Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотидгидролизующие экто-ферменты мембран легких и эндотелия: свойства, влияние на активность аденилатциклазы и агрегацию тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нуклеотидгидролизующие экто-ферменты мембран легких и эндотелия: свойства, влияние на активность аденилатциклазы и агрегацию тромбоцитов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ГЕ РАС И МО В С КАЯ (НЮПЕНКО)

Евгения Валерьевна

НУК«Л ЕОТИДГИДРОЛ ИЗУЮЩИ Е ЭКЮ-ФЕРМЕНТЫ МЕМБРАН ЛЕГКИХ

СВОЙСТВА, ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ'И АГРЕГАЦИЮ

И ЭНДОТЕЛИЯ:

ТРОМБОЦИТОВ

03.00.04— Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра Российской Академии Медицинских наук.

Научный руководитель Кандидат биологических наук М. П. Панченко.

Научный консультант доктор биологических наук В. А. Ткачук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О. И. Писаренко, кандидат медицинских наук Л. Б. Буравкова.

Ведущая организация — Институт биохимии имени А. Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится . 1994 г.

в « . » часов на заседании специализированного ученого совета в Кардиологическом научном центре Российской Академии медицинских наук по адресу: 125252, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией лгжно ознакомиться в библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан « ... . . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических на^

<л. И, Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальности проблемы..

Адениловые нуклготиды и аденозин участвуют в таких важных биологических процессах как передача нервного икпульса, поддериа ив гемостаза и троибогенеза, иммуномодуляция, изменение мвкбранной проницаемости, регуляция деятельности сердечнососудистой системы. Эффекты адениловых нуклеотидов в тканях-ьп:ыенях осуществляются чзраз два типа пуринергических рецепторов -Pj и За последнее время значительно расширились представления

о лягандаи и зффекторных системах, сопряяанньге с пурйие'ргическими рецепторами (Нз11е\'э1 and Pearson, 1987).

Ключевая роль в регуляции продолжительности и амплитуды внешних сигналов аденнлагих нухластидОЕ я эяенознна на кя'втки-ммшенк принадлежит ферментам, Ka'ÂaaFSHMCK на внешней стороне плазматической мембраны клетки и гидролизующим адёнИЛОИ^е нуклеотида, а такае системам транспорта адениловых нуклеотидов й аденоэина через плазматическую мембрану.

Ряд патологических процессов вызывает изменение баланса внеклеточных и внутриклеточных аевниловых нуклеотидов, что приводит к нарушению сосудистого гоиеостаза. Прелполагавтся, что изменение активности куклеотидгидрслизуюиих экто-фзрментоа клеток крови к сосудов мокет являться яатологич-jckoii основой ряда забопевйний .

Активное."!, чуклоотлдгидролпзуишик зкто-фермь'нтив обнаружена s различим« типа* кпйток и тканой млекопитающих, однако наиболее г:>].:шс«й уроил-ь дцрной активности выявлен "s клеткач сосуло» [Lin.

Gordon et a!, i»36; Haalyr. et al, 1983; Cnie 31 al, 1991: 4-r, • s: ai , !1 Pi dur et si, 1993].

Наличие и'стчг.гилролизукемх экго-фериептон необходимо

принимать ао ~инимсняо при иссл8доаании различных АТР-зависимы* «î>?l>,trv.>9. Тз». Kilt-îfl , ЙНИ.ИП ДЗчШвХ литерттурм nOKSSSS, что r.C'i::/тстаив s h i t фпр»;енто s, гидролнэ^княих адзниловм*

н^клеотнды, не учитывалось при измерении активно*!« вденилатииклазы (АС) легких - т»анц, е крайне высоким содержанием кровеносных сосудов. Гидролиз АТР ДО AMP под деис1виеы легочных ».зг.Срзч чригсг.ня - сн!»г.5нию урзчня субстр»!.; ад«ии.-:атцнклаз1'0!! рчакиин, я о-з зулв^а г* чего ¡<ез;го снижалась активность АС з стачаар-иой' инкубационной ерзг?. содержащей в качестве АI И—

регенерирующей системы креатинкинаэу и креатикфосфат.

С другой стороны, при изучении особенностей АС легки* некоторми авторами (шло обнаружено, что . исходно низкая активность фермента существенно возрастает при, добавлении цитозоля (Nijjar et al, 1988; Romano and Molinoff, l^.Kfij. На основании этого возникла теория об особом строении аденилатциклазного комплекса в клетках легких, предусматривающая, что, гюмимо интегральных мембранных белков (рецепторов, ОТР-связывдюших белков и каталитической субъединицы АС) этот комплекс содержит регуляторный белок, легко диссоциирующий из мембраны. К цачалу выполнения настоящей работы природа Так называемого "цитозольного активатора" АС и механизм его активирующего дэйствия оставались не установленными. Дао* работа.

Целью настоящей работы было установление природы растворимого фактора, активирующего аденилатциклазу в легких, выяснение функциональных к регуляторных особенностей ферментов, участвующих в превращениях адениловых нуклеотидов в мегл ран.чой и цитозольной фракции легких и эндотелия.

