Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НУКЛЕАЗЫ АКТИНОМИЦЕТОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "НУКЛЕАЗЫ АКТИНОМИЦЕТОВ"

л

\

■ АМЕЕШ,НАУК СССР л.. (■

; инсгагг микроеиолэпш

На правах рукописи.

ВЕЮШ10В ■ , Вадим Васильевич

Л'НУЮТЛЗЫ АКЕШСШГЦЕТОВ . -/0s.00.07 - микробиология/

АВТОРЕФЕРАТ • ..'у

диссертации на~соискание ученой степени

кандидата биологических наук.

у,.

Работа выполнена б Икститут'е'микробиалогии^АН СССР, .*■ Институте иоле кул явной Экологии Ай СССР и; на кафедре йиолгогии почв.биологог-псчвен'^го факультета Московского государственного университета. , .'..■/.;'. '..■

„.'■' . Научные, руководители: .член-корреспондент .АН СССР ■

-■'.'. '.■;;' . '■ ■ ■ S: .Н.А.КРАСЯГЬНИКОВ ■ ■'•;! ' '

■' ■ доктор.биологических^наук V-

' 'Ч- " "Р.ИЛАТАРСКАЯ

;;" ..Официальные оппоненты: доктор биологических, наук .

■Г ':■ Н.С. ЕГОРОВ : ' \ !' ,:

: ..■._.,:. ./'.. ■ г ■:" * доктор, биологических наук■■.

'■ • ■; Л .Г. ЛОГИПОВА ■ .■" V ■■ ';'-V

Ведущее п-<учьо-исследрвательское учреждение - V.■'■■' Институт биохи 'ИИ и физиологии микпоорганизмов АЙ СССР.^ '

//;/■'.. - Автореферат разослан " 3 " " и^Артц. 1973 г. 7 Зацита диссертации состоится " 'Atvft***-» г. в " часов на заседании Ученого совета Института микробиологии АН СССР, (Москва,Профсоюзная ул.',д.7,корп.2).

Ученый секу . .-■ ' ■

.-.■■'■. : Института миото' ^'V^i :*■^ АН "СССР ■ - ■'■/■■■': ' ■■-'■

'.'..'■ канд.бй<-. ■, : V"""/' .■ .V:'"" 'Vv-■■'>■'■'

/V;, ■ -С ■'■-'■-"'"■■'■ ' Л.К.Оснкцкая ; .

Ферменты нуклеинового обмена привлекают все более пристальное" внимание исследователей. С одной стороны, изучение их интересных и разнообразных свойств дает доаатаигельвав-свадеала о биологической ■ каталитической функция! этих ферментов, с другой стороны, нуклеази ваходат все большее применение как специфические реагев-пригодные для исследования структуры и функция соответствующих биополимеров. при получении таких биологически активных веществ как нуклеотиды, а также в качестве лечебвыхпрепаратов.

' В связи с этим перед отечественной биологией стоит задача изыс-,каняя наиболее доступных'иоточников выделения нуклеаэ и подбора методов получения очищенных препаратов." В этом плане изучение яук-дваз микроорганизмов представляет значительный интерес ж весьма ' перспективно.

7 В последнее время биологическая яаука обогатилась большим экспериментальным материалом по ферментам нуклеинового обмена микроорганизмов. Большой интерес представляет изучение нуклеаэ в связи

* ' *

с выявлением их рази в метаболизме нуклеиновых кислот, участия в механизме* регудируицем в них обменные процессы / вагп^га»1965» Е£М11,НвЬвюига,1'Э691 Кижапо е^а1.,197е|1)1геи^ в» 5Ь«ггег,

1972 * ДР./. 4 ■ : . '

Весьма разнообразны области практического применения нуклеаэ. ; Эоание способа действия а специфичности РНКаз, особенно специфичности к основаниям, позволяет анализировать структуру и нуклеотид-ную последовательность РНК /но11«у е* а1.,19б5| гасЬаи »* 19бб| &ев я др. ,1966/. В результате ферментного гидролиза рш можно получать ауклеотиди я оляговуклеотиды различных размеров я с разное нуклеотидноВ последовательности). РНКазы могут применяться.при различных цитологических и биологических анализах. Их мопк

вепользовать дхя удаленья следов РНК в препарата* ДНК. Бояывое значение е«епт работа по применении ауклеаз ддя тормояеаяя развитая,' болезнетворного вачада варусного и канцерогенного яроясхождения ■ /Сахганж В др.;1Э&4; Gire*;et Scbramm,19661 Кюае Я Др.,i960/. - " Значительный интерес представши ыакробнйе РНКаза, способнне : деградировать РШ до 5'-мояонуз«еотядов для ароиишеяного проаэвод-ства яноэян-б'-фойфата я гуаиозан-5 '-^ос^ата в качестве вкусовых орворав. которые в настоящее время находят широкое яримеваияе,; ; . особенно в Яловая в (Ж. Имеются гзкжв данные / Hirata *t »1.1963 4 что б'-вуклеотиды обладают к фармацевтически* действием,:, оказывая подоштелышй эффект прй внсудинова* иокв. Поду чей яв5*-взгвлеота- _ до» в* сЕавнвтельво больших количества* зваадтельво ускорят каучев») их фарыанеьтмесках свойств для возможного применеввя влечебвах ■педях. '- :

■ Настоящая работа посвящена изнсканвв возможностей получения, . яуклеаэ, пролуоируекшс вктивоошцегамд - весьма распростране нвой: ■ богатой фязмлогйческя аятаввим метаболитами группа; идвроорга--яявмов.-; ■ "" - ' ' • -■

-. В задачу работа входило: - -'--.'Х--.

' I. Изнсяаяле яовах, достаточно аятлвяых продуцеатов нуядааэ, особенно штаммов, свнтвзяруидих нуклевзы, прягодвне для структура ого ^ 'аяаиза РНК ■ опоообяив деградировать ИИ до 5'-моновуклеотвдо». ,

2. Внясвеня» зависимости ГНКазяой /РНК-дедолимераэвой/ активности, культурот мх таксоасмвческого подовввкя.- Л .

3.Сирмвлеваеусло»»*, ори котсрих бвосавтва фермента протекает паабслее ахтавно/оптамкэацва процесса/*, *

• \ ' ; . Матедиали м методы, ' 1 \v .:,«.* V ■

. Для отбора продуцентов различных РНКаз намабым обследованы ■ ; образца почв различных районов Советского Союза в Егвпта. Из яосле-.. . доваявых почв было выделено 574 культуры актввомвцегов. Все ятаммы . . . жсслвдоваля путем прижизненного мякроскопвровашщ. Культуральны» - ' . - признаки выделенных штаммов язучаля на сяятетяческвх я сложных ор- -; 1 ганвческях средах, способствовавши выявлены» отдельных групп ак-/ тивоииаетов. По окраске субстратного мицелия для пигментированных

штаммов и воздушного мицелия для непвгмевтврованвнх культур и г строенвв спороносцев выделенные штаммы бклк отнесены к II группам -; & пигментированных: синие, фиолетовые, красно-оранжевые, желтые« : ■ веление и в ве пигментированных: глобаепориаовде, серые, лавандовые, розовые, голубые, бурые.

