Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые нематодоцидные препараты в ряду бензимидазолов

ВАК РФ 03.00.20, Гельминтология

Автореферат диссертации по теме "Новые нематодоцидные препараты в ряду бензимидазолов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ " ГЕЛЬМИНТОЛОГИИ имени академика К.И. СКРЯБИНА

На правах рукописи

АВдаЕНКО Валентина Алексеевна

НОВЫЕ Нй«!АТОДСЦИД{ЦЕ ПРЕПАРАТЫ В РЯД/ ЕЕНЗИМИДАЗОЛОВ (эффективность, эмбриотропносгь, биодоступность)

Специальность 03.00.20-Гельминтология

Автореферат

диссертр.ции на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1993

я р^ссийскл)"

; к ЗС': ^

Работа аддадайна' -Все российском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.Я. Скрябина (ВИГИС)

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

профессор Т.П. Ееселова

кандидат химических наук А.Н. Михайлюк

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.И. Бенедикто

доктор ветеринарных наук, профессор Г,А, Таланов Ведущая организация - Московская ветеринарная

академия »

Защита диссертации состоится- ■О г.

в часов на заседании специализированного совета Д-020.04.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте гельминтологии имени К.И. Скрябина.

Адрес: 117218, г. Москва, Б-Черемушкннскал ул., 28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИГИС.

Автореферат разослан " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических-наук

М.К. Вертинская

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Антгельмин^чки, производные бензи-шдазола и метилового эфира карбаминовой кислоты, продолжают )анимать.одно из ведущих мест в арсенале данных терапевтичес-сих. средств. Причиной этому является широкий спектр антгельмин-гного действия, высокая активность при сравнительно малых до-!ах, низкая общая токсичность и т.д.

Широкие возможности по модификации химического строения Зензимлдаэолов делают реальным поиск новых антгельминтиков данного химического ряда. Естественно, что каждое новое проиэ-зодное следует всесторонне оценивать с позиций уже достигнутого в данном направлении. В частности, фенбендазол, обладая зцсокой антгельминтной активностью, не проявляет эмбриотропных :воЙств, что выгодно отличает его от других антгельминтиков -5ензимидазолов. Модификация его молекулы - возможный путь получения высокоэффективных антгельминтиков без побочных эффектов.

В ВИГИСе был синтезирован аналог фенбендазола - ортофен, проявивший нематодоцидную активность и не обладающий эмбрио-гоксическим и тератогенным действием. Наши усилия были направлены по пути повышения нематодоцидной активности введением в его молекулу, для усиления биодоступности, различных заместителей. Кроме того, попытались найти высокоэффективные неыа-годоциды среди бензимидазолов - полимеров, что представляет зобой оригинальный способ получения новых антгельминтиков. Эптимальный подбор состава лекарственных композиций может резко изменить биологические свойства активного начала, исходя из этого в обоих вышеуказанных случаях тестировали лекарственные (ориы.

Цель и задачи'исследований. Цель настоящих исследований - поиск нематодоцидов в ряду бензимидазолов.

Конкретно в задачи исследований входило:

- испытание на антгельминтное и эмбриотропное действие аналогов фенбендазола: ортофена, ортофена "О", орто-фена "А" и фталифена;

- выявление антгельминтной эффективности бензимидазолов-полимеров (препаратов СО-72 и У>-''.') и лекарственно!! формы последнего;

- изучение общетоксических свойств препаратов СО-72 и

и СО-77 и оценка кх влияния на эмбриональное развитие крыс;

- сравнительное изучение фармакокинетики препарата СО-77 при его введении перорально и в составе лекарственной формы.

Научная новизна. Целый ряд новых производных бензимида-зола одновременно оценен на антгельминтное и эмбриотропное действие, для дальнейшего изучения выделен препарат СО-77 и его лекарственная форма. Проведен анализ между химическим строением тестированных соединений и их биологической активностью: антгельыинтным и эмбриотропным действием.

Разработан метод анализа препарата СО-77 в биопробах на основе тонкослойной и жидкостной хроматографии высокого давления.

Установлены особенности фармакокинетики препарата СО-77 при введении перорально и в составе лекарственной формы.

Практическая ценность работы. Выявлено высокое антгельминтное действие препарата СО-77 при его введении перорально и в составе лекарственной формы. Малые дозы, отсутствие эмбриотроп-ной активности, низкая токсичность дают основание охарактеризовать его как весьма перспективное соединение и рекомендовать его для дальнейщих испытаний.

Разработанные методические рекомендации по определению микроколичеств препарата СО-77 могут быть внедрены в практику санитарно-гигиенического контроля за остатками препарата в продуктах животного происхождения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях Ученого Совета ВИГИС (1990, 1991, Г992 гг.), Всесоюзной научной конференции "Фармакологические и токсикологические аспекты применения лекарственных веществ в животноводстве" (1991 г) - М., 1992.

