308. Wagner R.D., Pierson C., Wagner T., Dohnalek M., Farmer J, Roberts L., Y. M. , Balish E. Biotherapeutic effects of probiotic bacteria on candidosis in immunodeficient mice// Infectlmmun. 1997. - Vol. 65. -№10. - P.4165-4172.

309. Wang S., Mei Ng L.H., Chow W.L., Lee Y.K. Infant intestinal Enterococcus faecalis down-regulates inflammatory responses in human intestine al cell lines//World J. Gastroenterology, 2008. Vol. 14. - № 7. - P. 1067-1076.

310. Woolfolk C. A. Metabolism of N-methylpurines by a Pseudomonas putida strain isolated by enrichment on caffeine as the sole source of carbon and nitrogen// J. Bacteriology, 1975. -№ 123.-P. 1088-1106.

311. Yang R., Ray B. Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria II Ibid. 1994. - № 4. - P. 281-291.

312. Yi H., Zhang, L., Tuo Y., Han X., Du M. A novel method for rapid detection of class Ha bacteriocin-producing lactic acid bacteria//Access Online Article Food Control/ Press, Corrected Proof, Available online. 9 July 2009.

313. Young G., Krasner R.I., Yudkofski P.L. Interaction of oral strains of Candida and Lactobacilli//J. Bacteriol. 1956. - Vol. 72. -№36. - P.525-529.

314. Zarate G., Santos V., Nader-Macias M.E. Protective Effect of Vaginal Lactobacillus paracasei CRL 1289 against Urogenital Infection Produced by Staphylococcus aureus m a Mouse Animal Model// Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 2007,- 48358

315. Zhong W., Millsar K., Bialkowska H., Reid G Differentiation of Lactobacilli species by molecular typing//Appl. Environm.microbiol. 1998. - Vol 64. - №7. - P. 2418-2423.

316. Zhou Z.-H., Tzioufas A.G., Notkins A.L. Properties and function of polyreactivc antibodies and polyreactive antigen-binding B cells// J. Autoimmun. 2007. - Vol. 29.-№ 4. - P. 219-228.

Информация о работе

Ермоленко, Елена Игоревна
доктора медицинских наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы