Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе

Барановский, Андрей Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе"

Направахрукописи

БАРАНОВСКИЙ АНДРЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ

НУКЛЕАЗНЫЕ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ

03.00.04 биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2004 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной меди! СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН)

Научный руководитель:

к.х.н., доцент Бунева В. Н.

Научный консультант:

д.х.н., профессор Невинский Г. А.

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Щелкунов С. Н. к.х.н., доцент Ходырева С. Н.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится «<# » ¡ШЛ^Ьб-_2004 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Автореферат разослан » ^■^бУЛ^- 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Д.Х.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммуноглобулины играют важную роль в защите организма от патогенного влияния окружающей среды. Исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать различные химические реакции. Антитела, полученные иммунизацией животных стабильными аналогами переходного состояния химической реакции, оказались способными эффективно катализировать данную реакцию.

В 1989 году в крови больных астмой были впервые обнаружены природные каталитически активные антитела (или абзимы). Позднее, при ряде других аутоиммунных заболеваний, а также в молоке здоровых рожениц, были найдены антитела с различными ферментативными активностями: протеолитической, ДНК- и РНК-гидролизующей, амилолитической, протеинкиназной, нуклеотид-гидролизующей и некоторыми другими. Индукция ДНК- и РНК-абзимов обычно происходит при заболеваниях, для которых характерно повышение в крови концентрации антител к ДНК и нуклеопротеидным комплексам. Для решения вопроса о возможной биологической роли и механизмах индукции антител с нуклеазными активностями необходимы детальные исследования их ферментативных свойств при различных заболеваниях.

Рассеянный склероз является аутоиммунным заболеванием, при котором в крови и ткани мозга больных нарабатываются анти-ДНК антитела. Вследствие многофакторной природы заболевания и чрезвычайно гетерогенного клинического течения, специфического теста для своевременной диагностики рассеянного склероза пока нет, как и нет методов ранней диагностики. Изучение каталитически активных антител при данном заболевании позволит расширить представление о роли и функции антител в процессах жизнедеятельности человека в норме и при патологии, а также может привести к разработке новых методов диагностики аутоиммунных заболеваний. Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе каталитических свойств антител с нуклеазными активностями при рассеянном склерозе. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг ДНК-гидролизующей активности антител при рассеянном

склерозе, а также при ряде других заболеваний и у здоровых доноров;

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

- провести анализ РНК-гидролизующей активности антител при гидролизе различных субстратов;

-доказать, что нуклеазная активность антител является их собственным свойством;

- локализовать активный центр на молекуле ДНК-абзимов;

- изучить ферментативные и физико-химические свойства ДНК-абзимов (металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза, рН- и термостабильность}, а также провести их сравнение с соответствующими характеристиками дезоксирибонуклеаз человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что иммуноглобулины класса G при рассеянном склерозе обладают высоким уровнем нуклеазной активности. Установлено, что одним из необходимых условий индукции ДНК-абзимов является протекание в организме аутоиммунных процессов. Проведена локализация активного центра ДНК-абзимов и определены структурные элементы, участвующие в его организации. Показано, что при рассеянном склерозе образуется широкий спектр абзимов с различными ферментативными характеристиками и механизмами гидролиза ДНК, при этом состав спектра индивидуален для каждого пациента. Выявлены существенные отличия каталитических свойств антител и секреторных дезоксирибонуклеаз человека. Полученные данные могут найти применение при изучении роли антител в развитии аутоиммунных патологий и в разработке новых методов диагностики аутоиммунных заболеваний.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: The International Conference "RNA as Therapeutic and Genomics Target", 2001, Novosibirsk, Russia; The Third Internationa] Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, 2002, Novosibirsk, Russia; The Workshop "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids", 2003, Novosibirsk, Russia.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 130 страницах, содержит 25 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 272 литературных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение антител и тестирование их ДНК-гидролизующей активности

С целью исследования ДНК-абзимов при рассеянном склерозе (PC) были получены гомогенные препараты антител (AT) из крови 53 больных. Выделение иммуноглобулинов проводили по следующей схеме:

1) осаждение сульфатом аммония,

2) аффинная хроматография на колонке с Protein A-Sepharose.

Белок А обладает высоким сродством к Fc-участкам иммуноглобулинов класса G, что позволяет проводить селективную элюцию компонентов иммунных комплексов в условиях с повышенной ионной силой и в присутствии неионных детергентов. Антитела элюировали кислым буфером с рН 2.6 и сразу нейтрализовали. Электрофоретический анализ препаратов антител после выделения показал высокий уровень гомогенности (рис. 1). В процессе хранения образцов наблюдается частичный распад молекул IgG на составляющие их субъединицы, что обусловлено разрушением межцепочечных цистеиновых мостиков вследствие дисульфидного обмена. Дополнительные полосы на электрофореграмме соответствуют легкой цепи и олигомерным формам IgG, что подтверждается результатами иммуноферментного анализа. Подвижность легкой цепи заметно снижается после восстановления

внутрицепочечных S-S связей, что объясняется полным разворачиванием полипептидной цепи и уменьшением ее компактности.

Рис. 1. Электрофоретический анализ препарата AT в системе Лэммли (5 - 18% градиент ПААГ) с предварительным восстановлением S-S связей (дор. 3) или без данной обработки (дор. 1, 2): а) окраска серебром, б) и в) -окраска коньюгатом пероксидазы хрена с кроличьими анти-Н и анти-L IgG, соответственно. М - белковые маркеры, дор. 1 - препарат AT сразу после выделения; дор. 2,3 - после двух недель хранения.

При оценке ДНК-гидролизующей активности антител в качестве субстрата использовали суперскрученную (sc) форму плазмидной ДНК, что обеспечивало высокую чувствительность метода детекции. Из данные рис. 2 видно, что удельная ДНК-гидролизующая активность абзимов при рассеянном склерозе

варьирует в широких пределах в зависимости от пациента. Одни препараты АТ вызывают за время реакции только одиночные разрывы в обеих цепях плазмидной ДНК (дорожки 1 — 3), что приводит к накоплению кольцевой открытой (со) формы; другие дают множественные разрывы, что приводит к образованию линейной (Ь) формы (дорожки 4 - 6) и низкомолекулярных продуктов реакции (дорожки 7-10). Количественная оценка степени гидролиза ДНК на основании этих данных достаточно сложна, поэтому была введена 10-ти балльная система оценки уровня активности, где 0 соответствует отсутствию активности в выбранных условиях (дорожки К и К3), а баллы от 1 до 10 соответствуют номерам дорожек.

Рис. 2. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК плазмиды рВК322 в 0.8% агарозном геле после ее инкубации с АТ (50 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 °С. Дор. К1 -контрольная инкубация ДНК в отсутствие АТ; дор. К2 и К3 -инкубации с АТ крови двух здоровых доноров; дор. 1-10 - с АТ крови больных РС. Номера дорожек 1-10 соответствуют баллам шкалы активности при гидролизе плазмидной ДНК.

ДНК-гидролизующая активность АТ была обнаружена у 50 из 53 исследованных образцов крови больных РС (табл. 1). Для сравнения ДНКазная активность антител была протестирована при ряде других заболеваний, а также у здоровых доноров. Уровень активности ДНК-абзимов при рассеянном склерозе и гепатите В варьировал во всем диапазоне измерения — от 0 до 10, при этом средние величины активностей в этих группах больных (5 и 4 балла, соответственно) были существенно выше, чем при других заболеваниях. Наработка ДНК-абзимов при гепатите В является вполне закономерной: хотя вирусные гепатиты не относят к аутоиммунным заболеваниям, их течение обычно сопровождается аутоиммунными реакциями, особенно в хронической стадии болезни.

В случае больных гриппом, пневмонией, туберкулезом, тонзиллитом, язвой 12-ти перстной кишки и некоторыми формами раковых заболеваний (рак матки, молочной железы, кишечника) тестируемого уровня ДНК-абзимов не обнаружено или их активность не превышала 1 балла.

Необходимо подчеркнуть, что у 50 здоровых доноров ДНКазная активность антител не детектировалась даже за 12 ч инкубации с плазмидной ДНК, что

К, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К, К>

является дополнительным показателем чистоты образцов и эффективности используемой схемы выделения.

Таблица. 1. Относительная ДНК-гидролизующая активность препаратов AT из крови пациентов с различными заболеваниями и здоровых индивидуумов.

Заболевание Количество проанализированных препаратов антител Количество препаратов антител с активностью > 1 балл Относительная активность, балл*

Диапазон варьирования Средняя величина

Рассеянный склероз 53 50 0-10 5

Гепатит В 26 26 1 - 10 4

Грипп 22 0 0 0

Тонзиллит 6 0 0 0

Пневмония 16 4 0-1 0

Язва 12-перстной кишки 8 2 0-1 0

Раковые заболевания 15 0 0 0

Туберкулез 8 2 0-1 0

Здоровые пациенты 50 0 0 0

Таким образом, результаты тестирования ДНКазной активности в препаратах антител, выделенных из крови больных различными заболеваниями, указывают на то, что одним из необходимых условий индукции ДНК-абзимов является протекание в организме аутоиммунных реакций.

При рассеянном склерозе аутоиммунные процессы в основном локализованы в центральной нервной системе, поэтому антитела спинномозговой жидкости могут иметь гораздо большее прогностическое значение по сравнению с антителами крови. С помощью аффинной хроматографии на Protein A-Sepharose были получены гомогенные препараты IgG из ликвора пяти больных и показано, что они также обладают ДНКазной активностью. Их удельная ферментативная активность в двух случаях была сравнима с таковой для препаратов IgG из крови тех же больных. В то же время антитела, выделенные из ликвора пациентов с сотрясением мозга, ДНК-гидролизующую активность не проявляли.

Доказательство наличия у АТ-РС каталитических функций Одной из наиболее важных задач при изучении каталитических функций антител является доказательство того, что химические реакции катализируются непосредственно иммуноглобулинами, а не примесями ферментов. В настоящее

время с нашим участием разработан ряд строгих критериев для однозначного отнесения каталитической активности непосредственно к абзимам:

• электрофоретическая гомогенность препаратов AT;

• совпадение профилей поглощения белка и ферментативной активности при гель-фильтрации в кислых или щелочных условиях;

• адсорбция активности из раствора специфичными к AT аффинными сорбентами;

• проявление ферментативной активности Fab-фрагментом антител;

• выявление ферментативной активности антител после электрофореза в SDS-ПААГ (анализ активности т $Ыи);

• сравнение субстратной специфичности, оптимальных условий, термостабильности и кинетических характеристик реакции, катализируемой антителами и ферментами с аналогичной активностью.

Следует отметить, что при доказательстве принадлежности каталитической функции непосредственно AT были использованы препараты наиболее активных иммуноглобулинов в реакциях гидролиза ДНК. Это вызвано применением жестких методов обработки антител, например, гель-фильтрации при рН 2.6 или электрофореза в присутствии SDS, что приводит к снижению удельной активности образцов. Инкубация препарата антител в течение 30 мин при кислых значениях рН с последующей гель-фильтрацией в таких же условиях обеспечивает диссоциацию нековалентных комплексов и последующее разделение их компонентов. Для всех исследованных препаратов антител профиль оптической плотности совпадал с профилем ДНК-гидролизующей активности. Аналогичные результаты были получены при проведении "щелочного шока".