Основные положения выносимые на защиту: . Поиск нематодоцидной активности среди аналогов фенбен-даэола.

2. Выявление нематодоцидов в ряду бензимидазолов-полимеров.

3. Изучение выявленных новых соединений класса бензими-дазолов на эмбриональное развитие крыс.

4. Определение параметров острой токсичности соединения СО-77 при энтеральном и парентеральном введениях.

5. Изучение фарыакокинетики препарата Си-77 при введении перорально и в составе лекарственной формы.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научные статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на /¿'^машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений. Работа иллюстрирована 33 таблицами, 3 графиками, 2 рисунками. Список литературы содержит 163 источника, из них 49 отечественных и 114 иностранных. Приложение на ¿О страницах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В литературном обзоре изложены сведения о терапевтической эффективности Фенб». щазола, который по данным многих авторов, штскоэф^ективен при большинстве нематодоэов легких и желудоч-«<о-;::тоепного тракта мелкого и крупного рогатого скота, а танке успешно применяется против нематодоэов лошадей, свиней, собаг' и птиц.'Имеются также сведения об эффективности фенбен-дааога при некоторых цестодозах и трематодозах жвачных живот-ню?, г также сведения об змбриотропном действии соединений химического класса бенэнмидазола.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Работу проводили в течение 3 лет (1909-1992 гг.) в виварии ВИГИС на кипчх и крысах и в хозяйствах Харьковской области Украины и Джамбуле кой области Казахстана, на овцах, спонтанно инвазированн)« стронгилятами пищеварительного тракта.

1.1. Культивирование и техника заражения крыс культурой кттфп-^гппкучч.* ^л^ИспМп

Для культивирования личинок ЪгавШепаАа применяли метод я.],. СогпжеИ , модифицированный А.И. Кротовым (1964), заключающийся в следующем: фекалии крысят содержащие, на 9-15 день после их заражения яйца ниппостронгилюсов помещают в ступку и увлажняют 0,1%-ным раствором салициламида. К содержимому добавляют равное количество активированного угля, тщательно перемешивают пестиком и эту массу наносят на круг из фильтровальной бумаги, которую помещают в чашку Петри, на дне которой находится увлажненная губка, закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 27-28°С. Инвазионные личинки скапливаются на краю фильтровальной бумаги с 3-го по 8-й день. Затем, свободные края фильтровальной бумаги отрезают и помещают в ал-парат Бермана, залив 0,7^-ним раствором хлорида натрия.

Для заражения пользовались общепризнанной моделью - белыми крысами весом 40-50 г, которым подкожно вводили 300-500 ниппостронгилюсов в 0,7%-ном растворе хлорида натрия. На 7-10 день после заражения животных обследуют методом Фюллеборна усовершенствованным Г.А. Котельниковым и В.М. Хреновым (1961), При обнаружении в фекальных массах яиц ниппостронгилюсов, крыс отбирают в опыт.

1.2. Скрининг нематодоцидного действия новых химических соединений класса бензимида-зола на лабораторной модели Шррозггоп-д.у1иэ Ьгаа111е-П518_

Опыты проведены на 325 крысах (самцах, массой 40-50 г), Зараженных и.Ъгаа111епз1з . Испытаны три химических соединения бензимидазола - ортофен, СО-72, СО-77, причем ортофен в 8 различных вариантах, а СО-72 и СО-77 еще в лекарственных формах, которые вводили животным после 24-часовой голодной диеты спустя 7 суток после заражения.

Через 5 дней послг введения препаратор животных убивали, предварительно выдержав на 24 часовой голодной диете, кишечники подвергали гельминтологическому исследованию. Процент снижения интенсивности инвазии в подопытной группе по сравнению с контрольной являлся критерием опенки эффективности.

1.3. Выявление нематодоцидного действия новых химических соединений класса бензимида -золов на естественно инвазированнцх_

стронгилятами овцах.

' Опыты по выявлению нематодоцидного действия ковых соединений химического класса бензимидазолов проводили на 144 овцах естественно инвазированных стронгилятами желудочно-кишечного тракте.

Животных отбирали в опыт двукратным гельминтологическим обследованием по методу Фюллеборна, усовершенствованному Г.А. Котельниковнм и В.М. Хреновым (1981). Группы формировались по принципу аналогов.

Эффективность препаратов проводили на 7-10 сутки после дачги, копроскопическим обследованием и убоем 50% животных с гельминтологическим вснрытием сычуга, тонкого и толстого отделов кишечника. Подсчитывали найденных в них гельминтов с определением их до рода и количественным сравнением их в подопытных и контрольных группах.