1 Кроме самостоятельно выделенных культур. Ошв исследованы жуль, туры ка коллекции Отвела взаимодействия микроорганизмов Кн-та ш-' роб в од о га л АН СССР: синяя группа - В2 штамма, относящихся к 16 в*; дам ахтвномвцетов; зеленая группа - 54 штамма, относшихся к 16 вв' . . дам актпиомоцетов; серая группа - 37 втаммов, относящихся к 37 вв; : дам ажтвномтвтов, в отдельные атаммы других влдов. ......

• Таким образом, способность актином вцетов продуцировать РНКаэн -'"■■■- была прове рева ва большом количестве'/более 650 /.штаммов. В отдель-

. ных случаях определялась ЛНКазная активность актиномицетов.

0 способности актвяомицетов продуцировать ШКалы /РНХ-деполиме- . разы/ судили по коякчеству кисяотораствершмых продуктов гадролаэа, ~ ■'; ■■■■'< которое определяла спектрофотометричесшш методом, измеряя погло- " венве при Д « 260 нм /кадета с оптическим сечением 10 **/. ■ ■ ■■; Источником фермента служила культуральвая кидкость, освобохдеа-; иа« от шцвлде. для вшива ислользоваля многодневен« /4-5-суто*- '

нне / культуры, в которых уже произошло накопление фермента.

■В качестве субстрата использовала: ." ■

:"1. РНК - суммарную дролаявую, фирма "Сита", нейтрализованную Гг- ' нв^он я отдвалиэованную для удаления низкомолекулярных продуктов" распада / 6 мг/мл, 0,5 мл на пробу /;

2. JiHK.- ИЗ МОЛОК сельди, фарш Flufra'A.G., Bucha S,ö. /Швеция/ /2 иг/«л^0,5 мл на прову/. ; ■."*

Для приготовления реакционной смеси, подвергавшейся исследова-~ нии ка ферментативную активность, раствор PKK -в 0,1 М глициновом " • буфере /рН 7,5 и 8,6/ смешивали на холоду с натявным раствором. Если применяли буфер с pH 8,8, добавляли Mg0l2 с конечной кон-/- : центрацией 5.10"^. После инкубации в течение 15 минут при' 37?С ; И охлаждения в ледяной бане ферментативную реакцию останавливали', добавлением охлажденного 0,75$ уранилацетата в 2Sf хлорной кислоте. Осадок удаляли це втрифугароваааем. Надосадочную жидкость разводили; дистиллированной'водой. ' 1 -

Имея в. виду возможность некоторого самораспада РНК ври инкуба- .„■ цяи, в каждой серии анализов ставали контроль, в который содержа- ^ щий фермент нативный раствор вносили после инкубации и прекращения реакции. Разность между оптическими плотностями опытной и контрольной, проб позволяла судить.о приросте мслоторастворимнх продуктов . при фермитатяввом гидролязе РНК. За единицу активности приникали, количество фермента, которое,в условия* определения давало прирост_ поглощения равные единице шкалы спектрофотометра'/I сп.ед./ в пересчете на всю пробу с учетом всех разведений,' , .:

Лля предварительного суждения о^характере нуклеаэ, выделяемых -

исследуемым итаымом, обычно проводили определение активности при двух значениях рН - 7,5 и 8,8. В отдельные пробы для доведения у„ рН культуральной жидкости'до 2,5 добавляли 2М Супера глацин-нс1 с рН 2,5. Подкисленную до рН 2,5 пробу прогревали 15 шт. при 80°.' затем раствор охлаждали и нейтрализовали. Разрушая активность ШКаз-гидролаэ, т^кая обработка мало отражалась на активности^ * ШСаз-транвфераз, обычно характеризующихся значительной термоста- -Сальностью х устойчивостью к кислотам.'

В тех случаях, когда определяли способность культур продуцировать в культуральнуп жидкость ДНКаэы, субстратом служил раствор ■ ЛНК /рН 7/. ДНКаэиую,активность определяли, используя буфер рН 8,8

При.исследовании условий биосинтеза вуклеаа изучаемыми культурами применяли среды различного состава в зависимости-от цели опыта. -Из большого числа испытанных сред в качестве основной;была выбрана мучная среда, содержащая /в г/л/; муки пшеничной - 20, пептона - 0.5, кормовых дрожжей'- 0,05, - I.' СаС03 - I на литр' водопроводной воды.".

Влияние источников углеродного и азотного питания ва юд ферментации л выход ШКаэ изучали на синтетических средах. Исследование влияния источников углерода проводили с использованием среды СРч1 /Красильнгков,1949/. Испытывали влияние различных Сахаров:■ «оно-, да- и полисахаридов. Сахара вносили в питательную среду в количестве от общеа массы. Источники азота вводили в состав кудьтуральных сред как в форме органических, так и неорганических > соединений. В качестве азотных компонентов были испытаны амиояийные ^По современной классификации РаСонуклеат пуклеотил0-2'-транофе-разы /цаклизупане/ /КФ 2.7.7. / V

нитратные, нитратные и органические сода азота. Испсяьзоваяи'среду Чапека, в которую азотные компоненты вновили в количестве 1,5$, №аммы культивировали в колбах Эрленмеиера на 250 ш, содержащих по ЬО мл культуральяой среды. После автоклавярованяя при 0,5 атмосферы в течение 30 мин в среду вносили смыв 5-суточной культуры,. варане ннойна плотной агаризоваииой среде CP-I с глюкозой или с крахмалом. Инкубацию проводили на каталке /180-200 oó/иаа/ в .термостате ири температуре 2S°C. -

' Ври изучении влияния рН на нуклеазвую активность отобранных . штаммов использовали среду CP-I с глюкозой, приготовленную на циг-•ратно-фосфатнон буфере / Вел озерска й,Проскуряков,1951/. Залев'среды проведали 5-суточной культурой, выращенной на мучной агарязован-ной среде, в количестве 2'мл суспензии на колбу. Культивирование -.проводили в течение 7 суток. Значении рН определяли с помощью "'' ЛПУ-01.

Влияние аэрации на синтез нуклеадиических ферментов актиноми-цетамя изучали о,использованием сосудов различного размера я'формы. Опыт проводили на мучной среде, которую засевали суспензией ' культуры, выравненной на среда CP-I с глюкозой илпе крахмалом, -в количестве В от об"ема среды в сосуде. Инкубацию проводили в течение 6 суток, для определения скорости растворения кислорода применяла сульфитный метод / Соорег et al.1944 /,'а содержание кислорода в Среде определяли полярографическим методом, используя изготовленный вами модифицированный а&трод Кларка /cierk, 1925 /• Накопление биомассы учитывалось путем высушивания осадка .после

центрифугированяя в течение 30 мая при 6000 об/мин, в сушльнш

о

шкафу при температуре 105 до воздушно сухого состояния. Высупев-

ную массу взвешивали.

ч_ Изучение процессов роста в биосинтеза нуклеаз в динамике проводили в смонтированном нами, совместно с Отделом физико-химических -методов исследования, настольном ферментере, поскольку во время

Ч . '

выполнения,работы мы не располагали соответствующими установками. Собранный нами ферментер обеспечивает благоприятные условия.роста , культур и надежные результаты. На этом приборе в течение всего .. процесса ферментации провешили наблюдения за накоплением'биомассы и нуклеазной активностью изучаемых культур. Система датчиков прибора показывала.значения основных параметров роста культур - рН, . ¡вь,' 'растворенного кислорода, оптической плотности культуральной среды, температуры и расхода воздуха на барботак. Прибор снабжен блоком преобразователей и многоточечным самописцем /Рис. I, /. Кулитуры выращивали на среде СР-1 с глюкозой и мучной среде. 1ер-ментаоия длилась 7 суток.4

Оптимизацию процесса продуцирования нуклеаз проводили с использованием методов математического планирования эксперимента /Мак--симов,Федоров,1969/. Опыты ставили по планам факторного эксперимента. В соответствии с матрицей дробного факторного эксперимента /ДФЭ 25-1/ или полного факторного эксперимента /ПФЭ 2*/ ставили -по 16 опытов, отдельно при рН 8,6 и рН 7,5, кавдый в трех повтор-ностях, в уравнении регрессии, представляющем выход нуклеаз функцией изучаемых факторов, коэффициенты регрессии /коэффициенты при соответствующих переменных/ расчитывали методом Ятса по данным измерения нуклеазной активности в опыте. Значимость коэф. фициентов регрессии, как меры влияния соответствущих факторов на процесс, определяли статистическим анализом уравнения, а также с

помощью графиков I/2-нормального распределения / JDani«l И9'9. /• Для нахождения оптимальной комбинации отобранных существенных факторов променяли метод крутого восхождения /Boi>wil«oa,i95i /, представляющий собой факторный эксперимент с последующим движением по градиенту к оптимуму; ^ \ •

. Изучение влияния различных компонентов муки на,рост и нуклеаз-ную активность культур проводили по методу случайного баланса /Sattertbwaite, Budiae,i959 Л Эксперимент ставился в со-

ответствии с матрицей планирования о числом факторов п« 12 в числом опытов я - 16. Накопление биомассы и нуклеазную активность измеряли на 4-х-суточной культуре. Отбор существенных факторов проводили по критерию медиан и выделяющихся точек, характеризую- , щах сдвиг гистограмм на диаграммах рассеяния результатов опыта.

Способность актяномацетов продуцировать РНКазы.

При исследовании выделенных нами втаммов и культур, взятых из коллекции, было установлено, что все они в той или иной мере синтезируют РНКазы. Культуры для исследования брали в экспоненциальной и стационарной фазах развития /з-5-суточные/. Активность фермента зависела рт индивидуальных особенностей пггамма. Установить -значительные различия в активности ыелду отдельными" группами актиномицетов не удалось. Также не была обнаружена закономерная связь мешу способностью синтезировать РНКазы к видовой принадлежностью штамма. . '

' Таким образом, проверка большого количества штаммов, предпринятая с целы) выяснения, не является ля способность продуцировать гаКазы дифференцирующим признаком,_не дала положительных" результатов. Анализ подученных данных не позволяет считать способность

- то -

синтезировать РНКазы видовым признаком.

. Широкое распространение РНКаз у актиномицетов свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения последних хак продуцентов, этих ферментов.

Среди штаммов,-в культуральной жидкости которых накапливалось значительное количество РНКазы, были отобраны 2 штамма - Act.aa-terooporua 16 группы Giiaeua и Act .cinereofueeua 88 грушш Flavua, дающие при расщеплении РНК фрагменты с 5»-концевым фосфатом. Мльне^иую работу проводили с этими двумя штаммами. \

В свази с тем, что одной из характерных особенностей актиноми-цетов является их большая изменчивость, вами было проверено на-скодько отовранные лггаммы является устойчивыми при пересевах.. При многократном рассеве на агаризованвую среду CP-I культура Act.аа-teroeporua 16 дала все колонии одинаковые по окраске воздушного . И субстратного мицелия. Act.cinereofuccue 88 расщепляется и дает три вида колоний: 1 вид - колонии мелкие, бесцветные, воздушный мицелий пепельного цвета; 2 вид - колонии серовато-палевые, с нижней стороны бесцветные, воздушный мицелий серого цвета; 3 вид - : колонии слабожелтоватые, о ньинеи стороны бесцветные, воздушный ■ мицелий серовато-белый, характер и,вид спороносцев у всех был оди-наховый. Расположенные моноосошально, спиральные спорояосцы имели : по 2-3 завитка, споры шаровидные с гладкой оболочкой. Определение нуклеаэной активности показало, что варианты различаются по иятен-, санности продуцирования РНКаз. Поскольку лучшую нуклеазную активность показал 2 вариант, он был выбран дая дальнейшей работы.

', Влияние условий культяваиованин на нуклеазную активность.

Одним из путей, повышения продуктивности микроорганизмов яв- . ляется подбор питательных сред, обеспечивашкх нормальный рост и биосинтез продуктов ах .жизнедеятельности. Изучение влияния условий кудагнвированиява нуклеазную активность проводили на двух отобранных штаммах. Проведенные исследования показали, что использование различных Сахаров в качестве источников углеродного пята- . няя в большинстве случаев обеспечивает хорошее накопление биомассы и синтез ШКази обеими культурами. Act . asterosporue 16 активно продуцирует фермент на синтетических средах, содержащих гли-■п ■ i. ■ церин, мальтозу, сахарозу, рамнозу, глюкозу - источники углерода

. хорошо усваиваемые культурой. Наибольшее накопление .фермента в культуральной жидкости Act .cinereofuncus ее наблюдалось на средах с идюкоэой и фруктозой, такле хорошо ассимилируемых этим штаммом. Лучшим источником азота для нуклеазнои активности Act .a ste-rosporus 16 оказался пептон. Мочевина, нитраты кальция и калия также обеспечивали высокое с одержанне фермента в культуральнои жидкости этого штамма. Зги же источники азота способствовали и хорошему росту культуры. Act.cinereofuícu» 8в проявил достаточно высокую нуклеаэную активность на самих разноооразных источниках азотного питания, но наибольший выход фермента наступался на средах с сульфатом аммония. Почти также хороао алиям на синтез ШКаз мочевина и Нитраты натрия и калия.