S работе были поставлены следующие задачи: 1) выделить в гомогенном состоянии и установить природу цитозольных факторов, активирующих АС мембран легких; 2) . охарактеризовать процессы деградации АТР мембранами легких и эндотелия; 3) исследовать влияние гипоксии на гидролиз АТР и ADP в мзхбранах эндотелиальных клеток; 4) исследовать возможное участие нуклеотидгидролизуощих экто-ферментов эндотелиальных клеток в регуляции агрегации тромбоцитов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлена природа "цитозольного активатора" адеиилатццклазы мембран легких. Полученные данные позволяют скорректировать методы измерения активности аденилатциклазы из ряда источников, обращал особое внимание на ткани с высоким содержанием кровеносных сосудов. В мембранах легких и эндотелия показана и охарактеризована высокая АТР-гидолизующая активность. Установлено, что

нуклеотидгидролизуюиие экто-фер.мэнты (экто-ЛТРаза и зкто-АОРаза) участвуют в модуляции агрегационного ответа тромбоцитов на ADP. Активность данных ферментов регулируется хронической гипоксией, что может указывать на их возможное участие в патогенезе ишемических заболеваний, сопровождающихся повышенным уровнем

активации тромбоцитов и/или гипоксией.

Апро0аиия работы. Результаты работы были представлены на

Меядународном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Мехдународной конференции (Сан Францискп, Калифорния, 1993)

Публикации. По теме диссертации опубликовано работ Сщцущгва И объем ца&ЩЦ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, аыводов и списка цитируемой литературы ( ссылок). Работа

изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована

рисунками и таблицами.'

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Вмпялениа плачмятческих мембран И ШШШ1ЛЯ 112 гомогоната ^агкиц цроликд и свиньц проводили как описано в работе [ТкасЬик е( а 1, 1989].

Очистку активаторов аденилатциклазы проводили из цитозольной фракции легких кролика (235 ООО х. % супернатант) Процесс очистки

состоял из четырех стадий и заключался » ионообменной хроматографии цитозольной фракции на ОЕАЕ-трисакриле, СМ-Сефарозе, гель-фильтраты на 1И:ю^е1 АсА 44 и гидрофобной ч-роматографии на РЬепу1-сефаро¡э. Чистоту и молекулярный вес полученных препаратов определяли методом 505~зпектрофореза в полиакрнл,1мидном геле по методу !.аеим1), 1970.

а юиишишшшш&й. жоахалиэ-льамх клеток из пупочной вены, легочной артерии и аорты проводили путем ферментативной обработки сосудов протеиназаии, как описано ран.ее [ЬШе ег а 1, 1973; Ап<опоу а1 а1, 1986; Уоупо-Уавепет5кауа е1 а1, 1989) с нел/ачнтвльчьыи кодификациями. Принадлежность культуры х сцсудистоку эндотелии проверяли, используя антитела против фактора фо|н Виллебрандта (VIII фактора) и по присутствию телец Вейбеля-Па!лладе [АпЮпоу е1 а!, 19861.

УййСтшШ! Фхишш» шдихгдиа получали как описано в работе (Паиченко с соизт., ¡993) нз конфликтного монослоя зкдотелкальны* клеток 2-6 пассажа.

ЙШ2£Л£ййШ18 ¡иШШШОЙ Мйдилаиаишды проводили а среди (об »¿и 50 ы.сд), содержащей 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5 при 37°С),'1 мМ сАМР, И)

мМ креатинфосфат, 0,25 мг/мл креатинкиказу, 0,5 мМ З-изобутил-1-метилксантин, 5 мМ MgCl^, 1мМ ДТТ, 0,1 мМ АТР, 1-2 мк(Л [а-^2Р]АТР и 10-15 мг мембранного белка. Аденилаткиказу (0.1 мк/ыл), форсколин (10 ~4М), GTPyS (10~4М), GDP0S (10~4М), гормоны к другие добавки вносили до указанных конечных концентраций. Образовавшийся сАМР определяли по методу White [White, 1974] на колонках с окисью алюминия.

Определение ¿ктивности адеиилзтхчкаэы проводили

спектрофотометрически по изменению поглоисния МАШ в системе сопрязенных реакций как описано в работе [ Hupenko et al, 1991]. С>рр.ед.ед£н.и£ АЦЬдаградирукжай шшашг^щ шайвая проводили спектрофотометрически как описано в работе [ Васильева с согвт., 1989] и тонкослойной хроматографией на РЕ!-целлюлозе как описано в работе [Nupenko et al, 1991].

Моделирований гипакски на культуре энт?диай1ггша иле то к

Клетки в 12-ячеечнмх плашках помешали з пластиковую камеру (Flow Laboratories). Камеру продували в течение 10 мин азотом, закрывали и помещали на 37°С. Зкi телиаг.ъг.ые клетки, культивированные б условиях хронической гипоксии (3% О2, 1-2 месяца), были любезно предоставлены i.Brody. jfccflggobatws вликния зНдогйлия на. агрехактэ

тромбоцитов. Агрегациониые ответы тромбоцитов определяли по изменению радиусов агрегатов как бьйо описано ранеа (Габасов и соавт., 1989; Yurenev et al, 1992].