1.4. Определение параметров острой токсичности нового химического соединения класса бензимидаэолов - СО-77

Данная работа проведена на 75 белых мышах массой 16-22 г по методу Литчфилда и Уилкоксона в модификации 3. Рота (М.Д. Беленький, 1963) с определением показателей: ЛД^ ЛД^,

Д%0. л%4. ЗДгоо-

Соединение С0-77 вводили энтерально - непосредственно в

желудок и парентерально - внутрибрюшинно.

В связи с тем, что препарат плохо растворяется в воде его вводили, как принято в таких случаях, в форме эмульсии, приготовленной на 2%-нон крахмальном коллогене (энтерально) и твине-80 (парентерально).

По полученным результатам устанавливали степень токсичности используя для этого общепризнанную в токсикологии классификацию вредных веществ - ГОСТ 12.1.ОСЬ - 76.

1.5. Изучение эмбриотропности новых химических • _соединений класса бензимидазолов

Опыты по изучению эмбриотропности проводили на 237 беспородных белых крысах, сачках массой 184-244 г и 30 самцах массой 240 - 260 г.

В основу опыта были положены "Методические рекомендации по проведению исследований в гельминтологии", утвержденных Отделением ветеринарии ВАСХНКЛ от 12 января 1963 года согласно пункту 4.2. "Тестирование эмбриотоксического и тератогенного действия ветеринарных антгельминтиков",и "Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияние на репродуктивную функцию", одобренных фармакологическим комитетом МЗ СССР от 10 января 1966 года.

Под опытом находилось 12 групп по 8-12 животных в каждой, с соответствующими контрольными группами. Самок и самцов содержали отдельно. К самкам находящимся в стадии проэструса и эст-руса, на ночь подсаживали самцов в соотношении 4:1. Утром следующего дня просматривали влагалищные мазки на наличие сперматозоидов. День обнаружения сперматозоидов считали первым днем беременности. На 1-й, 7-й, 14-й и 20-й дни беременности самок взвешивали. На 5 - б-й, 9 - 10-й дни после оплодотворения исследовали влагалищные маэки.

Животных убивали иа 20-й день. Извлекали матку и яичники. Плоды просматривали под бинокулярной лупой для обнаружения внешних аномалий, определяли пол, взвешивали и измеряли краниокау-дальный размер. Осматривали, измеряли диаметр и взвешивали плаценту для определения плодоплацентарного коэффициента по формуле:

масса плаценты х доо масса плода

После взвешивания плоды в помете от каждой самки делили на две равные группы. Одну часть для исследования на наличие аномалий внутренних органов по методу Вильсона, а другую часть плодов для исследования костной системы по методу Даусона.

По соотношению числа желтых тел беременности, мест имплантации и живых эмбрионов вычисляли общую, предимплантационную и по^.имплантационную смертность эмбрионов. Вычисления проводились в следующем порядке: предимгшинтационная гибель зигот -

разность между количеством желтих тел и количеством мест имплантации в процентах от числа желтых тел; общая эмбриональная смертность плодов - разность между числом желтых тел и живыми плодами в процентах от общего количества желтых тел; постимплан-тационная смертность плодов - разность между числом мест имплантации н живши плед иди в процентах от числа мест имплантации.

Показатели.«! эмбриотоксического действия явились пред-инплантационная гибель зигот и постиыплантационная гибель эмбрионов .

Показателями те;, лтогенного действия явились нарушения органогенеза во внутриутробном периоде и изменения костной системы плода.

Полученные данные подвергли математическому анализу статистическим методом Фишера и Стьюдекта с использованием коэффициента С.И. Ермолаева. За статистические значимые изменения был взят общепризнанный уровень Р = 0,05.

1.6. Метод определения препарата С0-77 в пробах животного происхождения.

Б целях изучения фармакокинетики препарата СО-77 необходим был метод определения препарата. Для этой цели в своей основе мы использовали ранее разработанные доктором биологических наук Т.С. Новик (IW2) ь.итодц определения производных бензимидазола, и с ее помощью были они модифицированы применительно к препарату СО-77.

Под опытом находилось 2А беспородных белых крыс, самцов " ' массой 160-220 г, от которых было получено 214 проб органов. -' ''

Выли отобраны поэтапные условия определения препарата л СО-77: экстракция, очистка окстракта от коэкстрактивных веществ,-" колитественное определение.

Экстракция препарата проводили непосредственным извлеченй-" ем зтилацетагом.

Метод очистки экстракта перераспределением в системе ацеТб-нитрил-гексан был вполне приемлем для препарата СО-77.

Отработку конечной стадии, а именно количественного определения проводили двумя методами: жидкостной хроматографией •• высокого давления и тонкослойной хроматографией.

Для первого метода использовали описанные Т.О. Новик.(1932), условия хроматографировяния, изменив лиаь объемные ссотноиенял

растворителей в элюирующей системе и скорость протекания элю-ента.

Отработка условий хроматографирования в тонком слое сорбента, заключалась в применении двумерной тонкослойной хроматографии в двух различных системах, с целью дополнительной очистки экстракта.