,Влияние различных условий аэрации на развитие и нуклеаэную активность изучаемых штаммов исследовали в ферментере /см. ним/ я с использованием сосудов различного раагиера и Формы. Спит показал, что с увеличением степени аэрации нуклеаэная активность увеличи» кается до определенного предела. Самая писокад нуклеаэная «ктив-

ность"обоих штаммов найл вдалась при скоростираствореная в - -среде равной 1,1 г/л.час. Дальнейшее увеличение содержания кислорода в среде не приводило к увеличению синтеза нуклеаз, Также било отмечено, чго сильная аэрация способствовала быстрому выходу |-ер-мента в среду, при слабой:аэрации нарастание активности идет мед- ; леннее.\ .. -1 ' V ■. - -■. - „/ •

- При изучен л и влияния рН нарост и нуклеазную активность исследуемых культур било установлено, что как для накопления биомассы, так. н для нукдеазной активности обоих штаммов оптимальными являют-, ся значения рН 7,8 - б.О.т.е. оптимальные значения рН среды для продуцирования нуклеаз совпадает с оптимальными значениями рН для -Гразьития культуры. При смещения рН среды в кислую сторону найдю-дается более резкое снижение.нуклеааной активности,чем при смещении рК в щелочку» сторону. ■.' .' ■ " ;

. Гакам образом, активный биосинтез нуклеаз зависят от специфических потребностей каждой культуры » источниках углеродного и азот- ^ ного питания,но имеет место при одинаковых значениях степени ; аэрации и рН среды;

■' Изучение процессов роста и синтеза нуклеаз в ферментере. . " " ■' Настольный Ферментер. :

Доя выявления основных факторов, влияющих на рост и нуклеазную активность и лучшего пснимания характера этих процессов мы прово- . дали их изучение в динамике, используя собранный нами настольный • Ферментер. Этот прибор обеспечивает хорошее , перемешивание в ферментационном сосуде несложной конфигурации при достаточном насыщении -

культуральной хидкоста кислородом воздуха, а таяле рема-рации осаовны* параметров роста культуры и стерильность в теченле всего процесса ферментайии, / '

Испытание работы фериентера проводили на культурах, резко отли чащцахся so характеру и скорости роста; бактериях, обладавших быстрым ростом в дающих равномерную суспеиэив клеток, к актаноми-цетах, оййадаюиих миаелаальнш ростом. образующнх агрегаты клеток довольно больших размеров и имеющих свойство с*3р<астать стеклянную поверхность.

В ошггах С культурами Act .cinereofuecus 88 И Act.еetero-«poi-u» 16 ферментация длилась 7 суток. Пробы отбирали 2 раза в -сутки. Во время ферментации мешалка делала 500 оборотов в млнуту воздух подавался в количестве 11,6 литров в час.

Характер развития обеих культур на среде CP-I весьма сходный, , Накопление биомассы достигло максимума на 5-е сутки для Act.eint reofuecu« 88а на 4-е сутки для Aet.aaterosporu» -t6. Соотве СТвенно и нуклеазнея активность Act .cinereotuacus 88 достигл-максимума на 5-е сутки. a Act .a»tero»poru« - на 4-е сутк

/Рис."2 /. Это свидетельствует о продуцированей фермента активно растущей культурой. Молда полагать, что выделяемая внеклеточная . РНКаэа участвует в процессах, связанных с ялэиенной функцией юге_ ток. ' ' ■ ^

Обе культуры за время ферментами подщелачивали среду. Значение pH изменилось при культивировании Act .elnereofuecu» 88 О 6,75 до в,0, й П?и культивирования Act.eeteroeporus -сб -с 6,6 до 8,8.

. ■ Окислительно-восстановительные условия в среде также изменились при культивировании обоих вгаммов. Величина потенциала ЕЬ

rílj Ch pH ííii-^i}

яг/н U

14

Т Í1 12

St 3J0

QSS to to 60

It ara

-: W В 40 ■

14 гю т

V» в зо

10 1W

"■■. а.5 4 ÜO

« 90

к» г - to •

г' 30 9 ■

Оа rtt» Eh „ КЖА. ОН ШИЛ.

мгм ES 14 70

44 эю (Я

44 to

At 550 11

- М' го 90

это •9

14 - 40

ÍK> 7

V® зо

ta ISO 5

гя го

в «0 3

us ■ t to

■ ■ ■ 2. 90 1 s ■

2 3 4

••'.:• - cvtkw

Двяаыяка изменения роста культур актиномяцетов, синтеза PHKas ж освоввых параметров роста при культивирования на синтетической среде CP-I:

вверху- Jtet .cine re of vacua 88, внизу - Act.a»toio»porua16 I--" — •■• —концентрация растворенного кислорода, 2— — — 3——■■—: zh, 4 v* ' V ' ' pb» ® ~' ---- нушгеазная активность, 6 ——-- накопление биомассы.

имела динамический характер. К концу экспоненциальной фазы разви- ' тия культур потенциал еь снизился с 345 до.69 мв для Act .clne-reofuacu* 88 И С 312 до Ш и для Act .aeterdaporua 16.После . ' того как закончилось размножение культура потребление кислорода уменьшилось, значение Bh увеличилось до Ш мв для Act.einereo-

fuscua 88 и ДО 126 MB / ДОЯ Act .«sterosporus '16. . .

Что касается окислительно-восстановительного потенциала iH2> то для Act .cinereofmou» 88 кайл сдалось некоторое паление' его в конце экспоненциальной фаза развития культуры /с 25.2 до 16,8/ в небольшое повешение /до 18,6/ к кошу ферментации.,Лдя Act teroeporu» 16 колебания величины тнг были очень малыми /23 -19,2 - 21 соответственно/. Это свидетельствует о том, что окийии-тельно-восстановитедьное состояние среды не претерпевало больших .изменений.

Сот ре бдение кислорода, возрастающее по мере роста мицелия, привело к значительному снижению концентраций растворенного кислорода в среде к концу экспоненциальной фазы развития культур. На Ы-е сутки культивирования Act .oittexeofuaaua ев концентpaаия растворенного каслррода достигла 1,0 мг Qj на литр и на 4-е сутки культивирования *с*.eaterоарсги« 16 - 1,1 мг С^ на литр. Во время стационарной фазы снижение активности дыхания обеих культур привело к повышен яв концентрации растворенного кислорода в -среде. •

Таким образом, развитие исследованных штаммов, изменение физико-химических условий культивирования за время ферментации. соотношение мехду ростом культуры и биосинтезом вуклеаэ носит в основном ouiuoHi ацкпр.

При увеличении степени аэрации для культуре Act .a»tero*po- • -гve,16 /количество оборотов мешалки - 1000 в минуту и подача воздуха - 17 литров в час/ время затраченное аа ферментацию резко сократилось» За 2-е суток накопление биомассы культурой превысило 4-х-еуточное накопление в опыте при более низкой степени аэрации. Значительно увеличилась и нухлеаэяая активность /180 сп.ед. вместо 70 сп.ед./, что свидетельствует о существенном ваикнии аэрации . i - ■ ■ ■ \ , ■ ■ на биосинтетические процессы у активомицетов. Изменяя окислительно-восстановительные условия, мияюшде на процессы обмена веществ и йиосинтетическую активность, аэрация является одним из существенных' факторов условна культивирования актиномицетов. Наши данные, полученные без ферментера /см.выше/ и с использованием ферментера подтверждают это положение. Возможность с помощью аэрации ' стимулировать продуцирование нуклеаз актиномицетами представляет определенный интерес. / ■

Оптимизация процесса продуцирования нуклеаз. - Одной из задач, стоящих перед нами, был подбор условий, при которых продуцирование нуклеаз изучаемыми штаммами было бы максим&ль иым. Поочередное изменение'в''эксперименте каждого фактора при условии постоянного уровня остальных оказывается недостаточным в сяу чае существования мехфакторных взаимодействий, поэтому нами Оыди -' применены математические методы планирования эксперимента. Большим преимуществом этих методов является возможность одновременного изу чения большого числа факторов, действующих в системе, что позволяет, наряду с учетом влияния каадого отдельного фактора, установить наличие и влияние в системе межфакторных взаимодействий. Су-щестенным является т^кже и то, что при сравнительной простоте планирования и небольшом об'еме вычислений обработка подученных ре-

зультатов дает минимальную ошибку в оценке аффектов.