ДНК-гидролизующая активность полностью ингибировалась после предынкубации антител со специфичными к IgG аффинными сорбентами (рис. 3), что также свидетельствует о ферментативной чистоте препаратов

абзимов. Выполнение остальных критериев будет рассмотрено ниже при детальном изучении ферментативных свойств ДНК-абзимов.

Сравнительный анализ ферментативных и физико-химических свойств АТ-РС и ДНКаз человека

Дальнейшие исследования ДНК-абзимов при рассеянном склерозе проводились на высокоочищенных препаратах IgG, чтобы исключить влияние на ДНК-гидролизующую активность возможных примесей IgA и IgM. Схема выделения состояла из следующих стадий:

а) аффинная хроматография на Protein A-Sepharose,

б) гель-фильтрация на Sepharose 6B-CL,

в) ионообменная хроматография на CM-Trisacryl.

Для сравнения ферментативных свойств ДНК-абзимов и секреторных дезоксирибонуклеаз были выделены ДНКазы первого и второго типа из мочи человека по известным методикам. Предварительное разделение кислой и нейтральной ДНКаз мочи осуществляли ионообменной хроматографией на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Затем проводили аффинную хроматографию на колонке с ДНК-целлюлозой в негидролизующих условиях, которые отличались для разных типов ДНКаз.

Исследование зависимости реакции гидролиза плазмидной ДНК от ионов двухвалентных металлов, таких как магний, марганец, цинк и кальций, показало, что наилучшими активаторами антител являются ионы магния и марганца. Для всех исследованных образцов активирующий эффект убывал в последовательности: и только у одного препарата

уровень активности в присутствии ионов был выше, чем в присутствии Из данных табл. 2 видно, что у одного из препаратов IgG ДНК-гидролизующая активность не ингибировалась полностью ЭДТА, что говорит о присутствии Ме2+-независимой субфракции в суммарном пуле абзимов. По характеру металл-зависимости ДНК-абзимы ближе всего к ДНКазе I человека, но при этом между ними наблюдается принципиальное различие в отношении синергичного влияния ионов Mg2+ и Са2+ на ДНК-гидролизующую активность. В случае ДНКазы I добавление ионов Са2* в реакционную смесь, содержащую 10 мМ MgCl2, приводит к увеличению скорости реакции приблизительно в 50 раз, в то время как для IgG данный эффект был незначительным. NaCl оказывает заметный ингибирующий эффект на ДНК-гидролизующую активность антител и ДНКаз, при этом препараты абзимов демонстрируют заметные различия в значениях I50.

Таблица 2. Данные по влиянию ионов металлов на ДНК-гидролизующую активность АТ и ДНКаз человека.

Катализатор Наиболее эффективные Ме2+-активатор ы V5MM3ffTA- 100%* ** VMg + Ca Значения I50 для NaCl, мМ

ViOMMMg Vtrfg + EGTA

IgG-ni Mn2+, Mg2+ 7 1.1 105

IgG-m 0 1.3 70

IgG-ПЗ 0 0.9 85

IgG-114 0 1.1 90

ДНКаза I Mg2+ + Са2+, Мп2+ 0 52.0 60

ДНКаза II не нужны 160 1.0 75

* - отношение скоростей реакции в присутствии 10 мМ К^С^ и 5 мМ ЭДТА ** - отношение скоростей реакции в присутствии 10 мМ М§С12 + 0.5 мМ СаС12 и 10 мМ М8С12 + 0.3 мМ ЕСГА. Погрешность измерений не превышала 15%.

При определении оптимальных условий было обнаружено, что антитела крови больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют плазмидную ДНК в широком диапазоне значений рН, и кривая зависимости ДНКазной активности от концентрации ионов водорода была индивидуальной для каждого из исследованных образцов. На рис. 4а представлены данные для двух препаратов IgG, имеющих значительные отличия в характере рН-зависимости. Обобщая полученные данные, можно заключить, что в большинстве случаев максимальный уровень активности ДНК-абзимов соответствует нейтральной или слабощелочной области рН. Наблюдаемые вариации рН-зависимости реакции гидролиза ДНК, скорее всего, отражают различия в организации каталитического центра абзимов, либо его окружения. Кривые рН-зависимости для кислой и нейтральной ДНКаз мочи человека имеют классический вид,

60 70 80 90 50 60 70 80 90

рН рН

Рис. 4. Зависимость ДНК-гидролизующей активности 2-х препаратов ^О-РС (а) и ДНКаз мочи человека (б) от рН реакционной смеси. 1 - ДНКаза II, 2 - ДНКаза I.

близкий к колоколообразному, с одним пиком активности в области рН 5.0 и 7.2, соответственно (рис. 46). Нейтральная дезоксирибонуклеаза проявляет заметную активность в области рН-оптимума ДНКазы II, что связано с повышением сродства к субстрату при снижении рН среды.

Таким образом, препараты IgG по оптимальным условиям проявления ДНК-гидролизующей активности ближе всего к ДНКазе I, чем к ДНКазе II, но не совпадают ни с одним из этих ферментов. Полученные результаты указывает на то, что ДНКазная активность антител является их собственным свойством, а не обусловлена примесями совыделяющихся ферментов.

Следует отметить, что кислая и нейтральная ДНКазы являются единственными ферментами крови, активными по отношению к двуцепочечной ДНК. Нейтральная ДНКаза человека гидролизует ДНК посредством внесения одноцепочечных разрывов, которые отстоят друг от друга на произвольном расстоянии, поэтому скорость накопления со-формы гораздо выше таковой для линейной формы (рис. 5). Вначале происходит количественный переход sc-формы плазмидной ДНК в со-форму и только после этого начинает накапливаться линейная форма, образование которой обусловлено совпадением одноцепочечных разрывов в противоположных цепях ДНК. Аналогичный характер гидролиза плазмиды pBluescript наблюдался и для ДНКазы II, а также для большинства препаратов IgG-PC. С другой стороны, в случае нескольких образцов AT скорость появления линейной формы плазмиды была сравнима с таковой для со-формы (дор. 9), что не характерно для секреторных

дезоксирибонуклеаз человека.

Рис. 5. Электрофоретический анализ продуктов гидролиза ДНК плазмиды рЬИиеяспр! в 1.2% агарозном геле после ее инкубации с препаратами ^в-РС и ДНКазы I человека

Дор 1 - 8 - последовательные двукратные разбавления ДНКазы I; дор. 9, 10 -препараты из крови 2-х больных РС; дор. 11 - контрольная инкубация ДНК в отсутствие ферментов.

В плане сравнения ДНК-гидролизующих антител с ДНКазами человека представляет интерес изучение их стабильности, а именно, устойчивости к воздействию высоких температур и закислению рН среды. Наиболее устойчивой к кислому шоку оказалась ДНКаза II, которая характеризуется самым кислым рН-оптимумом из сравниваемых биокатализаторов (рис. 6а).

Интересно, что IgG-абзимы проявляют большую устойчивость к закислению среды по сравнению с ДНКазой I, их удельная активность снизилась в 2 раза после инкубации при рН 2.5.

Ijo днки.1 ДНКЮ.П Рис.6. Влияние рН раствора (а) и

температуры предынкубации (б) на ДНК-гидролизующую активность ^О-РС и ДНКаз человека. В случае каждого препарата за 100% принята активность исходного образца.

Иная картина наблюдалась при исследовании температурной стабильности ДНК-гидролизующих AT и ДНКаз человека (рис. 66). Самыми термолабильными оказались IgG-абзимы, которые практически полностью денатурировали после инкубации при 65 °С в течение 10 мин. Кислая и нейтральная ДНКазы мочи человека инактивировались при 80 и 75 °С, соответственно. Полученные данные указывают на существенные различия между ДНК-гидролизующими антителами и ДНКазами человека в отношении температурной и рН-стабильности, что отражает особенности их структурной организации.

Локализация активного центра ДНК-абзимов

Одной из важных задач при изучении абзимов является локализация активного центра, что позволяет оценить вклад составляющих их субъединиц в организацию активного центра. Организация активного центра связана с типом ферментативной активности абзимов и зависит от характера аутоиммунных процессов, протекающих в организме больного.

На основании определенных структурных различий и антигенных свойств легкие цепи ^ человека подразделяются на два типа: к^ и Х-Ь. Значительный интерес представляет установление вклада AT с легкой цепью того или иного типа в суммарную активность ДНК-абзимов. Для 4-х препаратов ДНК-абзимов было проведено хроматографическое разделение по типу легкой цепи с помощью аффинной хроматографии на соответствующих сорбентах. Согласно полученным данным, приблизительно 20-30% суммарной активности связывалось с анти-Х IgG-Sepharose, и 70-80% - с анти-к-сорбентом, что

отражает различие в содержании ЛХ с легкой цепью того или иного типа в организме человека. Следует отметить, что при других аутоиммунных патологиях вклад Х-ЛХ в суммарную активность абзимов значительно ниже. Увеличение доли Х-ЛХ в составе пула ДНК-абзимов при РС может указывать на увеличение спектра активных центров и реализуемых абзимами гидролитических механизмов.

Молекулы антител являются сложными олигомерными структурами, и одним из способов локализации их активного центра является расщепление с помощью растительной протеиназы - папаина, в результате чего получается БаЬ- и Бе-фрагменты. В состав БаЬ-фрагмента иммуноглобулинов входят легкая цепь и фрагмент тяжелой цепи, содержащие антиген-связывающие вариабельные домены. БаЬ-фрагмент выделяли последовательно в несколько хроматографических стадий и его гомогенность была подтверждена электрофоретическим анализом в системе Лэммли. Эффективность гидролиза плазмидной ДНК полученным БаЬ-фрагментом оказалась в 2 раза выше по сравнению с исходным IgG. Полученные данные указывают на локализацию активного центра ДНК-абзимов в области БаЬ-фрагмента и, в совокупности с данными по их поликлональности, свидетельствуют об участии аминокислот вариабельных доменов антител в организации активного центра.

Однозначным и наглядным методом идентификации ферментативной функции белков является тестирование их активности в геле после электрофоретического разделения в присутствии SDS, который разрушает любые нековалентные комплексы (рис. 7). В качестве субстрата использовали меченую ник-трансляцией ДНК фага X, которая присоединялась к полиакриламидному гелю в процессе его полимеризации.

а б

Рис. 7. Тестирование ДНКазной активности РаЬ-фрагмента и ДНКаз после электрофорети-ческого разделения белков в 5 - 18% ПААГ (система Лэммли), содержащем радиоактивно меченную ДНК (3 нг/мл):

а) окраска серебром. М - белковые маркеры, дор. 1 - да, дор. 2 - да + 10 мМ ДТТ.