2. ИЗЫСКАНИЕ НОВЫХ НЕМАТОДОЦИДНЫХ СРЕДСТВ В РЯДУ ЕЕНЗИМИДАЗОЛОВ НА ОСНОВЕ МОДИФИКАЦИИ ИХ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

Многие современные антгельминтики относятся к химическому классу бензимидазолов, механизм действия которого как полагают, является общим для всех его представителей. Данные соединения интенсивно метаболизируются в организме животных, и различия в их фармакологимеских параметрах становятся существенным фактором, определяющим их антгельминтные и другие биологические свойства. В то же время особенности фармакокинетики и метаболизма становятся идеальной мишенью для целенаправленного поиска более высокоэффективных препаратов. Традиционными путями являются изменение молекулы того или иного соединения, а также включение активного начала в лекарственные формы различного состава. На основании указанного мы воспользовались данными способами применительно к производным бензимидазола.

2.1. Выявление нематодоцидной активности среди аналогов фенбендазола.

Особое место в химическом ряду бензимидазолов занимает фенбендазол, представляющий собой метиловый эфир 5(6)-фенилтио-2-бензимидазолил карбаминовой кислоты. В ВИГИС был синтезирован аналог фенбендазола - ортофен, отличающийся тем, что в ароматическом кольце тиофенольного фрагмента имеется заместитель -аминогруппа.

Ортофен представ/^эт собой порошок серого цвета, нерастворимый в воде и большинстве растворителей. Растворяется в кислотах, ДР.1С0 (диметилсульфоксиде) и ДМФА (диметилформамиде).

Исходя из литературных данных хорошо известно, что фенбендазол, будучи сульфидом, в организме животных превращается в

свой сульфоксид (оксфендазол) (рис. I), который как полагают, и является его действующим началом. Последний проявляет одинаковую с фенбендаэолом эффективность, не в меньших дозах. Далее сульфоксид окисляется до сульфона, который в результате гидролиза уретановой группировки превращается в 2-аминосульфон. Два последних продукта обладают очень малой антгельминтной активностью. Реакция превращения фенбендазола в сульфоксид обратима, т.е. в организме животных имеет место восстановление оксфенда-зола е фенбендазол.

На основании структурной аналогии мы предположили, что ортофен в организме животных подвергается аналогичным фенбенда-золу метаболическим превращениям, а окисление первого должно привести к усилению антгельминтных свойств препарата. С згой целью был приготовлен ортофен "О" (окисленный), который по физико-химическим свойствам аналогичен самому ортофену, а в химическом плане обличается тем, что s в молекуле окислена до

сульфоксида - s -II О

Кроме того, был синтезирован ацилированный ортофен "А" с целью модификации метаболизма препарата, точнее замедления гидролиза уретановой группировки, а в конечном итоге, более длительном сохранении °го в активной в антгельминтном отношении форме.

С целью повышения биодоступности ортофена было синтезировано фталиевое производное препарата, приготовлены лекарственные формы ортофена, в их состав вошли ПЭГ (лолизтиленгликоль) и ДСО.

2.1.1. Опыты на крысах экспериментально инва-

зированных Hippaatrengylus .ЬгааШсп.з1з

Полагая, иго метаболизм ортофена как аналога фенбендазола идет по схеме последнего, скринингу были подвергнуты ортофен, ортофен "О" (окисленный) и ортофен "А" (ацилированный), смеси ортофена и ортофена "О" в различных соотношениях.

В первой серии опытов проведено 3 опыта, в которых были испытаны ортофен "О" в разных дозах: опыт I - 40, 60 и dO иг/кг; опыт II - 10, 30, CZ>, 120'и 240 мг/кг и опыт III - L, 10, 20,

СУЛЬФИД (фенбендазол)

СУЛЬФОКСИД (оксфендазол)

СУЛЬФОН (гидролиз)

и сн. ЛЧ . I с

А0 / 0

н

^-Ус-осн3 ■Н о н

ч;;

г КСОСНо

II *

Н о

АМИНОСУЛЪФОН (аминопроизводные сульфона)

I

V:

н

Рис. I

Схема метаболических превращений фпнбендаэола в организме животных

40, 60, 80, 100, 120, 240 мг/кг, но полученная эффективность не показала желаемых результатов. В зависимости от дозы Парьи-ровала от 50 до 85,1% (при дозе Г?0 мг/кг).

При испытании ацилированного ортофена т.е. ортофена "Л" в дозах 10, 20, 40, 60, 80 и 120 мг/кг эффективность была незначительна (47,4 - 49,62).

Во второй серии опытов были испытаны ортофен и ортофен "0", а также их смеси в соотношении 40:60 в дозах 10 и 20 мг/кг, эф-. Фекгивность составила 61,1 и 73,7$.