В ffiwtax используемнх наш методов не существует принципиального различия мелду фи^ -ески разнородными факторами по характеру их влияния на выход процесса, вследствие чего можно проводить одновременно оптимизации как состава среды, так и временя культивирования* •

Ранее было установлено, что 'культура Act.cinereofuacu» ее хорошо растет и дает лучшая выход вуклеаз на.сложной органическом среде, содержащей /в г/л/: муки пшеничной - 20, пептона - 0,5, кормовых дрожжей - 0,05, KgS04 ; - I, С»СОэ - I. ¿ля выяснения оптимальных весовых соотношений компонентов этом среды был поста»-, лен дробный факторный эксперимент /дФЭ для 5 факторов:

Xj-мука, ^-пептон, Xg-дрожжа, Х^-время, Xg- MgS04• Каадый фактор ' исследовался на двух уровнях; . . ...

; /У/Т/ ■ пептон /г/л/ да ■ время /час/ S/rhf

нижний уровень /-/ верхний уровень /+/ : 5 15 .« ; о,2 ; .1 . 0,05 0,25 48 72 0,2 I

Статистическая проверка значимости коэффициентов регрессии, как , меры влияния фактора на процесс, доказала; что в данных условиях существенными для'продуцирований нуклеаз являются мука, пептон и время. Изменение концентрация Mgso4 Не оказало влияния на нуклеаз ную активность и в дальнейших опытах этот фактор не варьировался.

. Подбор оптимальных условий культивирования для синтеза вуклеаз осуществляли методом крутого восхождения, за исходный уровень которого был принят основной уровень дробного факторного эксперимента

Движение в направлена» градиента было прекращено после 4 вариан- ' та, т.к. дальнейшее увели чейее количества муки в среде приводило к тому, что после стерилизация среда превращалась в тестообразную массу. . . .

Результата серая опытов по методу крутого восхождения показали . как количественное изменение компонентов среди и временя культивирования влияет на нуклеазную активность. V

варяант опыте мука , /г/л/ ТО Ш* время /час/ нуклеазн.актявв. -/сл.ел,/

I 10 0,6 0,15 . 60 10,37

2 29,3 1,05 0,2 69 ' 17,25

3 '■' 48,6 ' 1,5 0,25 78: - 55

■4 6?,9 1,95 0,3 87 93 ' /■'.'

Полный факторный эксперимент /ПФЭ 24/, поставленный по результатам серии опытов крутого восхождения, показал, что для синтеза иуклеаэ в данных условиях самыми вушественшшк является мука я время, а также взаимодействие пептона и дрожжей. Йоскольку даль--. яеиоее увеличение муки в среде бвдо невозможно, были проведены серия опытов по методу крутого восхождения с увеличением временя до 240 часов 1С отбором проб через меньшие промежутки временя. Это позволяло установить максимальное значение вуклеааноЯ актив-ноет и в каждом варианте, которое во всех вариантах, за исключением четвертого, наблюдалось при 100 часах. После итого времени' наступал сцад йукжеазной активности« переходяяяй спустя 168 часов в почтя стационарную область, в пределах которой изменение фактора времени не вызывало заметных яэневешй выхода вужлеа». Ва ггом

опит был закончен, поскольку полный факторный эксперимент, проведенный после серки опытов по методу крутого восхождения по време-■ ни, практически был поставлен в почтя стационарной : области. " ; <>■ После анализа полученных данных мы пришли к заключению, что ; оптимальное средой для синтеза нуклеаз культурой Act .cicereofu»-cu» 88 является среда содержащая /в г/л/; муки пшеничной-"- 48,6, пептона —1,5, корковых дрожжей - 0,25, ; WgS04 _ I, CaCOj _ i„-Сйтимальнои время инкубирования составляет 100 часов.

Сопоставлен» исходных данных и данных, иол учен них в результа- . - те проведения оптимизации процесса, покаэываеткак изменение уело-, вий культивирования' отразилось на нуклеазной активности;

: '-Условия ■■.■' Содержание компонентов " Время Нунлеаэн.

культивн- ' мучной среды /г/л/ инкубац. актявя. ,

'-рования мука пептон дрожжи- /час/ /стг.ед./

Исходные 20 ' 0,5 0,05 120- 31,84

:Оптимизированные 48,6 1,5 0,25 ' ICO 240^2

Ддя увеличеная продуцирования куклеазкультурой , Aet .cinéreo- . fu»cu» 88 г требуется более высокая концентрация таких компонентов мучкой среды, как мука, пептон, дрожии."Особенно важное значение имеет мука, во проследить влияние дальнейшего повышения со: держания ее в среде было невозможно. Что касается времени"культя-■ вирования, то проводить его в течение 5 суток на такой среде нет надобности. Наибольшее накопление нуклеаз в культур ал ьной жидкое- ; ти наблсдалось уже спустя четверо суток. , ■

•V Подбор олтамадьяой среды и оптимального времени кулыивяровааия ■ позволил увеличить выход нуклеаз в культуральную среду Act.cine«»

r* of us cum as более чем a ? раз.

Патент, выделяемый Act .cinereofuecu* ее в культуральяую среду, создавал дополнительные трудноетя при очистке фермента. Иы попытались выяснить какие факторы при культивирования этого микроорганизма на мучвой среде влияют на выход пигмента. В эксперименте, поставленном по матрице планирования полного факторного эксперимента /ПФЭ zV, за основные уровни бняи приняты 2 и 3 варианты крутого восхождения /см.стр.20/. Отфильтрованную культура!ьяую жидкость промеряла на М-10. Пик максимума поглощения приходился на 580 нм. Статистическая проверка значимости коэффициентов регрессии показала,' что существенными для пигментообрааованая являются мука ■ время. Поскольку эти факторы являются существенный» и для выхода иук-леаз'в культуральнув среду, с наличием пигмента пригодится мириться. ■ .

Реоевне задачи оптимизации для культуры Act.a>t*r«ai>ortt« 16 проводили также как И АЛЯ Act.cinereofuecu» 88.

Результаты серии опытов по метой? крутого восхождения показывают, что с увеличением концентрации муки в среде яуклеазная активность возрастает, но перенасыщение среды мукой приводят к падению ну клеазной активности,

варианты опыта Ж/ Тг£7 время /час/ яукя.актявн. /сп.ед,/

I 10 0,6 0,15 54 . " 136,12

2 22 1.3 0,25 ■ 62 295,0

3 34 2,0 '0,35 70- 346,42

4 46 2.7 0,45 78 400,0 ,

5 58 3.4 0,55 86 409,68

6 ' 70 4,1 0,65 94 295,0

- Реализация полного факторного эксперимента после серии опытов по методу крутого восхождения показала, что он бил поставлен виоч-тв стационарной области.

. Так било.установлено, что оптимальной средой для синтеза нук-" ~ . леаз Act.mteroeporu» 16:,"' является среда, содержащая /в г/л/; муки пшеничной - 58, пептона - 3,4, кормовых"дрожжей --0,55, . ивао4 - I. cacoj - I. Оптимальное время инкубации культуры на такой среде составляет 86 часов. Увеличение нуклеазной активности достигнуто более чем в 3 раза..-

При сопоставлении'состава оптимальной среды для синтеза нук- , леаз культурами Act ,cinereofu»cu» 88 . :: И Act .aeterooporu«'' 6 ' видно, что существуют некоторые различия в количественном соотно- : шевии компонентов среды, а также во времени инкубации, : . \'

Оптимальные условия синтеза нуклеаз

Культура- : Содерлание компонентов ' мучной среды /г/л/ Нремя : инкубации

мука пептон* дро.^-ки - /час/

Act.cinereofuecue-88 .48,6 - . . " 1,5 : 0,25 100 :

Act.aateroaporu* 16 ' 58 ■'.■■.: 3,4 ' 0,55 86

.. Культура Act .aeteroeporu« 16 ддя активного сивтеэа нук-леаз требует еще более высоких концентраций муки, пептона, дрод-жей, но меньшего времени инкубации. Это говорит о том, что оптимизация процесса достигается для каждой культуры созданием ей присущих условий. Подбор таких условий осуществляетей Сравнительно небольшим числом.опытов и довольно простами расчетам« при применении методов математического планирования эксперимента, В тех случая*,, когда культура является продуцентом арктически ценных метаболитов

возмоадзсть поьыненля ез продуктивности таким путем, несомненно, представляет большой интерес.

Одновременно с определением нуклеазной активности, определяли накопление оиомйссы культурой act.aeteroaoorua 16. Шло уста-' новлено. что существенным* факторами для роста культуры являются мука и взаимодействие пептона и времени. Следовательно, на накопление биомассы этой культурой положительно влияют добавки муки и при увеличении концентрации пептона усиливается влияние времени 1 инкубации.

таким образом, в результате проделанной работы были определены оптимальные условия для синтеза нуклеаэ культурами Act.ctnereo-fuacua ее и Act .asteroapoxu* 16 установлены-концентрации компонентов мучной среды и оптимальное время культивирования отдельно для каждого штамма, достигнуто увеличение нуклеазной активности культур в 7 и 3 раза соответственно. При этом было показано, что самыми'существенными факторами для биосинтеза нуклеаз, при выращивании штаммов на мучной среде, являются мука .и время инкубации

' ■ I

Значение компонентов муки для роста и нуклеазной активности изучаемы» атаммов.

Установив, что из веществ, входящих в оптимальную культураль-ную среду, самым существенным фактором доя синтеза нуклеаз является мука, мы поставили задачу определить~~значенне различных компонентов муки для нуклеазной активности и накопления биомассы изучаемым культурами. *

Был подобран такой набор компонентов, который заменяя' в сравнительно сходных соотношениях составные части муки. Количество РНК

било взято не из расчета содержания ее в муке, а с учетом специфичности субстрата. В расчете на стандартную мучную среду, содержащую 20 г муки на литр води, баи о взято /в мг/; РНК /Xj/ - 220. клейковины /Х^/ - 320, крахмала.нерастворимого /Хд/ - 1560, крахмала.растворимого /x^/ - 3S0,"дрол^евого экстракта Лд/ - 2, жира /подсолнечного масла/ /Х6/ - ЭО, глицерина /Х^/ - 300, Сахаров /Xg/ - 155 /в том числе! сахароза - 140, мальтозы - 13,глюкозы фитина /х^/ - 18, фосфора'минерального А1С/ - 2, мочевины /Xjj/.-3,4, глицерофосфата /Xjg/ - 20, -

Изучение влияния вышеперечисленных веществ на нуклеазную актив-тность и накопление ; биомассы было проведено по методу случайного баланса. На первом этапе в качестве существенных (¡акторов били отобраны клейковина и фитин как для накопления биомассы,-так и для куклеазной активности обоих штаммов» Значимость соответствующих ■■'■ коэффициентов регрессии была подтверждена статистическим анализом. На втором этапе, согласно диаграммам рассеяния, построенным после.' исключения влияния факторов:клейковины и фитина на результаты опыта, для разных'культур и разных процессов оказались существенными различные эффекты. ДЛЯ нуклеазной активности Act .cinereofu»-. eu» 88 в ходе отсеивающего эксперимента в качестве существенных выделились положительный эффект жира я 2 эффекта парных взаямо-'действий; FHK о фитином и клейковины с миром. Следовательно, наличке клейковины, фитина и хира положительно влияет на синтез нуклеаз этим ятаммом, Существенность взаимодействия РНК с фитином и клейковины с-жиром означает усиление.положительного эффекта (много из взаимодействующих факторов при увеличении концентрации другого.

"Ка накопление биокассы этой культурой, креме клейковины и фитины, положительно влияет так*е увеличение содержания в среде РНК и глилерофосфага. : " ■' _

1ля нуклеазной активности Act .auterosporu"« 16 в ходе отсеи-взкдего эксперимента, кроме клеиковлнн и фитина', выделились ппло-*hTCibHhie вза«мод.еР.ствия Сахаров с мочевиной и дрожжевого экстракта с жиром. Взиимодействке дрожжевого экстракта с жиром является существенным также и для накопления биомассы этим штаммом. " -

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что компоненты му-- , ки, как существенного фактора оптимальной среды для продуцирования пуклеаз изучаемыми штаммамииграют различную роль в активизации процесса. Наиболее важную роль для нуклеазной активности, а также для накопления биомассы играют клейковина и органический фосфор. Клейковина на 70-8СЙ состоит из белков, являющихся основными азотсодержащими компонентами микробных клеток. Входящий в состав ва&-нейяих компонентов протоплазмы и играющий определенную роль в различных химических превращениях, особенно в углеводном обмене а в переносе'энергии, фосфор большинство микроорганизмов потребляется в виде неорганических фосфатов. Проведенными опытами показано, что при подборе сред для культивирования Act, cinereefuecue 88 и Act .Riteroaporue 16 необходимо учитывать не только минеральные фосфорсодержащие соединения, но а органические, к числу которых относится фитин.

Положительное влияние добавок клейковины и органического фосфора на биосинтез нуклеаз, добавок веществ, активизирующих рост изучаемых культур, подтверждает вывод о том, что фермент продуцирует-^ ся активно [истушими клетками.

В наших опытах не было обнаружено положительное влияние нали-.' чия крахмала, глицерина и минерального фосфора как на накопление биомассы," так в на нужлеазную активность изучаемых:культур.

Реэультаты проделанной работы дозволяли установить какими компонентами мухи обусловлено ее воздействие на рост в биосинтез нун-деаэ, а также показали, что помимо основных венеств /клейковины в органического фосфора/ активизация-этих процессов осуществляется ,,, у;разных культур разными веществами,' входящими.» состав.такого сложного органического материала как мука^ Biso также установлено у наличие взаимодействий между отдельными компонентами, при которых влияние одного вещества зависит от уровня в среде другого.