б) радиоавтограф геля. Дор. 1 - дор. 2 -РаЬ-фрагмент, дор. 3 - + 0.5 мМ ДТТ, дор. 4 - да + 10 мМ ДТТ, дор. 5 - чДНКаза I, дор. 6 - бДНКаза I, дор. 7 - чДНКаза I + 10 мМ ДТТ, дор. 8 - бДНКаза I + 10 мМ ДТТ.

В тех участках геля, где происходит расщепление ДНК, радиоактивность уменьшается, что приводит к появлению светлых полос на радиоавтографе. Положение полос на электрофореграмме (дор. 1 — 3), в которых проявляется ДНКазная активность, совпадает с положением IgG, РаЬ-фрагмента и отдельной легкой цепи, имеющих молекулярные массы 150, 50 и 25 кДа, соответственно. Для отделения легкой цепи использовали мягкие условия (0.5 мМ ДТТ), при которых происходит восстановление большей части межцепочечных дисульфидных связей, но не затрагиваются внутрицепочечные.

Для всех исследованных препаратов ДНК-абзимов при РС активность в области электрофореграммы, соответствующей легким цепям, была сопоставимой или в несколько раз выше по сравнению с таковой для интактных молекул IgG. Это свидетельствует о том, что одиночные легкие цепи ДНК-гидролизующих антител способны эффективно гидролизовать ДНК, и основные каталитические структуры расположены на них. В качестве положительного контроля были использованы препараты ДНКазы I из поджелудочной железы быка и мочи человека, имеющие молекулярные массы 31 и 33 кДа, соответственно. Следует отметить, что активность легких цепей антител, а также обеих ДНКаз, полностью исчезала после восстановления всех дисульфидных связей в образце, что говорит о важности внутрицепочечных 8-8 мостиков в формировании активной конформации данных биокатализаторов.

Исследование гидролиза олигодезоксирибонуклеотидов

Эффективность гидролиза одноцепочечных ДНК-субстратов препаратами антител была в среднем в 3 - 5 раз ниже по сравнению с плазмидной ДНК, тогда как для кислой и нейтральной ДНКаз человека эта разница достигала нескольких порядков. Следует отметить, что многие препараты АТ-РС проявляли как нуклеазную активность, так и фосфатазную, приводящую к отщеплению 5'-концевого фосфата, поэтому при гидролизе олигонуклеотидов использовали только те препараты АТ, у которых уровень ДНКазной активности значительно превышал фосфатазную.

Большинство исследованных препаратов IgG гидролизует гомо- и гетероолигонуклеотиды практически по всем фосфодиэфирным связям (рис. 8; дор. 6, 11), однако в некоторых случаях ДНК-абзимы демонстрировали избирательность к определенным последовательностям субстрата (дор. 3). Кажущееся отсутствие специфичности ДНК-абзимов, проявляемое при расщеплении олигонуклеотидов (0№), может объясняться их поликлональностью. Скорее всего, суммарный пул ДНК-гидролизующих АТ

состоит из нескольких субфракций, каждая из которых обладает определенным типом активности. Данное предположение подтверждается результатами влияния ЭДТА, ЭГТА и фосфата калия на специфичность расщепления олигонуклеотидов. При добавлении данных соединений в реакционную смесь степень ингибирования гидролиза по разным положениям субстрата сильно отличалась. Эти результаты также свидетельствуют о том, что препараты IgG-РС содержат субфракции, проявляющие различный характер Ме2+-зависимости.

В процессе гидролиза ДНК, катализируемом ДНКазой I, образуются олигонуклеотиды с 5'-фосфатом на конце, тогда как в случае ДНКазы II накапливаются З'-фосфаты (рис. 9). С другой стороны, при использовании одних препаратов ДНК-абзимов образуются продукты с фосфатом на 5'-конце (дор. 2, 3), в случае других - с фосфатом на З'-конце (дор. 4), а иногда при анализе продуктов расщепления наблюдается смесь 5'- и З'-фосфатов (дор. 1).

устойчивость к расщеплению, в то время как практически все препараты АТ обладали заметным уровнем экзонуклеазной активности (рис. 9). Более того, в зависимости от пациента ДНК-абзимы проявляют различные активности: 3'-экзонуклеазную (дор. 4), 3'- и 5'-экзонуклеазную (дор. 2), а также эндо- и экзонуклеазную (дор. 1, 3). Вполне возможно, что при увеличении выборки изучаемых образцов могут быть получены все комбинации эндо- и экзонуклеазных активностей.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о поликлональности ДНК-гидролизующих АТ при рассеянном склерозе, причем в организме каждого больного нарабатывается индивидуальный репертуар абзимов.

Кинетические характеристики реакции гидролиза ДНК Для измерения кинетических параметров гидролиза олигонуклеотидов был использован препарат АТ, отличающийся определенной специфичностью, которая не изменялась при ингибировании реакции гидролиза высокими концентрациями ДНК. Из данных таблицы 4 видно, что абзимы характеризуются достаточно высоким сродством по отношению к одноцепочечным субстратам. Каталитическая эффективность гидролиза декатимидилата и двух гетероолигонуклеотидов была практически одинаковой, тогда как величины Кт и кш отличались более чем на порядок.

Таблица 3. Кинетические характеристики реакции гидролиза различных 0№ препаратом ^в-РС.

(Ж Кт_ нМ ксаь мин'1 Кх/Кт ■ Ю-6, мин'-М"1

сГГСОСССОССАСТССТ 570 1.0 1.8

(ЗАОСАОТСОСОСССОА 250 0.26 1.0

¿(рТ)10 25 0.031 1.2

Погрешность измерений не превышала 20 - 40%.

Следует отметить, что секреторные дезоксирибонуклеазы человека характеризуются гораздо более высокими значениями Кт в реакции гидролиза 0№. Например, у фосфодиэстеразы I величина Кт для 15-ти-звенного равна 50 мкМ, а в случае кислой и нейтральной ДНКаз мочи человека значения Кт также превышают 10'5 М. Величина сродства данного препарата к

двуцепочечной ДНК была определена из данных по ингибированию гидролиза декатимидилата с помощью ДНК плазмиды рВШезепр!. Константа ингибирования равнялась 0.34 нМ или 0.68 мкг/мл, что в 24 раза ниже значения Кт полученного для ДНКазы I человека.

Необходимо отметить, что кажущиеся значения А^ рассчитывали, исходя из общей концентрации АТ в реакционной смеси без учета доли ДНК-абзимов в общем пуле которая обычно не превышает нескольких процентов.

Величины сродства порядка 109 - 106 М характерны для взаимодействий типа "антиген-антитело", и они на 1 - 2 порядка ниже величин Кт для всех известных на данный момент секреторных ДНКаз человека.

Исследование РНК-гидролизующей активности антител

Как показано ранее при других заболеваниях, высокоочищенные препараты антител способны гидролизовать не только ДНК, но и РНК, при этом РНКазная активность обычно на один-два порядка выше ДНКазной активности того же образца. Учитывая это, была проанализирована возможность гидролиза РНК антителами при рассеянном склерозе. Удельные активности антител при гидролизе поли(и) оказались достаточно высокими и, как и в случае гидролиза ДНК, значительно варьировали в зависимости от пациента. Образцы с высоким уровнем ДНКазной активности обладали также высокой РНК-гидролизующей активностью, при этом у трех образцов удельная активность при гидролизе поли(и) превышала таковую для РНКазы А в 2 - 3 раза.

Для 4-х наиболее активных препаратов в гидролизе различных РНК-субстратов был проведен анализ субстратной специфичности (табл. 4). С целью сравнения приведены также данные для различных РНКаз и препаратов абзимов из крови больных другими заболеваниями. Следует отметить, что исследуемые образцы были получены с помощью 3-х стадийной схемы очистки,

указанной выше. Для двух из этих образцов с помощью наиболее жестких критериев, таких как гель-фильтрация при кислых значениях рН и анализ активности и вИи, было показано, что РНК-гидролизующая активность является собственным свойством иммуноглобулинов класса в.

Субстратная специфичность антител крови больных рассеянным склерозом была индивидуальна практически для каждого пациента, но тем не менее сохранялась общая тенденция уменьшения скорости расщепления субстратов в порядке: суммарная дрожжевая РНК > поли(С) > поли(Ц) > поли(А). Более того, последовательность субстратов в данном ряду уникальна для каждого из приведенного в таблице А ИЗ. Например, дрожжевая РНК являлась лучшим субстратом для АТ-РС и АТ-СКВ, поли(С) - для препаратов АТ в случае полиартрита и аутоиммунного тиреоидита, поли(А) - для АТ крови больных гепатитом.

Таблица 4. Величины относительных удельных активностей препаратов IgG из крови больных различными АИЗ в сравнении с РНКазой А и РНКазами крови человека в реакции гидролиза различных полирибонуклеотидов и сСМР

Катализатор * Относительная удельная активность , %

сСМР поли(и) поли(А) поли(С) Едрож. РНК

РНКаза А 100 2 (200) 0.01 100(10000) 15 (1500)

АТ-РС 4-8 0.6-4.0 (8) 0.1-0.2 5-7 (43) 10-15(83)

АТ-Гепатит В 4-5 0.02 (0.3) 0.06 0 —

РНКазы крови человека — 3-16 0 100 , 5-10

АТ-СКВ 35 0.5-0.8 (4) 0.2 4(20) 5(25)

АТ-Полиартрит 4 0.2(10) 0.02 14(700) 3(150)

АТ-АИТ 10 0.2(10) 0.02 10(500) 2(100)

Удельные активности оценены в расчете на 1 моль белка. Удельные активности РНКазы А в реакции гидролиза поли(С) и сСМР приняты за 100%; удельные активности каждого из катализаторов в реакции гидролиза поли(и), поли(А) и суммарной РНК оценивались относительно реакции гидролиза поли(С) РНКазой А. В скобках приведены усредненные величины отношения скорости расщепления данного полимера к скорости расщепления поли(А)

Полученные данные указывают на то, что для каждого из заболеваний характерен свой собственный репертуар РНК-гидролизующих AT. Абзимы крови больных рассеянным склерозом существенно отличаются по субстратной специфичности как от РНКазы А, так и от РНКаз крови человека. Следует отметить, что препараты антител расщепляют поли(А) на порядок эффективнее по сравнению с этими рибонуклеазами.

Выводы

1. Впервые показано, что иммуноглобулины класса G из сыворотки крови и спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом, а также антитела крови больных гепатитом В, обладают высоким уровнем ДНК-гидролизующей активности. При заболеваниях, не сопровождающихся аутоиммунными процессами (грипп, тонзиллит, пневмония, язва 12-ти перстной кишки, туберкулез, различные типы рака), ДНКазная активность антител либо не тестировалась, либо была очень низкой. Препараты антител из крови здоровых доноров не содержат детектируемых количеств ДНК-абзимов.

2. Впервые показано, что антитела крови больных рассеянным склерозом способны эффективно гидролизовать РНК. Анализ субстратной специфичности позволяет сделать вывод об отличии репертуара РНК-гидролизующих антител при рассеянном склерозе и других заболеваниях, что предполагает различный механизм индукции абзимов при разных патологиях. На основании выполнения общепринятых критериев показано, что нуклеазные активности являются собственным свойством IgG при рассеянном склерозе.