В третьей серии опытов Еьглеуказанное применили в двух соотношениях 60:40 и 30:70 в дозе - 20 мг/кг, эффективность составила 55,9 - 62,4$ соответственно. Подобные смеси приготовили с цель» возможного изменения соотношения активных и неактивных в антгельминтном Отношении продуктов метаболизма и усиления терапевтической эффективности.

В четвертой серии опытов испытаны лекарственные формы, полученные на основе ортофена "О" с включением ПЭГ и ДОСО в разных дозах от 10 до 100 мг/кг, лерорально, внутримышечно, подкожно с эффективностью от 34,8 до 70,5% (100 мг/кг).

Таким образом, было установлено, что метаболизм ортофена имеет свои особенности отличающиеся от фенбендазола скоростью окисления и восстановления т.е. переходом из неактивной в активную и наоборот.

Далее проведен еще опыт, в котором скринингу был подвергнут фталифен+алкамон, в дозе 50 мг/кг, антгельминтная эффективность также была низкой (31,3 - 34,4%).

2.1.2. Опыты на овцах, естественно инвазированных стронгилятами пищеварительного тракта.

Поскольку данные по терапевтической э(!фективности, полученные на лабораторной модели не всегда подтверждаются таковыми, проведенными на сельскохозяйственных животных, которым предназначен изучаемый препарат, мы провели подобные опыты на овцах инвазированных стронгилятами пищеварительного тракта.

Ьроводены 2 серии опытов на 52 овцах с оценкой результатов по данным двукратной копроскопии.

В первой серии применялись ортофен в -'истом виде и с добавками. Ьол.ученндя 3.',Г?-ная эиФектирчость при действии его на

"другие строкгиляты" (гемонхи, осгертагии, маршаллагии, хабер-тии), 52,0^-ная иа нематодиры и 40%-ная на стронгилоиды. Подобная последовательность наблюдалась и при применении сртофена"А" - 73,3; 57,6; 46,2% соответственно.

Следует отметить, что данные опыты были проведены при очень низкой интенсивности инвазии в пределах одного десятка яиц в 3 г фекалий, поэтому считаем ортсфен, как недостаточно эффек-" <1внш, и неперспективным для дальнейших исследований.

Во второй серии опытов, это при испытании фтаяифена+ката-мина+ПЭГ в дозах 10 и 15 мг/кг по ДВ, испытуемый препарат также оказался неэффективным.

2.2. Поиск нематодоцидов в ряду бензимидазолов с усложнением химической структуры путем полимеризации и усовершенствования.пропа-ративных Форм ( СО-72 и С0-77).

В связи с тем, что использование вышеописанных модификаций в молекуле ортофена не привело к повышению кематодоцидной активности, был использован иной подход - полимеризация молекул, в результате которого в ВИГИСе были синтезированы два оригинальных и близких в химическом отношении препарата - СО-72 и С0-77.

2.2Л. Опыта на крысах, экспериментальна иива-зированных Nlppostrongylus toaglliengja

Был проведен опыт по испытанию нематодоцидной активности ' двух полимеров - бензимидазолов - СО-72 С0-77. СО-72 как исходный продукт вводили в большей дозе 15 мг/кг, а С0-77, как полученный из исходного в меньшей дозе - 10 мг/кг. В результате, несмотря на различие доз, получена почти идентичная эффективность - 70,4 и 73,4%.

2.2.2. Опыты на овцах естественно инвазированнцх стронгилятами пищеварительного канала

С целью испытания нематодоцидной активности полимеров СО-72 и СО-77 при стронгилятозах пищеварительного канала овец проведены три серии опытов. Под данными опытами находилось 92 овцы, из которых для оценки результатсч 24 были .убиты, а у 60

была проведена двукратная копроскопия.

В первой серии опытов при испытании препарата исходного продукта-СО-72 в дозе 15 мг/кг (перорально) и жидкой лекарственной формы С0-72(№2) в дозе 5 мг/кг (внутримышечно) получен низкий нематодоцидный эффект, как на нематодиры 59,0-68,4$, тая и на другие стронгиляты - 33,3-43,8%.

Наравне с этим при испытании соединения СО-77 во второй серии опытов хотя и в меньшей дозе - 10 мг/кг также перорально обеспечило 81,8%-ную эффективность на нематодиры, Ш,6%-ную на стронгилоиды и 98,2%-ную ка другие стронгиляты (гемонхи, остер-тагии, каршаллагии, хабертии).

Указанный эффект повторился и в меньших дозах - 5 и 2 мг/кг при введении в кидкой лекарственной форме С0-77(№1) внутримышечно.

Проведенная третья серия опытов являлась повторением и подтверждением второй.

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НОВЫХ СОВДШШ КЛАССА БЕНЗИ-(/.ИДА30Л0В НА ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ КРЫС .

