Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеаза и фосфатаза proteus mirabilis. Синтез, локализация, физико-химические и энзиматические свойства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салихова, Зифа Закарьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Proieus mirabilis: ссовременные данные о физиолого-биохимических и морфологических свойствах.

2. Гидролитические ферменты Proteus mirabilis.

3. Нуклеазы патогенных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нуклеаза и фосфатаза proteus mirabilis. Синтез, локализация, физико-химические и энзиматические свойства"

Актуальность проблемы. Изучение ферментных систем патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и регуляции экспрессии кодирующих их генов представляет интерес как для выяснения патогенеза инфекционного процесса и управления им, так и для более полного представления о физиологии и факторах вирулентности бактерий.

До настоящего времени наши сведения о ферментах патогенных бактерий ограничены. Это справедливо и в отношении нуклеаз - ферментов, вызывающих деградацию таких жизненно важных компонентов клетки, как нуклеиновые кислоты.

Нуклеазы, несомненно, играют роль в патогенезе бактериальных инфекций. Большинство патогенных бактерий, продуцирующих экзотоксины, как правило, выделяют в среду большие количества нуклеаз. В основном это ферменты с эндонуклеолитическим типом действия на ДНК или одновременно на ДНК и РНК - эндонуклеазы (Беляева с соавт., 1974; Лещинская, 1975; Юсупова, 1978; Лещинская с соавт., 1991). Секреция этих ферментов в среду нередко коррелирует с вирулентностью и токсигенностью бактерий (Юсупова, 1978). Имеющиеся данные позволяют рассматривать ДНКазы и эндонуклеазы патогенных бактерий как фактор, способствующий проникновению бактерий в ткани и распространению по организму. Результаты изучения механизма действия колицинов Е2 и ЕЗ говорят о том, что нуклеазы могут выполнять роль факторов агрессии и вызывать разрушение и гибель клетки при условии проникновения в нее (Оаппо1зс1ше1ёег е1 а1., 1997).

У патогенных и условно-патогенных представителей семейства ЕЫего-Ъа&епасеае> не продуцирующих экзотоксины, как правило, нуклеазы в среду не выделяются. Можно предположить, что у этих бактерий нуклеазы локализуются в периплазме и, также как и эндотоксин, выделяются в среду при разрушении микробной клетки и проявляют свое действие в комплексе с эндотоксином. 6

Кроме того, несмотря на хорошую изученность биохимических и физико-химических свойств отдельных секретируемых эндоДНКаз и эндонуклеаз патогенных и сапрофитных бактерий, до настоящего времени имеется недостаточно данных о регуляции экспрессии генов этих ферментов. Исключение составляет эндонуклеаза Serratia marcescens. Было показано, что биосинтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens индуцируется соединениями, блокирующими репликацию ДНК, индукторами SOS-функций клетки (Юсупова с соавт, 1990), и что для экспрессии гена эндонуклеазы Serratia marcescens необходим белок RecA (Ball et al., 1990).

В культуральной жидкости и бесклеточных экстрактах Proteus mirabilis была обнаружена активность ДНКазы и РНКазы. Изучены некоторые свойства ферментов, выделенных из клеток Proteus mirabilis (Center, Behal, 1968, 1968a,6; Goebel, Helinski, 1971, 1971a). Ферменты с высокой удельной активностью легко освобождались в среду при обработке клеток многократным быстрым замораживанием-оттаиванием, что предполагает локализацию их в периплазме (Соколова с соавт., 1976).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было установление локализации, регуляции синтеза, а также характеристика свойств нуклеаз Proteus mirabilis - возможных факторов вирулентности бактерий. В связи с поставленной целью планировалось решить следующие задачи:

1. Изучить уровень нуклеазной активности в культуральной жидкости и бесклеточных экстрактах различных штаммов Proteus mirabilis.

2. Провести сравнительный анализ нуклеазной активности Proteus mirabilis и других представителей энтеробактерий.

3. Установить локализацию нуклеаз, обнаруженных в бесклеточных экстрактах.

4. Установить состав белков с нуклеазной активностью в культуральной жидкости и периплазме Proteus mirabilis. 7

5. Изучить динамику синтеза и секреции нуклеаз при изменении физиологического состояния клеток в процессе роста бактерий.

6. Разработать эффективные методы получения и очистки нуклеазы, обнаруженной в культуральной жидкости и периплазме.

7. Изучить свойства очищенного фермента.

8. Исследовать механизмы регуляции биосинтеза эндонуклеазы.

9. В качестве контрольного фермента на всех этапах работы исследовать типичный периплазматический фермент - щелочную фосфатазу Proteus mirabilis.

Научная новизна работы. Впервые в сравнительном плане проведено исследование активности нуклеаз бактерий рода Proteus и других представителей семейства Enterobacteriaceae. Показано наличие невысокой ДНКазной и РНКазой активности в культуральной жидкости и высокого уровня активности ферментов в периплазме у различных штаммов Proteus mirabilis. Впервые показано, что в культуральной жидкости и периплазме P.mirabilis фермент обнаруживается в виде двух изоформ, обладающих ДНКазной и РНКаз-ной активностью одновременно. Разработана схема получения и очистки нуклеазы, описаны основные свойства фермента. Показано, что фермент обладает эндонуклеолитическим типом действия на ДНК, имеет оптимум рН -10 и требует для проявления активности ионы двухвалентных металлов. Фермент обозначен как неспецифическая эндонуклеаза. Выявлено, что эндо-нуклеаза синтезируется в период замедления роста бактерий. Впервые показана индукция синтеза и секреции эндонуклеазы Proteus mirabilis под влиянием митомицинаС, классического индуктора SOS-функций клетки. Показано, что в периплазме Proteus mirabilis обнаруживается один белок с активностью щелочной фосфатазы, активность и синтез фермента ингибируются неорганическим фосфатом, биосинтез фермента и секреция в среду, также как и биосинтез и секреция эндонуклеазы, индуцируется митомициномС. Накоп8 ление фермента в периплазме происходит в период перехода к стационарной фазе роста и в стационарную фазу роста бактерий.

Практическая ценность работы. Результаты, полученные в данной работе, могут быть использованы в лабораторной диагностике, при разработке систематики и классификации энтеробактерий в эволюционном плане. Разработанная схема получения и очистки эндонуклеазы может быть использована при получении фермента в препаративных количествах для структурно-функциональных исследований.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на итоговых научных конференциях КГУ за 1995 и 1998 годы, на XI Всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов'98» (г. Казань, 1998), на II Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (г. Саратов, 1998) и на международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов - 2000» (г. Москва, 2000).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ и двое тезисов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Proteus mirabilis: ссовременные данные о физиолого-биохимичесйих и морфологических свойствах

Согласно классификации, приведенной в Определителе бактерий Берджи (1994), род Proteus относится к семейству Enterobacteriaceae, и в пределах рода различают виды: Proteus vulgaris (типовой вид), Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens и Proteus penneri.

Морфологические и культурально-биохимические признаки. Все представители рода протеев имеют форму прямых палочек размером 0.4-0.6 х 1.0-3.0 мкм. У некоторых штаммов P.mirabilis обнаружены фимбрии и пили, являющиеся органеллами, определяющими адгезивные свойства микробной клетки (Езепчук, 1985; Pugsley, 1993). Описан белок UCA (uroepithelial cell adherence) P.mirabilis, ответственный за адгезию штамма на уроэпители-альных клетках человека (Cook et al., 1995).

Фимбрии определяют способность P.mirabilis колонизировать мочевой пузырь человека (Massad et al., 1994а). Уропатогенные штаммы P.mirabilis продуцируют, по крайней мере, четыре типа фимбрий (Massad et al., 1996). Гены двух из них выделены и определена их нуклеотидная последовательность: PMF - Proteus mirabilis fimbriae (Massad et al., 1994) и MR/P - mannose-resistant/proteus-like fimbriae (Bahrani et al., 1994). Помимо фимбрий y P. mirabilis обнаружены ворсинки, экспрессия синтеза белка которых зависит от температуры инкубации культуры (Massad et al., 19946).

В настоящее время изучена регуляция экспрессии локуса flaA P.mirabilis, состоящего из flaA и flaB, тандемносвязанных и почти идентичных копий гена флагелина, основного белка жгутиков. Показано, что при дифференциров-ке вегетативных клеток в роящиеся формы уровень экспрессии гена flaA увеличивается в 8 раз (Bêlas, 1994).

10

Протеи не образуют капсул, подвижны, им не свойственно образование пигмента (Энтеробактерии, 1985). Однако сравнительно недавно обнаружен пигмент, продуцируемый L-формами P.mirabilis меланиновой природы (Agodi et al., 1996).

Антигенная структура бактерий рода Proteus сходна в принципе с таковой других членов семейства Enterobacteriaceae и формируется из соматических О- и жгутиковых Н-антигенов, в некоторых случаях у протеев обнаруживали и поверхностные соматические K-антигены. Установлено, что О- и Н-антигены могут иметь мозаичное строение (Энтеробактерии, 1985).

Протеи способны расти на простых по составу питательных средах в широком диапазоне температур (от 10 до 43°С).Оптимальная температура роста - 37° С. В зависимости от условий роста P.mirabilis образует колонии различной морфологии (Nakahara et al., 1996).

Представители рода Proteus обладают свойствами, характеризующими семейство Enterobacteriaceae в целом (Определитель бактерий Берджи, 1997). Протей мало устойчив при высыхании, что, возможно, сказывается на результатах поиска его в некоторых объектах окружающей среды. Среди биохимических реакций особенно характерной, отличающей род Proteus от эн-теробактерий других родов, является дезаминирование фенилаланина. Идентифицирован ген, кодирующий фенилаланиновую дезаминазу P.mirabilis (Massad et al., 1995), обозначенный как aad.

Характерной особенностью протеев является их способность к роению и быстрому распространению по поверхности плотной питательной среды (Энтеробактерии, 1985). Роль подвижности во взаимодействии бактериальных и хозяйских клеток подробно описана Оттеман и Миллер (Ottemann, Miller, 1997). Потенциальными преимуществами подвижности являются увеличение эффективности поступления питательных веществ, возможность миновать токсические для клетки вещества и способность к транслокации, позволяющая колонизировать более выгодные участки тканей хозяина и распростра

11 няться в окружающей среде. Феномен Шукевича - всползание вверх из конденсационной воды по скошенной поверхности агара - является одним из диагностических признаков при идентификации Н-форм протеев. Со способностью протеев к роению связан и феномен Dienes, выражающийся в том, что у посеянных на разных участках питательного агара в чашках Петри штаммов протея, различных по Н-антигену, между зонами роения образуется разграничительная демаркационная полоса.

Роение связано с образованием из коротких бациллярных - длинных подвижных особей (55 - 100 мкм в длину), способных по одиночке или группами расползаться в радиальном направлении на поверхность свежей питательной среды, где они, делясь, превращаются в мелкие клетки, которые способны снова образовывать длинные формы роения (Джавец, 1982).