3. С помощью ряда методов (аффинная хроматография, ферментативный протеолиз, анализ активности in situ) установлено, что в состав абзимов, специфичных к двухцепочечной ДНК, входят легкие цепи к- и типа, активный центр располагается в Fab-фрагменте молекулы IgG, и отдельные легкие цепи способны эффективно гидролизовать ДНК.

4. Показано, что при рассеянном склерозе образуется широкий спектр абзимов с различными ферментативными характеристиками и механизмами гидролиза ДНК, при этом состав спектра индивидуален для каждого пациента. Каталитические свойства антител и секреторных дезоксирибонуклеаз человека (сродство к субстратам, металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность) существенно отличаются.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Барановский А. Г., Матюшин В. Г., Власов А. В., Забара В. Г., Наумов В. А., Жьеже Р., Бунева В. Н., Невинский Г. А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. Биохимия. 1997. Т. 62. С. 1590-1599.

2. Барановский А. Г., Канышкова Т. Г., Могельницкий А. С, Наумов В. А., Бунева В. Н., Гусев Е. И., Бойко А. Н., Заргарова Т. А., Фаворова О. О., Невинский Г. А. Поликлональные антитела из крови и спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют ДНК и РНК. Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1459-1469.

3. Невинский Г. А., Барановский А. Г., Могельницкий А. С, Доронин Б. М., Бунева В. Н. ДНК-гидролизующие антитела в диагностике рассеянного склероза. Консилиум. 2000. Т. 5. С. 19-24.

4. Baranovskii A. G., Ershova N. A., Buneva V. N., Kanyshkova Т. G., Mogelnitskii A. S., Doronin В. М., Boiko A. N., Gusev E. I., Favorova О. О., Nevinsky G. А. Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis. Immunol. Lett. 2001. V. 76. P. 163-167.

5. Барановский А. Г., Бунева В. Н., Невинский Г. А. Дезоксирибонуклеазы человека (обзор). Биохимия. 2004. Т. 69. С. 725-742.

Подписано к печати "19" октября 2004г. Формат бумаги 60x84 1/16. Объём 2 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 1326. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 356-600

»20 2 5 5

РНБ Русский фонд

2005-4 21674

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барановский, Андрей Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Каталитически активные антитела

1.1.1. Искусственные абзимы

1.1.2. Природные абзимы

1.1.2.1. Абзимы-протеазы

1.1.2.2. Абзимы-нуклеазы

1.1.2.3. Природные абзимы с другими активностями

1.1.2.4. Механизмы возникновения КААТ

1.1.2.5. Биологическая роль КААТ

1.2. Рассеянный склероз

1.3. Дезоксирибонуклеазы человека

1.3.1. ДНКаза

1.3.2. ДНКаза II

1.3.3. Фосфодиэстераза I

1.3.4. ДНКаза DFF

1.3.5. Эндонуклеаза G

1.3.6. Лактоферрин

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ

2.2.1. Исследуемая группа больных рассеянным склерозом и группы сравнения

2.2.2. Получение сульфат-аммонийного осадка белков крови

2.2.3. Выделение антител крови аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose

2.2.4. Выделение антител из спинномозговой жидкости

2.2.5. Очистка IgG с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии

2.2.6. Аффинная хроматография IgG на ДНК-целлюлозе

2.2.7. Концентрирование препаратов белка

2.2.8. Определение концентрации белка

2.2.9. Электрофоретическйй анализ белков

2.2.10. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивание коллоидным раствором серебра

2.2.11. Иммуноферментное окрашивание IgG и их субъединиц

2.2.12. Синтез конъюгатов IgG кролика против легких и тяжелых цепей IgG человека с пероксидазой хрена

2.2.13. Проведение рН-шока для препаратов антител

2.2.14. Исследование взаимодействия ДНК-абзимов с аффинными сорбентами

2.2.15. Разделение молекул IgG с легкими цепями к- и А.-типа

2.2.16. Получение и очистка Fab-фрагментов IgG

2.2.17. Выделение ДНКазы I человека

2.2.18. Выделение ДНКазы II человека

2.2.19. Получение и очистка ДНК плазмиды pBluescript

2.2.20. Получение и очистка 5'-[ Р]-меченых олигонуклеотидов

2.2.21. Определение активности антител в реакции гидролиза ДНК плазмиды pBluescript

2.2.22. Экспресс-оценка ДНК-гидролизующей активности антител

2.2.23. Определение активности ДНКаз в реакции гидролиза ДНК плазмиды pBluescript

2.2.24. Определение активности ДНКаз по Кунитцу

2.2.25. Исследование рН-зависимости реакции гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз

2.2.26. Исследование металл-зависимости реакции гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз

2.2.27. Исследование кислотолабильности IgG-абзимов и ДНКаз человека

2.2.28. Исследование термостабильности IgG-абзимов и ДНКаз человека

2.2.29. Исследование гидролиза дезоксирибоолигонуклеотидов препаратами IgG и ДНКаз человека

2.2.30. Тестирование нуклеазной активности в геле

2.2.31. Определение кинетических параметров реакции гидролиза олигонуклеотидов препаратами IgG

2.2.32. Определение активности антител в реакции гидролиза полирибонуклеотидов исСМР

2.2.33. Определение РНКазной активности антител в реакции гидролиза (pU)io методом кислотонерастворимых осадков

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение препаратов антител из крови человека

3.2. Скрининг ДНК-гидролизующей активности в препаратах антител

3.3. Доказательство наличия у антител крови больных рассеянным склерозом каталитических функций

3.3.1. "Кислый шок" препаратов антител

3.3.2. Связывание ДНК-гидролизующих антител аффинными сорбентами

3.4. Получение высокоочищенных препаратов IgG из крови больных рассеянным склерозом

3.5. Взаимодействие ДНК-абзимов с ДНК-целлюлозой

3.6. Выделение ДНКаз из мочи человека

3.7. Определение оптимальных условий гидролиза ДНК препаратами IgG и ДНКаз человека

3.7.1. Исследование металл-зависимости

3.7.2. Исследование рН-зависимости

3.8. Сравнение рН- и термостабильности ДНК-абзимов и ДНКаз человека

3.9. Локализация активного центра ДНК-гидролизующих антител при рассеянном склерозе

3.9.1. Определение типа легких цепей ДНК-абзимов

3.9.2. Каталитическая активность Fab-фрагментов IgG

3.9.3. Тестирование ДНК-гидролизующей активности антител in situ

3.10. Исследование гидролиза дезоксирибоолигонуклеотидов препаратами IgG и

ДНКазами человека

3.11. Кинетические характеристики реакции гидролиза ДНК препаратами IgG

3.12. Сравнение субстратной специфичности препаратов антител и РНКаз

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе"

Иммунная система высших организмов играет важнейшую роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды. Иммуноглобулины являются одним из основных специфических факторов иммунитета, направленных против чужеродного соединения, явившегося причиной их возникновения. До недавнего времени считалось, что результатом взаимодействия антиген-антитело (АГ-АТ) является формирование иммунного комплекса за счет нековалентных связей, а образование или разрыв ковалентных связей невозможен. Исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать различные химические реакции. Теоретическое предсказание данного явления было сделано В. Дженксом в 1969 году [1], однако для практического подтверждения его гипотезы потребовалось не одно десятилетие. В настоящее время абзимология - область биохимии, изучающая каталитически активные антитела (КААТ), является интенсивно развивающимся направлением науки, а число известных примеров химических превращений, катализируемых абзимами, превышает сотню. Субстратная специфичность абзимов в ряде случаев выше, чем ферментов; описаны примеры КААТ, которые катализируют химические реакции с эффективностью, близкой к эффективности ферментов с аналогичной активностью. Более того, существуют примеры абзимов, для которых не известны ферменты с аналогичной активностью. В связи с этим, дизайн антител с заданной каталитической специфичностью имеет огромный спектр возможностей в биотехнологии и медицине.

Новые перспективы в области изучения КААТ возникли с открытием в 1989 году природных абзимов: аутоантитела к вазоактивному интестинальному пептиду, полученные из крови больных бронхиальной астмой, не только связывали, но и эффективно гидролизовали данный пептид. Позднее, при ряде других аутоиммунных заболеваний, а также в молоке здоровых рожениц, были обнаружены абзимы с различными ферментативными активностями: протеолитической, ДНК- и РНК-гидролизующей, амилолитической, протеинкиназной, нуклеотид-гидролизующей и некоторыми другими. Появление каталитически активных антител в крови человека связывают с протеканием в организме аутоиммунных процессов, когда происходит срыв толерантности к собственным антигенам и наработка антител к ним.

Рассеянный склероз (PC) - хроническое, прогрессирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), для которого характерна многофакторная природа и чрезвычайно гетерогенное клиническое течение. Основную роль в патогенезе PC играет сочетание хронического воспалительного и нейродегенеративного процессов, сопровождающихся аутоиммунными реакциями. Хотя аутоиммунный ответ в основном направлен к компонентам миелина - белково-липидной оболочке проводящих нервных волокон, в крови и ткани мозга больных также нарабатываются антитела к ДНК и нуклеопротеидным комплексам, что указывает на возможность индукции каталитических анти-ДНК AT при PC.

Цель настоящей работы заключалась в детальном анализе каталитических свойств антител с нуклеазными активностями при рассеянном склерозе. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг ДНК-гидролизующей активности антител при рассеянном склерозе, а также при ряде других заболеваний и у здоровых доноров;

- провести анализ РНК-гидролизующей активности антител при гидролизе различных субстратов;

- доказать, что нуклеазная активность антител является их собственным свойством;

- локализовать активный центр на молекуле ДНК-абзимов;

- изучить ферментативные и физико-химические свойства ДНК-абзимов (металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза, рН- и термостабильность), а также провести их сравнение с соответствующими характеристиками дезоксирибонуклеаз человека.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Барановский, Андрей Геннадьевич

выводы

На основании выполнения общепринятых критериев показано, что нуклеазные активности являются собственным свойством IgG при рассеянном склерозе.

3. С помощью ряда методов (аффинная хроматография, ферментативный протеолиз, анализ активности in situ) установлено, что в состав абзимов, специфичных к двухцепочечной ДНК, входят легкие цепи к- и А.-типа, активный центр располагается в Fab-фрагменте молекулы IgG, и отдельные легкие цепи способны эффективно гидролизовать ДНК.

4. Показано, что при рассеянном склерозе образуется широкий спектр абзимов с различными ферментативными характеристиками и механизмами гидролиза ДНК, при этом состав спектра индивидуален для каждого пациента. Каталитические свойства антител и секреторных дезоксирибонуклеаз человека (сродство к субстратам, металл- и р Н- з ависимо сть, субстратная специфичность) существенно отличаются.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Барановский, Андрей Геннадьевич, Новосибирск

1. Jencks W. Catalysis in chemistry and enzymology (1969) New York, McGraw-Hill.

2. Лейтмен Г., Гуд P.M. Иммуноглобулины (1981) Москва, Мир.

3. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A.Catalytic antibodies (1986) Science, 234, 15661570.

4. Pollack S.J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an antibody (1986) Science, 234, 1570-1573.

5. Janda K.D., Schloeder D., Benkovic S.J., Lerner R.A. Induction of an antibody that catalyzes the hydrolysis of an amide bond (1988) Science, 241, 1188-1191.

6. Benkovic S.J., Adams J.A., Borders C.L.J., Janda K.D., Lerner R.A. The enzymic nature of antibody catalysis: development of multistep kinetic processing (1990) Science, 250, 11351139.

7. Krebs J.F., Siuzdak G., Dyson H.J., Stewart J.D., Benkovic S.J. Detection of catalytic antibody species acylated at the active site by electrospray mass spectrometry (1995) Biochemistry, 34, 720-723.

8. Zhou G.W., Guo J., Huang W., Fletterick R.J., Scanlan T.S. Crystal structure of a catalytic antibody with a serine protease active site (1994) Science, 265, 1059-1064.

9. Guo J., Huang W., Zhou G.W., Fletterick R.J., Scanlan T.S. Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-state analog (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1694-1698.

10. Schultz P.G., Lerner R.A. From molecular diversity to catalysis: lessons from the immune system (1995) Science, 269, 1835-1842.

11. Nevinsky G.A., Favorova O.O., Buneva B.N. Catalytic antibodies: New characters in the protein repertoire (2002) Protein-protein interactions. A molecular cloning manual (Ed. Golemis, E.), New York, Cold Spring Harbor Lab. Press, 523-534.

12. Невинский Г.А., Семенов Д.В., Бунева B.H. Каталитически активные антитела (абзимы) индуцированные стабильными аналогами переходного состояния (2000) Биохимия, 65, 1233-1244.

13. Paul S., Sun М., Mody R., Tewary H.K., Stemmer P., Massey R.J., Gianferrara Т., Mehrotra S., Dreyer Т., Meldal M. Peptidolytic monoclonal antibody elicited by a neuropeptide (1992) J. Biol. Chem., 267, 13142-13145.

14. Slobin L.I. Preparation and some properties of antibodies with specificity toward p-nitrophenyl esters (1966) Biochemistry, 5, 2836-2841.

15. Кульберг А., Дочева В., Тарханова И.А., Спивак В.А. О протеолитической активности в препаратах очищенного иммуноглобулина G и антител кролика (1969) Биохимия, 34, 1178-1183.

16. Paul S., Voile D.J., Beach С.М., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody (1989) Science, 244, 11581162.

17. Paul S., Mei S., Mody В., Eklund S.H., Beach C.M., Massey R.J., Hamel F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies (1991) J. Biol. Chem., 266, 16128-16134.

18. Mei S., Mody В., Eklund S.H., Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains (1991) J. Biol. Chem., 266, 15571-15574.

19. Paul S., Li L., Kalaga R., Wilkins-Stevens P., Stevens F.J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment (1995) J. Biol. Chem., 270, 15257-15261.

20. Paul S., Kalaga R., Gololobov G.V., D. B. Natural catalytic immunity is not restricted to autoantigenic substrates (2000) Appl. Biochem. Biotechnol., 83, 71-84.

21. Thiagarajan P., Dannenbring R., Matsuura K., Tramontano A., Gololobov G., Paul S. Monoclonal antibody light chain with prothrombinase activity (2000) Biochemistry, 39, 6459-6465.

22. Sun M., Gao Q.S., Li L., Paul S. Proteolytic activity of an antibody light chain (1994) J. Immunol., 153, 5121-5126.

23. Gao Q.S., Paul S. Site-directed mutagenesis of antibody-variable regions (1995) Methods Mol. Biol., 51, 319-327.

24. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies (1995) J. Immunol., 154, 3328-3332.

25. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук О.А., Габибов А.Г. Антиидиотипические и природные каталитически активные антитела (1991) Молекуляр. биология, 25, 593601.

26. Татишвили Н.И., Меунаргия В.В., Соселия Т.С. Молекулярные и клеточные механизмы иммунологического распознавания (1988) Тбилиси, Меиниереба.

27. Pisetsky D.S. The immunologic properties ofDNA (1996) J. Immunol., 156, 421-423.

28. Гололобов Г.В., Богомолова, Ядав, Ермолаева, Белостоцкая, Прокаева, Шустер A.M., Габибов А.Г. Выделение и харакеристика каталитических антител к ДНК при системной красной волчанке (1993) Биохимия, 58, 313-318.

29. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Schourov D.V., Chernova E.A., Yadav R.P. DNA-hydrolyzing autoantibodies (1994) Appl. Biochem. Biotechnol., 47, 293-302.

30. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smirnov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies (1992) Science, 256, 665-667.

31. Щуров Д.В., Макаревич О.И., Лопаева О.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А., Габибов А.Г. Взаимодействие ДНК гидролизующих аутоантител с низкомолекулярными субстратами (1994) ДАН, 337, 407-410.

32. Gololobov G.V., Chernova Е.А., Schourov D.V., Smirnov I.V., Kudelina I.A., Gabibov

33. A.G. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 254-257.

34. Власов А.В., Барановский А.Г., Канышкова Т.Г., Принц А.В., Забара В.Г., Наумов

35. B.А., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом (1998) Молекуляр. биология, 32, 559-569.

36. Харитонова М.А., Сизякина Л.П., Невинский Г .А. ДНК-гидролизующая и протеолитическая активность абзимов в динамике ВИЧ-инфекции (2003) Иммунология, 24, 68-69.

37. Gololobov G.V., Mikhalap S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.F., Gabibov A.G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies (1994) Appl. Biochem. Biotechnol., 47, 305-314.

38. Kozyr A.V., Kolesnikov A.V., Iakhnina E.I., Astsaturov I.A., Varlamova E., Kirillov E.V., Gabibov A.G. DNA-hydrolyzing antibodies in lymphoproliferative disorders (1996) Biull. Eksp. Biol. Med., 121, 204-206.

39. Бунева В.Н., Андриевская О.А., Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонуклеотидами (1994) Молекуляр. биология, 28, 738-743.

40. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии (2000) Биохимия, 65, 1473-1478.

41. Власов А.В., Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Барановский А.Г., Наумов В.А., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. РНК-гидролизующие антитела из крови больных системной красной волчанкой (1997) Биохимия, 62, 556-562.

42. Vlassov A., Florentz C., Helm M., Naumov V., Buneva V., Nevinsky G., Giege R. Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serum with RNase activity (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5243-5250.

43. Андриевская О.А., Бунева B.H., Забара В.Г., Наумов В.А., Ямковой У.И., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК( 1998) Молекуляр. биология, 32, 908-915.

44. Andrievskaia О.A., Buneva V.N., Zabara V.G., Naumov V.A., Iamkovoi V.I., Nevinskii G.A. Catalytic heterogeneity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus (2000) Med. Sci. Monit., 6, 460-470.

45. Бунева B.H., Кудрявцева A.H., Гальвита A.B., Дубровская В.В., Хохлова О.В., Калинина И. А., Галенок В.А., Невинский Г .А. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации (2003) Биохимия, 68, 1088-1100.

46. Канышкова Т.Г. Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека (1999) Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Новосибирск.

47. Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Vlassov A.V., Semenov D.V., Khlimankov D., Breusova L.R., Nevinsky G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers (1998) Appl. Biochem. Biotechnol., 75, 63-76.

48. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Vlassov A.V., Gal'vita A.V., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers' milk catalyzes nucleic acid hydrolysis (2000) Appl. Biochem. Biotechnol., 83, 115-129.

49. Андриевская О.А., Канышкова Т.Г., Ямковой В.И., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Моноклональные антитела к ДНК лучше гидролизуют РНК, чем ДНК (1997) ДАН, 355, 401-403.

50. Nevinsky G.A., Buneva B.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies (2002) J. Immunol. Methods, 269, 235-249.

51. Gololobov G.V., Rumbley C.A., Rumbley J.N., Schourov D.V., Makarevich O.I., Gabibov A.G., Voss E.W., Jr., Rodkey L.S. DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity (1997) Mol. Immunol., 34, 1083-1093.

52. Kit Y.Y., Kim A.A., Sidorov V.N. Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein (1991) Biomed. Sci., 2, 201-204.

53. Kit Y., Semenov D.V., Nevinsky G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A (1996) Biochem. Mol. Biol. Int., 39, 521-527.

54. Семенов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит А., Хлиманков Д., Акимжанов A.M., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G человека гидролизуют нуклеотиды (1998) Биохимия, 63, 40-45.

55. Кит, Шипицин М.В., Семенов Д.В., Рихтер В.А., Невинский Г.А. Фосфорширование липидов, прочно связанных с секреторным иммуноглобулином А, в препаратах антител из молока человека, обладающих протеинкиназной активностью (1998) Биохимия, 63, 852-858.

56. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Shabalin К.A., Filatov M.V., Neustroev K.N. Antibodies with amylolytic activity (1999) Protein Peptide Lett., 6, 179-184.

57. Savel'ev A.N., Kanyshkova T.G., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Eneyskaya E.V., Filatov M.V., Nevinsky G.A., Neustroev K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk{2001) Clin. Chim. Acta, 314, 141-152.

58. Wentworth P., Jr., Jones L.H., Wentworth A.D., Zhu X., Larsen N.A., Wilson I.A., Xu X., Goddard W.A., 3rd, Janda K.D., Eschenmoser A., Lerner R.A. Antibody catalysis of the oxidation of water (2001) Science, 293, 1806-1811.

59. Zhu X., Wentworth P.J., Wentworth A.D., Eschenmoser A., Lerner R.A., Wilson I.A. Probing the antibody-catalyzed water-oxidation pathway at atomic resolution (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 2247-2252.

60. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system (1974) Ann. Immunol., 125, 373-398.

61. Puzzetti A., Madaio M.P., Bellese G., Migliorini P. Anti-DNA antibodies bind to DNase I (1995) J. Exp. Med., 181, 1797-1804.

62. Gololobov G., Sun M., Paul S. Innate antibody catalysis (1999) Mol. Immunol., 36, 12151222.

63. Tyutyulkova S., Gao Q.S., Thompson A., Rennard S., Paul S. Efficient vasoactive intestinal polypeptide hydrolyzing autoantibody light chains selected by phage display (1996) Biochim. Biophys. Acta., 1316, 217-223.

64. Paul S. Catalytic activity of anti-ground state antibodies, antibody subunits, and human autoantibodies (1994) Appl. Biochem. Biotechnol., 47, 241-253.

65. Paul S. Mechanism and functional role of antibody catalysis (1998) Appl. Biochem. Biotechnol., 75, 13-24.

66. Suenaga R., Abdou N.I. Cationic and high affinity serum IgG anti-dsDNA antibodies in active lupus nephritis (1993) Clin. Exp. Immunol., 94, 418-422.

67. Prince W.S., Baker D.L., Dodge A.H., Ahmed A.E., Chestnut R.W., Sinicropi D.V. Pharmacodynamics of recombinant human DNase I in serum (1998) Clin. Exp. Immunol., 113, 289-296.

68. Ramaswamy H., Swamy C.V., Das M.R. Purification and characterization of a high molecular weight ribonuclease from human тйк(\99Ъ) J. Biol. Chem., 268, 4181-4187.

69. Gillin F.D., Reiner D.S., Wang C.S. Human milk kills parasitic intestinal protozoa (1983) Science, 221, 1290-1292.

70. Suchkov S.V. Mechanisms underlying cytotoxicity of anti-DNA antibodies (2001) Bull. Exp. Biol. Med., 131, 475-478.

71. Sinohara H., Matsuura K. Does catalytic activity of Bens-Jones proteins contribute to the pathogenesis of multiple myeloma? (2000) Appl. Biochem. Biotechnol., 83, 85-94.

72. Гусев Е.И., Демина Т.JI., Бойко А.Н. Рассеянный склероз (1997) Москва, Нефть и газ.

73. Archelos J. J., Storch M.K., Hartung H.P. The role of В cells and autoantibodies in multiple sclerosis (2000) Ann. Neurol., 47, 694-706.

74. Shoenfeld Y., Ben-Yehuda O., Messinger Y., Bentwitch Z., Rauch J., Isenberg D.I., Gadoth N. Autoimmune diseases other than lupus share common anti-DNA idiotypes (1988) Immunol. Lett., 17, 285-291.

75. Collard R.C., Koehler R.P., Mattson D.H. Frequency and significance of antinuclear antibodies in multiple sclerosis (1997) Neurology, 49, 857-861.

76. Sierakowska H., Shugar D. Mammalian nucleolytic enzymes (1977) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 20, 59-130.

77. Moore S. Pancreatic DNase (1981) The Enzymes (Ed. Boyer, P.D.), New York, Academic Press, 281-296.

78. Funakoshi A., Tsubota Y., Wakasugi H., Ibayashi H., Takagi Y. Purification and properties of human pancreatic deoxyribonuclease /(1977) J. Biochem. (Tokyo), 82, 1771-1777.

79. Love J.D., Hewitt R.R. The relationship between human serum and human pancreatic DNase 7(1979) J. Biol. Chem., 254, 12588-12594.

80. Nadano D., Yasuda Т., Kishi K. Purification and characterization of genetically polymorphic deoxyribonuclease I from human kidney (1991) J. Biochem. (Tokyo), 110, 321323.

81. Schmidt В., Peil S., Zahn R.K. The major fraction of deoxyribonuclease activity from human urinary proteins. Purification and properties (1978) J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 16, 607612.

82. Yasuda Т., Awazu S., Sato W., Iida R., Tanaka Y., Kishi K. Human genetically polymorphic deoxyribonuclease: purification, characterization, and multiplicity of urine deoxyribonuclease 1 (1990) J. Biochem. (Tokyo), 108, 393-398.

83. Yasuda Т., Sawazaki K., Nadano D., Takeshita H., Nakanaga M., Kishi K. Human seminal deoxyribonuclease I (DNase I): purification, enzymological and immunological characterization and origin (1993) Clin. Chim. Acta, 218, 5-16.

84. Kishi K., Yasuda Т., Ikehara Y., Sawazaki K., Sato W., Iida R. Human serum deoxyribonuclease I (DNase I) polymorphism: pattern similarities among isozymes from serum, urine, kidney, liver, and pancreas (1990) Am. J. Hum. Genet., 47, 121-126.

85. Yasuda Т., Nadano D., Iida R., Takeshita H., Lane S.A., Callen D.F., Kishi K. Chromosomal assignment of the human deoxyribonuclease I gene, DNASE 1 (DNL1), to band 16pl3.3 using the polymerase chain reaction (1995) Cytogenet. Cell Genet., 70, 221-223.

86. Yasuda Т., Kishi K., Yanagawa Y., Yoshida A. Structure of the human deoxyribonuclease I (DNase I) gene: identification of the nucleotide substitution that generates its classical genetic polymorphism (1995) Ann. Hum. Genet., 59, 1-15.

87. Yasuda Т., Nadano D., Takeshita H., Tenjo E., Kishi K. Molecular analysis of the third allele of human deoxyribonuclease I polymorphism (1995) Ann. Hum. Genet., 59, 139-147.

88. Iida R., Yasuda Т., Aoyama M., Tsubota E., Kobayashi M., Yuasa I., Matsuki Т., Kishi K. The fifth allele of the human deoxyribonuclease I (DNase I) polymorphism (1997) Electrophoresis, 18, 1936-1939.

89. Yasuda Т., Takeshita H., Iida R., Kogure S., Kishi К .A new allele, DNASE1*6, of human deoxyribonuclease I polymorphism encodes an Arg to Cys substitution responsible for its instability (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 260, 280-283.

90. Yasuda Т., Takeshita H., Iida R., Yuasa I., Kishi K. Population studies of human deoxyribonuclease I polymorphism (1997) Hum. Hered., 47, 121-124.

91. Shak S., Capon D.J., Hellmiss R., Marsters S.A., Baker C.L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 91889192.

92. Shiokawa D., Tanuma S. Characterization of human DNase I family endonucleases and activation of DNase gamma during apoptosis (2001) Biochemistry, 40, 143-152.

93. Nadano D., Yasuda Т., Kishi K. Measurement of deoxyribonuclease I activity in human tissues and body fluids by a single radial enzyme-diffusion method (1993) Clin. Chem., 39, 448-452.

94. Gibson U.E., Chen А.В., Baker D.L., Sinicropi D.V. An antibody capture bioassay (ACB) for DNase in human serum samples (1992) J. Immunol. Methods, 155, 249-256.

95. Shimada O., Suzuki S., Tosaka-Shimada H., Ishikawa H. Detection of deoxyribonuclease I in a hormone-secretory pathway of pituitary cells in humans and rats (1998) Cell Struct. Funct., 23, 49-56.

96. Wolf E., Frenz J., Suck D. Structure of human pancreatic DNase at 2.2 resolution (1995) Protein Eng., 8, 79.

97. Oefner C., Suck D. Crystallographic refinement and structure of DNase I at 2 A resolution (1986) J. Mol. Biol., 192, 605-632.

98. Cacia J., Quan C.P., Pai R., Frenz J. Human DNase I contains mannose 6-phosphate and binds the cation-independent mannose б-phosphate receptor (1998) Biochemistry, 37, 1515415161.

99. Yasuda Т., Mizuta K., Ikehara Y., Kishi K. Genetic analysis of human deoxyribonuclease I by immunoblotting and the zymogram method following isoelectric focusing (1989) Anal. Biochem., 183, 84-88.

100. Pan C.Q., Lazarus R.A. Engineering hyperactive variants of human deoxyribonuclease I by altering its functional mechanism (1997) Biochemistry, 36, 6624-6632.

101. Lahm A., Suck D. DNase I-induced DNA conformation. 2 A structure of a DNase I-octamer complex (1991) J. Mol. Biol., 222, 645-667.

102. Weston S.A., Lahm A., Suck D. X-ray structure of the DNase I-d(GGTATACC)2 complex at 2.3 A resolution (1992) J. Mol. Biol., 226, 1237-1256.

103. Doherty A.J., Worrall A.F., Connolly B.A. The roles of arginine 41 and tyrosine 76 in the coupling of DNA recognition to phosphodiester bond cleavage by DNase 1: a study using site-directed mutagenesis (1995) J. Mol. Biol., 251, 366-377.

104. Suck D. DNA recognition by DNase I (1994) J. Mol. Recognit., 7, 65-70.

105. Jones S.J., Worrall A.F., Connolly B.A. Site-directed mutagenesis of the catalytic residues of bovine pancreatic deoxyribonuclease /(1996) J. Mol. Biol., 264, 1154-1163.

106. Drew H.R. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases (1984) J. Mol. Biol., 176, 535-557.

107. Bernardi A., Gaillard C., Bernardi G. The specificity of five DNAases as studied by the analysis of 5'-terminal doublets (1975) Eur. J. Biochem., 52, 451-457.

108. Mehdi S., Gerlt J.A. Syntheses and configurational analyses of thymidine 4-nitrophenyl 170,180.phosphates and the stereochemical course of a reaction catalyzed by bovine pancreatic deoxyribonuclease /(1984) Biochemistry, 23, 4844-4852.

109. Herrera J.E., Chaires J.B. Characterization of preferred deoxyribonuclease I cleavage sites (1994) J. Mol. Biol., 236, 405-411.

110. Fish E.L., Vournakis J.N. Properties of DNase I digestion of the deoxyoligonucleotide: 5'd(ATCGTACGAT)2(3') (1987) Nucleic Acids Res., 15, 9417-9428.

111. Junowicz E., Spencer J.H. Studies on bovine pancreatic deoxyribonuclease A. II. The effect of different bivalent metals on the specificity of degradation of DNA (1973) Biochim. Biophys. Acta, 312, 85-102.

112. Clark P., Eichhorn G.L.A predictable modification of enzyme specificity. Selective alteration of DNA bases by metal ions to promote cleavage specificity by deoxyribonuclease (1974) Biochemistry, 13, 5098-5102.

113. Suck D., Oefner C. Structure of DNase I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA (1986) Nature, 321, 620-625.

114. Suck D., Oefner C., Kabsch W. Three-dimensional structure of bovine pancreatic DNase I at 2.5 A resolution (1984) EMBO J., 3, 2423-2430.

115. Poulos T.L., Price P. A. Some effects of calcium ions on the structure of bovine pancreatic deoxyribonuclease A (1972) J. Biol. Chem., 247, 2900-2904.

116. Price P.A. Characterization of Ca2+ and Mg2+ binding to bovine pancreatic deoxyribonuclease A (1972) J. Biol. Chem., 247, 2895-2899.

117. Pan C.Q., Lazarus R.A. Ca2+-dependent activity of human DNase I and its hyperactive variants (1999) Protein Sci., 8, 1780-1788.

118. Evans S.J., Shipstone E.J., Maughan W.N., Connolly B.A. Site-directed mutagenesis of phosphate-contacting amino acids of bovine pancreatic deoxyribonuclease I (1999) Biochemistry, 38, 3902-3909.

119. Hugli Т.Е. The preparation and characterization of an active derivative of bovine pancreatic deoxyribonuclease A formed by selective cleavage with alpha-chymotrypsin (1973) J. Biol. Chem., 248, 1712-1718.

120. Price P. A. The essential role of Ca2+ in the activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease (1975) J. Biol. Chem., 250, 1981-1986.

121. Campbell V.W., Jackson D.A. The effect of divalent cations on the mode of action of DNase I. The initial reaction products produced from covalently closed circular DNA (1980) J. Biol. Chem., 255, 3726-3735.

122. Zimmer C., Luck G., Triebel H. Conformation and reactivity of DNA. IV. Base binding ability of transition metal ions to native DNA and effect on helix conformation with special reference to DNA-Zn(II) complex (1974) Biopolymers, 13, 425-453.