Известно, что наряду с высокой антгельминтной активностью для большинства производных бензимидазола характерно специфическое побочное эмбриотропное действие. Однако его проявление тесно связано с химическим строением данных соединений. Поэтому с этих же позиций проведен анализ оценка данных соединений на эмбриотоксическое и тератогенное действие.

3.I. Оценка аналогов фенбендазола на эмбриотоксическое и тератогенное действие .

Изучая эмбриотролные свойства новых соединений класса бен-зимидазолов, нами получены следующие результаты:

I) Окисленный ортофен в дозе 30 мг/кг (в три раза увеличенной терапевтической) не показал уродств плодов при даче его на 9-Я - наиболее чувствительный день эмбриогенеза. Однако, при введении крысам его в дозе 100 мг/кг обеспечивающей его более высокую концентрацию, последняя проявилась, о чем свидетельствуют результаты измерения костной системы, наибо"ее лодверж« ¡ной изменению под воздействием бензимидазолов. Так, длина трубчатых костей -

бедренных правой и левой в контрольной группе больше, чем в опытной 1,б1±0,02 и I,52*0,02; Г,57±0,02 и . 1,5010,02 (Р > 0,001), в то время как органогенез проходил без видимых отклонений.

2) ЛцилированныЙ ортофек в дозе 10 мг/кг на 9-й день эмбриогенеза проявил эмбриотоксический эффект. Так, пост-имплантационная смертность повысилась до 14,49^5,58 против 2,85^0,20 в контроле (Р^.0,01). Достоверно различались также длины трубчатых костей: лопаточной правой и левой 2,2710,03 и 2,3610,02; 2,261-0,03 и 2,33±0,02, плечевой правой 2,22±0,03 и 2,3010,03 (Р^0,01); локтевой правой 2,1910,04 и 2,2610,03 (Р> 0,001); локтевой левой 2,1а±0,03 и 2,3310,03 (Р< 0,001); лучевой левой 1,7610,03 и 1,5510,02 (Р > 0,01) соответственно.

Эмбриотоксический эффект отмечен и при визуальном осмотре плодов, которые, в опытной группе били меньайм размером и анемичны, "днако при исследовании внутренних органов по методу Вильсона не было выявлено каких-либо отклонений.

3) Результаты оценки фталифена в дозе 50 мг/кг, свидетельствуют о том, что изучаемые показатели в подопытных » контрольных группах статистически не отличались (Р> 0,(6).

3.2. Опенка препаратов С0-72 и С0-77 на змбрио-токсическое и тератогенное действие .

Установлено, что при введении СО-72 в дозе 45 мг/кг основные показатели эмбриотоксического действия (общая эмбриональная смертность, пред и постэмбриональная смертность) в опытной и контрольной группах существенно*не отличалась.

На отсутствие эмбриотропности С0-72 указывай- и другие показатели: общее количество самок больше, чем самцов в помете и отсутствие плодов с аномалиями развития.

Однако имеется разница в длине участков окостенения эмбрионов. Так, длина правой плечевой и локтевой костей в контрольной группе меньше длины отих же костей в подопытной группе (Р* О,СБ).

Изучал эмбриотоксическое и тератогенное действие препарата СО-77 в дозе 30 мг/кг - в три раза увеличенной терапевтической доге на 9-Й день беременности, он не оказал отрицательного вли-

1НИЯ,

В связи с тем, что препарат СО-77 в терапевтических'опытах проявил высокую нематодопидную активность, то данное соединение Зцло оиенено более детально. В частности, в первой серии опытов препарат вводили двукратно в критические периоды: на I—2-й; 7-8-Й и 13-14-Й дни беременности, соответственно периодам образования зиготы, имплантации и плацентации. Во второй серии препарат вводили многократно в течение всей беременности разбив se на три этапа: с 1-го по 7-й, с 8-го по 13-й и с 14-го по 19-й дни. Это было проведено с целью выявления наиболее чувствительного полного периода беременности крыс на которое приходилось воздействие т.к. чувствительность эмбриона к химическому веществу различна и варьирует от стадии развития плода.

Тератогенн&й эф$ект нами не обнаружен. Так, при измерении костной системы по Даусону, установлено, что длина костей, у под-эпытных и контрольных группах находится в близких пределах (Р>0,0э). Не выявлено случаев уродств и изменений внутренних эрганоа при исследовании эмбрионального материала по Вильсону.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ХИМИЧЕСКОГО КЛАССА БЕНЗИЩДАЗОЛОВ -СО-77

Установлены параметры острой токсичности соединения СО-77 при парентеральном - (внутрибрюшинном) введении, которыми являются следующие (в vr/кг): Л^ = 195.,0; ЛД1б =2I9;0; ДД^ =230,0 (221,15т239,20); Л%4 =240,0 и ЛД100 =270,0

В отношении установления данных величин СО-77 при энтера-льном введении следует сказать, что дльа 7000 мг/кг, не вызвала летального исхода у животных, а увеличенную дозу из-за большого объема ввести не представлялось возможным и поэтому мы ее условно приняли за Д%0' хотя она безУсл0ВН0 больше.

Согласно принятой классификации веществ при парентеральном ■ введении соединение СО-77 относится к классу малотоксичных веществ т.к. его JIígQ находится в пределах 101-1000 мг/кг и при перорачьнпм введении также к классу малоопасных веществ т.к. -"Ukn его белее 5000 мг/кг.

5. ИЗЭТЕНИГ ФАРМАКОКИНЕТИКИ НОВОГО ПРЕПАРАТА СО-77 ПРИ ВВЕДЕНА per ае И В СОСТАВЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ

Изучая фармакокикетику следует отметить, что при введении препарата СО-77 через рот максимальное накопление в органах и тканях можно отметить через 1-3 часа после введения. Г шболее высокое содержание препарата установлено в легких и печени. Через 6 часов концентрация препарата падала и практически затем не изменялась в течение всего 24 часового опыта.

Судя по уровню препарата в толстом отделе кишечника его выделение начиналось через 6 часов и активно продолжалось и к 24 часам.

Фармакокинегика препарата СО-77 при введении б лекарственной форме отличалась от таковой при пероральнон применении. Уже через 30 минут в большинстве органов и тканей крыс установлен высокий уровень препарата, сравнимый лишь с периодом максимального накопления при введен^! через рот. При использований лекарственной формы практически отсутствовал читкай ыангинуи накопления. Содержание препарата в большинстве органов а г'ечлше первых 24 часов оставалось на одном уровне с незначительными колебаниями.

Довольно высокую и длительно сохраняющуюся кенцьйтращда препарата СО-77 при введении лекарственной формы ысисно откстнгь в мышцах, она превышала таковую при пероральнсм введении препарата. Это указывает на испытание его при трихинелле и легочных нематодозах.

Несиотря на парентеральный путь введения препарата СО-77 установили его высокое содержание в желудочно-кишесном тракте (тонком и толстом отделах кишечника), за счет чего, вероятно и его антгельминтное действие. Причем, он присутствовал там уже через 30 минут после введения, вероятно, выделяясь с кедчью.

Таким образом, при введении лекарственного препарата СО-77 через рот и парентерально в составе лекарственной формы имеются различия в фармакокинетики данного соединения в первое 24 часа. Быстро и длительно сохраняющееся накопление препарата СО-77 во всех тканях и органах крыс свидетельствует о более высокой биодоступности.

ЗЛКЛЮЧЕНИЕ

Необходимо несколько сказать о фенбендазоле, как об особо эригинальном антгельминтике из х.-лического класса бенэимидаэола ? одной стороны и с другой - являющимся объектом наших исследований т.к. на его основе или близком к нему синтезированы новые соединения, которым посвящена наша работа.

Оригинален фенбендазол тем, что в ходе метаболизма в орга-шоме животных он превращается в оксфендазол, для которого характерно выраженное эмбриотоксическое и тератогенное действие. Зднако, в опытах на крысах - наиболее чувствительном тесте та-того рода исследований - фенбендазол не проявил не только тако-эого действия при однократном, но и при ежедневном введении в наиболее уязвимый период - с 7 по 17-й дни беременности [С. Bsedar et al t 1974). Причем, не вызывал данного действия только у крыс, но и овец, коров, лошадей (т. Becker , 1966) 1 свиней ( р, Delatour ,Е. Parish , 1986)Объяснение этому тредставлено на рис. I, в котором указана схема его метаболизма ) сульфоксид (оксфендазол), обладающий эмбриотропностью и далее î сульфон и сминосульфон в отличие от сульфоксида не только не )бладаюдие указанным действием, но и последний обладающий нао-iopoT протиЕотератогенным. Это зависит от скорости превращения (етаболитов (Т.С. Новик),

Принимая во внимание высокие нематодоцидные свойства про-[эводных бенэимидаэола и их эмбриотропность, а также современна недостаток нематодоиидов, возникла необходимость сохранения ix для ветеринарного производства. С указанной цель» в одних лучаях шли по пути изыскания противотератогенных добавок, нап-тмер БМК (Т.С. Новик, 1992; В.Н. Скира, 1984). В результате был голучен кубен (В.А. Оробен и др., 1988; C.B. Березкина и др., 968), а в других - созданию бензимидазолов с изменением моле-:улы, влекущее отсутствие эмбриотропного действия. Так был поучен бифен (Г.Н. Волкова, 1990; И.А. Кравченко, 1990). В пос-еднем случае были использованы аналоги фенбендазола или близко к нему по химической структуре.

Наши исследования относятся ко второму пути и имеют цель оздания такого антгельминтика, который был бы не только высоко-ффективгн, но и дозы его были бы значительно меньше, чем у

Екшеотмеченных, а гларное не обладал бы омбриотропностью без противотератогенннх добавок. Таким образом, нами изучено новое химическое соединение из класса бенэимидазолов - CG-77 полностью отвечающее вышеотмеченным требоьанккы.