Суспензии контрольных и культивированных s условиях хронической гипоксии (1 месяц, 3% Oj) зидотелиальных клеток (6-3 х 104 кл/мл) инкубировали в 50 мкл среды, содержащей 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5, 37°С), 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотрейтсл (ДТТ), 10 мкМ индометацин, 10 мкМ АТР или 10 мкМ А0Р. Прсбы инкубировали 15 мин при 37®С, реакцию останавливали перенесением проб на лед и центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об/мчн, +4°С, . (Microfuge 12, Backman). Супернатанты отбирали и использовали в качестве индукторов агрегации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование активации аденилатциклазы меибран легких цитозолем В таблице 1 представлены данные об активности и регуляторннк свойствах мембранной АС в отсутствие и в присутствии цитозольнлй фракции. Как видно из таблицы, АС мембран логких облапает низкой

удельной активностью, но чувствительна к активирующему действию изопротеренола, бТР^, форсколина. и к ингибируюиему действию

ОПР/З"?. Это указывает на функциональное сопряжение аденилатциклазы с С-белками и ыешраниши рецепторами. Добавление цитозоля иизьякэе* примерно в 10 раз как базальную, так и стимулированную ОХР,-?, форсгголинои мли смесью 0ТРу5 + форснолнн активности АС. ССРуБ не п£,?.г;ятгтвует способности цитозоля повышать активность АС.

Таблица 1. Влканыо гугниловых ну&леотг.дов, изопротеренола, форссолняг х цнтозолл лзгкиз на а;ггивкооть одскнлстцмклязы

яагочиб'Е ::з::браЕ;.

Активность АС Добавки (>00 мкМ) пиоль сАМР/мин без цитозоля на кг белка с цитозолем

без поб-.£ок 0,4310,01 3,9210,12

Нзопротеренол 0,64*0,02 5,9310,24

СОРЗЗ 0,30*0,08 3,1310,25

СОР0& + нзопротеренол 0,31*0,06 3,1010,33

йТРтХ 2,7210,18 28,7210,10

ОТРуЗ -г кзопротяренол 5,44±0, 14 58,1910,23

Форсколкн 3,6710,71 37.5610,31

СОР^Б + фогсколин З.бОгО, 14 26,9011,72

ОТГагЗ + фор-иолан 5,51*0,24 66,2312,40

Лктиеиру!ьл:1й зс|;ф£цитозоля на АС легких не язляется гканеспгцифичныы. Спсссбиостыо повьшать активность АС мембран мгкпд обладил»: гак-иг цнтозоли, выделенные из сердца, головного мозга или печени кролика. Определение активности АС а мембранах данных щ-лнгЗ .юказалэ, что эта акт»рность значительно превышает активность ЛС з шпбрамьх легких и практически не изменяется при лрбавлз.чни цитозоля легких. Из эти* данных можно заключить, что различия 9 цнтозоль-зазисимой активации аденилатциклазы между легкими и другими тканями заключаются не в различии состава их цнтозолвй фракция, а различии плазматических меибрз'н .

Для того, чтобы падснить механизм активирующего действия читозплн [¡-л ^С мембран легких мы разработали метод выделений зкяогениого активатора АС из циюзочьной фракции легких,

Очистка и идентификация активатора АС из цитпзольной фракции легких

В процессе очистки активность цитозольного фактора определяли по его способности повышать сиснтез сАМР мембранной АС. Кроме того, фракции элюата тестировали на ОТР-связывающую активность. На рис.1 представлена хроматография цитозольной фракции легки* на ОЕАЕ-трисакриле. Как видно из рисунка, белки, активирующие АС, не связываются с аниокообменником и элюируктся в свободном рбьеме

колонки. Б данных фракциях выявляется не более 10%

32

[а- Р]0ТР-связывающей активности. Основная часть

[а- Р]0ТР-связывающей активности прочно связывается с матриксом и . элюируется линейным градиентом НаС1 (от 0 до 40С кМ) в виде двух хорошо разрешенных пиков: при 50-100 мМ №С1 и при 150-200 мМ МаС1. Таким образом, на данной стадии очистки происходит практически полное разделение эндогенного активатора АС и СТР-связывлоиих белков цитозоля.

Фракции 3-15 с ОЕАЕ-трисакрила, соде-чащие активатор АС наносили на колонку с СМ-сефарозой (рис. 2 А). Элюиия активатора аденилатциклазы с катионообменника происходит под действием линейного градиента МаС1 (от 0 до 200 мМ) при концентрации соли 40-60 мМ. Фракции, содержащие наибольшую по величине (е-^Р ]СТР-связывающую активность, совпадают с фракциями, содержащими максимальное количество активатора АС. Фракции 15-30 с СМ-сефарозы, содержащие активатор АС, концентрировали и наносили на колонку с Ultгogel АсА44 (рис. 2 Б). Активатор аденилатциклазы элюируется с матрикса в виде ассиметричного пика в объеме элюции, соответствующем объему элюции химотрипсиногена А с молекулярным весом 25 кйа. Таким образом, на стадии гель-фильтрации фракции, содержащие активатор АС, практически полностью отделяются от фракций, обладающих СТР-связывающей активностью. Фракции 15-23, содержащие активатор объединяли и подвергали гидрофобной хроматографии на колонке с РЬепу1-сефарозой (ркс. ЗА). Как видно из рисунка, около 5096 общей активности не связывается с матриксом (пик .1), а оставшаяся часть элюируется (пик 2) обратным линейным градиентом №С1 (400-0 мМ) при концентрации соли 300-250 мМ.

Чистоту и молекулярный вес полученных препаратов цитозольных активаторов АС определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Иа (рис. 3 Б). Согласно данным электрофореза активаторы мембранной АС представляют собой

0 16 25 35 48 ва ее ТЬ

и1?

'Л'

а*

Е4

«ч

:-гек€рыш -!• фр^гиупг г ВЕАЕ- Трисагфяда : 2 С 12 13 10 Я28ет^З!3333;г!,39"51«1',.8<га513363В9е45Э?3

Рис. 1. Л: Хроматография цитозольной фракции легких на 0ЕАЕ-

трисакриле. (---): поглопенив элоата при 279 нм; (о—

г.кти»ность циглаолосого активатор?. АС, пмель/мин мг белка мембран;

(о-----о): [ а- ? !0ТР-сзязмзамшая активность фракций элита, еря

О1 ь пробе; (- - -): концентрация ИаС1, Активность оитозольного фактора исследовали,' добавляя 20 мкл фракции элюата в определения активности ЛС (конечный объем 60 мкп) содермгазй 0,2 мМ АТР, ¡4 мкг белка легочных мембран, 100 мкМ (ТР-у5 и 100 чкМ форс:солин;

Б: Анализ АТР и продуктов гидролиза з среве определения активности АС методом тонкослойной хроматографии в отсутствие в присутствии фракций с ОЕАЕ-трисакрила. Аликвоты объемом 1 мкл из среды определения активности АС (рис.1А) наносили на пластину с РИ-целлюлозой и хроматографировали.

~ 70

и <

номера фракций 8 ?о 1Я го 25

О <

о

8

70

60

30

Б

0.3

о.г ¡г «

<

аз

о покера фракций о б м 15 го гз ао ез 4с

Рис.2. Очистка цитозольного активатора АС мембран легких на СМ-

сефарозе СЬ-бВ (А) и на АсА44 (Б). (------): поглощение

элюата при 279 нм; (о----о): активность эндс-^нпого активатора

АС, пмоль/мин мг белка мембран; («----в)^ [Р ]СТР-гвлзыьающая

активность фракций элюата, ерш 10 & пробе; (- - -): концентрация ЛаС1. Влияние фракций элюата на активность мембранной АС определяли тем же способом, что и на предыдущей стадии очистки.

Ü «9

4

S to 1S 20 SS 30 гз 40 4a ЯОКЛрЙ фр^ГЦКЗ

Б

ra» S7 ítDc

ci 4йШа »-ж! за 5¡Da

2Z. ыипа

•>•} Шэ ""* 'г Da

а б в

Рис.3. А: Очистма цитоэольного ястнаатора АС кембран легки* ка Fíiany i-сефарсзе CL-оЙ. ( поглошекис элгоат?. при

¿79 нм; (о-----о): актианость

эндогенного активатора АС, пмоль/мнн мг бел::а Мембран; (- - -): концентрация Ns.C¡.

С: SDS-электрофоре ¿ s полнакриламидном гэпс

иитозольиых активаторов пС. Линия а: 2 мкг очищенного цитозольнсго активатора АС с Phenyl ~с?фйрозы (фрг:;иии 1 пик:».: У-14); ли нил б: У "кг О'!яш»нкого скп'пгторг АС с Phehyl-сефароз-! (Фракции 2 i<í№« пчка: 21-27); линия' в; 20 мкг 6?.псов-с тан дар то в ( SDS-7,

DAL'iON MARK, £ ! ОМ,» ). ¿»краску гелей проводили серсОрим.

гомогенные белки с молекулярными массами соответственно 23 kDa и 29 kDa.

При хроматографии исходного цитозоля ра DEAE^-Трисакриле было замечено, что фракции, обладающие способностью активировать АС, обладали также способностью регенерировать АТР в „среде определения активности (рис. 2 5). Под действием иембраа легких происходит полный гидролиз АТР до AMP'. .

Ранее существовало предположение, что активирующий эффект цитозоля на АС мембран легких мояет быть обусло?лсп цитозольной адекил&ткнназной активностью [Romano and Uolinoff, ¡986]. В то же время, по данным других авторов, [Ofuiue and Nijjar, 1981; Whitsett at al, 1986} активирующий эффект цитозоля достигался без добавления аденилаткиназы » среду определения активности АС легких. Более того, добавление аденилаткиназы не приводило к активации АС, тогда как в этих яе условиях легочный цитозоль вызывал сильное активирующее действие на иембранку» AC. (Whitsett et ai, 1986]. Однако, как в этих, так и г других работах цитозольный активатор не был идентифицирован, « поэтому можно было предполагать, что . активирующий эффект цитозоля обусловлен содераанием в цитозоле фактора(ов), препятствующего гидролизу АТР до AMP в среде определения АС активности.

Очищенные до гомогенного состояния цктозольные активатора АС, представляют' собой белки с молекулярной массой 23 kDa и 29 kDa, которые обладают высокой аденилаткиназной, активностью (рис.4).

ПК + ЛДГ ПК + ДДГ ПК + лдг

2 НМЛ

Рис. 4. Определение активности аденилаткиназм в препарате коммерческой аденилаткиназы и б очищенных 23 кОа и 29 кОа цитозольных активаторах АС. Конечная концентрация

диаденозинпентафосфата составляла 50 мкМ.

Данная активность составляет около 70 мкмоль АОР/мин мг белка и прлно^ьи. подавляется специфическим ингибитором аденилаткиназы диадгнозинпентафосфатом (ДАПФ). Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что содержащиеся в цитозолс легких 23 кРа и 29 кОа белки, активирующие мембранную АС, по физико-хпкическим свойствам, удельной активности и чувствительности к диаденозинпентафосфату идентичны

аденклаткиназе.

Для того чтобы исключить зозможпое участие других цитозольных факторов в активации АС, мы сравнили активирующий эффект еыделснкыг нами 23 !;0а и 29 кОа белков с эффектом исходного цитозоля, а также с эффектом коммерческой аденилаткиназы (Табл..2) Оказалось, что феноменология актиаирующегр дейстни'л 23 кОа и 29 кЭа белков на мембранную АС легких не отличалась от таковой для цитозоля или коммерческой адгкилаткиназы. При этом активирующее действие 23 кОа и -29 кОа белков • исчезает в среде, содержащей коммерческую аденилаткиназу.

Таблкца 2 Действие цитозоля легких, экзогенной здеиилаткиназы (АК) и очиаешых из цитозольпой фракции легких 23 кОа и 29 кОа белкой ка гстизность зденилатцикяазн кеибрак легких. Среда определения актниност:: АС издергала 13 икг белка легочных мембран и, где указано, 112 мкг белка цитозоля, 2,5 ккг экзогенной аденилаткиназы, 1 икг 23 кВа белка и 1 икг 29 кОа белка.

Активность АС, пмолв сАМР/мип на мг белка

без +цитозоль + АК +23 к0.1 +29 кОа

добавок белок белок

- АК 10,1x0.4 101±9,0 И 5±7, 1 108t6.2 114±7,0

+ АК 118±9,0 120±10,1 111±8,5 • 123* 13,0 117*4, 1

Таким обратом, мы выделили и установили природу цитозольного активатора АС ьеибран легких. Оказалось, что аденилатциклаза мембран легких не имеет никаких особенностей по сравнению с аденилагциклазой других тканей. Отличительной особенностью легких являетсл наличие в мембранах легких высокой АТР-гидролидуюшей активности. Наличие данной активности приводит к тому, что при

определении активности АС в условиях in vitro на препарате плазматических мембран, представляющего собой преимуиественно не замкнутые в везикулы фрагменты плазматической мембраны, субстрат аденилатцикл^зы АТР под действием мембран легких подвергается деградации до AMP. Это делает невозможным регенерацию АТР за счет креатинкиназы и креатинфосфата, в результате чего в стандартной среде инкубации выявляется занийекная активность АС мембран легких.

Идея существования растворимого белкового активатора АС в легких возникла вследствие того, что исследователи этого фермента не учитывали особенностей легочной ткани, заключающейся о быстром , гидролизе АТР до AMP, не вносили в инкубационную среду аденилаткиназу, регенерирующую AMP до ADP, что позволило бы креатинфосфат-креатинкиназной системе поддерживать постоянную концентрацию АТР, субстрата АС.

Изучение особенностей нуклсотидгидролизувисй актизкЭсти

плазматических мембран легких и эндотелия

Изложенные выше результаты свидетельствуют о том, что АС легких не отличается от АС других тканей: имеет обычную удельную активность, регулируется гормонами и гуаниловыми нуклеотидами и нб нуждается в неком цитозольном "активаторе". Отличными оказались мембраны, выделенные из легочной ткани - они необычайно быстро гидролизуют АТР, и для поддержания постоянной концентрации этого нуклеотида необходимо добавление как креатинфосфаг-креатинкиназы, так и аденилаткинаэы. Возник вопрос о природе этой АТР-деградируюшей активности в мембранах легких и возможном' физиологическом значении этого фермента или ферментов в /íes'««*. Поиску ответов на этот вопрос была посвящена дальнейшая работа, проведенная как на легких, так и ка трех, типах ялеток -эндотелиальн ых, гладкомышечных и эпителиальных, представляющих основную часть легочной ткани,

В отсутствие АТР-рсгенерируюшей системы аденилозые нуклеотиды:

ADP, АОРэБ, AppNHp, или AMP в конечной концентрации 1ыМ замедляют

32

начальную скорость деградации [с- Р]АТР и изменяют соотношений между продуктами гидролиза - {ос-^'Р JADP и [ ¡AMP. Кроме того,

внесение аяениловых нуклеотидов и их аналогов приводит к явному обнаружению промежуточного продукта гидролиза {«-^"Р ]АТР |a-32P]ADP (рис.5, линии 1-6). Неорганический фосфат (P¡, 20 мМ) и пирофосфат (PP¡, 20 мМ) практически не влияют на скорость деградации АТР (линии 7-8).

со

«а. о. а.

а ~

<

1 I 3 г

AiWP ADP ■

® у

I

1

I | I |

-

><i i»»« wb н -if-»0 .<* st i

Рис.5. Влияние аяениловых нуклеотидов, фосфата . и лирофосфата на гидролиз £ а- р ]АТР мембранами

легких. Среда инкубации содержала 10 мкг мембранного белка, 0.2 мМ ATP, 1 мкСi [ а- Р ]АТР, 1 мМ указанных нуклеотидов, 20 мМ Pj или 20

PPj. Пробы инкубировали 5 мин, по окончании инкубации аликвоты объемом 1' мкл наосили на PEi-целлюлозу и хрикатографировали. I Распределение радиактивности в пятнах ( в %) рассчитывали, принимая за 100% радиактивнорть в • иг"-'одном пятне [с- Р]АТР.

Использование в качестве субстратов реакции ADP и кегицролизуемого по (З-у фосфорильной связи, (но не по a-jS фосфорильиой ' связи) аналога АГР - AppNHp показало, что добавленный к мембранам легких ADP (1 мМ) быстро гидролизуется с образованием AMP, тогда как AppNHp (1 мМ) деградации до AMP.под дейстзием ««дмбран легких не подвергается.

Суммируя полученные дание можно заключить, что под действием мембран г.ггких гидролиз АТР до AMP идет через образование ADP пугем поел?товательного отмелления терминального 40СФата согласно

ATP--->ADF---->АМР, а не за счет отщепления пирофосфата от

- 32

АТР. Обнаружен;??. промежуточного продукта - [а- Р JADP в пользу

того, что в гидролизе АТР до AMP ■ участвуют, либо два фермента

(ЛТРаза и АОРаза), либо фермент, гидролизующий как АТР, так и ADP.

Выявленная исходно в ь-ембранах гомогената легких АТР--->АМР

гидролизующая активность была также обнаружена в других типах легочных сосудистых «леток. !'ак нмдко из рис. 6, данная активност-, ¿ыяеляется во всех типах сосудистых клеток: эндотелии легочной артерии, аорты и, я меньшей степени, в эндотелии пупочной вены и гладкемышечных клетках аорты. В то *е время, АТР-гмдролизующая активность не выявляется в альвеолоцитах эп'^телигльиых клетках легких, ответственных за синтез и секрецию «урфактанта. ¡"¿ким образом, высокая АТР-гидролизующря активность 8 легких ¡может на являться особенностью истинно легочных клеток

-легкйё

¿львеэАодйт^ П порядка ¿¡¡¡) ёйДотелйЙ ttytid>taoii вены

эндотелий Легочной артерии

■ .V««

•<яв»'

. /ф эндотелий аорты .-^fc-i'jf гладкомьшкечныс кяехш

V I f

ATP ADP AMP

Рис.6. [<x-32P]ATP- гидролизующая активность в мембрана* клеток легких и сосудов.

(альвеолоцитов), а быть особенностью клеток, формирующих сосуды. Известно, что более половины всего сосудистого эндотелия приходится на эдотелий легочных сосудов. Из этого следует, что высокая АГР-гидролизующая активность в мембранах легких моает отражать высокое содержание кровеносных сосудов в ланкой ткани.

Эксперименты с применением порообразуюшего антибиотика аламетицина на интактном моноглое эндотелиальиых . клеток свидетельствуют б пользу того, что "АТР-деградируюмие" столь характерные для сосудистых клеток, являются экто-ферментамн, то есть имеют активный центр на внешней стороне плазматической мембраны клатки. Добавление аламетицина создает проницаемость плазматической мембраны для АТР. Обработка интактнсго монослоя, эндотелия пупочной вены человека 5-50 мкг аламетицина, как видно из табл.3, приводит к увеличению гидролиза АТР но более, чем па 12%. Незначительное увеличение гидролиза АТР энл^гслиальными клетками может объясняться вкладом внутриклеточных АТРаз и выходом образовавшегося продукта гидролиза ADP в инкубацнопнуо среду при нарушении целостности плазматической мембраны.

■ ■ 32

Таблица 3 . Влияние алакетицина на гидролиз [ а- Р ]АТР монрслоем зндотелкальных клеток пупочной вены.

аламетицин, мкг/мл ATP : ADP : AMP, %

- 65 15 20

5 62 17 2)

20 56 21 23

50 53 24 23

Для характеристики АТР-гидролизующей активности лег очных мекбран был использован ряд различных агентов (Таб/1.4). Из данных таблицы видно, что нуклеотидтрифосфаты, а Такие нуклеотиддифосфатм тормозят гидролиз ATP. АТР-"деградирующая" активность не чувстзительна к ингибиторам известных ионных транспортных АТРаз -олкгомицину (ингибитору Н+-АТРазы) и уабаину (ингибитору Na+-FT АТРазы), что указывает на отличие свойств экто-АТРазы мембран легких от свойств вышеуказанных мембранных АТРаз. АТР-

Таблица 4. Действие различных агентов на АТР-гидролизупшуп активность мембран эндотелия легочной артерии

добавки АТРазная активность, %

- 100

СТР ( 1 кМ) 48

GIF, UTP (1 мМ ) 57

1ТГ (1 мМ) 62

ADF (1 мМ) 25

TDP, UDP, GDP (1 мМ) 54

олигомицин (50 мкг/мл) 100

уабаин (2 мМ) 98

окадилат (100 мкг/мл) 100

NaF (20 мМ) 66

Chaps (0,1%) 46

Lubro! (0,1«) 7

NaCI (100 мМ) 95

гидролизующая активность нечувствительна к ингибитору неспецифической фосфатазной активности - ' окадилату, но частично ичгибируется под действием NaF. Неионные детергенты Chaps и особенно Lubfol РХ обладают выраженным ингибйрукмцим эффектом, что указывает на то, что исследуемый фермент является мембранным белком. - ,

Кинетические параметры АТР-азной и ADP-азной реакций, измеренные на мембранах легких «пектрофотокетрическим методом составили: Кт(АТру= 90 мкМ; VBax,(ATP)« 172 гжоль/мин мг белка;

Km(ADP)*° 40 мкМ; Vmax(ADP)a 33 нмоль/мии мг ^елка. На конослов культивированных эндотелиальных 'клеток соответствующие значения t кинетических параметров составили: 660 нкМ;

134 нмоль/мин мг белка; ^¿Dp)" 200 мкМ; Д|,р 9 нмоль/мин

мг белка.