123. Douvas A., Price P.A. Some effects of calcium and magnesium ions on the activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A (1975) Biochim. Biophys. Acta, 395, 201-212.

124. Pan C.Q., Lazarus R.A. Hyperactivity of human DNase I variants. Dependence on the number of positively charged residues and concentration, length, and environment of DNA (1998) J. Biol. Chem., 273, 11701-11708.

125. Riley D.E. Deoxyribonuclease I generates single-stranded gaps in chromatin deoxyribonucleic acid (1980) Biochemistry, 19, 2977-2992.

126. Ulmer J.S., Herzka A., Toy K.J., Baker D.L., Dodge A.H., Sinicropi D., Shak S., Lazarus R.A .Engineering actin-resistant human DNase I for treatment of cystic fibrosis (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8225-8229.

127. Polzar В., Nowak E., Goody R.S., Mannherz H.G. The complex of actin and deoxyribonuclease I as a model system to study the interactions of nucleotides, cations and cytochalasin D with monomeric actin (1989) Eur. J. Biochem., 182, 267-275.

128. Peitsch M.C., Polzar В., Stephan H., Crompton Т., MacDonald H.R., Mannherz H.G., Tschopp J. Characterization of the endogenous deoxyribonuclease involved in nuclear DNA degradation during apoptosis (programmed cell death) (1993) EMBO J., 12, 371-377.

129. Rodriguez A.M., Rodin D., Nomura H., Morton C.C., Weremowicz S-> Schneider M.C. Identification, localization, and expression of two novel human genes similar to deoxyribonuclease 7(1997) Genomics, 42, 507-513.

130. Parrish J.E., Ciccodicola A., Wehhert M., Cox G.F., Chen E., Nelson D.L. A muscle-specific DNase I-like gene in human Xq28 (1995) Hum. Mol. Genet., 4, 1557-1564.

131. Zeng Z., Parmelee D., Hyaw H., Coleman T.A., Su K., Zhang J., Gentz R., Ruben S., Rosen C., Li Y. Cloning and characterization of a novel human DNase (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 231, 499-504.

132. Pergolizzi R., Appierto V., Bosetti A., DeBellis G.L., Rovida E., Biunno I. Cloning of a gene encoding a DNase I-like endonuclease in the human Xq28 region (1996) Gene, 168, 267-270.

133. Baron W.F., Pan C.Q., Spencer S.A., Ryan A.M., Lazarus R.A., Baker K.P. Cloning and characterization of an actin-resistant DNase I-like endonuclease secreted by macrophages (1998) Gene, 215, 291-301.

134. Los M., Neubuser D., Coy J.F., Mozoluk M., Poustka A., Schulze-Osthoff K. Functional characterization of DNase X, a novel endonuclease expressed in muscle cells (2000) Biochemistry, 39, 7365-7373.

135. Shiokawa D., Kobayashi Т., Tanuma S. Involvement of DNase gamma in apoptosis associated with myogenic differentiation of C2C12 cells (2002) J. Biol. Chem., 277, 3103131037.

136. Bernardi G. Spleen acid deoxyribonuclease (1971) The Enzymes (Ed. Boyer, P.D.), New York, Academic Press, 271-287.

137. Шапот B.C. Нуклеазы (1968) Москва, Медицина.

138. Baker К.P., Baron W.F., Henzel W.J., Spencer S.A. Molecular cloning and characterization of human and murine DNase 7/(1998) Gene, 215, 281-289.

139. Shiokawa D., Tanuma S. Cloning of cDNAs encoding porcine and human DNase II (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 247, 864-869.

140. Rrieser R.J., Eastman A. The cloning and expression of human deoxyribonuclease II. A possible role in apoptosis (1998) J. Bio I. Chem., 273, 30909-30914.

141. Yasuda Т., Nadano D., Sawazaki K., Kishi K. Genetic polymorphism of human deoxyribonuclease II (DNase II): low activity levels in urine and leukocytes are due to an autosomal recessive allele (1992) Arm. Hum. Genet., 56, 1-10.

142. Yasuda Т., Takeshita H., Iida R., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y., Kishi K. Molecular cloning of the cDNA encoding human deoxyribonuclease II (1998) J. Biol. Chem., 273, 2610-2616.

143. Yasuda Т., Takeshita H., Iida R., Tsutsumi S., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y., Mori S., Kishi K. Structure and organization of the human deoxyribonuclease II (DNase II) gene (1998) Ann. Hum. Genet., 62, 299-305.

144. MacLea K.S., Krieser R.J., Eastman A. Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease Ilalpha (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun., 292, 415-421.

145. Murai K., Yamanaka M., Akagi K., Anai M. Purification and properties of deoxyribonuclease IIfrom human urine (1980) J. Biochem. (Tokyo), 87, 1097-1103.

146. Yasuda Т., Takeshita H., Nakazato E., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y., Kishi K. Activity measurement for deoxyribonucleases I and II with picogram sensitivity based on DNA/SYBR Green 1 fluorescence (1998) Anal. Biochem., 255, 274-276.

147. Takeshita H., Yasuda Т., Iida R., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y., Mori S., Nomoto H., Kishi K. Identification of the three non-identical subunits constituting human deoxyribonuclease //(1998) FEBS Lett., 440, 239-242.

148. Harosh I., Binninger D.M., Harris P.V., Mezzina M., Boyd J.B. Mechanism of action of deoxyribonuclease IIfrom human lymphoblasts (1991) Eur. J. Biochem., 202, 479-484.

149. Mcllroy D., Tanaka M., Sakahira H., Fukuyama H., Suzuki M., Yamamura K., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Nagata S. An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation provided by phagocytes (2000) Genes Dev., 14, 549-558.

150. Odaka C., Mizuochi T.Role of macrophage lysosomal enzymes in the degradation of nucleosomes of apoptotic cells (1999) J. Immunol., 163, 5346-5352.

151. Barry M.A., Eastman A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis (1993) Arch. Biochem. Biophys., 300, 440-450.

152. Perez-Sala D., Collado-Escobar D., Mollinedo F. Intracellular alkalinization suppresses lovastatin-induced apoptosis in HL-60 cells through the inactivation of a pH-dependent endonuclease (1995) J. Biol. Chem., 270, 6235-6242.

153. Gottlieb R.A., Nordberg J., Skowronski E., Babior B.M .Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 654-658.

154. Krieser R.J., MacLea K.S., Park J.P., Eastman A. The cloning, genomic structure, localization, and expression of human deoxyribonuclease Ilbeta (2001) Gene, 269, 205-216.

155. Shiokawa D., Tanuma S.I. Isolation and characterization of the DLAD/Dlad genes, which lie head-to-head with the genes for urate oxidase (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun., 288, 1119-1128.

156. Shiokawa D., Tanuma S. DLAD, a novel mammalian divalent cation-independent endonuclease with homology to DNase //(1999) Nucleic Acids Res., 27, 4083-4089.

157. Goding J.W., Terkeltaub R., Maurice M., Deterre P., Sali A., Belli S.I. Ecto-phosphodiesterase/pyrophosphatase of lymphocytes and non-lymphoid cells: structure and function of the PC-1 family (1998) Immunol. Rev., 161, 11-26.

158. Takahashi Т., Old L.J., Boyse E.A. Surface alloantigens of plasma cells (1970) J. Exp. Med., 131, 1325-1341.

159. Haugen H.F., Skrede S. Nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase. I. Organ distribution and activities in body fluids (1977) Clin. Chem., 23, 1531-1537.

160. Hynie I., Meuffels M., Poznanski W.J. Determination of phosphodiesterase I activity in human blood serum (1975) Clin. Chem., 21, 1383-1387.

161. Tsou К.С., Ledis S., McCoy M.G. 5'-Nucleotide phosphodiesterase isoenzyme pattern in the serum of human hepatoma (1973) Cancer Res., 33, 2215-2217.

162. Rebbe N.F., Tong B.D., Finley E.M., Hickman S. Identification of nucleotide pyrophosphatase/'alkaline phosphodiesterase I activity associated with the mouse plasma cell differentiation antigen PC-1 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5192-5196.

163. Buckley M.F., Loveland K.A., McKinstry W.J., Garson O.M., Goding J.W. Plasma cell membrane glycoprotein РС-1. с DNA cloning of the human molecule, amino acid sequence, and chromosomal location (1990) J. Biol. Chem., 265, 17506-17511.

164. Funakoshi I., Kato H., Horie K., Yano Т., Hori Y., Kobayashi H., Inoue Т., Suzuki H., Fukui S., Tsukahara M. Molecular cloning of cDNAs for human fibroblast nucleotide pyrophosphatase (1992) Arch. Biochem. Biophys., 295, 180-187.

165. Jin-Hua P., Goding J.W., Nakamura H., Sano K. Molecular cloning and chromosomal localization of PD-Ibeta (PDNP3), a new member of the human phosphodiesterase I genes (1997) Genomics, 45, 412-415.

166. Ito K., Yamamoto Т., Minamiura N. Phosphodiesterase I in human urine: purification and characterization of the enzyme (1987) J. Biochem. (Tokyo), 102, 359-367.

167. Haugen H.F., Skrede S. Nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase I. Demonstration of activity in normal serum, and an increase in cholestatic liver disease (1976) Scand. J. Gastroenterol., 11, 121-127.

168. Hosoda N., Hoshino S.I., Kanda Y., Katada T. Inhibition of phosphodiesterase/pyrophosphatase activity of PC-1 by its association with glycosaminoglycans (1999) Eur. J. Bioche^i., 265, 763-770.

169. Belli S.I., Goding J.W. Biochemical characterization of human PC-1, an enzyme possessing alkaline phosphodiesterase I and nucleotide pyrophosphatase activities (1994) Eur. J. Biochem., 226, 433-443.

170. Yano Т., Horie K., Kanamoto R., Kitagawa H., Funakoshi I., Yamashina I. Immunoaffinity purification and characterization of nucleotide pyrophosphatase from human placenta (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147, 1061-1069.

171. Luthje J., Ogilvie A. 5'-Nucleotide phosphodiesterase isoenzymes in human serum: quantitative measurement and some biochemical properties (1987) Clin. Chim. Acta, 164, 275-284.

172. Hawley D.M., Crisp M., Hodes M.E. Tissue specificity of human phosphodiesterase. I. Blood serum (1983) Clin. Chim. Acta, 130, 31-37.

173. Luthje J., Ogilvie A. Catabolism of Ap4A and АрЗА in human serum. Identification of isoenzymes and their partial characterization (1987) Eur. J. Biochem., 169, 385-388.

174. Luthje J., Ogilvie A. Separation of 5'-nucleotide phosphodiesterase isoenzymes of human serum by anion exchange high pressure liquid chromatography (1987) Clin. Chim. Acta, 169, 183-188.

175. Eder P.S., DeVine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specificity and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma (1991) Antisense Res. Dev., 1, 141-151.

176. Yano Т., Funakoshi I., Yamashina I. Purification and properties of nucleotide pyrophosphatase from human placenta (1985) J. Biochem. (Tokyo), 98, 1097-1107.