ВЫВОД!

1. Изменение молекулы ортофена (окисленного по сере, ацили-рование, введение остатка фталиевой кислоты), применение лекарственных смесей с целью модификации его метаболизма и фармакокинетики не привело к усилению гшгге-льминтного аффекта исходного соединения как на крысах, зараженных ниппостронгилмсами, так и спонтанно иквьзк-рованных стронгилятами желудочно-кишечного тракта овцах.

2. На экспериментально зараженных ниппостронгилюсами крысах установлена определенная зависимость антгельмин?-ного действия от дозы окисленного ортофена с максимумом при двух дозах 10 мг/кг и 60-120 мг/кг. видимо связанная с особенностями метаболизма соединения.

3. В результате скрининга выявлено перспективное соединение С0-77, показаБ'лее в дозе 10 ыг/кг (пероральг.о/ 70,4?-нуто эффективность.

4. Препарат С0-77 при введении через рот и б cc-cmse гладкой лекарственной форме для внутримышечного 1Гриыенания соответственно в дозах 10 и 5 мг/кг показал ьысокух антгельминтную эффективность (на гемонхн 9854 - t'S.d; нематодиры 97,8-100; остертагии 100, маркаляапш 100$; . 100 , 94,0-99,6, 100 и 1(Х% соответственно) при сломанных стронгилятозах желудочно-кишечного трасту овец.

.5, Выявлена зависимость "структура-змбриотропная активность" в ряду тестированных производных ортофена:

- окисленный ортофен в дозе 30 мг/кг не проявил змбрио-токсического и тератогенного действия, cju^o е дозе 100 мг/кг установлено уменьшение длины зачаткор трубчатых костей;

- ацилированный ортофен оказал выраженно.» ембри-.-тоис»-ческое действие в дозе 10 мг/кг - увели «eras ¡юегдщ-лантационней смертности I4,49ib,5U в подопытной группе и 2,85±0,20 в контрольной; кР< 0,01) и достоверное различие длины длины трубчатых костей.

-196. Препараты СО-72 и СО-77 не проявили эмбриотоксического и тератогенного действия на крысах в трехкратной те- • рапевтической дозе,(30 мг/кг) при однократном, а соединение 00-77 и при многократном применении в той же дозе.

7. По значению ЛД^ф соединение СО-77 относится как при энтеральном (7000 мг/кг), так и при парентеральном (230,0 мг/кг ) введениях к классам малотоксичных веществ.

8. Разработан метод определения микроколичеств препарата СО-77 в биопробах на основе жидкостной хроматографии высокого давления и тонкослойной хроматографии. Чувствительность методов соответственно равняется 0,0Ь мг/кг, полнота определения - 00i£$.

9. Выявлены особенности фармакокинетики препарата СО-77 при введении per se и в составе лекарственной формы. В последнем случае происходит быстрое и длительное накопление соединения в тканях и органах крыс, что и является основанием для снижения терапевтической дозы.

ЛРЛКШЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Новое химическое соединение из класса бензимидазолов--СО-77 и его лекарственная форма СО-771'il) обладают высоким антгельминтнш действием в малых дозах 10 мг/кг и 5 мг/кг. Отсутствие эмбриотропной активности, низкой токсичности дает основание охарактеризовать его как . перспективное соединение и рекомендовать его для дальнейших испытаний.

2. Разработанные методические рекомендации по определению микроколичеств препарата СО-77 могут быть внедрены в практику санитарно-гигиенического контроля за остатками препарата в продуктах животного происхождения.

3. СО-77 и его лекарственная форма в наиболее высокой, длительно сохраняющейся концентрации находится в мышцах и легких, что указывав на испытание его терапевтической эффективности при трихинеллезе и легочных нематодозах.

СПИСОК РАГОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Авдиенко В.А. Нематодоцидная активность соединений химического класса бензимидазолов при экспериментальном ниппострон-гилезе крыс // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - I99I.-JJ65. -С. 7-И.

2. Авдиенко В. А. Испытание антгельминтной эффективности нового соединения из химического класса бензимидазола - С0-77 и его лекарственной формы // Фармакологические и токсикологические аспекты применения лекарственных веществ в животноводстве.

' - Сб. науч. тр. МВА. - N.. 1992.-С.89-91.

3. Авдиенко В.А. Изучение возможной эмбриотоксичности нового соединения из химического класса бензимидазолов - CQ-77 // Фармакологические и токсикологические аспекты применения лекарственных веществ в животноводстве. - Сб. науч. тр. МВА.

- М., 1992.-С.150-151.

Подписано в печать I0.I.I0J3 г. Uuc. 70J. „ораат ГОхВ4Дб, Tup. IOC.

■Москва. Тллогра^ця iv.cn.