Поведение, подобное роению (swarming behavior) наблюдалось и при культивировании P.mirabilis на богатой жидкой среде, когда из нормальных коротких палочек развиваются несегментированные нитчатые клетки. Эти нити сочли идентичными роящимся клеткам, сформированным на агаре, потому что они прекратили беспорядочное деление, образовывали большое количество жгутиков, и распределение нуклеоида в нитях показывало, что сегрегация была нормальная (Dick et al., 1985). На способность к роению P.mirabilis влияет и кислородный режим культивирования (Wilkerson, Niederhoffe, 1995).

Аллисон с соавторами (1992) идентифицировали 3 этапа в цикле роения P.mirabilis: дифференцировка коротких вегетативных клеток (V) в многоядерные многожгутиковые роящиеся (S) клетки; популяция роящихся клеток (С) и превращение роящихся клеток в короткие вегетативные (Vc) клетки (консолидация) (Allison et al., 1992). В результате циклически повторяющихся событий на поверхности агара при посеве в центр чашки можно наблюдать образование концентрических колец (рис. 28). Однако до сих пор оста

12 ется невыясненным вопрос о способах контакта клеток популяции между собой при координации цикла роения (Bêlas et al., 1998).

Белас с соавторами (1998) идентифицировали генетический локус, мутации в котором вызывают преждевременное развитие роения. Этот локус P.mirabilis кодирует RsbA (regulator of swarming behavior) и белки P.mirabilis, гомологичные RcsB и RcsC (Bêlas et al., 1998). Кроме того, получен мутант P.mirabilis, не утративший подвижности, но не способный к проникновению в клетки эпителия. Ген, отвечающий за этот признак, кодирует белок, предположительно похожий на трансферазы Сахаров, участвующие в модификации кора липополисахарида (Gugi et al., 1995). Определена структура кап-сульного полисахарида, выделенного из роящегося штамма P. vulgaris СР2-96 (Rahman et al., 1997).

Основываясь на экспериментальных наблюдениях клеточной дифферен-цировки и групповой подвижности, американские ученые создали кинетическую модель роения P.mirabilis, ключевым элементом которой является зависимость поведения роения от возраста клетки. Кинетические модели, подобные этой могут быть применимы к периодическим явлениям в других биологических системах (Esipov, Shapiro, 1998).

Фалкинхем и Хофман показали (1984), что роящиеся и короткие клетки P.mirabilis и P.vulgaris отличаются друг от друга синтезом (или недостатком синтеза) определенных ферментных и внемембранных белков: синтез уреазы конститутивен в роящихся клетках и индуцибелен в коротких клетках; при развитии роящихся клеток уровень цитохрома b уменьшается, а синтез цито-хромов and репрессирован; дыхательная активность роящихся клеток ослаблена. Все эти изменения обусловлены регуляцией транскрипции (Falkin-ham, Hoffman, 1984). Дифференцировка уропатогенных P.mirabilis, от типичных вегетативных клеток к жгутиковым сопровождается увеличением активности внеклеточного гемолизина и металлопротеазы, которые, наряду с уреа-зой, занимают центральное место в вирулентности P.mirabilis (Allison et al.,

13

1992). Способность P.mirabilis внедряться в клетки мочевого тракта человека in vitro является главной характеристикой роящихся клеток, а не вегетативных. Активность фосфатазы не увеличивалась во время дифференцировки и при превращении клеток в вегетативные формы. (Allison et al., 1992). Связь факторов вирулентности P.mirabilis со способностью клеток к роению описана и другими авторами (Mobley et al., 1996).

Особенности строения клеточной стенки. Организация оболочки клеток рода Proteus в целом соответствует ее строению у грамотрицательных бактерий и, в частности, энтеробактерий (Шлегель, 1987). Исследование общей морфологии клеток и профиля оболочки P.mirabilis и Е. coli методом электронной микроскопии с использованием криотехники показало аналогию в строении клеточной оболочки этих двух бактерий (Graham et al., 1991). Профили оболочки включали прозрачную периплазму, связанную с плазматической и наружной мембранами. Наружные мембраны волнообразны, с переплетением тонкого, от 2 до 3 нм, пептидогликанового слоя. Они представляют собой мутные, неоднородно окрашенные структуры равномерно и широко обрамляющие периплазматический гель (от 10.6 до 14.3 нм шириной) и без труда визуализирующиеся при окраске. Цитоплазматическая мембрана выглядела как бислой, появляющийся сразу после окраски, хотя наружный слой этой мембраны часто был очень плотно прижат к периплазматическому гелю, и вследствие этого его трудно было наблюдать. У P.mirabilis обнаруживался капсульный полисахарид волокнистой структуры с волокнами, расположенными перпендикулярно к клеточной поверхности.

Липополисахарид внешней мембраны клеточной оболочки Proteus рассматривается как один из факторов вирулентности этого микроорганизма, а тонкая структура его полисахаридной цепи (О-специфического полисахарида или О-антигена) определяет серологическую специфичность штамма. Было найдено, что наряду с общими для липополисахаридов энтеробактерий моносахаридами (глюкоза, глюкозамин, Ь-глицеро-Б-манногептоза, З-дезокси-D

14 манноактулозоновая кислота) липополисахариды всех серотипов P.mirabilis и P.vulgaris содержат галактуроновую кислоту, а многие и лизин (Kotelko et al., 1975). Систематическое структурное исследование бактерий рода Proteus проводится группой исследователей института органической химии им. Н.Д. Зелинского и центра микробиологии и вирусологии Польской Академии наук (Шашков с соавт., 1996, 1996а). Установлено строение О-специфических полисахаридов, определяющих серологическую специфичность P.mirabilis се-рогрупп 026, 028, 029, 030 и 013, и показано, что они представляют собой кислые полисахариды за счет присутствия остатков D-галактуроновой кислоты, часть которых О-ацетилирована, а другая часть образует амид с а-аминогруппой L-лизина, глюкуроновой кислоты или D-галактозы, 2-ацетамид-2-дезокси-Б-глюкозы и 1Ч-эпсилон-( 1 -карбоксиэтил)-1чГ-альфа-(В-галактуронил)-лизина (Шашков с соавт., 1996а, 1997; Перепелов с соавт., 2000).

Пептидогликан P.mirabilis аналогичен по структуре пептидогликану других представителей семейства энтеробактерий, за исключением одного важного отличия - присутствия О-связанных ацетильных групп. Эта модификация пептидогликана имеет место при Сб группе N-ацетил-мурамового остатка, образуя соответственно производное 2,6-диацетил-мурамовой кислоты. О-ацетилированный пептидогликан устойчив к действию многих лизоцимов, включая человеческий. Так, в процессе инфекции большие фрагменты О-ацетилированного пептидогликана циркулируют в организме хозяина, индуцируя многие патологические эффекты (ревматоидный артрит). Ряд бактерий, включая многие патогенные виды как грамположительные {Staphylococcus aureus), так и грамотрицательные {Neisseria gonorrhoeae и P.mirabilis), обладают О-ацетилированным пептидогликаном, что является важным феноменом. Пептидогликан некоторых видов О-ацетилирован более чем на 70%, так что они могут быть относительно или полностью устойчивы к гидролизу лизоцимом (Dupont, Clarke, 1991).

15

В наружной мембране P.mirabilis 6515 были обнаружены несколько белков, регулируемых железом, с молекулярными массами от 64 до 75 к Да. Эти белки экспрессировались при культивировании клеток в условиях лимитации по железу уже через 15 минут. Авторы предполагают, что данные белки играют определенную роль в патогенезе вызываемых протеем инфекций (Piccini et al., 1998).

Некоторые генетические свойства Proteus mirabilis. Генетические исследования, проведенные с P.mirabilis, весьма разнообразны, и охватить весь их спектр в рамках небольшого обзора не представляется возможным. Поэтому мы позволим себе сузить круг обсуждаемых вопросов и, учитывая специфику данной работы (изучение регуляции синтеза фермента, и возможное участие в этом SOS-системы клетки), остановимся более подробно на исследованиях гес-генов P.mirabilis.

В начале 80-х годов текущего столетия в составе плазмиды pBR 322 был клонирован ген P.mirabilis, способный заменять гесА ген E.coli. Рестрикци-онная карта клонированного гена отличалась от рестрикционной карты гена гесА E.coli. Рекомбинантная плазмида, содержащая гесА ген P.mirabilis, обладала способностью восстанавливать уровень устойчивости к ультрафиолету (УФ) до уровня диких штаммов у ряда делеционных (по гесА гену) мутантов E.coli (Eiter et al., 1981, 1982). Несколько позднее другими авторами была установлена нуклеотидная последовательность гесА гена P.mirabilis (Akaboshi et al., 1989). Очищен RecA белок P.mirabilis и изучены его свойства. Показано, что очищенный RecA белок P.mirabilis катализирует in vitro расщепление белка LexA (репрессор генов SOS-системы E.coli и репрессор CI фага X). Полученные данные позволяют предположить наличие у P.mirabilis SOS-системы, сходной с SOS-системой E.coli (West et al., 1983, West, Little., 1984). Показана консервативность АТФ-связывающего домена RecA белков P.vulgaris, Erwinia carotovora и E.coli К-12 и B/r (Kwight et al., 1988).

16

Немецкими учеными в E.coli клонированы фрагменты ДНК P.mirabilis, комплементирующие делеционные мутации recBCD E.coli. Полученные гибридные клоны восстанавливали способность к рекомбинации в конъюгаци-онных скрещиваниях, характеризовались нормальным уровнем устойчивости к УФ-облучению, а также обнаруживали АТФ-зависимую экзонуклеазную активность. Установлено, что геныP.mirabilis расположены на хромосомной ДНК в таком же порядке, как соответствующие гены E.coli: thyA, recC, recB, recD, araA. Показано, что образующиеся in vivo гибридные белки способны осуществлять функции репарации и рекомбинации (Weichenhan, Wackernagel, 1988; Wackernagel et al., 1989). Особенности механизма репара-тивных процессов у P. mirabilis исследованы другой группой немецких ученых. В процессе исследований ими использовались мутанты, дефектные по репарации, чувствительные к УФ и митомицинуС. Изучены особенности му-тантных штаммов (Böhme, 1967, 1968, 1970; Hofemeister, Böhme, 1975).

Помимо вышесказанного нужно упомянуть ряд работ американских и японских исследователей, посвященных изучению физических свойств R-факторов Proteus (Haapala, Falkow, 1971) и уровня устойчивости к лекарственным препаратам, определяемой R-фактором NR1 (Haapala, Falkow, 1971; Hashimoto, Rown, 1975). Авторами, показано, что R-фактор P.mirabilis состоит из двух различных единиц: RTF (resistance transfer factor) и частицы, несущей гены лекарственной устойчивости (г-детерминанта). В отличие от E.coli и Serratia marcescens, у которых RTF и r-детерминанта прочно ассоциированы в форму сложной структуры, R-фактор P.mirabilis может в различной степени диссоциировать на RTF и г-детерминанту.

Многими исследователями описана продукция бактериоцинов разными видами протея. Указывалось, что чувствительность к бактериоцинам обычно ограничена штаммами того же вида (лишь Р.vulgaris и P.mirabilis проявляют перекрестную чувствительность), однако прикладного значения эти наблюдения пока не приобрели (Энтеробактерии, 1985). Изучена продукция бакте

17 риоцинов - протоцинов - у 250 клинических штаммов P.mirabilis. Исследована спонтанная протицинная активность P.mirabilis и протицинная активность, индуцированная митомициномС. Установлено, что 90.4% штаммов являются продуцентами протоцинов. Метод типирования протоцинов у P.mirabilis предлагается для эпидемиологических целей (Tavechio, Bushinelli, 1993).

Чешскими авторами представлена новая схема фаготипирования штаммов P. vulgaris и P.mirabilis, основанная на 22-х фагах, поделенных на четыре морфологических типа Al, А2, В1 и Cl и классифицированных как представители семейств Myoviridae, Sphoviridae и Podoviridae (Sekaninova et al., 1994, 1996, 1998).

Распространение в природе и роль в патогенезе человека. Хаузер, открывший впервые Proteus vulgaris в 1885 году, находил его в гниющих субстратах и считал весьма распространенным микроорганизмом. Работы Мечникова по изучению этиологии детской диареи открыли новую страницу в изучении бактерий рода Proteus. Ему удалось экспериментально получить аналогичные заболевания после заражения протеем обезьян и крыс (Энтеро-бактерии, 1985).

Бактерии рода Proteus обнаруживаются в испражнениях многих видов животных, в испражнениях и моче больных и здоровых людей. Они выделяются при циститах, остеомиелитах и нагноении ран, вызывая в комбинации с другими микробами тяжелые осложнения; обнаруживаются в сточных водах и почве, особенно богатой гниющими органическими субстратами. В объектах окружающей среды, загрязненных органическими отбросами, выделяются как Р. vulgaris, так и P.mirabilis, но по многочисленным данным, в объектах, загрязненных выделениями человека, чаще присутствует P. m irab His. Считают, что Proteus участвуют во вспышках пищевых токсикоинфекций. Данные об обнаружении представителей рода в кишечном тракте кур, лошадей, крыс незначительны, очевидно, их присутствие в испражнениях живот

18 ных - явление не столь частое. Замечено, что совпадение промысла рыб с максимальной активностью бактерий рода Proteus увеличивает риск ее инфицирования в Волго-Каспийском регионе. Высокая протеолитическая активность, способствующая автолизу и порче рыбы, устойчивость бактерий к солевым растворам обязывают вести жесткий контроль за рыбой (Ларцева, Жуков, 1993). На некоторых фермах наблюдались заболевания свиней с лихорадкой, кашлем, одышкой, диареей, рвотой, обнаруживались изменения в легких, бронхах, лимфоузлах и тонком кишечнике. Летальность свиней при этом заболевании составляла 28.7 - 52.5%. Из 17 выделенных препаратов было выявлено 12 изолятов рода Proteus. Возбудитель продуцировал термолабильный энтеротоксин (Руденская, 1991).

С протеем связывают возникновение урологических и госпитальных инфекций (Jacqueline, 1991). У пациентов с мочевыми катетерами или со структурными нарушениями мочевого тракта зачастую обнаруживается P.mirabilis, важнейшим фактором вирулентности которого является уреаза (Mobley et al., 1994). В Нидерландах впервые описан случай выделения P.mirabilis при спинномозговом остеомиелите у детей (Deweerd et al., 1997). В последнее время в литературе все чаще появляются сообщения о выделении P.mirabilis при заболевании людей ревматоидным артритом (Wilson et al., 1997, 1998). Вопрос об участии P.mirabilis в патогенезе ревматоидного артрита возник впервые 10-13 лет назад. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что у больных ревматоидным артритом, особенно в острой фазе, титр антител классов M, A, G выше, чем у здоровых лиц. Существует сходство в аминокислотной последовательности между третьей областью главного комплекса гистосовместимости, определяющей предрасположенность к ревматоидному артриту, и гемолизином протеев. Больные ревматоидным артритом имеют антитела к гемолизину в более высоком титре, чем здоровые люди (Fielder et al., 1995; Gaston, 1995).

19

Внутрибольничные инфекции, обусловленные P.mirabilis, с высокой частотой регистрируются в хирургических отделениях, у больных после тяжелых хирургических вмешательств; при патологии респираторного тракта; сердечно-сосудистых заболеваниях и как осложнения при урогенитальных манипуляциях. Описаны протейные менингоэнцефалиты новорожденных как осложнение пупочной инфекции с высокой летальностью. Большую проблему представляет устойчивость протеев к антибактериальным препаратам (Gomes, 1991). Все это делает весьма актуальным исследование особенностей физиологии этих бактерий.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Салихова, Зифа Закарьевна

выводы

1.Уровень нуклеазной и фосфатазной активности в клетках Proteus mirabilis намного превышает уровень активности аналогичных ферментов у других исследованных видов семейства энтеробактерий.

2.Нуклеаза и фосфатаза локализованы в периплазме P.mirabilis, выделяются в среду при образовании сферопластов и при многократном быстром замораживании-оттаивании клеток. Внеклеточная активность ферментов составляет 11-19% от суммарной активности в клетках и культуральной жидкости.

З.Электрофоретический анализ показал наличие в периплазме и культуральной жидкости P.mirabilis двух изоформ нуклеазы и одной фосфатазы.

4.Нуклеаза и фосфатаза синтезируются клетками в период перехода к стационарной фазе роста и в стационарную фазу роста.

5.Разработан метод очистки периплазматической нуклеазы P.mirabilis, включающий хроматографию на КМ-целлюлозе и на колонке MonoQ в режиме FPLC, дающий возможность получить нуклеазу в электрофоретически гомогенном состояния.

6.Фермент обладает эндонуклеолитическим типом действия, имеет оптимум рН 10, активируется ионами двухвалентных металлов, ингибируется ЭДТА, не ингибируется неорганическим фосфатом, гидролизует ДНК и РЕК и обозначен как неспецифическая эндонуклеаза Рт.

7.Регуляция биосинтеза эндонуклеазы осуществляется нуклеиновыми кислотами по типу субстратной индукции и неорганическим фосфатом (негативная регуляция). Последний ингибирует синтез и активность фосфатазы. Синтез и секреция изучаемых ферментов индуцируется митомицином С — индуктором SOS-функций клетки, что свидетельствует об участии белков SOS-системы в регуляции синтеза внеклеточных ферментов Proteus mirabilis.

119

8.Синтез эндонуклеазы и щелочной фосфатазы Proteus mirabilis не индуцируется при дифференцировке вегетативных клеток в роящиеся формы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ литературы показывает, что в связи с возрастающей ролью представителей семейства энтеробактерий и, в частности, рода Proteus в патогенезе вторичных инфекций человека, эти микроорганизмы привлекают все большее внимание исследователей. Особенности строения клеточной стенки протеев делают их нечувствительными к основным используемым медикаментозным препаратам и затрудняют лечение вызванных ими инфекционных процессов.

Основной особенностью Proteus, интересующей ученых, является их способность к роению. С роением авторы многих публикаций связывают вирулентные свойства протеев. Показано, что способностью проникать в эпителиальные клетки мочевого тракта человека и животных обладают именно роящиеся клетки, у которых к тому же наблюдается повышенный синтез таких факторов вирулентности, как уреаза, металлопротеаза, гемолизины, что свидетельствует о координированной регуляции синтеза факторов вирулентности у этих бактерий. Широко изучаются флагеллины Proteus, ответственные за его адгезивные свойства.

Судя по данным литературы, большее внимание уделяется уропатоген-ным штаммам P.mirabilis по сравнению со штаммами, вызывающими или осложняющими гнойные процессы.

P.mirabilis синтезирует ряд гидролитических ферментов, локализованных в пределах клетки и секретируемых в среду, большинство из которых участвует в патогенезе протейной инфекции. Среди ферментных систем P.mirabilis наиболее изученными являются уреаза, металлопротеаза, (З-лактамазы, несколько в меньшей степени - гемолизины. Для многих из них изучены свойства, закономерности синтеза, нуклеотидные последовательности структурных и регуляторных генов. Гораздо в меньшей степени уделяется внимание

39 нуклеазам, хотя из анализа литературы становится ясно, что они, несомненно, играют определённую роль в патогенезе бактериальных инфекций. Исследования по нуклеазам P.mirabilis датируется 1960 - 1970 годами и касается в основном изучения свойств отдельных нуклеаз бесклеточных экстрактов, полученных в результате разрушения клеток. Вопросы, связанные с локализацией, секрецией в среду, составом, основными закономерностями и регуляцией синтеза до настоящего времени остаются малоизученными. Кроме того, анализ литературы показал, что очень мало известно о генетических механизмах регуляции синтеза бактериальных эндонуклеаз.

Необходимо отметить, что в настоящее время значительно возрос интерес к неспецифическим эндонуклеазам растительных и животных клеток в связи с установлением ключевой роли этих ферментов в быстрой деградации ядерной ДНК клетки при апоптозе.

Таким образом, выяснение механизмов регуляции экспрессии генов неспецифических эндонуклеаз приобретает общебиологическое значение.

В данной работе изучались секретируемые неспецифические нуклеазы Proteus mirabilis - потенциальные факторы вирулентности микроорганизма -и возможные механизмы регуляции их синтеза. В качестве рабочей гипотезы выдвигалось предположение об универсальных способах регуляции экспрессии генов неспецифических секретируемых эндонуклеаз бактерий по типу SOS-ответа клетки на блокирование репликации и повреждения ДНК. В связи с недостаточностью сведений о нуклеазах Proteus mirabilis предварительно планировалось исследовать локализацию, состав и свойства секретируемых нуклеаз у этих бактерий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы

1.1. Штаммы бактерий, использованные в работе

В работе использованы: штаммы рода Proteus, полученные из патологического материала различных микробиологических лабораторий клинических больниц г. Казани; штаммы представителей родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Hafnia, Salmonella, Shigella, Morganella, Providencia, полученные из Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии. Основные исследования проведены при использовании Proteus mirabilis штамм 4, выделенного из гнойного содержимого раны.

При характеристике биохимических свойств штамма Р.mirabilis4 были использованы энтеротесты 1 и 2 для дифференциации кишечных бактерий (изготовитель "Lachema", Чехословакия). Способность штамма сбраживать отдельные сахара определяли общепринятыми методами - на средах Гисса (Энтеробактерии, 1985). Способность к роению определяли по образованию вуалеобразного налета на плотных питательных средах и в посеве по Шуке-вичу.

1.2. Питательные среды

Среда № 1 - мясо-пептонный агар (МПА). Среда № 2 - мясо-пептонный бульон (МПБ). Среда № 3 - ТВY(Eiter et al, 1981), %: триптон дрожжевой экстракт

-1.0

-0.5

NaCl

-0.5 дистиллированная вода юссийоуа « . рН 7.8.

Среда № 4 - полусинтетическая среда с низким содержанием неорганического фосфата (Знаменская с соавт.,1982), %: глюкоза - 1.00 пептон - 2.00

СаС12-2Н20 -0.01

1^04 • 7Н20 - 0.03

ЫаС1 - 0.30

Мп804 -0.01 дистиллированная вода рН 7.8.

Среда № 5 - кровяной агар.

Среда № 6 - желточно-спиртовый агар.

1.3. Выращивание бактерий и получение бесклеточных экстрактов

Бактерии выращивали на жидких или плотных питательных средах различного состава в зависимости от поставленных задач. Во всех случаях посевным материалом служил смыв в 0.14М растворе 1ЧаС1 ночной культуры, выращенной на МПА. Посев проводили из расчета 0.05 - 0.10 единиц оптической плотности (Бб5о) на 1 мл среды. Бактерии выращивали в конических колбах в инкубационном шкафу-качалке при 200 об/мин и 37°С, отношение объема среды к объему колбы 1:5. В кратковременных опытах с культурой отмытых клеток бактерии, выращенные в течение 20-ти ч, осаждали центрифугированием, отмывали 0.14 М раствором №С1 и ресуспендировали в среде того же состава, сохраняя исходную концентрацию клеток. Клетки, взвешенные в свежей питательной среде, распределяли по колбам, добавляли необходимые агенты и помещали на качалку. Инкубировали в течение 4 ч при 37°С. По окончании выращивания в КЖ определяли: величину биомассы по Б65о, активности ферментов - после осаждения клеток центрифугированием

42 при 10000 g, 15 мин при +4°С. Осажденные клетки отмывали 0.14 М раствором NaCl и заливали стерильным 0.01М трис-HCl буфером, рН 7.4. После тщательного ресуспендирования отбирали пробы для определения белка биомассы и сухого веса клеток. Оставшуюся суспензию подвергали обработке различными методами. Полученный экстракт центрифугировали при 10000g, 20 мин при +4°С для освобождения от обломков и не разрушенных клеток. В полученном бесклеточном экстракте определяли белок и активности ферментов.

Для получения гипержгутиковых роящихся форм вегетативных клеток чашки Петри, содержащие МПА (агара 2%), засевали бактериальной петлей в центре чашки ночной культурой и инкубировали при 37еС 6-7 ч (Allison et al, 1992). Сегменты агара, несущие вегетативные или роящиеся клетки, вырезали отдельно и отмывали бактериальную массу от агара 0.1М фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.9% NaCl. Из полученной таким образом суспензии готовили фиксированные препараты для микроскопии, оставшуюся суспензию разрушали методом многократного быстрого замораживания-оттаивания для получения бесклеточных экстрактов, в которых определяли содержание белка и активность ферментов.

1.4. Контроль за ростом клеток

Оптическую плотность замеряли на ФЭК "Spectromom-410" (Венгрия). За единицу биомассы принимали поглощение клеточной суспензии в односантиметровой кювете при длине волны 650 нм, равное единице.

Вес сухой биомассы определяли высушиванием бактериальной массы при 105°С до постоянного веса.

Число колониеобразующих единиц определяли методом посева на чашки Петри с МПА, содержащим 4% агара.

43

Белок определяли методом Лоури, а также спектрофотометрически при длине волны 280 нм в односантиметровой кювете, принимая за мг белка оптическое поглощение раствора, равное единице (Кочетов, 1980).

ДНК определяли по методу Бартона (Burton, 1956).

1.5.Методы обработки клеток

Разрушение клеток проводили дезинтеграцией ультразвуком на установке УЗДН-1 (Россия) при силе тока 0.18 А и частоте 22 Кгц в течение 10 мин (по 30 сек с интервалами в 1 мин - 20 раз). О разрушении клеток судили по результатам микроскопии и освобождению белка и ДНК клеток.

Методы избирательного освобождения ферментов периплазмы.

Попеременное многократное быстрое замораживание-оттаивание жидким азотом, процедуру повторяли 12 раз (Соколова с соавт., 1976).

Обработка хлороформом (Ames G.F.)-L. et al., 1984). 2 мл водной клеточной суспензии с D65o 3 ед/мл центрифугировали при 2000 об/мин, 10 мин. Надосадок аккуратно сливали, к осадку добавляли 20 мкл хлороформа и выдерживали 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0.2 мл трис-НС1 буфера, pH 8.0 и центрифугировали при 6000 об/мин, супернатант собирали (бесклеточный экстракт).

Медленное замораживание-оттаивание (Lall S.D. et al., 1989). Клетки замораживали в течение ночи при -20°С. Затем оттаивали при комнатной температуре.

Быстрое замораживание-оттаивание (Lall S.D. et al., 1989). Клетки однократно быстро замораживали жидким азотом, выдерживали в таком состоянии 10 мин и постепенно размораживали при комнатной температуре.

Получение сферопластов. Бактерии выращивали на МПБ или полусинтетической среде с низким содержанием Pi (0.008 г/л). Сферопласты получали по методу Ню и Хеппеля (New, Heppel, 1964). Клетки бактерий в экспоненциальной фазе роста осаждали при 10000g, 15 мин при +4°С. Осадок дважды

44 отмывали холодным 0,01М трис-НС1 буфером, рН 8,1. Клетки суспендировали в 8.0мл трис-сахарозной среды, рН 8,0 и доводили до 3 единиц оптической плотности (концентрация сахарозы - 20%). В полученную суспензию клеток вносили ЭДТА до конечной концентрации 0,001 М и немедленно - лизоцим до конечной концентрации 10 мкг/мл. Клетки, обработанные ЭДТА и лизо-цимом, осаждали центрифугированием при 10000§, 15 мин. В надосадочной жидкости определяли белок и активность ферментов. Осадок, дважды отмытый в трис-сахарозной среде, суспендировали в холодной дистиллированной воде для лизиса образовавшихся сферопластов, В лизате, после осаждения центрифугированием оставшихся интактными клеток, определяли содержание белка и активность ферментов. Объем обрабатываемой суспензии и объем воды, в котором происходил лизис сферопластов, были одинаковыми, что позволяло сравнивать активность высвобождаемых ферментов. Об образовании сферопластов судили по результатам микроскопии и по снижению оптической плотности суспензии после лизиса сферопластов.

1.6.0пределение активности ферментов

Активность ДНКазы и РНКазы определяли по образованию кислоторас-творимых продуктов расщепления ДНК, растворимых в 2% НСЮ4, поглощающих при 260 нм. Состав реакционной смеси: ДНК (РНК) - 1 мг/мл; буфер трис-НС1, рН 8.5 - 0.06 М; М§С12 - 0.006 М; исследуемый материал - 0.1 мл; общий объем смеси 1 мл. За единицу активности принимали количество фермента, дающее увеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными на 1 единицу за 1 ч инкубации в односантиметровой кювете (Татарская с соавт., 1966: Апйтеп е1 а1., 1954).

Активность фосфатазы определяли по расщеплению модельного субстрата. Состав реакционной смеси: 0.8 мл 0.2% раствора п-нитрофенилфосфата натрия в 0.2 М буфере трис-НС1, рН 8.5, содержащем 0.02М М^СЬ, 0.2 мл исследуемого материала (Лещинская с соавт., 1980). За

45 единицу активности принимали количество фермента, освобождающего при расщеплении субстрата, 1 мкмоль п-нитрофенола в 1 мл исследуемого раствора за 1 мин. Для пересчета использовали калибровочную кривую зависимости поглощения при 410 нм от концентрации п-нитрофенола.

Активность протеазы определяли по видоизмененному методу Ансона (Каверзнева, 1976) с казеином в качестве субстрата. К 0.5 мл исследуемого материала добавляли 0.5 мл 2 % раствора казеина. Реакционную смесь инкубировали 15 мин при 37°С. Непереваренный белок осаждали, добавляя один мл 5 % раствора ТХУ, и инкубировали 20 мин при 37°С. Осадок удаляли центрифугированием при 7000 15 мин. К 0.5 мл супернатанта добавляли 2.5 мл 0.5 М раствора Ма2С03 и 0.5 мл раствора Фолина, разведенного в 2 раза. Ставили на 20 мин в темноту для развития окраски. Измерения проводили при 670 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости один см. Количество единиц протеазы находили по формуле:

ОБ • А - Р -2

ПЕ=-(мэкв • мл • мин), где:

1620-15

ПЕ - единицы активности протеазы.

ОВ - разность поглощения опытной и контрольной проб.

4, 2 - коэффициенты разведений на момент опыта.

Р - разведение исследуемого материала перед реакцией.

1620 - молекулярная экстинкция тирозина при 670 нм.

Активность ферментов рассчитывали на единицу белка биомассы или единицу сухой биомассы.

Гемолитическая и лецитиназная активности. О наличии гемолитической активности судили по образованию зон гемолиза на чашках с кровяным МПА. Лецитиназную активность определяли по образованию опалесцирую-щих зон вокруг бляшек исследуемого штамма на чашках с желточно-спиртовым агаром (Керашева, Притчина, 1974).

46

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по Кочетову (Кочетов, 1980). Состав реакционной смеси: глкжозо-6-фосфат, натриевая соль - 0.006 М, рН 7.5; глицил-глициновый буфер - 0.057 М, рН 7.5; хлористый магний - 0.007 М; МАОР - 0.0005 мМ, рН 6.0; исследуемый материал -0.05 мл; общий объем смеси - 3 мл. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее превращение 1 мкМ НАБР за 1 мин.

1.7. Определение удельной скорости роста бактерий и удельной скорости синтеза фермента

Удельную скорость роста, ц, рассчитывали по формуле (Перт, 1980): х=---, где: х0 - количество биомассы в начальный момент времени; х - количество биомассы через промежуток времени Ь Удельную скорость синтеза фермента, в, по аналогии с |1:

2,3(1ёА-1ёАо) в=-, где:

Ао - удельная активность фермента в начальный момент времени; А - удельная активность фермента через промежуток времени 1:. Время удвоения биомассы, принятое равным времени генерации клеток рассчитывали по формуле:

0,693 - , где: - время удвоения биомассы.

1.8. Концентрирование внеклеточных белков и электрофорез

Полученную после центрифугирования культуральную жидкость насыщали сульфатом аммония до 90 % и выдерживали на холоду в течение ночи. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием при 10000 затем

Al растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды, диализовали против дистиллированной воды, а в конце диализа - против необходимого буфера, до отрицательной реакции на анионы S04 Диализ проводили на холоду на магнитной мешалке для ускорения процесса.

Электрофорез белков проводили в 7,0 и 12.5% ПААГ в нативных и денатурирующих условиях по Лэммли (Laemmli,1970). По окончании электрофореза в нативных условиях проводили субстратный блоттинг с целью обнаружения белков с фосфатазной, ДНКазной и РНКазной активностью, для чего гель покрывали 1% агарозной пластинкой, содержащей 5 мг/мл п-нитрофенилфосфата натрия в 0.2 М трис-HCl буфере, рН 8.5 или же 0.3% ДНК или 0.5% РНК в 0.075 М трис-HCl буфере, рН 8.8, содержащем 0.0075 М MgCl2, и инкубировали при 37° С до появления желтой окраски в препаратах агарозного геля, содержащего п-нитрофенилфосфат натрия, или же до появления зон гашения флуоресценции в препаратах агарозного геля, содержащего ДНК или РНК и окрашенного 0.02% раствором бромистого этидия в течение 15 мин.

В денатурирующих условиях электрофорез проводили в 12.5% ПААГ в присутствии Ds-Na и p-меркаптоэтанола. Молекулярную массу определяли по кривой зависимости логарифма молекулярной массы от относительного расстояния миграции белков. Гели окрашивали 0.2% кумасси ярко-синим (Coomassie Brilliant Blue G250 "Serva") или же аммиачным серебром (Винтер с соавт., 1993 ).

1.9. Выделение, очистка и характеристика нуклеазы

Подготовка обменников к работе. В работе использовали ДЭАЭ - и КМ-целлюлозы, которые обрабатывали по общепринятой методике (Остер-ман,1985). Ионообменники уравновешивали 0.01М натрий-ацетатным буфером, рН 6.3 (для КМ-целлюлозы) и 0.01М трис-HCl буфером, рН 8.5 (для ДЭ АЭ-целлю л озы).

48

Сефадексы G100 и G25 готовили по Детерману (1970) и уравновешивали 0.01М натрий-ацетатным буфером, рН 6.3 (для G100) и 0.01М трис-HCl буфером, рН 7.8 (для G25).

Процедура очистки. Для получения фермента бактерии выращивали на агаризованной среде TBY в чашках Петри в течение 24 ч при 37°С. Бесклеточные экстракты получали методом многократного быстрого замораживания-оттаивания клеток и использовали в качестве исходного материала для дальнейшей очистки фермента. На первом этапе очистки экстракты подвергали фракционированию сульфатом аммония. Для работы использовали фракцию от 40 до 80 % насыщения, которую диализовали против дистиллированной воды, а в конце диализа против 0.01М натрий-ацетатного буфера, рН 6.3 до отрицательной реакции на анионы SO4 Для дальнейшей очистки нуклеазы использовали метод ионообменной хроматографии. В качестве ио-нообменника использовали КМ-целлюлозу, уравновешенную 0.01 M натрий-ацетатным буфером, рН 6.3. На колонку размером 20 х 1.2 см помещали 3 -10 мл ферментного раствора. Элюцию проводили 0.01 M натрий-ацетатным буфером, рН 6.3 в линейном градиенте концентрации NaCl (от 0 до 0.6 M NaCl) в общем объеме 120 мл со скоростью Збмл/ч. Фракции собирали с помощью автоматического коллектора. Фракции с нуклеазной активностью собирали, концентрировали и помещали на колонку с сефадексом G25, уравновешенным 0.01М трис-HCl буфером, рН 7.8 для смены буфера и обессолива-ния. Фракции, содержащие нуклеазную активность собирали и подвергали дальнейшей очистке на колонке MonoQ HR 5/5 в режиме FPLC ("Pharmacia", Швеция), уравновешенной 0.01М трис-HCl буфером, содержащим 0.002М MgCl2-6H20, рН 7.8. Элюцию проводили тем же буфером в линейном градиенте NaCl (0-0.5М) со скоростью 1 мл/мин.

Определение рН-оптимума. При изучении условий действия фермента использовали следующие буферные растворы: 0.2М глицин-HCl, рН 2.0, 3.0,

49

4.0, 5.0; 0.2М трис-ацетатный буфер, рН 5.0, 6.0, 7.0; 0.2М трис-НС1 буфер, рН 7.0, 8.0, 9.0; 0.2М глицин-ЫаОН, рН 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0 при 37°С.

Определение термостабильности. Фракцию очищенного фермента прогревали при 40, 50, 60, 70, 80 и 90°С в течение 10, 30 и 60 мин, после чего определяли активности, которые выражали в процентах от активности не-прогретого фермента.

Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность нуклеазы. Очищенный ферментный препарат обессоливали на колонке с сефадексом 025, уравновешенной 0.01М трис-НС1 буфером, рН 7.8. Влияние катионов металлов (Мп , Mg , Со , Си , Са , Бе ) исследовали, внося соль соответствующего металла в реакционную смесь до определенной конечной концентрации.

Характер действия нуклеазы (экзо- или эндонуклеолитический) изучали, сравнивая кинетику падения вязкости раствора ДНК с накоплением кислото-растворимого материала (Шапот, 1968), а также методом, рекомендованным для оценки топоизомеразной активности микоплазм (НогоVкг е1 а1., 1996). Для этого фракцию очищенного фермента помещали в инкубационный буфер (трис-НС1 - 6мМ; М§С12 - 6мМ; №С1 - 50мМ; меркаптоэтанол - 6мМ; бычий сывороточный альбумин - 0.1%), добавляли ДНК плазмиды р11С19 и инкубировали 1 ч при 37° С. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА. Содержимое проб оценивали методом электрофореза в 1% агарозном геле при напряженности электрического поля 5-8 У/см в том же буфере. О ходе электрофореза судили по миграции бромфенолового синего. Продукты расщепления ДНК регистрировали фотографированием через светофильтр ОС-14 в проходящем УФ-свете после окраски геля бромистым этидием (1 Омг/мл).

50

1.10. Использованные материалы

В работе использовали: РНК производства НИКТИ Б AB (г. Новосибирск); п-нитрофенилфосфат Na, хлорамфеникол и митомицинС фирмы "Serva" (Германия); высокополимерную ДНК, казеин, глюкозо-6-фосфат, ДЭАЭ-целлюлозу фирмы "Reanal" (Венгрия); смеси маркерных белков №1 и №2 СП "Интернаука" (Пущино); NADP фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия); пептон марки "Семипалатинский", содержащий Pi в количестве 0.8 мг% (Знаменская с соавт., 1982); КМ-целлюлозу, рестриктазу Pstl фирмы "Sigma" (США); сефадекс Gl00 и G25 фирмы "Pharmacia" (Швеция).

1.11. Математическая обработка результатов

Эксперименты проводили минимум в пяти повторностях. Математическую обработку полученных результатов проводили по Плохинскому (1978) по следующим формулам: а) Средняя арифметическая величина: М= EV/n, где: V - дата (результат измерения признака), п - объем группы (число объектов в группе). в) Средняя ошибка средней арифметической: т= ±

Результаты считали статистически достоверными при среднеквадратичном отклонении а< 10%.

В качестве критерия достоверности разницы принимали критерий Стью

- разность выборочных средних; ^ - стандартные значения критерия Стьюдента по первому порогу ве роятности (3= 0.95. б) Среднее квадратическое отклонение: <т

M,-M2 дента:

51

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салихова, Зифа Закарьевна, Казань

1.Беляева М.И., Лещинская И.Б., Юсупова Д.В. Нуклеазы микроорганизмов. М.: Наука, 1974.- С.7-106.

2. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем М.: Медицина, 1987.

3. Бенинг Г.П. Исследование биохимических свойств экстрацеллюляр-ной дезоксирибонуклеазы Corynebacterium diphtherie. Автореф. Дисс. . канд. биол. наук.- Казань, 1968

4. Бикмухаметова A.B. Дезоксирибонуклеазная активность сыворотки крови при различных формах воспаления и опухолевом росте, осложненном воспалением. Автореф. . канд. биол. наук.- Казань, 1974.

5. Бойко О.В. Секретируемые факторы Listeria monocytogenes, направленные на преодоление естественной резистентности макроорганизма/ Мат. II Всеросс. конф. «Гомеостаз и инфекционный процесс», Саратов, 1998.-С.11.

6. Винтер В.Г., Зоткина Н.Л., Зо Сын Ха, Абрамова З.И. Очистка и им-мунохимическая характеристика нейтральной Мп2+-зависимой ДНКазы хроматина//Биохимия.- 1993.- Т.58, № 9.- С.1394-1402.

7. Газизова Г.Р., Федоров Р.В., Султанбекова Н.Г. О критериях оценки биологической активности реакторного дифтерийного токсина// Ж. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1968.- № 2.- С.28-33.

8. Детерман Г. Гель-хроматография. Гель-фильтрация. Гель-проникающая хроматография. Молекулярные сита. М.: Мир, 1970.- 252 с.

9. Джавец Э., Мельник Д., Эйдельберг Э. Руководство по медицинской микробиологии М.: Медицина, 1982.- Т.2.- С.207-208.

10. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т.1. М.: Мир, 1982.- С. 291-365.

11. П.Дюбо Р. Биохимические факторы в микробных заболеваниях. М.:

12. Изд-во иностранной литературы, 1957.- 181с.121

13. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул.- М.: Медицина, 1985,- С.26-30.

14. Жестяников В.Д. Генетика репарационных процессов у микроорганизмов// Итоги науки и техники.- ВИНИТИ.- Микробиология.- 1985.- Т. 15.-С.70-125.

15. Иванова Г.С., Безбородов А.Н. Индукция синтеза рибонуклеазы у ак-тиномицетов. В кн.: Ферменты микроорганизмов М.: Наука, 1973.- С. 177182.

16. П.Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназы// Прикладная биохимия и микробиология.- 1976.- Т.7, вып.2.- С.225-228.

17. Капранова М.Н., Филимонова Т.В., Лещинская И.Б., Юсупова Д.В., Беляева М.И. Влияние экзогенных факторов на синтез внеклеточной щелочной рибонуклеазы Bac.intermediusll Микробиология.- 1978.- Т.47.- С.436-440.

18. Керашева С.И., Островский А.Д., Илинская В.В. Микробиологические методы идентификации вирулентного протея. Вопр. физиол. метаболизма и идентификации микроорганизмов. М.: Медицина, 1987.- С. 113-115.

19. Керашева С.И., Притчина Е.А. Определение лецитиназной активности бактерий рода Proteus!I Лабораторное дело.- 1974.- № 2.- С.99-100.

20. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980.- 272с.122

21. Ларцева Л.В, Жуков Н.И. Бактерии рода Proteus у ценных промысловых рыб Волго-Каспийского региона// Ветеринария.- 1993.- Т.2, № 4.-С.31-33.

22. Леонтьева А.Н, Нестерова Г.Н, Макарова И.Б. О лецитиназной активности бактерий рода Proteus!I Ж. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол.-1973.- Т.9, № 11.- С.124-126.

23. Лещинская И.Б. Нуклеодеполимеразы сапрофитных бактерий. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1975.- 180с.

24. Лещинская И.Б, Балабан Н.П, Капранова М.Н, Голубенко И.А. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов /В кн.: Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов.- Казань: Изд-во КГУ, 1980.- С.53.

25. Лещинская И.Б, Варламов В.П, Куриненко Б.Н. Нуклеазы бактерий. Казань: Изд-во Казан, ун-та, 1991 232с.

26. Медицинская микробиология/Под ред. В.И. Покровского, O.K. Поз-деева.- М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998,- 1200 с.

27. Мельников Н.И, Мельников В.Н, Гимранов М.Г. Ферменты патогенности и токсины бактерий. М.: Медицина, 1969.- С. 170-180.

28. Мухин И.В, Фирсова К.Ф, Мессинова О.В. Некоторые данные о де-зоксирибонуклеазах патогенных клостридий// Ж. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол.- 1966.- № 10.- С.54-58.

29. Нестерова Т.Н. Биология протея. Горький, 1972.- 62 с.123

30. Нестерова Г.Н., Носова J1.C. Электронно-микроскопическое изучение цитопатического действия бактерий рода Proteus на клеточных культурах /В сб.: Физиология и биохимия микроорганизмов. М., 1974.- Вып.2.- С.152-155.

31. Окулова Е.М.//Вопросы ревматизма.- 1973.- № 2.- С.56.

32. Определитель бактерий Берджи в 2-х т., т.1: Пер. с англ./ Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса.- М.: Мир, 1997.- С.190.

33. Зб.Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.- 536с.

34. Перепелов А.В., Шашков А.С., Сенченкова С.Н., Книрель Ю.А., Ли-терачка Э., Каца В. Структура О-специфического полисахарида бактерии Proteus mirabilis029 II Биохимия.- 2000.- Т.65, № 2.- С.213-218.

35. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов. М.: Мир, 1980.-331с.

36. Плохинский Н.А. Математические методы в биологии. М.: Изд-во МГУ, 1978.- 265с.

37. Поликарпов Н.А., Окропиридзе Г.Г., Петраков А.А. Экзонуклеазная активность строго анаэробных бактерий, выделенных у больных и здоровых людей// Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1994.- № 3.- С.21-23.

38. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. М.: Мир, 1987.-117с.

39. Руденская И. Изучение протейной инфекции у свиней/ZActa vet. Et zootech.- 1991.- V.22, N 1.- Р.74-77.

40. Сазыкин Ю.О. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку. М.: Наука, 1965.- 267 с.

41. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.- 358с.

42. Соколова Р.Б., Беляева М.И., Юсупова Д.В. Внутриклеточные нук-леодеполимеразы бактерий — представителей группы Proteus и Providencia.124

43. Получение и некоторые свойства// Вопросы медицинской химии.- 1976.-Т.22, вып.4.- С.488-493.

44. Соколова Р.Б., Юсупова Д.В., Беляева М.И. Активность внеклеточных и внутриклеточных нуклеодеполимераз бактерий группы Proteus -Providencia в процессе роста клеточной популяции// Ж. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол.- 1977.-№ 6.- С.137-138.

45. Тарасов В.А. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. М.: Наука, 1982.- 225 с.

46. Татарская Р.И., Кореняко А.И., Куроедова И.А., Абросимова-Амельянчик Н.М., Аксельрод В.Д., Баев А.А. Фосфодиэстеразы актиномице-тов// Известия АН СССР. Серия биологическая.- 1966.- Т.5.- С.653.

47. Филимонова М.А. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens в эволюционном ряду родственных нуклеодеполимераз. Автореф. . докт. биол. наук.- Казань, 1999.- 43 с.

48. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993.-496с.

49. Шапот В.С. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968.- 125 с.

50. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Марданова А.М., Нехотяева Н.В., Дементьев А.А., Вершинина О.А., Гарусов А.В., Лещинская И.Б. Получение и характеристика секретируемой щелочной фосфатазы Bacillus intermediusll Биохимия.- 1998.- Т.63, вып. 10.- С. 1385-1390.

51. Шашков А.С., Тоукач Ф.В., Жиолковский А., Парамонов H.JL, Сен-ченкова С.Н., Каца В., Книрель Ю.А. Структура О-специфического полисахарида бактерий Proteus mirabilis030ll Биохимия.- 1996.- Т.61, вып.5.- С.800-805.

52. Шашков А.С., Тоукач Ф.В., Парамонов H.JL, Сенченкова С.Н., Каца В., Книрель Ю.А. Структура нового лизинсодержащего О-специфического полисахарида бактерий Proteus mirabilis026ll Биохимия.- 1996а.- Т.61, вып.1.- С.24-34.125

53. Шлегель Г. Общая микробиология. Пер. с нем М.: Мир, 1987.- 567 с. 57.Энтеробактерии/ Под ред. В.И. Покровского М.: Медицина, 1985.321с.

54. Юсупова Д.В. Нуклеодеполимеразная активность бактерий в связи с некоторыми особенностями их физиологии. Казань: Изд-во Казанск. ун-та, 1978.- 203 с.

55. Юсупова Д.В., Порфирьева О.В., Соколова Р.Б., Петухова Е.В. Влияние соединений, индуцирующих SOS-ответ, на динамику и уровень синтеза внеклеточных гидролаз Serratia marcescens!7 Прикл. биохим. и микробиол.1995.- Т.31, № 3.- С. 316-322.

56. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Петухова Е.В. Влияние налидиксовой кислоты и митомицина на рост и биосинтез внеклеточных белков Serratia marcescensll Антибиотики и химиотерапия.- 1993.- Т.38, № 9.- С. 16-21.

57. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Пономарева А.З. Влияние митомицина на биосинтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescensll Антибиотики и химиотерапия.- 1990.- Т.35, № 2.- С. 13-15.

58. Юсупова Д.В., Соколова Р.Б., Порфирьева О.В., Пономарева А.З. Индукция синтеза внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens агентами, подавляющими репликацию ДНК// Микробиология.- 1991.- Т.60, №2.- С.279.

59. Abrell J.W. Ribonuclease I released from Escherichia coli by osmotic shockII Arch. Biochem. Biophys.- 1976.- V.142, № 2,- P.693-700.

60. Agodi A., Stefani S., Corsaro C., Campanile F., Gribaldo S., Siche G. Study of a melanic pigment of Proteus mirabilis!I Research in Microbiology.1996.- V.147, № 3,- P.167-174.126

61. Akaboshi E., Jip M.Z.R., Hovard-Flanders P. Nucleotide sequence of the recA gene of Proteus mirabilisll Nucleic Acids Research.- 1989.- V.17, № 1.-P.4390-4396.

62. Allison C., Lai H. and Hughes C. Co-ordinate of virulence genes during swarm cell differentiation and population migration of Proteus mirabilisll Mol. Microbiol.- 1992.- V.6, № 12.-P.1583-1591.

63. Ames G. F.-L., Prody C., Kustu S. Simple, rapid and quantitative release of periplasmic proteins by chloroform// J. Bacteriol.- 1984.- V. 160, № 3.- P. 11811183.

64. Anfinsen C.B., Redfield R.R., Choate W.I., Page J., Carrol W.R. Studies of gross structure, cross-linkage and terminal sequences in ribonuclease// J. Biol. Chem.- 1954.-V.207.- P.201-210.

65. Anfinsen C.B., Cuatrecasas P., Taniuchi H. Staphylococcal nuclease, chemical properties and catalisis// N.Y. Acad. Press./ The Enzymes.- 1971.-V.4(VII).- P.77.

66. Anraku Y. A new cyclic phosphodiesterase having a 3'-nucleotidase activity from E.coli B. I. Purification and some properties of the enzyme// J. Bacteriol. Chemistry.- 1964.- V. 239.- P.3412-3419.

67. Bahrani F.K., Mobley H.L.T. Proteus mirabilis MR/P fimbrial operon: Genetic organization, nucleotide sequence, and conditions for expression// J. Bacteriol.- 1994.- V.176, № 11.- 3412-3419.

68. Ball T.K., Wasmuth C.K., Braunagel S.C. and Benedik M.J. Expression of S.marcescens extracellular proteins requires recA// J.Bacteriol.- 1990.- V.172, №1.- P.342-349.

69. Belas R. Expression of multiple flaggellinen coding genus of Proteus mirabilisll J. Bacteriol.-1994.- V.176, № 23,- P.7169-7181.

70. Belas R., Schneider R., Melch M. Characterization of Proteus mirabilis precocious swarming mutants: Identification of rsbA, encoding a regulator of swarming behavior// J. Bacteriol.- 1998.- V.180, № 3.- P.6126-6139.127

71. Bendjennat M., Blanchard A., Loutfi M., Montagnier L., Bahraoui E. Puri2.f" 2+fication and characterization of Mycoplasma penetrans Ca /Mg -dependent en-donuclease// J. Bacteriol.- 1997.- V.179, № 7,- P.2210-2220.

72. Benedik M., Stryck U. Serratia marcescens and its extracellular nuclease// FEMS Microbiology Letters.- 1998.-V.165.-P. 1-13.

73. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9-th ed. J.G.Holt, N.R.Krieg, P.H.A.Sneath, J.T.Staley, S.T.Williams.- Baltimorei Williams & Wil-kins, 1994.

74. Berger U. Desoxyribonuklease bei Neisseria gonorrhoeae!/ Naturwissenschaften.- 1971.- Jg.58.- H.63.

75. Bernarder R., Akerlung T., Nordstrom K. Effects on exponentially growing E.coli cells//J. Bacteriol.- 1995.- V.177, № 7,- P.1670-1682.

76. Böhme H. Untersuchungen an reparaturdefekten mutanten von Proteus mirabilis// Studia Biophysica.- 1970,- V.19.- P. 150-162.

77. Bonato M., Costa S., Bianco M. Regulation of extracellular protease secretion in Proteus mirabilis!! Braz. J. Genet.- 1982.- V.3, № 1.- P.467-482.

78. Branca G., Galasso C., Cornaglia G., Fontana R., Satta G. A simple method to detect bacteriolytic enzymes produced by Enterobacteriaceae!! Microbios.- 1996.- V.86, № 349.- P.205-212.

79. Braude A.I., Siemenski J. Role of bacterial urease in experimental pyelonephritis//J. Bacteriol.- I960.- V.80, № 9.- P.171-180.

80. Bryan L.E., Razzell W.E., Cambel J.N. Purification, modification during purification, and characterization of a deoxyribonuclease from Pseudomonas aeruginosa!! J.Biol.Chem.- 1972.- V.247.- P. 1236.128

81. Burton K. A Study the Conditions and Mechanism of the Diphenylamine Acid// Biochem. J.- 1956.- V.62, № 2.- P.315-325.