177. Kelly S.J., Dardinger D.E., Butler L.G.Hydrolysis of phosphonate esters catalyzed by 5'-nucleotide phosphodiesterase (1975) Biochemistry, 14, 4983-4988.

178. Luthje J., Pickert S., Ogilvie A., Homemann E., Siegfried W., Waldherr A., Domschke W. Levels of 5'-nucleotide phosphodiesterase isoenzymes in normal and pathological sera (1988) Clin. Chim. Acta, 177, 131-139.

179. Shaw J.P., Kent K., Bird J., Fishback J., Froehler B. Modified deoxyoligonucleotides stable to exonuclease degradation in serum (1991) Nucleic Acids Res., 19, 747-750.

180. Vichier-Guerre S., Pompon A., Lefebvre I., Imbach J.L. New insights into the resistance of alpha-oligonucleotides to nucleases (1994) Antisense Res. Dev., 4, 9-18.

181. Belli S.I., Sali A., Goding J.W. Divalent cations stabilize the conformation of plasma cell membrane glycoprotein PC-1 (alkaline phosphodiesterase I) (1994) Biochem. J., 304, 75-80.

182. Karpouzas G.A., Terkeltaub R.A. New developments in the pathogenesis of articular cartilage calcification (1999) Curr. Rheumatol. Rep., 1, 121-127.

183. Liu X., Zou H., Slaughter C., Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis (1997) Cell, 89, 175-184.

184. Mukae N., Enari M., Sakahira H., Fukuda Y., Inazawa J., Toh H., Nagata S. Molecular cloning and characterization of human caspase-activated DNase (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9123-9128.

185. Halenbeck R., MacDonald H., Roulston A., Chen T.T., Conroy L., Williams L.T. CPAN, a human nuclease regulated by the caspase-sensitive inhibitor DFF45 (1998) Curr. Biol., 8, 537-540.

186. McCarty J.S., Toh S.Y., Li P. Study of DFF45 in its role of chaperone and inhibitor: two independent inhibitory domains of DFF40 nuclease activity (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 176-180.

187. McCarty J.S., Toh S.Y., Li P. Multiple domains of DFF45 bind synergistically to DFF40: roles of caspase cleavage and sequestration of activator domain of DFF40 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun., 264, 181-185.

188. Wolf B.B., Schuler M., Echeverri F., Green D.R. Caspase-3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor-45/inhibitor of caspase-activated DNase inactivation (1999) J. Biol. Chem., 274, 30651-30656.

189. Liu X., Zou H., Widlak P., Garrard W., Wang X. Activation of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease). Oligomerization and direct interaction with histone HI (1999) J, Biol. Chem., 274, 13836-13840.

190. Inohara N., Koseki Т., Chen S., Benedict M.A., Nunez G. Identification of regulatory and catalytic domains in the apoptosis nuclease DFF40/CAD (1999) J.Biol. Chem., 274, 27021 A.

191. Sakahira H., Takemura Y., Nagata S. Enzymatic active site of caspase-activated DNase (CAD) and its inhibition by inhibitor of CAD (2001) Arch. Biochem. Biophys., 388, 91-99.

192. Meiss G., Scholz S.R., Korn C., Gimadutdinow O., Pingoud A. Identification of functionally relevant histidine residues in the apoptotic nuclease CAD (2001) Nucleic Acids Res., 29, 3901-3909.

193. Widlak P., Garrard W.T. Ionic and cofactor requirements for the activity of the apoptotic endonuclease DFF40/CAD (2001) Mol. Cell Biochem., 218, 125-130.

194. Widlak P., Li P., Wang X., Garrard W.T. Cleavage preferences of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and chromatin substrates (2000) J. Biol. Chem., 275, 8226-8232.

195. Huang K.J., Zemelman B.V., Lehman I.R. Endonuclease G, a candidate human enzyme for the initiation of genomic inversion in herpes simplex type 1 virus (2002) J. Biol. Chem., 277, 21071-21079.

196. Low R.L., Buzan J.M., Couper C.L. The preference of the mitochondrial endonuclease for a conserved sequence block in mitochondrial DNA is highly conserved during mammalian evolution (1988) Nucleic Acids Res., 16, 6427-6445.

197. Gerschenson M., Houmiel K.L., Low R.L. Endonuclease G from mammalian nuclei is identical to the major endonuclease of mitochondria (1995) Nucleic Acids Res., 23, 88-97.

198. Ruiz-Carrillo A., Renaud J. Endonuclease G: a (dG)n X (dC)n-specific DNase from higher eukaryotes (1987) EMBO J., 6, 401-407.

199. Ohsato Т., Ishihara N., Muta Т., Umeda S., Ikeda S., Mihara K., Hamasaki N., Kang D. Mammalian mitochondrial endonuclease G. Digestion of R-loops and localization in intermembrane space (2002) Eur. J. Biochem., 269, 5765-5770.

200. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W.T. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I{2001) J. Biol. Chem., 276, 48404-48409.

201. Low R.L., Gerschenson M. Endonuclease G isolation and assays (2002) Methods Mol. Biol., 197, 331-349.

202. Ikeda S., Seki Y., Ozaki K. Mitochondrial factors modulate the activity of endonuclease G, the major nuclease of Mammalian mitochondria (2002) J. Biochem. Mol. Biol. Biophys., 6, 17-21.

203. Parks W.A., Couper C.L., Low R.L. Phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine enhance the activity of the mammalian mitochondrial endonuclease in vitro (1990) J. Biol. Chem., 265, 3436-3439.

204. Cote J., Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G (1993) Science, 261, 765-769.

205. Li L.Y., Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria (2001) Nature, 412, 95-99.

206. Jameson G.B., Anderson B.F., Norris G.E., Thomas D.H., Baker E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335.

207. Канышкова Т.Г., Бунева B.H., Невинский Г .А. Лактоферрин и его биологические функции (2001) Биохимия, 66, 5-13.

208. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities (1999) FEBS Lett., 451, 235-237.

209. Semenov D.V., Kanyshkova T.G., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Human milk lactoferrin binds ATP and dissociates into monomers (1999) Biochem. Mol. Biol. Int., 47, 177-184.

210. Furmanski P., Li Z.P., Fortuna M.B., Swamy C.V., Das M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity (1989) J. Exp. Med., 170, 415-429.

211. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., Neustroev K.N., Kul'minskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of human milk lactoferrin (2003) Eur. J. Biochem., 270, 3353-3361.

212. Mann D.M., Romm E., Migliorini M. Delineation of the glycosaminoglycan-binding site in the human inflammatory response protein lactoferrin (1994) J. Biol. Chem., 269, 2366123667.

213. Beaucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites A new class of key intermediates for deoxypoly nucleotide synthesis (1981) Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862.

214. Gerald D., Fasman P.D. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Nucleic Acides (1975) New York, CRC Press.

215. Kurtzke J.F. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS) (1983) Neurology, 33, 1444-1452.

216. Фриммель Г. Иммунологические методы (1987) Москва, Медицина.

217. Suelter C.H. A practical guide to enzymology (1985) Vol.3, New York, John Wiley & Sons.

218. Остерман JT.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (1981) Москва, Наука.

219. Morrissey J.H. Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivity (1981) Anal. Biochem., 117, 307-310.

220. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A laboratory manual (2001) New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

221. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354.

222. Scopsi L., Larsson hi. Increased sensitivity in peroxidase immunocytochemistry. A comparative study of a number of peroxidase visualization methods employing a model system (1986) Histochemistry, 84, 221-230.

223. Lee J.S., Dombrovski D.S., Mosmann T.R. Specificity of autoimmune monoclonal Fab fragments binding to single-stranded deoxyribonucleic acid (1982) Biochemistry, 21, 49404945.

224. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA (1979) Nucleic Acids Res, 7, 1513-1523.

225. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика (1991) Москва, Мир.

226. Kunitz М. Crystalline deoxyribonuclease: Isolation and general properties; a spectrophotometric method for the measurement of deoxyribonuclease activity (1950) J. Gen. Physiol., 33, 349-362.

227. Irie M., Mikami F., Monma K., Ohgi K., Watanabe H., Yamaguchi R., Nagase H. Kinetic studies on the cleavage of oligouridilic acids and poly U by bovine pancreatic ribonuclease A (1984) J. Biochem., 96, 89-96.

228. Crook E.M., Mathias A.P., Rabin B.R. Spectrophotometric assay of bovine pancreatic ribonuclease by the use of cytidine 2':3'-phosphate (1960) Biochem. J., 74, 234-238.

229. Schauenstein E., Dachs F., Reiter M., Gombotz H., List W. Labile disulfide bonds and free thiol groops in human IgG (1986) Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 80, 174-179.

230. Schurman J., Perdok G.J., Gorter A.D., Aalberse R.C. The inter-heavy chain disulfide bonds of 'IgG4 are in equilibrium with intra-chain disulfide bonds (2001) Mol. Immunol., 38, 1-8.

231. Соринсон C.H. Вирусные гепатиты (1998) Санкт-Петербург, Теза.

232. Manns M.P. Autoantibodies in chronic hepatitis: diagnostic reagents and scientific tools to study etiology, pathogenesis, and cell biology (1994) Prog. Liver Dis., 12, 137-156.

233. Balint J.P., Jr., Ikeda Y., Nagai Т., Terman D.S. Isolation of human and canine IgM utilizing protein A affinity chromatography (1981) Immunol. Commun., 10, 533-540.

234. Косик О.Г. Физико-химические особенности IgA, IgM и IgG сыворотки крови здоровых людей (1991) Иммунология, 1, 21-23.

235. Андриевская О.А. РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой (1998) Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Новосибирск.

236. Puccetti A., Madaio М.Р., Bellese G., Migliorini P. Anti-DNA antibodies bind to DNase I (1995) J. Exp. Med., 181, 1797-1804.

237. Beintema J.J., Hofsteenge J., Iwama M., Morita Т., Ohgi K., Irie M., Sugiyama R.H., Schieven G.L., Dekker C.A., Glitz D.G. Amino acid sequence of the nonsecretory ribonuclease of human urine (1988) Biochemistry, 27, 4530-4538.

238. Рыкова E. Взаимодействие олигонуклеотидов с белками сыворотки крови. Изучение условий образования и свойств олигонуклеотид-белковых комплексов (1994) Диссертация на соискание уч. степени канд. биол. наук, Новосибирск.

239. Rosenthal A.L., Lacks S.A. Nuclease detection in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1977) Anal. Biochem., 80, 76-90.

240. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Khlimankov D., Buneva V.N., Nevinsky G.A. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers (1997) FEBS Lett., 416, 23-26.

241. Власов А.В. Рибонуклеазы человека (1998) Биохимия, 63, 1587-1599.

242. Akagi К., Murai К., Hirao N., Yamanaka M. Purification and properties of alkaline ribonuclease from human serum (1976) Biochim. Biophys. Acta., 442, 368-378.

Информация о работе

Барановский, Андрей Геннадьевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы