Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses"

Российская Академия Наук Ордена Трудового Красного Знамени Институт биоорганической химии им. академиков М.МШемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи УДК 577.322:577.539.26

Волков Денис Александрович

НОВАЯ АСПАРТАТНАЯ ПРОТЕИНАЗА РЕТРОТРАНСПОЗОНА ULYSSES (DROSOPHELAVIRILIS)

03.00.04.-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

профессор, доктор химических наук Л.Д.Румш.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Габибов А.Г. доктор химических наук Филиппова И.Ю.

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский нститут биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН.

Защита диссертации состоится "02" марта 2005 г. в 10 часов на заседании специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина, и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан "02"февраля 2005 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функции аспартатных протеиназ в живом организме чрезвычайно разнообразны. Они участвуют в процессах пищеварения, в процессинге различных гормонов и нейропептидов, в деградации белкового материала. К аспартатным протеиназам также относятся протеиназы большинства ретровирусов, включая вирус иммунного дефицита человека (HIV) и аналогичные вирусы животных.

В последнее время обнаружено множество эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов (мобильных генетических элементов, широко распространенных в геномах бактерий, растений, животных). При этом оказалось, что ретротранспозоны содержат нуклеотидные последовательности, продуктами трансляции которых являются белки, гомологичные ретровирусным аспартатным протеиназам.

Полученные недавно данные о возможности активации эндогенных ретровирусов животных при пересадке органов человеку, а также активации эндогенных ретровирусов человека при заражении HIV, делают изучение ретротранспозонов актуальной проблемой. Аспартатные протеиназы являются ключевыми ферментами жизненного цикла ретровирусов и ретротранспозонов. Они осуществляют процессинг полибелков-предшествеников, высвобождая тем самым фунционально-активные ферменты, ответственные за транспозицию и встраивание ретровируса или транспозона в геном клетки-хозяина. Поэтому эти ферменты представляют собой основную мишень лекарственной терапии.

Цель работы. Целью данной работы было выделение и исследование протеиназы мобильного генетического элемента Ulysses (Drosophila virilis). Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Локализация гена протеиназы Ulysses в составе ретротранспозона.

2. Гетерологичная экспрессия в E.coli гена протеиназы ретротранспозона Ulysses.

3. Исследование физико-химических и энзиматических свойств протеиназы Ulysses.

4. Построение пространственной модели протеиназы Ulysses методом гомологичного

моделирования и молекулярной динамики.

Научная новизна и практическая ценность работы. Ретротранспозон Ulysses имеет структурную организацию, характерную для LTR-содержащих ретротранспозонов: первая свободная рамка считывания кодирует белки матрикса и капсида, вторая -протеиназу, обратную транскриптазу, РНКазу Н и интегразу.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей аспартатных протеиназ ретровирусов и ретротранспозонов позволил сделать предположение о

первичной структуре и фланкирующих последовательностях протеиназы Ulysses, предполагаемая последовательность которой содержит консервативные для аспартатных протеиназ структурные области, в том числе триаду DTG в области активного центра.

Соответствующий фрагмент кДНК был клонирован и экспрессирован в E.coli. Рекомбинантный белок был подвергнут рефолдингу и очищен методом аффинной хроматографии на пепстатин-агарозе. Полученная протеиназа обладает протеолитической активностью и имеет рН оптимумом действия в области рН 5,5, что характерно для большинства аспартатных протеиназ. Исследованы физико-химические свойства и субстратная специфичность протеиназы Ulysses.

В целом, данная работа является первой попыткой получения и исследования свойств аспартатной протеиназы из мобильного элемента.

Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на V Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 2002), на международной конференции "ICAPI 03"(Kioto, Japan. November 14-16, 2003), на VII чтениях посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 2004).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 2 печатных работы.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 95 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. включающего 125 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1.Определение локализации протеиназы Ulysses Drosophila virilis в составе полибелка-предшественника.

Первым этапом работы было установление локализации протеиназы Ulysses в составе полибелка-предшественника. Для того, чтобы выявить консервативные структурные области в предполагаемой последовательности протеиназы ретротрансиозоиа Ulysses, был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей известных аспартатных протеиназ экзогенных и эндогенных ретровирусов (рис. 1), основанный на использовании "внутренних систем координат" для молекул белков. Полученные данные позволили сделать предположение о фланкирующих последовательностях фермента. Однако, мы столкнулись с определенными трудностями, связанными с тем, что стандартная для всех ретровирусных протеаз темп летная последовательность - гидрофобная аминокислота-гидрофобная аминокислота-глицин-аргинин (рис. 1), характерная для сегмента молекулы, проходящего через активную петлю активного центра и близкого к С-концевому сегменту, попадала совсем в другое место

молекулы. Это противоречие можно было бы снять, предположив, что сегменты, связывающие петлю-козырек с центральным Р-слоем молекулы, укорочены и молекула в целом короче молекулы протеиназы HIV-1. С другой стороны, было высказано предположение, что молекула протеиназы Utysses может быть длиннее молекулы протеиназы HIV-1 за счет С-концевой части. Поэтому было принято решение клонировать фрагмент, несколько увеличенный с N- и С-концов, по сравнению с данными по выравниванию, в расчете на то, что при автопроцессинге протеиназа сама обеспечит нужную длину молекулы. Таким образом, на основании вышеизложенного, было решено клонировать фрагмент кДНК соответствующий аминокислотным остаткам с номерами 119-231 для второй рамки считывания.

Рис.1. Сравнение аминокислотных последовательностей аспартатных протеинам ретровирусов и ретротранспозонов. Консервативные последовательности в области активного центра и С-концевой части молекулы выделены рамкой, а - область активного центра, б - С-концевая теплетная последовательность. SIV- протеиназа вируса иммунодефицита обезьяны; HIV-2 и HIV-1 - протеиназы вируса иммунодефицита человека первого и второго типа; EIAV -протеиназа вируса инфекционной анемии лошади; P.AER - аспартатная протеиназа Pseudomonas aeruginosa; Dr.Vir - протеиназа транспозона Ulysses Drosophila virilis.

- 2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторе рЕТ-23а(+).

Для получения рекомбинантной протеиназы соответствующий ген клонировали в плазмидном векторе рЕТ-23а(+). Фрагмент ДНК, кодирующий протеиназу, получали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве матрицы фрагмент гена ретротранспозона Utysses, любезно предоставленный Евгеньевым М.Б. (институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгарда РАН). Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера: 1 - 5'-АА ААА CAT ATG GTC AGA CGG GAG GAG AGT-3', содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концу гена протеиназы. Праймер содержал на 5'-конце сайт узнавания рестриктазой Nde I (последовательность подчеркнута); антисмысловой праймер 2 - 5'-АА ААА AAG CTT TTA CAG CTC TGG TGC GAT СТС АА-3' содержал последовательность, комплементарную С-концевой области гена протеиназы. Сайт Hind III (подчеркнуто) введен для последующего клонирования. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК (-350 п.о.) клонировали в вектор рЕТ-23а(+) по рестриктным сайтам Nde I - Hind III (рис. 2). Ген протеиназы был клонирован таким образом, что первому кодону протеиназы предшествовал инициирующий кодон, а вслед за последним кодоном был вставлен терминирующий кодон.

Ген протеиназы Ulysses. полученный в результате ПЦР

Nde I

Hind III

Цитирование

Рис.2 Схема клонирования гена протеиназы Ulysses в плазмидном векторе рЕТ23а(+)

З.Экспрессия рекомбинантного гена. Очистка белка.

В настоящей работе клонирование гена протеиназы из мобильного элемента Utysses проводили в клетках E.coli штамма НВ101, не содержащего гена Т7 РНК-полимеразы. Для экспрессии соответствующего гена рекомбинантной плазмидой были трансформированы компетентные клетки E.coli штамма BL2](DE3), имеющего хромосомную копию гена Т7 РНК-полимеразы под контролем промотора lac UV5, индуцируемого IPTG. Синтез рекомбинантного белка тестировали методом электрофореза в присутствии SDS (рис. 3). Целевой белок (-13 кДа) накапливался в клетках в виде тел включения с высоким выходом. Выделенные тела включения растворяли в буфере, содержащем 8 М мочевину, и подвергали рефолдингу. Рефолдинг (ренату-рацию) денатурированных целевых белков проводили диализом относительно 25 мМ фосфатного буфера рН 7,0 при +4 °С. Затем белок подвергали дальнейшей очистке методом аффинной хроматографии на пепстатин-агарозе. Полученный белок связывался с аффинным сорбентом Связавшийся белок элюировали буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCl, рН 9,5. Чистота полученного препарата составляла не менее 90 %. Из 1 литра культуральной среды получали 5-8 мг очищенной протеиназы. Взаимодействие белка с пепстатин-агарозой свидетельствовало о том, что произошло формирование субстрат-связывающего участка, характерного для аспартатных протеиназ. Следовательно, можно было ожидать

наличие ферментативной активности полученного препарата белка.

Рис. 3. Экспрессия гена протеиназы Ulysses в клетках Е. coli штамма BL21(DE3); очистка рекомбинантного белка. Результаты электрофореза в 15%-ном ПААГ в присутствии SDS: 1- белковые стандарты; 2- суммарные белки клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pET-Ulysses без индукции; 3- суммарные белки клеток Е coli, трансформированных плазмидой pET-Ulysses после индукции IPTG, 4- препарат белка после аффинной хроматографии

4.Исследование свойств протеиназы Ulysses.

4.1 .Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки (pi).

По данным гель-электрофореза в денатурирующих условиях молекулярная масса мономера протеиназы Ulysses составляет приблизительно 13 кДа. Для более точного определения молекулярной массы полученной протеиназы, использовали метод MALDI-TOF масс-спектрометрии. Молекулярная масса составила 12738 Да (рис.4) , что соответствует расчетной массе мономера протеиназы Ulysses, соответствующей 12775 Да. Был проведен N-концевой и С-концевой анализ аминокислотных последовательностей. Определено шесть N-концевых аминокислотных остатков: Val-Arg-Arg-Glu-Glu-Ser. Обработка белка карбоксипептидазой А позволила установить первую С-концевую аминокислоту белка - Leu. Полученные данные находятся в полном соответствии с ожидаемой структурой протеиназы Utysses и говорят об отсутствии автопроцессинга экспрессированного белка.

76 -7472' 706В-666462605В

: 5000 10000 15000 20000

| масса, m/z

Рис. 4. MALDI-TOF-масс спектр протеиназы Ulysses

Определение изоэлектрической точки фермента проводили методом изоэлектрического фокусирования. Экспериментальное значение составило 5.5, что согласуется с расчетным значением- 5.24. Следует отметить, что pi большинства аспартатных протеиназ находятся в кислой области, за исключением протеиназы HIV-1, обладающей необычайно высокой изоэлектрической точкой - 10,5

4.2. Гидролиз мелиттина.

Полученный после рефолдинга препарат белка был исследован на наличие в нем протеолитической активности. В качестве субстрата нами первоначально был выбран пептид, используемый при исследовании активности протеиназы HIV-1 LysAJaArgValNle-NphGluAlaNleNH2.. Однако оказалось, что пептидная связь Nle-Nph. гидролизуемая протеиназой HIV-1 в этом пептиде не гидролизуется протеиназой Ulysses в интервале рН 3-10 при 37 °С в течение суток.

Поэтому для тестирования активности полученного белка нами в качестве субстрата был выбран мелиттин - пептид, содержащийся в яде пчелы. Так как в состав мелиттина входят как отдельные остатки, так и кластеры гидрофобных и заряженных аминокислот, он использовался в качестве субстрата для сравнительного анализа специфичности сериновых и аспартатных протеиназ. Поэтому нам представлялось интересным исследовать специфичность протеиназы Utysses в отношении мелиттина. Гидролиз мелиттина протеиназой проводили при рН 5.5 в течение 1 часа (37 °С). Протеиназа эффективно гидролизовала мелиттин. Продукты гидролиза разделяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Ultrasphere С18 ("Beckman"). Обнаружено три продукта ферментативного гидролиза субстрата ферментом (рис. 5-1). Анализ N-концевых аминокислотных последовательностей и молекулярных масс полученных пептидов позволил установить гидролизуемые пептидные связи. Полученные результаты и известные из литературы данные представлены в таблице 1. Гидролизовались связи лейцил-треонин и лизил-аргинин. Как видно из таблицы, специфичность протеиназы Ulysses частично совпадает со специфичностью протеиназы HIV-1 и протеиназы из Trichoderma viridi.. В то же время гидролиз связи, образованной двумя положительно-заряженными остатками - лизил-аргинин, является необычным для аспартатных протеиназ.

4.3.Гидролиз В-цепи инсулина

Для дальнейшего проведения работ по изучению специфичности полученной протеиназы в качестве субстрата был выбран олигопептидный субстрат - В-цепь инсулина. В-цепь инсулина эффективно гидролизуется протеиназой Ulysses. Продукты гидролиза разделяли методом ВЭЖХ на колонке СЦ (рис. 5-2), были установлены их N-концевые последовательности. В таблице 1 приведены данные по расщеплению В-цепи инсулина некоторыми аспартатными протеиназами. Гидролизовались связи: валил-глутаминовая кислота, тирозил-треонин, лейцил-тирозин и глутамил-аланин. Как видно из таблицы, специфичность при гидролизе В-цепи инсулина как и при гидролизе мелиттина

сохраняется: гидролизуются связи, образованные как гидрофобными аминокислотами, так и заряженными.

Рис. 5. ВЭЖХ продуктов ферментативного гидролиза, рН 5,5, мелиттина (1) и В-цепи инсулина (2) протеиназой Ulysses на колонке Ultrasphere С18. Гидролизуемые связи отмечены стрелками.

Таблица 1. Специфичность различных аспартатных протеиназ в отношение мелиттина и В-

1-цепи

инсулина.

Протеиназа Гмдролизуемая связь в мелиттине Гидролнэуемая связь в В-иелн инсулина

AVL-KVL His5Leu6

TGI.-PAL Ser9-Hisl0

PA1.-1SW Glul3-Alal4

Пепсин A la 14.1.eu 15 Ï.eul5-Tyr!6 Tyrl6-Leul7 Phe24-Phe25 Phe25-Tyr26

VUC-VLT His5-Lcu6

KVL-TTG Glu8-Ser9

Аспартатная протеиназа из Trichoderma viridi TGL-PAL PAL-1SW 1SW-1KR Sei9-Hisl0 Glul3-Alal4 Alal4-Leu! 5. LeulS-Tyrl6 Tyrl6-Leul7 Phe25-Tyr26

G1G-AVL Ser9-Hisl0

Протеиназа HIV KVL-TTÜ LIS-WIK Cysl9-Gly20

KVL-TTG Va]12-Glu!3

Протеиназа Ulysses KRK-RRQ G1ul3-Alal4 Leul5-Tyrl6 Tyr26-Thr27

4.4. Определение рН-оптимума.

На следующем этапе работы была исследована рН-зависимость гидролиза мелиттина протеиназой Ulysses. Реакцию проводили в диапазоне рН от 2 до 10. За реакцией следили по убыли субстрата. График зависимости степени гидролиза субстрата от рН представлен на рисунке 6. График имеет колокообразную форму, оптимум рН для протеиназы находится в области рН 5,5. Это обстоятельство роднит полученную нами протеиназу с известными аспартатными протеиназами, которые проявляют наибольшую активность при кислых значениях рН.

Интересными оказались результаты по анализу рН-зависимости скорости образования продукта, появляющегося при гидролизе связи Lys-Arg. Эта связь более эффективно гидролизовалась при щелочных значениях рН (9-10). Подобный факт можно объяснить тем, что остатки аргинина и лизина, при щелочных значениях рН, находятся в незаряженном состоянии. Таким образом, взаимодействие субстрата с ферментом носит

11

Рисунок 6. рН зависимость гидролиза мелиттина протеиназой Ulysses. Степень гидролиза выражена в процентах от исходного количества мелиттина в реакционной смеси.

по преимуществу гидрофобный характер, что согласуется со специфичностью протеиназы Ulysses по отношению к связям, образованным гидрофобными и незаряженными аминокислотами.

4.5. Имитирование гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses пепстатином А.

Пепстатин является конкурентным ингибитором, моделирующем переходное состояние субстрат-ферментного комплекса. Он представляет собой пептид, содержащий необычную аминокислоту - статин. Большинство аспартатных протеиназ, в том числе протеиназа HIV-1, достаточно эффективно ингибируется пепстатином А.

Мы изучали ингибирование пепстатином А реакции гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses. Исследование зависимости степени ингибировапия реакции гидролиза от концентрации пепстатина в реакционной смеси, позволило определить константу ингибирования IC50, равную 72 микромоль. Таким образом, протеиназа Ulysses проявляет свойства, характерные для аспартатных протеиназ.

4.6.Автолиз

Аспартатные протеиназы ретровирусов склонны к автолизу - самопроизвольной каталитической деградации. Представлялось интересным исследовать свойства протеиназы Ulysses в отношении автолиза. Как оказалось, протеиназа Ulysses не является исключением. Эксперементы по автолитическому расщеплению проводились при рН 7. Как указывалось ранее, после рефолдинга (рН 7, 4°С) не наблюдалось продуктов автолиза протеиназы Ulysses. Однако, при инкубировании протеиназы при рН7 и температуре 37°С

Рис. 7. ВЭЖХ продуктов автолитического расщепления протеиназы Ulysses.

начинается процесс автолиза. 2 часовое инкубирование в этих условиях приводит к 50% расщеплению протеиназы (рис.7).

Как и в случае протеиназы HIV-1 в первую очередь автолизу подвергаются пептидные связи, экспонированные на поверхности белковой глобулы (таблица 2). Полученные результаты в дальнейшем были подтверждены после построения трехмерной модели фермента.

Таблица 2. Специфичность протеиназы Ulysses при автолизе.

время гидролизуемая связь масса пептида (MALDI) Пространственное расположение гидролизуемой связи

3 часа IleValPhe(87)-Tyr(88 JMetCys ArgGluGlu(5)-Ser(6)IleAsp GlylleAsp( 102)-Phe( 103)TrpArg GluLeuTyr(98)-Leu(99)Glylle 9729 12019 11562, 1291 1689,1778 одна из боковых петель Ы-конец спираль С-кониа одна из петель

6 часов ThrGlyAla(30)-Ser(31 )Va)Ser ArgProTyr(53)-Glu(54)SerMet 1792 5818 бетта-стренд на входе на флаппу

12 часов ArgGluGlu(5)-Ser(6)lleAsp 1 leLeuGly(70)-Arg(71 )ValVal GlnGlyCys(39)-Arg(40)GluLeu 6937,3417 6937 3417 петля-козырек

Гидролиз по связи Glu5-Ser6 приводит к дестабилизации системы водородных связей, образованных N- и С-концевыми фрагментами протеиназы Ulysses. Эта область ответственна за стабильность молекулы димера. Гидролиз связей Tyr53-Glu54 и Gly70-Arg71, находящихся в области петли-козырька, которая так же участвует в стабилизации молекулы, приводит к дальнейшей дестабилизации межсубъединичных взаимодействий и разворачиванию полипептидной цепи белка.

Специфичность при автолитическом гидролизе соответствует специфичности

фермента при гидролизе полипептидных субстратов (мелиттин и В-цепь инсулина). Гидролизуются как связи образованные алифатическими и слабозаряженными аминокислотами: Phe-Tyr, Tyr-Leu, Ala-Ser , так и связи, содержащие заряженные аминокислоты: Glu-Ser, Gly-Arg, Asp-Phe. Следует отметить, что способность фермента подвергаться автолизу, может являться одним из способов регуляции его активности в клетке.

5. Построение трехмерной модели протеиназы Ulysses.

Знание о трехмерных координатах белка, а в особенности фермента, дают возможность объяснить многие его физико-химические свойства: субстратную специфичность, чувствительность к ингибиторам, устойчивость к денатурирующим агентам, способность к автолизу и.т.д. Для определения трехмерных координат используются методы рентгеноструктурного анализа и ЯМР. Эти методы являются достаточно трудоемкими и требуют больших концентраций и количеств белка, что не всегда возможно достигнуть как из-за низкой растворимости белка, так и из-за низкой стабильности фермента. В связи с этим, в последнее время широкое применение нашел метод гомологичного моделирования, позволяющий построить пространственную структуру белка с использованием известных координат гомологичных белков.

Предварительно были получены некоторые дополнительные физико-химические характеристики структуры белка, в частности сняты спектры флуоресценции и кругового оптического дихроизма. Дополнительные экспериментальные данные о структуре белка могли помочь в построении модели.

5.1. Моделирование трехмерной структуры.

Расчет элементов вторичной структуры протеиназы Ulysses был проведен с помощью программы PSIPRED. Большая часть структуры представлена в виде бета-структуры (80%), количество альфа- спиральных участков составляет 20 %. Полученные данные свидетельствует о наличии 2 участков с альфа-структурной организацией. Остатки 100-107, соответствуют альфа-спирали С2, характерной для всех ретровирусных аспартатных протеиназ. Второй участок, (остатки 37-47), по-видимому соответствует структурному элементу спирали С1 - элементу, широко представленному у аспартатных протеиназ высших организмов, но отсутствующему у ретровирусных аспартатных протеиназ (единственным исключением является протеиназа вируса инфекционной анемии лошади - EIAV). В связи с этим, для выравнивания аминокислотных последовательностей и последующего построения трехмерной модели в качестве шаблонных структур были взяты: протеиназа HIV-1 (файл 1а94), протеиназа вируса инфекционной анемии лошади (файл 2fmb), протеиназа вируса иммунного дефицита

обезьяны (файл к^), протеиназа вируса иммунного дефицита кошки (файл 1Ы1) и протеиназа вируса саркомы Роуза (файл Ibai).

Ретровирусные аспартатные протеиназы имеют низкую степень гомологии (3060%). Наиболее консервативными являются области активных центров и С-концевых частей молекулы. Выравнивание аминокислотных последовательностей, выполненное программой ClustalW, было скорректировано, исходя из представления о «темплетных областях» аспартатных протеиназ (Андреева, 1992). Результат выравнивания представлен на рисунке 8.

Модель была построена методом гомологичного моделирования. За основу были взяты результаты выравнивания аминокислотной последовательности протеиназы Ulysses и последовательностей шаблонных структур. Полученная модель представлена на рисунке 9. Представлены все элементы структуры, характерные для ретровирусных аспартатных протеиназ, за исключением спирали С1, которая была смоделирована, исходя из данных по предсказанию вторичной структуры.