82. Carpenter C.B, Milton J.D, Mowbray J.F, Butterworth A.E.// Immunology.- 1972,- V.23.-P.171.

83. Center M.S., Behal F.J. A Cyclic Phosphodiesterase with 3'-Nucleotidase Activity from Proteus mirabilis// J. Biol. Chemistry.- 1968.- V.243, № 1.- P.138-143.

84. Center M.S., Behal F.J. Studies on the ribonuclease activity of Proteus mirabilisll Biochim. Biophys. Acta.- 1968a.- V.151, № 3.- P.698-699.

85. Cocks G. And Wilson A.S. Enzyme Evolution in the Enterobacteriaceae!7 J.Bacteriol.- 1972.- V.l 10, № 3.- P.793-802.

86. Cook S.W, Mody N, Vail J, Hull R. Molecular cloning of Proteus mirabilis uroepithelial cell adherence (uca) genes// Infect. And Immunity.- 1995.-V.63, № 5.- P.2082-2086.

87. Costa S.O.P. A review of protease secretion instability in Proteus mirabilisll Brazil. J. Genetics.- 1990.- V.13, № 2,- P. 165-172.

88. Costa S.O.P, Pessoa G.V.A, Irino K. Behavior of protease (gelatinase)-excreting and non-excreting cells from a single Proteus mirabilis strain when inoculated into mice// Rev. Microbiol.-1981.- V. 12, № 4.- P. 117-120.

89. Cotton F.A, Hazen E.E.// N.Y. Acad. Press./ The Enzymes.- 1971.-V.4(VII).- P. 153.96.de Koning-Ward T.F, Ward A.C, and Robins-Browne R.M. Characterization of the urease-encoding gene complex of Yersinia enterocolitical7 Gene.-1994.-V. 145.-P.25-32.

90. Deng G.E, Podack E.R. Deoxyribonuclease induction in apoptotic cytotoxic T lymphocutes// FASEB Journal.- 1995.- V.9, № 8.- P. 665-669.

91. Deweerd W, Kimpen J.L.L, Miedema C.J. Spinal osteomyelitis caused by Proteus mirabilis in a child// European Journal of Pediatrics.- 1997.- V.l 56, № 1.-P.33-34.129

92. Dick H., Murray R., Walmsley S. Swarmer cell differentiation of Proteus mirabilis in fluid media// J. Microbiol.- 1985.- V.31, № 2.- p. 1041-1050.

93. D'Orazio S.E.F., Collins C.M. Characterization of a plasmid-encoded urease gene cluster found among members of the family Enterobacteriaceael1 ¿Bacterid.- 1993.-V.175.- P.1860-1864.

94. D'Orazio S.E.F., and Collins C.M. The plasmid-encoded urease gene cluster of the Enterobacteriaceae is positively regulated by UreR, a member of the AraC family transcriptional activators// J. Bacterid.- 1993a.- V.175.- P.3459-3467.

95. D'Orazio S.E.F., Thomas V., Collins C.M. Activation of transcription at divergent urea-dependent promoters by the urease gene regulator UreR// Mol. Microbiol.- 1996.- V.21, № 3.- P.643-655.

96. Dupont C., Clarke A.J. In vitro synthesis of O-acetylation of peptidogly-can by permeabilized cells of Proteus mirabilis!I J. Bacterid.- 1991.- V.173, № 15.- P.4618-4624.

97. Either G., Solomin A.S., Tanyashin B.I. Cloning of a recA-like gene of Proteus mirabilis!! Gene.- 1981.- V.14.- P.301-308.

98. Either G., Adler B., Zanzov V.A., Hofmeister J. Interspecies recA protein substitution in E.coli and Proteus mirabilis!! Mol. Gen. Genet.- 1982.- V.185, № 11. p. 481-486.

99. Esipov S.E., Shapiro J. A. Kinetic model of Proteus mirabilis swarm colony development// J. Mathematical Biology.- 1998.- V.36, № 3.- P.249-268.

100. Falkinham J., Hoffman P. Unique developmental characteristics of the swarm and short cells of Proteus vulgaris and Proteus mirabilis!7 J. Bacteriol.-1984.- V.158, № 11.- P.1037-1040.

101. Falkow S. Bacterial Entry into Eucaryotic Cells// Cell.- 1991.- V.65.- P. 1099-1102.

102. Gale G.R. Urease Activity and Antibiotic Sensitivity of Bacteria// J. Bacterid- 1966.- V.91, № 2.- P.499-506.

103. Garinotschneider C., Penfold C.N., Moore G.R., Kleanthous C., James R. Identification of residues in the putative TolA box which are essential foe the toxicity of the endonuclease toxin colicin E9// Microbiology.- 1997.- V.143, № 9.- P. 2931-2938.

104. Gaston H. Proteus in it a likely etiological factor in chronic polyarthritis?//Ann. Rheum. Diseases.- 1995.- V.54, № 3.- P.157-158.

105. Goebel W., Helinski D.R. Endonuclease I of Proteus mirabilis. I. Purification and demonstration of limited endonuclease activity// J. Biol. Chem.- 1971.-V.246, № 12.- P.3851-3856.

106. Goebel W., Helinski D.R. Endonuclease I of Proteus mirabilis. II. Properties of the noncomplexed and transfer ribonucleic acid-complexed forms of the enzyme//J. Biol. Chem.- 1971a.- V.246, № 12.- P.3857- 3862.

107. Gomes A. EI genero Proteus: aspectos microbiologicos y clinicos// En-ferm. Infecc. y Microbiol. Clin.- 1991.- V.9, № 9.- P.567-575.

108. Graham L., Harris R, Villiger W., Beveridge T. Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles// J. Bac-teriol.- 1991.- V.173, № 5.- P.1623-1633.

109. Gray E., Yasmineh W. Streptococcal nuclease W. some properties and specifities of the ribonuclease action of the band D enzymes// Biochemistry.-1968.- V.7.-P.98.

110. Guo M.M.S. and Liu P.V. Serological specificities of ureases of Proteus species// J. Gen. Microbiol.- 1965.- V.38.- P.417.

111. Haapala D.K., Falkow S. Physical studies of the drug-resistance transfer factor in Proteus!I J. Bacteriol.- 1971.- V.106, № 1.- P.294-295.

112. Hancock R.E.W. Alteration in outer membrane permeability// Ann. Rev. Microbiol.- 1984.- V.38.- P.237-264.

113. Hashimoto H., Rown R. Transition of the R-Factor NR1 in Proteus mirabilis: Level of Drug Resistance of Nontransitioned and Transitioned Cells// J. Bacteriol.- 1975.- V.123,№ 1.-P.56-68.

114. Heppel L.A. Selective release of enzymes from bacteria// Science.-1967.- V.156.- P.1451-1455.

115. Hofemeister J., Böhme H. DNA Repair in Proteus mirabilis. III. Survival, Dimer excision, and UV reactivation in comparison with Escherichia coli K12H Molec. Gen. Genet.- 1975.- V.141.- P.147-161.

116. Horovitz S., Maor R., Priel E. ATF dependent DNA topoisomerase in varios mycoplasmas// IOM Lett.- 1996.- V.4.- P.239-240.

117. Jones H., Mobley H.L.T. Proteus mirabilis urease: nucleotide sequence determination and comparison with jack bean urease// J. Bacteriol.- 1989.- V.171.-P.6414-6422.

118. Kotelko K., Fromme J., Sidorczuk Z. Further investigations of Proteus mirabilis lipopolysaccharides// Bull. De L'Academie Polonaise des Sciences. Serie des sciences Biologique.- 1975, Cl.VI.- V.23, № 4.- P.249-256.

119. Kwight K.Z., Hess R.M., Moentee K. Conservation of an ATP-binding domain among RecA proteins from Proteus vulgaris, Erwinia carofovora and Escherichia coliK-12 and B/rll J. Bacteriol.- 1988,- V.170, № 6.- P. 2427-2432.

120. Labigne A., Cussac V., and Courcoux P. Shuttle cloning and nucleotide sequences of Helicobacter pylori genes responsible for urease activity// J. Bacteriol.- 1991.-V. 173.-P. 1920-1931.

121. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4// Nature.- 1970.- V.227, № 15.- P.680-685.

122. Lall S.D., Eribo B.E., Jay J.M. Comparison of four methods for extracting periplasmic proteins// J. Microbiological Methods.- 1989.- V.9, № 3.- P. 195199.

123. Lewin B. Genes V. Oxford University Press.: Oxford, NY, Tokyo, 1994.1272 p.

124. Loomes L, Senior B. and Kerr M. A proteolytic enzyme secreted by Proteus mirabilis degrades immunoglobulins of the immunoglobulins A1 (IgAl), IgA2, and IgG isotypes// Infect. Immun.- 1990.- V.58, № 6.- P.1979-1985.

125. Lukomski S, Mtiller B, Schmidt G. Extracellular Haemolysin of Proteus penneri Coded by Chromosomal hly Genes is Similar to the a- Haemolysin of Escherichia coli// Zbl. Bakt.- 1990.- V.273.- P. 150-155.

126. Maeda M, Hidaka M, Nakamura A, Masaki H, and Uozumi T. Cloning, sequencing, and expression of thermophilic Bacillus sp. strain TB-90 urease gene complex in Escherichia colill J. Bacterid.- 1994.- V.176.- P.432-442.

127. Malamy M.H, Horecker B.L. Release of alkaline phosphatase from cells of Escherichia coli upon lysozyme spheroplast formation// Biochemistry.- 1964.-V.3,№ 12.-p.1889-1893.

128. Martin W.J, Ewing W.H. The deoxyribonuclease testas applid to certain gram-negative bacteriaII Canad. J. Microbiol.- 1967.- V.13.- P.616.

129. Massad G, Fulkerson J.F, Watson D.C, Mobley H.L.T. Proteus mirabilis ambient-temperature fimbriae: Cloning and nucleotide sequence of the atf gene cluster// Infect, and Immunity.- 1996.- V.64, № 10.- P.4390-4395.

130. Massad G, Mobley H.L.T. Genetic organization and complete sequence of the Proteus mirabilis pmf fimbrial operon// Gene.- 1994.- V.150, № 1.- P. 101104

131. Massad G, Lockatell C.V, Johanson D.E, Mobley H.L.T. Construction of an isogenic pmfA mutant and analysis of virulence in a CBA mouse model of ascending urinary tract infection// Infect, and Immunity.- 1994a.- V.62, № 2.-P.536-542.

132. Massad G, Bahrani F.K, Mobley H.L.T. Proteus mirabilis fimbriae: Identification, isolation and characterization of a new ambient-temperature fimbria// Infect, and Immunity.- 19946.- V.62, № 5.134

133. Massad G., Zhao H., Mobley H.L.T. Proteus mirabilis amino acid deaminase: Cloning, nucleotide sequence, and characterization of aad// J. Bacterid." 1995.- V.177, № 20.- P.5878-5883.

134. Mcconkey P.J., Fernandez A., Trent J., Ananthaswamy H.N. Oncogene regulation of endonuclease activation in apoptosis// Cancer Letters.- 1995.- V.94, № 1.- P.9-16.

135. McLean R.J.C., Cheng K.-J., Gould W.D., Nickel J.C., and Costerton J.W. Histochemical and biochemical urease localization in the periplasm and outer membrane of two Proteus mirabilis strains// Can. J. Microbiol.- 1986.- V.32.-P.772-778.

136. Miller J.F., Mikalson J.J., Falkow S. Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence// Science.- 1989.-V.243.- P.916-922.

137. Mobley H.L.T., and Hausinger R.P. Microbial urease: significance regulation, and molecular characterization// Microbiol. Rev.- 1989.- V.53.- P.85-108.

138. Mobley H.L.T., Island M.D., Hausinger R.P. Molecular Biology of Microbial Ureases// Microbiol. Rev.- 1995.- V.59, № 3.- P. 451-480.

139. Mobley H.L.T., Island M.D., Massad G. Virulence determinants of uro-pathogenic Escherichia coli and Proteus mirabilisll Kidney International.- 1994.-Suppl.47.- P. S129-S136.

140. Mulrooney S.B., and Hausinger R.P. Sequence of the Klebsiella aero-genes urease genes and evidence for accessory proteins facilitating nick incorporation//J. Bacterid.- 1990.- V.172.- P.5837-5843.135

141. Mulrooney S.B., Lynch M.J., Mobley H.L.T., and Hausinger R.P. Purification, characterization, and genetic organization of recombinant Providentia stu-artii urease expressed by Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1988.- V.170.- P.2202-2207.

142. Nakahara A., Shimada J., Wakita J., Matsushita M., Matsuyama T.// J. Phys. Soc. Jap.- 1996.- V.65, № 8.- P.2700-2706.

143. Nestle M. and Roberts W.K. An extracellular nuclease from Serratia marcescens.- I. Purification and some properties of the enzyme. II. Specificity of the enzyme// J. Biol. Chem.- 1969.- V.224.- P. 5213-5225.

144. Neu N.C., Chou J. Release of surface enzymes in Enterobacteriaceae by osmotic shock// J. Bacteriol.- 1967.- V.94, № 6.- P.1934-1945.

145. Neu N.C., Heppel L.A. On the surface localization of enzymes in E.colill Biochem. Biophys Res. Commun.- 1964.- V.17, № 3.- P.215-219.

146. Neu N.C., Heppel L.A. The release of ribonuclease into the medium when Escherichia coli cells are converted to spheroplasts// J.Biol.Chem.- 1964a.-V.239, № 11.- P.3893-3900.

147. Nicholson E.B., Concaugh E.A., Foxall P.A., Island M.D., Mobley H.L.T. Proteus mirabilis urease: transcriptional regulation by ureR// J. Bacteriol.-1993.-V.175.- P.465-473.

148. Nikaido H. Outer membrane barrier as a mechanism of antimicrobial resistance// Antimicrobial agents and chimioterapy.- 1989.- V.33, № 11.- P. 18311836.

149. Peerbooms P., Verwej A. and Maclaren D. Vero cell invasiveness of Proteus mirabilisH Infect. Immun.- 1984,- V.43, № 1.- P. 1068-1071.

150. Pemberton J.M., Kidd S.P., Schmidt R. Secreted enzymes of Aeromo-nasllFEMS Microbiol. Letters.- 1997.- V.152, № 1.- P.l-10.

151. Pessoa G.V.A. Behavior of protease (gelatinase)-excreting and non-excreting cells from asingle Proteus mirabilis strain when inoculated into mice// Rev. Microbiol- 1981,- V.12, № 4,- P.l 17-120.

152. Piccini C.D., Barbe F.M., Legnanifajardo C.L. Identification of iron-regulated outer membrane proteins in uropathogenic Proteus mirabilis and its relationship with heme uptake// FEMS Microbiol. Letters.- 1998.- V.166, № 2-P.243-248.

153. Pingoud A., Franke I., Friedhoff P., Gast F.-U., Kolmes В., Meiss G., Wende W., Gimadutdinow O. The Serratia nuclease: structure, function and evolution// В сб.: «Грани сотрудничества».- Казань: Унипресс, 1999.- С. 262-274.

154. Ро11 К. and Braun V. Iron regulation of Serratia marcescens haemolysin gene expression// Infect Immun.- 1988.- V.56, № 9.- P.2967-2971.

155. Pompei R. Use of a novel phosphatase test for simplified identification of species of the tribe Proteae/I J. Clin. Microbiol.- 1990.- V.28, № 6.- P.1214-1218.

156. Pugsley A.B. The complete General Secretory Pathway in GramNegative Bacteria// Microbiol. Rew.- 1993.- V. 57, № i. p. 50-108.

157. Rahmann M.M., Guardpetter J., Asokan K., Carlson R. The structure of the capsular polysaccharide from a swarming strain of pathogenic Proteus vulgaris// Carbohydrate Res.- 1997.- V.301, № 3.- P.213-220.137

158. Rothberg N.W., Swartz M.N. Extracellular deoxyribonuclease in members of the family Enterobacteriaceae!I J. Bacterid.- 1965.- V.90.- P.294.

159. Satta G., Pompei R., Grazi G., and Cornaglia G. Phosphatase Activity Is a Constant Feature of All Isolates of All Major Species of the Family Enterobacteriaceae! I J. Clin. Microbiol.- 1988.- V.26, № 12.- P.2637-2641.

160. Sekaninova G., Hofer M., Rychlik I., Pillini J., Kolarova M., Zajicova V. A new phage typing scheme for Proteus mirabilis and Proteus vulgaris strain. 1. Morphological analysis// Folia Microbiologica.- 1994.- V.39, № 5.- P.381-386.

161. Sekaninova G., Rychlik I., Pillini J., Zajicova V. A new phage typing scheme for Proteus mirabilis and Proteus vulgaris strain. 2. Serological and genetic analysis// Folia Microbiologica.- 1996.- V.41, № 2.- P. 137-140.

162. Sekaninova G., Rychlik I., Kolarova M., Pillini J., Semenka J., Zajicova V. A new phage typing scheme for Proteus mirabilis and Proteus vulgaris strain. 3 Analysis of lytic properties// Folia Microbiologica.- 1998.- V.43, № 2.- P.136-140.

163. Shortman K., Lehman I.R. The deoxyribonucleases of Escherichia coli // J.Biol. Chem.- 1964.- V.239, № 9- P.2964-2974.

164. Sriwanthana B., Island M.D., and Mobley H.L.T. Sequence of the Proteus mirabilis urease accessory gene ureG// Gene.- 1993.- V.129.- P.103-106.

165. Suh Y., Jin S., Ball T.K., and Benedik M.J. Two-step secretion of the Serratia marcescens extracellular Nuclease// J. Bacteriol.- 1996.- V. 178, № 13.-P. 4140-4147.

166. Swihart K.G., Welch R.A. Cytotoxic activity of the Proteus haemolysin HpmAII Infect. Immun.- 1990.- V.58, № 6.- P.1861-1869.

167. Takeuchi S., Suto T. // Nat. Inst. Anim. Health. Quart.- 1973.- V.13.-P.196.

168. Tavechio A., Bushinelli S. Proticine typing of Proteus mirabilis strains// Rev. Microbiol.- 1993.- V.24, № 2.- P.88-93.

169. Taylor R.K. Genetic studies of enterotoxin and other virulence factors of Vibrio cholerae. London: Acad. Press, 1989.- P.309-329.

170. Tillet W.S., Sherry S., Christensen L.R.// Proc. Soc. Expth. Biol. Med.-1948.-V.68.-P.184.

171. Torriani A. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia colill Biochim. Biophys. Acta.- I960.- V.38.- P.460-479.

172. Wannamaker L.W., Yasmineh W. Streptococcal nucleases. I. Farther studier on the А, В and С enzymes// J. Exptl. Med.- 1967.- V.126.- P.475.

173. Wassif C., Cheek D., Belas R. Molecular analysis of a metalloprotease from Proteus mirabilis// J. Bacteriol.- 1995.- V.177, № 20.- P.5790-5798.

174. Weicheham D., Wackernagel W. Cloning of the recB, recC and recD genes from Proteus mirabilis in Escherichia coli: in vivo formation of active hybrid enzymes//J. Bacteriol.- 1988.- V.170, № 3,- P. 1412-1414.

175. Welch R.A. Identification of two different haemolysin determinants in uropathogenic Proteus isolates// Infect. Immun.- 1987.- V.55,№ 9.- P.2183-2190.

176. West S.C, Countryman J.L, Howard-Flanders P. Purification and properties of the RecA protein from Proteus mirabilis!I J. Biol. Chem.- 1983.- V.258, № 11,-P.4648-4654.

177. West S.C, Little J.W. Proteus mirabilis RecA protein catalyses cleavage of E.coli LexA protein and the J repressor in vitro// Mol. Gen. Genet.- 1984.-V.194, № 1.-P.111-113.

178. Wilkerson M.L, Niederhoffe E.C. Swarming characteristics of Proteus mirabilis under anaerobic and aerobic condition// Anaerobe.- 1995.- V.l, № 6.-P.345-350.

179. Wilson C, Senior B.W, Tiwana H, Caparoswanderley W, Ebringer A. Antibiotic sensitivity and proticine typing of Proteus mirabilis strains associated with rheumatoid arthritis// Rheumatology Int.- 1998,- V.17, № 5.- P.203-205.

180. Wilson C, Thakore A, Isenberg D, Ebringer A. Correlation between anti-Proteus antibodies and isolation rates of P. mirabilis in rheumatoid arthritis// Rheumatology Int.- 1997.- V.16, № 5.- P.187-189.

181. Yasmineh W.G, Gray E.D.// Biochemistry.- 1968.- V.7.- P.105.

182. Yasmineh W.G, Gray E.D, Wannamaker L.W.// Biochemistry.- 1968.-V.7.-P.91.

183. Zhivotovsky B, Wade D, Nicotera P, Orrenius S. Role of nucleases in apoptosis// Int. Arch. Allergy and Immun.- 1994.- V.105, № 4.- P.333-338.

184. Znamenskaya L.V, Gabdrakhmanova L.A, Chernokalskaya E.B, Lesh-chinskaya I.B, Hartley R.W. Phosphate regulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria// FEBS Letters.- 1995.- V.3357.- P.16-18.

185. Zorn C, Dietrich R, Kaltwsser H. Regulation by repression of urease biosynthesis in Proteus rettgeri!! Zeitschrift fur Allg. Microbiology.- 1982.- V.22, № 3.- P.197-203.