Влияние гипоксии на активность нуклеотидгидролкзуванг фэриентов

эндотелия и эндотелий-зависамув агрегаций тромбоцитов.

Из вышеприведенных данных следует, что значении Кш для обеих реакций лежат в диапазоне 10~^-10-4М. Известно, что такой величины концентрация адениловых нуклеотидов достигается в крови при травматическом повреждении тканей, инфаркте, гипоксии и, возможно, некоторых других патологиях. Следовательно, осли при этих состояниях происходит, изменение концентраций адениловых нуклеотидов, что сопровождается выраженными муринергическими эффектами, то можно было оямдйть и изменения нуклеотидгидролизуюдих ферментов, от активности которые зависят внеклеточные концентрации адениловых 'нуклеотидоь. Нами было исследовано влияние кратковременной и хронической гипоксии на активность нуклеотидгидролиэующих ферментов эндотелия легочной артерии. Воздействие 2-х часовой гипоксии, как видно из рис.7, не влияет на скорость гидролиза АТР эндотелием. Под действием острой хронической гипоксии (3% Oj, 1-2 мес.) происходит тсрмоаение каг АОРазной, так и АТРазной стадии гидролиза АТР. Наблюдаемый эффект может объясняться как изменением количеств:

нуклеотидгидролизующих ферментов, так и изменениьм и) каталитической активности.

Полученные результаты указывают на возможный мехакиз! повышения уровня ADP в циркуляторном русле при гипоксии, что може сказываться, в частности на степени активации тромбоцитов, модельных экспериментах было показано влияние экто-ЛТРазы

J6

AMP ADP ATP

AMP

ADP atp

i 2

2 3

Рис . 7. Влияние кратковременной и хронической гипоксии на АТР-гидролизукмаую -активность эндотглиальных клеток. А:Мализ продуктовЁ гидролиза [а- Р ]АТР монослоем нормальных эндотелиальных клеток' 1) -л клеток, ин;:у6ирозанных Ъ условия" острой ^¡оксия з течение -х часов (2). Б: дн&лиз продуктов гидролиза [о.- Р ]АТР суспензией нормальных эндотелиальных клеток (1) и клеток, культивированных в условиях хронической гипоксии (1 и 2 месяца, 3% О2 ) соответственно

(2) и (3).

зкто-АОРазы эндотелия на агрегацию торомбоцитов. "Добавление к обогащенной тромбоцитами п..азме 0,5 мкМ ADP приводит к развитию агрегационного ответа (рис.8 А, кривая 2). Инкубация индуктора

агрегации г присутствии мембран эндотелиальных клеток, культивированных г стандартных условиях приводит к гидролизу нуклео". нда до AMP, что вызывает выраженное снижение величины агрега11ионного ответа (рис. 8 А, кривая 3). 8 присутствии меыбран эндотелия, культивированного в условиях хронической гипоксии (3% Oj, 1-2 мес.) гидролиз ADP протекает медленнее, что приводит к сохранению нуклеогида в среде инкубации и менее выраженному сниманию агрегационного ответа (рис. 8 А, кривая 4).

Повышение уровня активации тромбоцитов может быть вызвано как эгзогегиьг? ЛОР, так и эндогенным, содержащимся в специальных гранулах тромбоцитов [Вогп, Ю80]. В условиях эксперимента спонтанный выброс ADP может происходить при механическом воздействии на тромбоциты, например, при перемешивании клеток в спе.<трофотометрической кювете. Добавление мембран эндотелиальных ii теток, культивированных в условиях гипоксии (3% О2, 1-2 мес.), сохраняет «еличину агрегационного ответа тромбоцитов (рис. 8, Б,

время, мин

Рис. 8. Влияние нуклеотидгидролизующих экто-ферменгов эндотелия на величину агрегациокных ответов тромбоцитов.

А: 1 ответ тромбоцитов на добавление среды определения АТР/АОРазной активности; 2 - 'ответ на АОР (0,5 мкМ), предикубйрованный в среде определения АТР/АОРазной активности, не содержащей эндотелиальных клеток; 3 - ответ тромбоцитов на АОР, прединкубированный в среде с эндотелием, культивированным в нормальных условиях; 4 - ответ на АОР, прединкубированный с среде с эндотелием, культивированньп< в условиях хронической гипоксии

В: 1 - уровень спонтанной агрегации тромбоцитов; 2 - ответ на АОР, прединкубированный в среде с эндотелием, культивированным в условиях хронической гипоксии; 3 - ответ на АОР, прединкубированный с эндотелием, культивированным в нормальны* условиях.

кривые 1,2). Добавление мембран нормальных эндотелиальных клеток приводит к значительному снижению агрегационного ответа (рис. 8, Б, кривая 3).

Известно, что эндотелиальные нуклеотидгидролизующие экто-ферменты, а также секретируемые эндотелием окись а^ота и простациклин являются факторами, снижающими степень активации тромбоцитов [Marcus and Safier, 1993]. В проведенных нами экспериментах показано влияние именно экто-АТРазы и экто-АОРазы на агрегацию тромбоцитов, поскольку данные эксперименты проводились в условиях, исключающих влияние окиси азота и простаниклина.

Обнаруженные нами в клетках сосудов, экто-ферменты являются регулируемыми (подавляются при гипоксии) и имеют кинетические

свойства, котормз позволяют им регулировать' эффекты пурикергических агонкстов на тромбоциты, а, возможно, и на клетки сосудов (эидотелиальные и гладкомышечные клетки тоже имеют

пурпкергические рецепторы). Изменение активности дантах нуклзотидгидрояизующих ферментов под действием гипоксии согласуется с феноменом повышенной активации тромбоцитов при патологических состояниях, сопровождающихся гипоксией.

ЗЬГЕОДЫ

1. Из цитозольной фракции легких очиден до гомогенного

с ос толки гак назыьаемый "растворта-ай активатор" ме"<5рчнно8 здснилатциклазы. Показано, что "активатор" преястазляпт собой 23 kDa и 29 kDa белки, обладакнние аденилаткиназной активностью. Активирующее Влияние этих белков на аденилатциклазу легких объясняется крайне высокой скоростью гидролиза субстрата аденилатциклазы АТР до AMP, которая характерна только для мембран легких, а не мембран других тканей (сердца, печени, мозга).

2. Показано, что характерная для мембран легких высокая скорость гидролиз; АТР до AMP монет объясняться зысоким содержанием п этой т:<ап!1 экдотелильнмх и гладкомышечных клеток. При лобг-вле:-;'.';:! к этим клетка;; АТР происходит его пыстрый гидролиз яо AMP, и 'тот процесс не ускоряется поя действием аламетицина, знзыпаю'цэго вход АТР в клетку, что указывает :ia внеклеточную локализацию активного центра пуклеотидгмдролизумтгих ферментов.

3. Проведен кинетический ¡; янгнбиторный анализ реакций ¡¿¡дролиза ЛТ? мембранами зняотелиальны:; клеток, h,i основании чего сделано заключесъе, что в этой процессе участвуют по крайней мере два фермента. Распад AT? до АМр происходит через стадию образовгтгяя ADP, а путем отщепления РР; от АТР,

V Мбнаруаеко. что хроническая гипоксия ( 0~, 1-2 мес) значительно подавляет реакцию гидролиза ADP до АМР и 2 меньшей степени гидролиз АТР до ADP. В результате этого гипоксия может ослаблять знтиагрегационное действие эндотелиальных клеток, ^'■уа:'с7злл''к(>е ими путем гидролиза индуктора агрегпйии Л DP до АМР. В модальных экспериментах показана принципиальная возможность влияния гипоксии на агрегацию тромбоцитов нутом изменения соотношения активностей экто-АТРазы и экто ADP-азм эндотелиальных ;:.:гток.

СЙЙСОК ПУЕЛИУА^ЯЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т.A. Voyno-YaseBeUkaya, М.Р. Panchenko, E.V.Nupenko, V.O. Ryb'iii And V.A. Tkachuk. Histamine and bradykinin stimulate the phospli'diiiositide turnover in human umbilical vein endothelial celli Via different G-proteins. FEBS Lett, 1989, v.259, p.67-70.

2. tkichuk V.A., Hoffenberg S.I., Starikova M.G., Panchenko M.P., Daniienko M.P., Voyno-Yasenetskaya, T.A., Nupenko E.V., Rybin V.O. involvement of guanine nucleotids-bindieg regulatory proteins into the process of hormonal regulation of signal transducing systems in mammalian cells. International Symposium "Molecular organization of biological structures". Moscow, 1989 Abstr. Book; v.l, p.114.

3. E.V. Nupenko, M.P. Panchenko, M.G. Starikova, А.У. Grishin and V.A. Tkachuk. Apparent activation of rabbit lung membrane adenylate cyclase by cytosolic proteins pqssessing adenylate kinase activity. Biochim.Biophys. Acta. 1991, v.1091, p.213-221.

4. Панченко М.П., Старикова М.Г., Гришин А.В., Нюпвнко Е.В., Кабаева Н.В., Романов Ю.А., Антонов А.С., Ткачук В.А. Сигнал-проводящие и низкомолакулярные GTP-связываюшие белки легких и эндотелия: локализация в мембранах и цитозоле, взаимодействие с F-актином. Биохимия, 1993. т. 58 (ij> c.H3S

5. Tkachuk V.A., Hoffenberg S.I., Starikova M.G., Panchenko" M.P., Daniienko M.P., Voyno-Yasenetskayn, T.A., Nupenko E.V., Rybin V.O. Involvement of guanine nucleotide-binding regulatory proteins into the process of hormonal regulation of ■ signal transducing systems in mammalian cells. International Symposium "Molecular organization of biological structures". Moscow, 1989 Abstr. Book, v.l, p.114.

6. Е.В.Нюпенко, М.П.Панченко, Ю.А.Романов, А.В.Гришин, Н.В.Кабаева, А.С.Антонов, В.А.Ткачук. АТФ-деградирующая активность мембран легочной ткани: исследование особенностей гидролиза, клеточной специфичности и локализации. Пульмонология, 5992, N 4, с.53-60.