Характеристика кукяеаз. синтезируемых - 16 я А<?* .oineraof u»cu> вб . '

Работы во выделению и очистке нуклеаэ, синтезируемых изучаемыми штаммами, проводились в Институте молекулярной биологии АН ; СССР в лаборатории функциональной знзимологии под "руководством д-ра бвох.наук Р.И.Татарской. ■ /

Нуклеаэы обоих штаммов яесвязааы с мицелием и находятся в куль* туральаой жидкости. Для выделения вуклеаз пользовались методами 1 выделения и очистки белков /высаливанием сульфатом аммония, гель-фильтрацией на сефадексе с-75» хроматографией на ДЭАЭ-целлшозе/.

Aot.a«teroepüru« i6 - обладает нуклеазной активностью,в несколько раз превышающей активность других исследованных нами втам-мов. Согласно предварительным даннш, основная доля этой активности - активность зкзонукяеазная /Ш 3.1,4.1/, однако к вей приме- ' дано немного гуаяиловой РНКаэн /К® 2.7.7.26/. Эти активности пока '

разделить ив удалось.

Нуклеаза Act .cinereofuacua вв является экзонуклеазой /КФ 3.1.4.1/, при расщеплении РНК дашей 5• -мовонуклеотиды. После полкоб очистки она может быть пригодна для исследования структура а функции нуклеиновых кислот. Применение ее возможно для концевой го анализа олягонуклеотидных фрагментов и для расшифровки три- и тетранухлеотидов, а также для определения положения концевого фосфата в фрагментах, полученных с помощью какой-либо аюхонуклеаэы. ; : Экэонуклеазная активность Aot .cio«reofu»eu» 88 может бить ис-~" пользована для выяснения характера изменения концевых нуклеотидов s ходе расщепления их неспецифическими к основаниям эндонуклеаза-. ми, т.е. выяснения вопроса о том. какие связи расщепляются такими , эндонуклеазами в первую очередь и какие - позднее.

. Полученные с помощью акзоиуклеазы Act ,cineteorua«u» 88. З'-нужлеотяды могут Сыть использованы как таковые в случае хямк- , чесхого синтеза или в виде ли- и трифосфатов в случае ферментативного синтеза нуклеиновых кислот. ,

Применение 5'-раОонукдеотидов в качестве вкусовых приврав широко проводится в Японии к (Ж, и наша лицевая промышленность уже; начинает проявлять интерес к этим приправам. В Японии в настолпее время инознновая в хуавиловая кислоты я их смеси используются преимущественно при промышленнсм изготовлении пищи, в то время как • комбинация мононатриЯ - L - глутамат /use' / о 5»-иуклеотидамж применяется в домашних условиях.

В гидролиза те, полученном с помощью препарата из . Act .cinereo-fuacu« ее , обнаруживаются инозин-, гуанозин-, аденозин-, цити- ' дин- и уркдин-5'-фосфаты. Разделение. моновуклеотидов проводилось

на яадоике дауэкс-2 по методу, разработанному Р.И,Татарской /Шреноа и др. ,1966/. .'.'.'

'Наличие 5'-fffl№ в гидролиза те свидетельствует о присутствии в ферментном препарате дезаминаэы, которая превращает аденилову» кислоту в мнозвновую, не входящую в состав РНК. Одновременное рри-сутстриа ШФ и в гидролиза те РНК махно считать преимуществом экэонуклеазы Act .cmeieofuscue SB , представляющим интерес для пищевой промышленности, ,* ' ' _

б'-фосфодиастераза Act .cinereof uec-и» BS , даже будучи ве . • Совсем очищена от примеси фосфатазы, дает при гидролизе РНК 50-55i, б'-Еуклеотидов от исходам PRtt. .Суммарное количество 5*-П№ к 5*'№Ф составляет 19$. Такой выход можно считать уже удовлетвори-' тельным /Цыреяов,1968/. Дальнейшая очистка фермента позволит использовать его еще более эффективно. ' . . ' 1

'" • ; ■ *' Обсуждение. . ■ ■

■ Ухе зарекомендовавшие себя активными продуцентами различных биологически активных веществ, актиномицетн является также источником пукле олитвческих ферментов. Работы, проведенные с отдельан-мн культурами, еще ие давали достаточной уверенности в. широком,' раопространении РНКаа среди актяномицетов. Предпринятая вами про- -верка большого количества штаммов /более 650/, -докаэавиая. чтовсе ; исследованные культуры в той или ивой мере tQjjRyiwpyer РНК-деполи-верази /ШКазн/, позволяет с большей уверенностью говорить о спо- , собвосгх актин оищетов синтезировать такие ферменты. ■

Вря исследовании большого количества штаммов мы имели в виду выяснить ее является ли способа ост» синтезировать РНКаэн таксономическим признаком. Нам не удалось установить закономерной связи между- способности» скате аировать РНКаэн • видовой принадлежность!)

лтамма. Продуцирование ГНКаз определяется птаммовыми различиями1 т и для классификации актаномядатов не может быть использовано.

Среди достаточно активных продуцентов РНКаэ нами были вше лены два штамма, идентифицированные как АсКс1пег«оГиясив 88' группы Латд» Я Ае».*о1вго»рогив .16 группы С*1е»ив ,_даодие при 'расщеплении РНК фрагменты с 5'-концевым фосфатом. Культура Лег . *• *егоароги» 16 отличается своей высокой нуклеазной активностью, - в несколько раз превышашей активность других исследованных нами -штатов, активность эта является, по-видимому, суммарной актав-ност ы> двух ферментов - экэонуклеазы, раощепляюаей РНК с образованием б'-мононуклеотядо» /К5 3.1.4.1/, и гуаниловой РНКазы /Ш 2.7.7.26/. Разделять эти две активности пока ие удалось.

Нуклеаза Асг.сШегеоГивсив 88 оказалась зкэонуклеаэой, дающей при расщеплении ГНК 5'-мононукдеотиды. Также зкзонуклеаэы, типа экэонуклеазы змеиного яда, очеяь нужны и возможность получения этого ценного фермента с помощью актяношщетов несомненно пред- . ставляет• интерес. Препарат, получаемый из АсЬ,с1яегео?иасие 88 выгодно отличается от других подобного типа препаратов тем, что в полученным о его помощью гидролазате РНК присутствует ввозиновая кислота, которая, как я гуаяиловая кислота, представляет'интерес-для патовой промышленности..