1. SIV

3. HIV1

4. FIVa

5. HSV

6. EIAV 8. D.VIR

turn strand

strand

PQFHL---W---К RPWT AH I E----------G QPV EVLLD

PQJTL --- W---Q RPLVT IK: G----------G QLK EALLD

VGTTTTL---E---К RPEIL IFV N----------G YPI SFLLD

LAMTM -EH К---D RPLVR VIL TNTGSHPVKQRS VYI TALLD

VTYNL---E---К RPTTI VLI N----------D TPL NVLLD

VRREE---S---1 DPRVF AEV EV-------AG AKM KGLLD

1. SIV

3. HIV1

4. FIVa

5. RSV

6. EIAV 8. D.VIR

turn strand helix strand tarn strand Strand

TGAD DS1VT G—I---ELG-PH---YT-P-K-IVGG IG GFINTKEY- •KN VEVEV

TGAD DTVLE E--M---SLP-GP.---WK-P-K-IVGG IG GFIKVRQY- DQ I LI El

TGAD ITILN RRDF---QVKNSI---ENGR-Q-NMIG VG GGKRGTNY- IN VHLEI

TGAD DTVIS EEDW---PT-DWP---VMEAAN PQIHG IG GGIPVRKSRDM IELGV

TGAD TSVLT TAH YNRIKY-RGR---KYQG-T-GIGG VG GNVETFST- -P VTIKK

TGAS VSLLG QGCRELVEF'.LGWEARPYESMVRTACKG AN RPILGRVV- •LP VKYGI

strand strand turnstrand helix strand

I . SIV

3. HIV1

4. FIVA

5. RSV

6. EIAV 6. D.VIR

L------G KRIKG TIMTG---DTP INIFG RNLLTALG MSLNF

С------G HKAIG TVLVG---FTP VNIIG RNLLTOIG CTNLF

RDENYK-T QCIFG NVCVLEDNSLI QPLLG RDNMIKFN IRLVM

IN3DGSLE RPLLL E'PLVA---MTP VNILG RDCLQGLG RLRTNL

К------G RHIKT RMIVA-—DIP VTILG RDILQDLG AKLVL

E------R LDIVF YMCPD---LRQ ELYLG IDFVRAFE IAPEL

Рис.8 Сравнение аминокислотных последовательностей аспартатных протеиназ. SIV -протеиназа вируса иммунного дефицита обезьяны, HIV1 - протеиназа HIV-1, FIVa - протеиназа вируса иммунного дефицита кошки. RSV - протеиназа вируса саркомы Роуза EIAV - протеиназа вируса инфекционной анемии лошади, D.VIR — протеиназа Ulysses.

Рис 9 Трехмерная модель протеиназы Ulysses. Показана основная цепь молекулы, выделены каталитически активные остатки аспарагиновой кислоты 27(27')

5.2. Молекулярно-динамическое моделирование пространственной структуры молекулы протеиназы Ulysses.

Метод гомологичного моделирования, при всех достоинствах, имеет один существенный недостаток: невозможность проследить поведение модели во времени и проверить ее стабильность Для решения поставленной задачи, нами был выбран метод молекулярной динамики (МД), позволяющий анализировать поведение молекулы биополимера в условиях, наиболее приближенных к реальным.

В качестве поля потенциальной энергии нами было выбрано поле CHARMM, а в качестве программы для его реализации - одноименный программный комплекс

Молекула протеиназы Ulysses, полученная после моделирования, была сольватированна (добавлены молекулы растворителя и ионы) при помощи программы SOLVATE. Прежде чем начать молекулярно-динамический эксперимент, необходимо было провести минимизацию энергии. Минимизация была проведена методом коньюгированного градиента с числом шагов равным 2000.

Уравновешивание структуры проводилось в несколько этапов. Вначале была проведена молекулярная динамика с фиксированной молекулой белка, когда подвижными являлись только молекулы воды и ионов, затем фиксирующие потенциалы были убраны, и было проведено окончательное уравновешивание системы в течение 100 пикосекунд с шагом 1 фс.

Окончательный запуск молекулярной динамики проводился в течение 1

наносекунды с шагом 1 фемптосекунды. За поведением системы следили по изменению потенциальной энергии системы от времен (Рис.10). Из графика видно, что полученная модель сохраняет стабильность в течение длительного (1 не) промежутка времени.

Рис.10 Зависимость потенциальной энергии системы от времени во время процедуры молекулярной динамики.

Для проведения дальнейших исследований была взята средняя структура протеиназы Ulysses.

5.3.Анализтретичной структуры.

Трехмерные структуры аспартатных протеиназ в значительной степени схожи. Можно выделить ряд элементов третичной, структуры характерных для всех представителей данного класса ферментов (Рис.11). Как уже указывалось ранее, аспартатные протеиназы ретровирусов представляют собой гомодимер, образованный из двух идентичных субъединиц, не связанных между собой ковалентно. Мономер состоит из четырех основных элементов: шпильки, содержащей петлю А1, широкой петли В1. содержащей каталитический остаток аспарагиновой кислоты, спирали С1 и второй шпильки D1. Второй мономер содержит идентичные элементы, называемые А2, В2, С2 и D2. В целом, модель протеиназы Ulysses не имеет явных отличий от известных ретровирусных аспартатных протеиназ, за исключение дополнительной альфа спирали С1. Как уже отмечалось, спираль С1, характерная только для структуры протеиназы EIAV, среди ретровирусных протеиназ, была добавлена при моделировании. Спираль оставалась стабильной на протяжении всех экспериментов по молекулярной динамике, что может указывать на то, что включение ее в модельную структуру было корректным.

Рис.11 Трехмерная структура протеиназы Ulysses с указанием элементов вторичной структуры.

5.4.Междоменный слой.

Чрезвычайно важны для сохранения стабильности и функциональной активности молекулы аминокислотные остатки, участвующие в образовании междоменного слоя. Исходя из полученных нами данных, их можно разбить на три группы:

1) Аминокислотные остатки, N- и С-концевой части молекулы, образующие четырехтяжевый антипарралельный бетта-слой. В молекуле протеиназы Ulysses в его образовании участвуют аминокислотные остатки 1-6 и 109-] 13. Эта часть междоменного слоя стабилизирована за счет образования водородных связей между атомами кислорода и азота пептидной связи, что характерно для бетта-структуры. ( Рис 12-1)

2) Аминокислотные остатки, расположенные в области петли-козырька: Gln95, азот пептидной связи, которого образует водородную связь с кислородом Gly63 второго мономера; азот пептидной связи А1а64, образующий водородную связь с кислородом пептидной связи остатка А1а64 другого мономера; Кислород пептидной связи остатка Arg66, взаимодействует с азотом боковой группы Asn65 другого мономера, образуя устойчивую водородную связь ( Рис 12-2)

3) Аминокислотные остатки, примыкающие к области активного центра, и участвующие в образовании разветвленной сети водородных связей, известной так же как «fireman grip». В образовании водородных связей участвуют: OD1 кислород остатка Asp27, взаимодействующий с азотом Thr28 другого мономера, OD2 кислород остатка Asp27, взаимодействующий с OD1 кислородом остатка Asp27 второго мономера; гидроксильная группа Thr26 образует водородную связь с кислородом пептидной связи Leu26 другого мономера, то же справедливо и для второго мономера. (Рис. 12-3)

Рис. 12 Междоменные взаимодействия в молекуле протеиназы Ulysses.

1- аминокислотные остатки, N- и С-концевой части молекулы, образующие

ч етырехтяжевы й антипарралельный бетта-слой.

2- Аминокислотные остатки, расположенные в области петли-козырька

3 -Аминокислотные остатки, примыкающие к области активного центра, и учавствующие в образовании разветвленной сети водородных связей, известной так же как «fireman grip».

5.5. Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses.

Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses и сравнение их с карманами связывания протеиназы HIV-1 позволил выявить ряд особенностей, способных объяснить широкую специфичность протеиназы Ulysses. Во-первых, карманы связывания протеиназы Ulysses более глубокие по-сравнению с карманами связывания протеиназы HIV-1, что способствует связыванию и гидролизу субстратов, содержащих аминокислоты с разветвленными боковыми цепями, в том числе и заряженными. Во-вторых, карманы связывания S1 и S2 протеиназы Ulysses содержат отрицательно заряженные остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот, что дает возможность предполагать наличие ионных пар при образовании субстрат-связывающего комплекса и частично объясняет специфичность протеиназы Ulysses по отношению к связям, образованным положительно заряженными аминокислотами (рис.13). Карманы связывания протеиназы HIV-1 не содержат заряженных аминокислот, это объясняет тот факт, что она не гидролизует связи, содержащие заряженные аминокислоты.

S2 SI SI' S2'

A!a64 Glu96 Gly63 Val32 Asp92 Met62 Glu96 Ala30

-Arg—Lys-Arg--Arg-

P2

P1 РГ P2

Рис.13 Схематическое изображение карманов связывания протеиназы Ulysses при гидролизе связи Lys-Arg.

Способность протеиназы Ulysses гидролизовать связи, образованные отрицательно-заряженными аминокислотами, можно объяснить глубиной карманов связывания, позволяющим свободно двигаться отрицательно-заряженным боковым цепям субстрата в положении Р1, не встречая наталкивания со стороны отрицательно заряженных остатков Glu96 и Met62.

Максимум спектра флуоресценции протеиназы Ulysses составил 350 нм (рис.14). Димер протеиназы Ulysses содержит восемь остатков тирозина и четыре остатка триптофана. Основной вклад в спектр флуоресценции вносят остатки триптофана, т.к. они имеют более широкую область поглощения. Форма спектра свидетельствует о наличии двух популяций остатков триптофана, это Тгр 48 (Тгр 48') и Тгр 104 (Тгр 104'). Исходя из данных по выравниванию аминокислотных последовательностей протеиназы Ulysses и известных ретровирусных аспартатных протеиназ, а так же полученных ранее данных молекулярного моделирования, можно предположить, что Тгр 48 (48') находятся на поверхности молекулы и должны в большей степени влиять на спектр флуоресценции. Остатки Тгр 104 (104') повернуты внутрь белковой глобулы и, соответственно, должны оказывать минимальное влияние на интенсивность и характер флуоресценции. В тоже время, асимметрия спектра флуоресценции свидетельствует о том, что они вносят вклад в суммарную флуоресценцию молекулы. Это может быть вызвано тем, что молекула протеиназы Ulysses является нековалентным гомодимером. Мономеры находятся в

5.6.Спектр флуоресценции.

состоянии динамического равновесия с молекулой димера. Таким образом, определенная часть молекул находится в диссоциированном состоянии, при этом остатки Тгр 104 (104') экспонированы к растворителю, и таким образом влияют на спектр флуоресценции.

150 - / \

100-

50 _

0 ! I I I I I I ! I I I I I ! I I

ЗС ¡ i 0 ! I ! I I 350 I I I I I 400 I I I I 450

Рис.14 Спектр флуоресценции протеиназы Ulysses.

Кроме того, получены спектры флуоресценции протеиназы Ulysses в комплексе с пепстатином, который полностью совпадает со спектром свободного фермента. Раннее, при исследовании протеиназы HIV-1 (Джудит Фиди и авторы), было показано что связывание пепстатина не влияет на спектр флуоресценции фермента. Это связано, по-видимому, с тем, что полярное окружение остатков триптофана в молекуле протеиназы HIV-1 слабо меняется при связывании пепстатина, что в свою очередь, находит свое отражении в неизменности спектра флуоресценции. Учитывая отсутствие влияния связывания пепстатина на спектр флуоресценции в обоих случаях, можно сделать заключение о сходстве пространственной конфигурации протеиназы HIV-1 и протеиназы Ulysses в области активного центра.

5.7. Круговой оптический дихроизм (КД) Вторичная структура белка может быть определена при помощи КД спектрометрии. Измерения проводят в дальней УФ области (190-250 нм). В этом диапазоне длин волн хромофором является пептидная связь, возникновение сигнала происходит в том случае.

если белок свернут в регулярную структуру. КД спектр протеиназы Ulysses представлен на рисунке 15.

Состав элементов вторичной структуры протеиназы Ulysses, определенных из спектров КД (интервал 1 нм) можно представить следующим образом:

Wavelenglh.nm

Рис.15 Спектр КД протеиназы Ulysses.

Полученные результаты хорошо согласуется с данными по предсказанию вторичной структуры: 20 % альфа-спирали и 80 % бетта-структуры. Количество областей с альфа-спиральной организацией у протеиназы Ulysses, как по данным КД так и по данным теоретических расчетов, оказывается большим, чем у большинства ретровирусных аспартатных протеиназ, например у протеиназы HIV-1. Это вызвано, по-видимому, наличием двух областей с альфа-структурной организацией: С2, характерной для всех представителей этого класса ферментов и С1- альфа спирали, представленной только у протеиназы E1AV.

Выводы

1. На основе сравнительного анализа продукта трансляции гена ретротранспозона Ulysses (Drosophila virilis) и первичных структур известных ретровирусных аспартатных протеиназ определены фланкирующие последовательности протеин&зы Ulysses.

2. Клонированием и экспрессией гена протеиназы ретротранспозона Ulysses в E.coli впервые получен кодируемый им белок, обладающий протеолитической активностью.

3. Исследованы физико-химические свойства протеиназы Ulysses, в том числе ее устойчивость при автолизе, а также специфичность при гидролизе пептидных субстратов и проведено сравнение с протеиназой HIV-1. Показано, что протеиназа ретротранспозона Ulysses обладает широкой специфичностью (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных и заряженных аминокислот). Оптимум рН действия равен 5.5.

4. Методом молекулярного моделирования построена пространственная модель протеиназы Ulysses, согласующаяся с экспериментальными данными по спектрам флуоресценции и КД и результатам автолиза.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Волков Д.А., Дергоусова Н.И. Савватеева Л.В., Евгеньев М.Б, Румш Л.Д., Андреева Н.С. Аспартатные протеиназы из транспозона Drosophila virilis. V Симп. «Химия протеолитических ферментов». Посвящ. 75-летию со дня рождения чл.корр. РАН В.К.Антонова. Москва, 22-24 апр. 2002 г. Тезисы докл. и стенд.сообщ,- С.47

2. Волков Д.А., Дергоусова Н.И. Савватеева Л.В., Румш Л.Д. Аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysess (Drosophila virilis). Вопросы мед. Химиии.2002,48(6), с.533-560

3. Volkov DA, Dergousova N1, Rumsh LD. "New Aspartic Proteinase of Ulysses

Retrotransposone From Drosophila Virilis". Int. Aspartic Proteinase and Inhibitors Conf. "I CAP I 03", Kioto, Japan. November 14-16, 2003 Abstr.G35

4. Волков Д.А., Дергоусова Н.И., Румш Л.Д. Новая аспартатная протеиназа из ретротраспозона Ulysess (Drosophila virilis). Биохимия. - 2004, 69(6), с.856-861.

Принято к исполнению 31/01/2005 Исполнено 01/02/2005

Заказ № 576 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

.00

И8

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Волков, Денис Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика аспартатных протеиназ. 3 1.1. Основные принципы структурной организации аспартатных протеиназ.

1.1.1. Трехмерная структура пепсина.

1.1.2.Трехмерная структура протеиназы HIV-1.

1.3. Общая характеристика ретровирусных аспартатных протеиназ на примере протеиназы вируса иммунодефицита человека.

1.3.1. Субстраты и субстратная специфичность.

1.3.2. Механизм катализа и факторы, влияющие на каталитическую активность.

1.4. Протеиназы эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов.

2. Общая характеристика мобильных генетических элементов.

2.1. Транспозоны.

2.2. Ретропозоны.

2.3. Ретротранспозоны.

2.3.1. Строение ретротранспозонов на примере copia Drosophila melanogaster и

Ulysses Drosophila virilis.

2.3.2. Жизненный цикл ретровирусов и ретротранспозонов.

2.3.3. Влияниеретротранспозиций на геном хозяина.

2.3.3.1. Негативное влияние.

2.3.3.2. Залечивание двухцепочечныхразрывов ДНК.

2.3.3.3. Удлинение теломер.

3. Теоритически-рассчетные методы исследования аспартатных протеиназ.

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Определение локализации протеиназы Ulysses Drosophila virilis в составе полибелка-предшественника.

2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторерЕТ-23а(+).

З.Экспрессия рекомбинантного гена. Очистка белка.

4.Исследование свойств протеиназы Ulysses.

4.1. Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки (pi).

4.2. Гидролиз мелиттина.

4.3.Гидролиз В-цепи инсулина

4.4. Определение рН-оптимума.

4.5. Ингибирование гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses пепстатином

4.6.Автолиз

5. Построение трехмерной модели протеиназы Ulysses.

5.1. Моделирование трехмерной структуры.

5.2. Молекулярно-динамическое моделирование пространственной структуры молекулы протеиназы Ulysses.

5.3. Анализ третичной структуры.

5.4.Междоменный слой.

5.5. Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses.

5.6.Спектр флуоресценции.

5.7. Круговой оптический дихроизм (КД)

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы.

2. Методы исследования. 73 ВЫВОДЫ 80 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses"

Функции аспартатных протеиназ в живом организме чрезвычайно разнообразны. Они участвуют в процессах пищеварения, в процессинге различных гормонов и нейропептидов, в утилизации белкового материала. К аспартатным протеиназам так же относятся протеиназы большинства ретровирусов, включая вирус иммунного дефицита человека (HIV) и аналогичные вирусы животных. Трехмерные структуры аспартатных протеиназ в значительной степени сходны, хотя ретровирусные протеиназы имеют ряд принципиальных особенностей.

Недавно обнаружено, что ретротранспозоны (мобильные генетические элементы, широко распространенные в геномах бактерий, растений, животных) содержат нуклеотидные последовательности, продуктами трансляции которых являются белки, гомологичные ретровирусным аспартатным протеиназам.

В последнее время обнаружено множество эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Полученные недавно данные о возможности активации эндогенных ретровирусов животных при пересадке органов человеку, а так же активации эндогенных ретровирусов человека при заражении HIV, делают изучение ретротранспозонов актуальной проблемой. Аспартатные протеиназы являются ключевыми ферментами жизненного цикла ретровирусов и ретротранспозонов и поэтому представляют собой основную мишень лекарственной терапии.

Аспартатные протеиназы играют важную роль в жизненном цикле ретровирусов, эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Мутации аспартатов активного центра, приводят к неспособности образования функционально-активных белков ретроэлемента и как следствие неспособности к дальнейшему функционированию.

Наше внимание привлек Ulysses - мобильный генетический элемент, обнаруженный в Drosophila virilis. Он имеет структурную организацию, характерную для LTR-содержащих ретротранспозонов: первая свободная рамка считывания кодирует белки матрикса и капсида, вторая - протеиназу, обратную транскриптазу, РНКазу Н и интегразу.

Предмет наших исследований - протеиназа ретротранспозона Ulysses, предполагаемая последовательность которой содержит консервативные для аспартатных протеиназ структурные области, в том числе триаду DTG в области активного центра.

В связи с этим, целью данной работы является проведение клонирования, выделения и исследование свойств полученного белка из мобильного элемента Ulysses Drosophila virilis. В целом данная работа является первой попыткой получения аспартатной протеиназы из мобильного элемента.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волков, Денис Александрович

выводы

1. На основе сравнительного анализа продукта трансляции гена ретротранспозона Ulysses (Drosophila virilis) и первичных структур известных ретровирусных аспартатных протеиназ определены фланкирующие последовательности протеиназы Ulysses.

2. Клонированием и экспрессией гена протеиназы ретротранспозона Ulysses в E.coli впервые получен кодируемый им белок, обладающий протеолитической активностью

3. Исследованы физико-химические свойства протеиназы Ulysses, в том числе ее устойчивость при автолизе, а также специфичность при гидролизе пептидных субстратов и проведено сравнение с протеиназой HIV-1. Показано, что протеиназа ретротранспозона Ulysses обладает широкой специфичностью (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных и заряженных аминокислот). Оптимум рН действия равен 5.5.

4. Методом молекулярного моделирования построена пространственная модель протеиназы Ulysses, согласующаяся с экспериментальными данными по спектрам флуоресценции и КД и результатам автолиза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Волков, Денис Александрович, Москва

1. Szecsi. Р.В. The aspartic proteases. // Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52, pp. 22-25.

2. Bennett K., Levine Т., Ellis J.S., Peanasky R.J., Samloff I.M., Kay J. Chain B.M. Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E. // Eur. J. Immunol., 1992, v. 22, pp. 1519-1524.

3. Lees W.E., Kalinka S., Meech J., Capper S.J., Cook N.D., Kay J. Generation of human endothelin by cathepsin E.// FEBS Lett., 1990, v. 273, pp. 99-102.

4. Pungercar J., Strukelj В., Gubensek F., Turk V., Kregar I. Amino acid sequence of lamb prechymosin and its comparison to other chymosins. //Adv. Exp. Med. Biol., 1991, v. 306, pp. 127-131.

5. Kay J., Dunn B.M. Viral proteinases: weakness in strength. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1048, pp. 1-18.

6. Антонов B.K. // Химия протеолиза. / M.: Наука, 1991, 363 с.

7. Rajagopalan T.G., Stein W.H., Moore S. The inactivation of pepsin by diazoacetylnorleucinemethyl ester. // J. Biol. Chem., 1966, v. 241, pp. 4295-4297.

8. Tang J. Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like epoxides. // J. Biol. Chem., 1971, v. 246, pp. 4510-4517.

9. Marciniszyn J. Jr., Hartsuck J.A., Tang J. Mode of inhibition of acid proteases by pepstatin. // J. Biol. Chem., 1976, v. 251, pp. 7088-7094.

10. Toogood H.S., Prescott M., Daniel R.M. A pepstatin-insensitive aspartic proteinase from a thermophilic Bacillus sp. // Biochem. J., 1995, v. 307, pp. 783-789.

11. Ito M., Dunn B.M., Oda K. Substrate specificities of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from gram-negative bacteria. // J. Biochem. (Tokyo), 1996, v. 120, pp. 845-850.

12. Андреева H.C. Структура пепсина. I. Собственная симметрия молекулы фермента и возможные пути эволюции аспартатных протеиназ. // Мол. биол., 1985, т. 19, стр. 218-224.

13. Davies D.R. The structure and function of the aspartic proteinases. //Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1990, v. 19, pp. 189-215.

14. Tang J., Wong R.N. Evolution in the structure and function of aspartic proteases. // J. Cell. Biochem., 1987, v. 33, pp. 53-63.

15. Hartsuck J. A., Koelsch G., Remington S.J. The high-resolution crystal structure of porcine pepsinogen.//Proteins, 1992, v. 13, pp. 1-25.

16. James M., Moore S., Sielecki A., Chernaia M., Tarasova N. The molecular structure of human progastricsin and its comparison with that of porcine pepsinogen. // Adv. Exp. Med. Biol., 1995, v. 362, pp. 11-18.

17. Moore S.A., Sielecki A.R., Chernaia M.M., Tarasova N.I., James M.N. Crystal and molecular structures of human progastricsin at 1.62 A resolution. // J. Mol. Biol., 1995, v.247, pp. 466-485.

18. Gardner,M.J., Hall,N., Fung,E., White,O., Berriman,M., Hyman,R.W. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. // Nature, 2002, v.419 (6906), pp. 498-511.

19. Sielecki A.R., Fedorov A.A., Boodhoo A., Andreeva N.S., James N.G. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution.// J. Mol. Biol. -1990 v.214 - pp.143-170.

20. Andreeva N.S. Consensus template for the aspartic proteinase fold.// Adv. Exp. Med. Biol. 1992 - v.306 - pp.559-572.

21. Андреева H.C., Гущина A.E., Жданов A.C., Печик И.В., Сафро М.Г., Федоров А.А. Некоторые аспекты структурных исследований аспартатных протеиназ.// Молек. биол. 1989 - т.23 - стр.1523-1534.

22. Lapatto R., Blundell Т., Hemmings A., Overington J., Wilderspin A., Wood S., Merson

23. J.R., Whittle P.J., Danley D.E., Geoghegan K.F., Hawrylic S.J., Lee S.E., Scheld K.G., Hobart P.M. X-ray analysis of HIV-1 proteinase at 2.7 A resolution confirms structural homology among retroviral enzymes. // Nature, 1989, v. 342 , pp. 299-302.

24. Stebbins J., Towler E.M., Tennant M.G., Deckman I.C., Debouck C. The 80's loop (residues 78 to 85) is important for the differential activity of retroviral proteases. // J. Mol. Biol., 1997, v. 267, pp. 467-475.

25. Katz R.A. & Skalka A.M. The retroviral enzymes. // Annu. Rev. Biochem., 1994, v. 63, pp.133-173.

26. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. // Microbiol. Rev., 1993, v. 57, pp. 183-289.

27. Overton H.A., McMillan D.J., Gridley S.J., Brenner J., Red-Shaw S., Mills J.S. Effect of two inhibitors of the human immunodeficiency virus protease on the maturation of the HIV gag and gag-pol polyproteins. // Virology, 1990, v. 179, pp. 508-511.

28. Jhonson M.I. & Hoth D.E. Present status and future prospects for HIV therapies. // Science, 1993, v. 260, pp. 1286-1292.

29. Daube H., Billich A., Mann K., Schramm H.J. Cleavage of phosphorylase kinase and calcium-free calmodulin by HIV-1 protease. // Biochem. Biophys. Res. Communs., 1991, v. 178, pp. 892-896.

30. Krafft G.A. & Wang G.T. Sinthetic approacher to continuous of retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 70-86.

31. Kay K. & Dunn B.M. Substrate specifity and inhibitors of aspartic proteinases. // Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52, pp. 23-30.

32. MeekTh.D., Rodriguez E.J., Angeles Th.S. Use of steady state kinetic methods to elucidate the kinetic and chemical mechanisms of retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 127-156.

33. Darke P.L., Jordan S.P., Hall D.L., Zugay J.A., Shater J.A., Kuo L.C. Dissociation and association of the HIV-1 protease dimmer subunits: equilibria and rates. // Biochemistry, 1994, v.33, pp. 98-105.

34. Darke P.L. Stability of the dimeric retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 104-127.

35. Rose J.R., Salto R., Craik C.S. Regulation of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid substitutions. // J. Biol. Chem., 1993, v. 286, pp. 1193911945.

36. Jordan S.P., Zugay J.A., Darke P.L., Kuo L.C. Activity and dimerization of human immunodeficiency virus protease as a function of solvent composition and enzyme concentration. // J. Biol. Chem., 1992, v. 267, pp. 20028-20032.

37. Davis DA, Dorsey K, Wingfield PT, Stahl S J, Kaufman J, Fales HM, Levine RL. Regulation of HIV-1 protease activity through cysteine modification. I I Biochemistry, 1996, v. 35(7), pp. 2482-8.

38. Dunn B.M., Goodenow M.M., Gustchina A. and Wlodawer A. Retroviral proteases. // Genome Biology, 2002, v. 3(4), pp. 30061-30067.

39. Jurgen H.B., Seelmeir S., von der Helm K. Molecular and enzymatic characterization of porcine endogenous retrovirus protease. // Journal of Virology, 2002, v.76, pp. 7913-7917.

40. Zabransky A., Andreansky M., Hruskova-Heidingsfeldova O., Havlicek V., Hunter E., Ruml Т., Pichova I. Three active forms of aspartic proteinase from Mason-Pfizer monkey virus. // Virology, 1998, v. 245(2), pp. 250-256.

41. Merkulov G.V., Lawler J.F., Eby Y., Boeke J.D. Ту 1 proteolytic cleavage are required fortransposition: all sites are not equal. // Journal of Virology, 2001, v.75, pp. 638-644.

42. Irwin P. A., VoytasD.F. Expression and processing ofproteins encoded by the Saccharomy ces retrotransposon Ty5. // Journal of Virology, 2001, v.75, pp. 1790-1797.

43. BergD.E., and Howe M. // Mobile DNA. / American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989, p. 347.

44. Engel W., and Preston C. Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila. // Genetics, 1984, v. 107, pp. 657-678.

45. Langley C., Montgomery E., Hudson R., Kaplan N. and Charlesworth B. On the role of unequal exchange in the containment of transposable element copy number. // Genet. Res., 1988, v. 52, pp. 223-236.

46. Strand D., and McDonald J. Insertion of a copia element 5' to the Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase gene (adh) is associated with altered developmental and tissue-specific patterns of expression. // Genetics, 1989, v. 121, pp. 787-794.

47. Cai H., and Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. // EMBO J., 1997, v. 16, pp. 1732-1741.

48. Georgiev P., and Corces V. The su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, pp. 5184-5188.

49. Moore J.K. & Haber J.E. Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand breaks. // Nature (London), 1996, v. 383, pp. 644-646.

50. Biessmann H., Valgeirsdottir K., Lofsky A., Chin C., Ginther В., et al. HeT-A, a transposable element specifically involved in "healing" broken chromosome ends in Drosophilamelanogaster. // Mol. Cell. Biol., 1992b, v. 12, pp. 3910-3918.

51. Levis R., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L. and Sheen F. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. // Cell, 1993, v. 75, pp. 1083-1093.

52. Rio D. Regulation of Drosophila P-element transposition. // Trends Genet. 1991, v. 7, pp. 282-287.

53. Kaufman P. and Rio D. P-element transposition in vitro by a cut-and-paste mechanism and uses GTP as a cofactor. // Cell, 1992, v. 69, pp. 27-39.

54. Beall E.,and Rio D. Drosophila IRBP/Ku p70 corresponds to the mutagen-sensitive mus309 gene and is involved in P-element excision in vivo. // Genes. Dev., 1996, v. 10, pp. 921-933.

55. Siebel C., Admon A. and Rio D. Soma-specific expression and cloning of PSI, a negative regulator of P-element pre-mRNA splicing. // Genes. Dev., 1995, v. 9, pp. 269-283.

56. Rebatchouk D., and Narita J. Foldback transposable elements in plants. // Plant Mol. Biol., 1997, v. 34, pp. 831-835.

57. Dawson A., Hartswood E., Paterson T. and Finnegan D. A LINE-like transposable element in Drosophila, the I factor, encodes a protein with properties similar to those of retroviral nucleocapsids. // EMBO J., 1997, v. 16, pp. 4448-4455.

58. Xiong Y., and Eikbush T. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. // EMBO J., 1990, v. 9, pp. 3353-3362.

59. Luan D., Korman M., Jakubczak J. and Eickbush T. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. // Cell, 1993, v. 72, pp. 595-605.a

60. Kim A., Terzian C., Santamaria P., Pelisson A., Purdqhomme N., et al. Retroviruses ininvertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, pp. 1285-1289.

61. Tanda S., Mullor J. and Corces V. The Drosophila Tom retrotransposon encodes an envelope protein. // Mol. Cell. Biol., 1994, v. 14, pp. 5392-5401.

62. Nuzhdin S., Pasyukova E. and Mackay T. Positive association between copia transposition rate and copy number in Drosophila melanogaster. // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1996, v. 263, pp. 823-831.

63. Zelentsova H., Poluectova H., Mnjoian L., Lyozin G., Veleikodvorskaja V., Zhivotovsky L., Kidwell M.G., Evgen'ev M.B. Distribution and evolution of mobile elements in the virilis species of Drosophila. // Chromosoma, 1999, v. 108, pp. 443-456.

64. Evgen'ev M.B., Corces V.G., Lankenau D.-H. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses. // J. Mol. Biol., 1992, v. 225 (3), pp. 917-924.

65. Lower R., Lower J., Kurth R. The viruses in all of us: characteristics and biologicalsignificance of human endogenous retrovirus sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, pp. 5177-5184.

66. Yoshioka K., Kanda H., Akiba H., Enoki M. and Shiba T. Identification of an unusual structure in the Drosophila melanogaster transposable element copia: evidence for copia transposition through an RNA intermediate. // Gene, 1991, v. 103, pp. 179-184.

67. Eichinger D. and Boeke J. A specific terminal structure is required for Ту 1 transposition.//

68. Genes. Dev., 1990, v. 4, pp. 324-330.

69. Lower R. The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantasies. // Trends in microbiology, 1999, v. 7 (9), pp. 350-355.

70. Kazazian H.H.J. Mobile elements and disease. // Current opinion in genetics & Development, 1998, v. 8, pp. 343-350.

71. Challem J.J. and Taylor E.W. Retroviruses, ascorbate, and mutations, in the evolution of Homo Sapiens. // Free radical biology & Medicine, 1998, v. 25 (1), pp. 130-132.

72. Kazazian H.H.J., Wong C., Scot A.F., Philips D.G. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represent a novel mechanism for mutation in man. // Nature, 1998, v. 332, pp. 164-166.

73. Kazazian H.H.J & Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome. // Nat Genet., 1998, v. 19, pp. 19-24.

74. Kidwell M.G. and Lisch D.R. Transposable elements and host genome evolution. // Tree, 2000, v. 15 (3), pp. 95-99.

75. Teng S.-C., Bohue K. & Gabriel A. Retrotransposon reverse-transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. // Nature (London), 1996, v. 383, pp. 641-644.

76. Биологический энциклопедический словарь. / M.: Сов. Энциклопедия, 1989, 864с.

77. Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA ofTetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989, v. 337(6205), pp. 331-7.

78. Cooke HJ, Smith В A. Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986;51 Pt 1, pp. 213-9.

79. Allshire RC, Gosden JR, Cross SH, Cranston G, Rout D, Sugawara N, Szostak JW,

80. Fantes PA, Hastie ND. Telomeric repeat from T. thermophila cross hybridizes with human telomeres, Nature, 1988, v. 332(6165):656-9.

81. Lundblad V, Szostak JW. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell, 1989, v.57(4), pp. 633-43.

82. Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, Goldstein S, Younglai EV, Futcher AB, Greider CW, Harley CB. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl AcadSciUSA, 1992, v. 89(21), pp. 10114-8.

83. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, v. 266(5193), pp. 2011-5.

84. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wright WE. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science, 1998, v. 279(5349), pp. 349-52.

85. Pardue M.-L. & DeBaryshe P.G. Drosophila telomeres: two transposable elements with important roles in chromosomes. // Genetica, 1999, v. 107, pp. 189-196.

86. Kidwell M.G. and Lisch D. Transposable elements as sources of variation in animals and plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, pp. 7704-7711.

87. Eickbush Т.Н. Telomerase and retrotransposons: which came first? // Science, 1997, v. 277, pp. 911-912.

88. Nakamura T.M., Gregg B.M., Chapman K.B. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. // Science, 1997, v. 277, pp. 995-997.

89. Попов E.M. // Проблема белка. Том 3 / М.: Наука, 1997, с. 75-77.

90. Huang Xiao-Qin, Jiang Hua-Liang, Luo Xiao-Min. A 3D-structural model of memapsin 2protease generated from theoretical study. // Acta Pharmacol Sin, 2001, v. 22(1), pp. 50-56,,

91. Andreeva N., Bogdanovich P., Kashparov I., Popov M., Stengach M. Is histoaspartic protease a serine protease with a pepsin-like fold? // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2004, v. 55, pp. 705-710.

92. Kulkarni S.S., Kulkarni V.M. Structure based prediction of binding affinity of human immunodeficiency virus-1 protease inhibitors. // Journal Chem. Inf. Comput. Sci., 1999, v. 39, pp. 1128-1140.

93. Ersmark K., Feierberg I., Bjelic S., Hulten J., Samuelsson В., Aqvist J, Hallberg A. C2-symmetric inhibitors of Plasmodium falciparum plasmepsin II: synthesis and theoretical predictions. // Bioorg Med Chem., 2003, v. 11(17), pp. 3723-33.

94. Андреева H.C., Печик И.В. Сравнение трехмерных структур гибких молекул белков. // Мол. биол., 1995, т. 29, стр. 1102-1113.

95. Scheinker V.S., Lozovskaja E.R., Bishop J.G., Corces V.G., Evgen'ev M.B. A Long Terminal Repeat-Containing Retrotransposon is Mobilized During Hybrid Dysgenesis in Drosophila virilis . // Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1990, v. 87, pp. 9615-9619.

96. Andreeva N.S. A consensus template for the aspartic proteinase fold. // Adv. in Exp. Med. Biol., 1991, v. 306, pp. 559-572.

97. Stebbins J. & Debouk Ch. Expression system for retroviral proteases. // Meth. Enzymol:.,1994, v. 241, pp. 3-16.

98. Rizzo C.J. & Korant B.D. Genetic approachesdisigned to minimize cytotoxicity of retroviral protease. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 16-24.

99. Wondrak E.M., Louis J.M., MoraP.T., Orozlan S. Purification of HIV-1 wild-type protease and characterization of proteolytically inactive HIV-1 protease mutants by pepstatin A affinity chromatography. // FEBS Lett., 1991, v.280, pp. 347-350.

100. Mirgorodskaya O., Kazanina G., Mirgorodskaya E., Vorotynseva Т., Zamolodchikova Т., Alexandrov S. A comparative study of the specificity of melittin hydrolysis by dupdenase, trypsin and plasmin. // Prot. Pept. Lett., 1996, v. 3, pp. 315-320.

101. Дергоусова Н.И. // Исследование структурных основ функционирования аспартатных протеиназ. Мутагенез протеиназы ВИЧ-1. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. / Москва, 1998.

102. Симанкова А.Н., Миргородская О.А., Савельева Н.В., Кернер Р., Ройпсторфф П., Александров СЛ. Грибная аспартатная npoTeHHa3aH3Trichodermaviride. Специфичность при гидролизе олигопептидов. // Биоорганическая Химия, 1997, т. 25, с. 611-614.

103. Marti-Renom M.A, Stuart A., Fiser A., Sanchez R., Melo F., Sali A. Comparative protein structure modeling of genes and genomes. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2000, v. 29, pp. 291-325.

104. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., StatesD.J., Swaminathan S., and Karplus M. CHARMM: A Program for Macromolecular Energy, Minimization, and Dynamics Calculations. //J. Сотр. Chem., 1983, v. 4, pp.187-217.

105. Fidy J., LabergeM., Ullrich В., Polgar L., Szeltner Z., Gallay J., and Vincent M. Tryptophan rotamers that report the conformational dynamics of proteins // Pure Appl. Chem., 2001, v. 73(3), pp. 415-419.

106. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.

107. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.//Anal. Biochem., 1976, v.72 pp.248254.

108. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Т47/Nature (London), 1970, v.227 pp.680-685.

109. Lin КН., Cheng S.Y. An efficient method to purify active eukaryotic proteins from the inclusion bodies in Escherichia coli.// Biotechniques , 1991, v. 11 p.748

110. Provencher,S.W.,Glockner J., Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry, 1981,v.20, pp. 33-37.

111. Laskowski R A, MacArthur M W, Moss D S & Thornton J M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. //J. Appl. Cryst., 1993, v.26, pp.283291.