- Выяснение влияния условий культивирования на вугогеазную актив-ноигь двух штаммов показало, что для активного выделе нияв культу-ральную сраду фермента лучшими являются те источники углеродного я азотного питания, которые хоропо ассимилируются культурой. Для „ каждого продуцента нукдеаэ среди актиноыацетов приходится подбирать пятатехльвую среду, исходя иа^збирательного отношения культуры к этим источникам питания. Ори этом одтамалышеэвачеиия рй -

а степени аэрации среды совпадали для обоих изученных штаммов. 1

Изучение процессов роста и биосинтеза нуклеаз в динамике выяви-" до определенное сходство в развитии исследованных штаммов как в из* 'мен«яда основных физико-химических условий культивирования, так,и в соотношении между ростом и нуклеазной активность» культуры; что позволило сделать заключение о продуцированни РНКаз активно расту- -цей культурой. Наибольшая нуклеазнал активность наблюдалась в.конце экспоненциальной фазы развития культуры. " ' • , Ври решении задачи оптимизации процесса продуцирования,нуклеаз весьма эффективным оказалось' применение методов математического планирования эксперимента. Этими методами были определены состав оптимальной среды и оптимальное время инкубации для каждого штам-V ума отдельно. При этом Сало достигнуто увеличение нуялеазной актив-' КОСТИ Act.ola»r«ofuio'ue 88 более чем в 7 раз и Act.aatero- -eporue i6 более чем в 3 раза. Последние штамм и до оптимизации ' процесса имея высокую активность.

Довольно сложная задача определения влияния компонентов мухи на.рост и нуклеазиую активность изучаемых штаммов была также сравнительно просто решена методами математического планирования эисле-■ рямента, Наряду с выявлением роли отдельных комповевтов мука в активизации процесса, было установлено также и наличие взаимодействий между ними. При этом оказалось,,что на рост и биосинтез нук- -леаэ нашими продуцентами положительно влияет органический фосфор г ./фитин/, хотя использование последнего в качестве источника фоефо-" ра не'всегда благоприятно отражается на Оиосивтетической деятельности микроорганизмов /Еезбородов,1969/,-'~ ' Таким образом, нам удалось разрешить поставленные в работе задача, Кроме топ, в ходе работы смл емоятиромм настолмна ф«ри*а-

тер,'на котором было проведено изучение роста в биосинтеза нуклеаз■ в динамике,. так^е ролен воп^оз' о алвянаа компонентов,мука ва ■ ■ рост н вуклеазну» активность втаммов, представлявши* интерес вка-. честве продуцентов нуклеаз, Вопрос этот возник в связи с выявлением значения муки как основного1 фактора оптимальной среды для '■ —: продуцирования нуклеаз. ■ . "

' * ' ВЫВОДЫ: . . . ' .

' 1. Установлено широкое распространение ИВСаз.среди актиномице- .' . тов при исследовании свыше 650 штаммов.

3. Интенсивность продуцирования РНКаз определяется штаммовымя различиями и не является таксономическим признаком. - V ~

3. Выявлены культуры, являющиеся перспективными продуцентами ... нуклеаз* Act.»etero»pome 16 обладает нуклеазной активностью, , в несколько раз превышающей активность других,исследованных намя'.Л штаммов. По предварительным данным, основная доля »той активности -вкзонухлеазная активность, к которой примешано немного гуаниловой ... ШКазы. Вухлеаза Aot .clnereofuecu» 88 обладает,эизонуклеодитичес жим действием и при расцеплении РНК дает 5'-мовонуклеотиды /фер-меит типа экзонуклеазы змеиного яда/,'Преимуществом ферментного преврати из Act ,cinereofu«cu» 88 по сравнение с другими npe-j пяратамя этого типа, является наличие в гидршгизаге РНКивоэшювой и гуаниловой кислот, представлятощх интерес для пищевой промышленности. . "'"-i./ ■ 4. Нуклеазная активность, определяемая индивидуальными особенностями штамма, в значительной степени зависит от условий культи-: вирования. Активный биосинтез нуклеаз протекает в зависимости от специфических потребностей к^лдой культуры s источниках углеродно-

го и азотного питания, но имеет место при одинаковых значениях степени аэрации и рН среды. '' . ; _ .-

-5. Научение процессов роста я синтеза нуклеаа в динамике ' '/ в смонтированном нами настольном ферментере/ показано, что' про- -Аудирование ШКаз. осуществляется живыми растущими клетками. На ко-' шгение фермента достигает максимума до наотушгешш автолиза. Наи-\ большая нуклеазная активность наблюдается в конце экспоненциаль- • ной фазы развития культуры. ч ^

г 6. Проведена оптимизация процесса цродуцированиявуклеаз при- ", мененнем'методов математического планирования эксперимента.' Опре- -делены,оптимальные весовые соотношения компонентов, входящих в мучную среду, и время инкубации отдельно для Ас^,е1пегео£ив- ' си*:88 и для 16. Достигнуто увеличение кукдеаз-

йой активности до*.с1л»геоТияеия а8 . в 7-раз я. Aot.ввtвтo»pc^ г«> 16В 3 раза. '- ;.-. ' .."■' •'. /ч;'

! .7.' Установлено влияние компонентов муки на рост и нуклеазную активность культур Д.сг ,с1ьвгво1 ияеи» 88 а Ас1.в«гехо«рогив 16, а также'наличие взаимодействий меаду отдельнааи компонентами а их влияние.на процессы роста и биосинтез нухлеаз. Показано, *»го воз-действие муки на зги процессы.обусловлено в первую очередь входящими- в ее состав клейковиной и органическими фоофорными соедине-'.'

..'S

- 32 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Кочкина В.М., Верзилов В.В., Татарская Р.И.,1966.' Нуклеазы ■ AdtinoByee» sp. штаммы 16 и 88. Тезисы докладов на Всесоюзном совеидоии по биосинтезу ферментов микроорганизмами и применению их в народном хозяйстве. Тбилиси, И, 82, ' .

3. Татарская Р.И., Львова Т.Н., Абросимова-Амельявчик Н.М., \ Кочкина В.М,, Верэмов В.В., Кореняко А.И., 1969. Экзонуклеази, актиномицетов» сходные с фосфодизсгеразой змеиного яда. Тезисы второго Всесоюзного биохимического с"еэда. Ташкент, X, 35.

3. Верзилов В.В., Татарская Р.И., Красил ънивав H.A., 1970. ' Нуклеазы актиномицетов синей группы. Известия АН СССР, сер.биол,, * I, 133. ■ '

4. Верзилов В.В. ■ Татарская Р.И., Красильников H.A., 1970. Нуклеазы зеленой группы актиномицетов. Микробиологическая-против-девность, * I, 6. -

5. Верзилов В.В., Максимов В.Н., Красильников H.A.. 1972.

»

Влияние компонентов муки не рост и нуклеазеую активность активо— иицетов. Известия АН СССР, сер.биол., * 6, 897.. ' '

6. Верзилов В.В., Максимов В.Н.Красилышков H.A.,.1972. ' Оптимальные питательные среды для образования нукяе&з актиномице-тами. Микробиология,'т.41; * 6 , 964. -1 ■.

Материалы диссертации докладывались на Всесоюзном совещании до биосинтезу ферментов микроорганизмами и применению их в яародвом хозяйстве /Тбилиси,1968/, на Симпозиуме "Нуклеазы. Функция, препа- , ративаая химия к применение"/Москва,1968/ и на втором Всесоюзном -биохимическом с"еэде /Ташкент,1969/.

.. Л-91ЬЬ7 1 ■ . .

Подписано к ттачати "¿У" £1 г.

Усл. печ. л;. ; Тире* экз. заказ{65

Отпечатано в кнозитолыюЗ лаборатории геологического факультета ЛПГ, Ыосква; Лен горн.