Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Никотинамидные коферменты и коррекции метаболических нарушений при экспериментальном стрентозотциновом диабете у крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Никотинамидные коферменты и коррекции метаболических нарушений при экспериментальном стрентозотциновом диабете у крыс"

2 1 АП? Ш

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О. В. ЇІАЛЛАДША

ФЕДИК МАРТА ЯРОСЛАВІВНА

УДК 577.164.15:577.124:616.379-008.61

НІКОТИІІАМІДНІ КОФЕРМЕНТИ В КОРЕКЦІЇ МЕТАБОЛІЧНИХ ПОРУШЕНЬ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ СТРЕПТОЗОТОЦИНОВОМУ . ДІАБЕТІ У ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня канлндята біологічних наук

Київ - тя

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського державного університету ім. Івана Франка Міністерства освіти України

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор '

Великий Микола Миколайович,

Львівський державний університет ім. Івана Франка, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Хмелевський Юрій Володимирович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор;

кандидат біологічних наук Кучмеровська Тамара Муратівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАНУ, старший науковий співробітник

Провідна установа - Львівський медичний університет (кафедра біохімії)

Захист відбудеться 20 квітня 1998 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (252601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Автореферат розісланий “20” березня 1998 р.

Вчений секретар ^

спеціалізованої вченої ради Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Нікотинамідним коферментам, внаслідок широкого розповсюдження о біологічних системах і виключній ролі у функціонуванні ряду основних процесів життєдіяльності, належить особливе місце в біохімії вітаміновмісних кофермент ів.

Каталітичні функції NAD(P)-nap в клітині зумовлені їх здатністю до окисно-відновних перетворень. Зворотня оксидоредукція в дегідрогеначних системах, як універсальний біохімічний механізм ключових процесів метаболізму здійснюється молекулою нікопшаміцу, включеною в нуклеотидну структуру NAD+ і NADP’ [Kaplan N. 1956, Халмурадов A. 1982]. Конформація останніх, стаціонарність їх концентрації у відповідних компартментах клітини і їх метаболічний стан (окисленість чи підновнісіь) відіграють провідну роль в регуляції швидкості і спрямованості реакцій проміжного обміну [Великий М. 1976, Jong J. 1983, Krebs 11. 1973].

Особливо акіуальним є питання про застосування нікотинаміду - попередника нікотинамідних кофермент ів в корекції метаболічних порушень при річних патологічних станах, зокрема цукрового діабету 1 типу [Elliot R 1991, Pociot H 1993, Kretowski A. 1996, Сфімов A. 1988].

Постульовано ряд можливих механізмів протекторної дії нікотинаміду при інсуліноз^лежному діабеті. Один з них грунтується на опосередкуванні дії нікогинаміду цикло-АОР-рибочою, яка є вторинним месенджером вивільнення Са ' з ендоплазматичною ретикулуму, і тим самим глюкозоіндукованої секреції інсулін) (l-клітинами. Важливим аспектом дії нікотинаміду с індукція біосинтезу NAD' і його використання як джерела ADP-рнбози в реакціях полі-АОР-рибозилюванш ядерних білків. Біологічне значення полІ-АРР-рибозилювання полягає у забезпеченні структурно-функціональної цілісності геному та активації ренаративних процесів при одноланшогових розривах ДНК, які мають місце при деструкції ß-клігин підшлункової залози при цукровому діабеті (Okamoto H., I9fc5, Andersen H., 1993). В літературі наведені дані про збільшення мітотичного індексу (5-клітин під впливом нікотинаміду (Sugiyama K., 1991) і пропротекторну дію нікотинаміду при с^рептозотоциновому діабеті (Masiello P., 1990, Elliot R., 1991).

Актуальними проблемами біохімії цукрового діабету г пізнання механізмів розвитку метаболічних порушень, діабетичних ускладнень, рання діагностика захворювання та пошук оптимальних шляхів корекції даної патології. Згідно з міжнародною програмою ENDIT - European Nicotinamide Diabetes intervention Trial -

останні дна роки ведуться дослідження протекторної та корегуючої ефективності нікопінаміду при інсулінозалсжному цукровому діабеті. Наявність такої програми шлі нерджус актуальність проведеної нами роботи і науково-практичну перспективність висновків щодо використання нікотинаміду в терапії цукрового діабету.

Зв'язок робот з науковими програмами, плинами, темами. Проведені дослідження є органічною складовою частиною наукового напрямку роботи кафедри біохімії та науково-дослідної лабораторії “Радіаційної та молекулярної біології” Львівського державного університету ім. Ів.Франка. Окремі розділи роботи виконувались згідно з планами науково-дослідних робіт по темах: "‘Дослідження механізму дії нікотинаміду в корекції метаболічних порушень при ускладненнях діабету і розробка їх ранньої діагностики”, “Діагностика та розробка •засобів корекції метаболічних порушень при цукртвому діабеті”, “Біохімічні дослідження патології цукрового діабету та розробка засобів попередження тканинної гіпоксії”.

Мста і задачі дослідження. Метою роботи було (¡становлення механізмів розвитку метаболічних порушень при експериментальному стрептозотоциновому діабеті у щурів та вивчення корегуючої дії різних доз нікотинаміду при цій патології. Відповідно до основної мети в роботі вирішувались наступні завдання:

1. Дослідити тканинну специфічність .та особливості динаміки біосинтезу

нікотинамідних коферментіп з двох попередників: нікотинаміду та

нікотинової кислоти:

2. На основі виміряних стаціонарних концентрацій метаболітів та констант рівноваги ряду дегідрогеназних систем охарактеризувати окисно-відновний стан вільних NAD-, NADP-nap (співвідношеная NAD/ NADH і NADP’/

. NADPH) в цитоплазмі і мітохондріях печінки щурів в умовах інтенсифікації біосинтезу нікотинамідних коферментів з нікотинаміду.

3. Охарактеризувати окисно-відновний стан вільних NAD- та NADP- пар в цитоплазмі і мітохондріях тканин щурів при стрептозотоциновому діабеті.

'1 Дослідити внесок процесів глікозилювання білків крові і зміни концентрації п еритроцитах 2,3-ДФГ-модулятора спорідненості гемоглобіну до кисню - в киснево-транспортну функцію крові при експериментальному діабеті.

5. Дослідити регуляторний вплив окисно-відновного стану вільних нікотинамідних коферментів на метаболічні процеси при одноразовому та довготривалому введені діабетичним щурам нікотинаміду у фізіологічних та иисоких дозах. .

з

6. Охарактеризувати корегуючий оплив змін иікотинаміду иа киснево-транспортну функцію крові при експериментальному інсулінозалежному діабеті.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі встановлено існування чітко вираженої тканинної специфічності та особливостей інтенсивності біосинтезу нікотинамідиих коферментів з двох основних попередників: иікотинаміду та нікотинової кислоти. Для тканини печінки і мозку кращим попередником є нікотинамід, для крові і слизової тонкої кишки - нікотинова кислота.

. Дістала подальший розвиток теорія про роль окисно-відновного стану NAD- та NADP-иар як системного фактора регуляції дегідрогеиазних систем, що беруи» участь у ключових ланках вуглеводного та енергетичного обміну.

■ При порівнянні двох типів клітин що характеризуються різною чутливістю до інсуліну і проникністю глюкози, а саме гспатоцитів, еритроцитів та клітин мозку, виявлено індивідуальність метаболічних змін в процесі розвитку діабетичної патології. В гепатоцитах внаслідок обмеженого проникнення глюкози гальмується її окислення та активується біосинтез. В еритроцитах і тканині мозку має місце активація гліколізу, тобто посилюється окислення глюкози.

Вперше^ продемонстровано, що глікозилювання гемоглобіну, як незворотіїіґі процес, є визначальним фактором у зміні киснево-транспортної функції крові при цукровому ліабеті. Навіть за умови зростаючого вмісту 2,3-ДФГ при експериментальному діабеті спорідненість гемоглобіну до кисню підвищується.

Введення нікогинаміду в фізіологічних та високих дозах мас чітко виражений і ¡not лікемічний та нормалізуючий вплив на метаболічні пронеси, а саме:

- зростає співвідношення вільних NAP'/NAPH та NADPVNADPH. спряжене із змінами концентрації окислених і відновлених метаболітів дегідрогеназних систем; .

~ зменшення кількості глікозильонаних білків, зокрема гемоглобіну та 2,3-ДФГ', нормалізує киснево-транспортну функцію крові.

Практичне значеним одержаних результатів. Теоретичне і експериментальне обтрушування роліміікоіинамілних коферментів у регуляції внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та при патології послужило основою для рекомендацій щодо застосування нікогинаміду t метою корекції метаболічних порушень при експериментальному цукровому діабеті. Продемонстровано, що тривале введення иікотинаміду у фізіологічній та високих лозах, суттєво підвищуючи рівень нікотинамідиих коферментів в тканинах, супроводжується чітко вираженим

ииогдікемічним ефектом та нормалізує ккснево-танспортну функцію крові, понижуючи інтенсивність пронесу ГЛІКО'ІШІЮВаШІИ білків.

Чому доцільним і' використання иікотинаміду в комплексній терапії ч метою корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті та длн попередження ускладнень, таких як прогресування гіперглікемії, іінерліпідемія. кетоаїшдот, ані іонаїії, ретинопатії, полшеїіронаїії.

Особистим внесок здобувача полите у виконанні експриментальної частий роботи, підборі та обробці літературних даних. Аналіз та обговорення проведено спільно ч науковим керівником. ,

Апробацій реіулі.та ііи дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на Пессоюіній конференції і клінічної нііамінології (Росія, Москва, І91Я). VI Українському біохімічному і 'їзді (Київ, 1992), Міжнародній Студентській Конференції (Польща, Гданськ, 1996), III та IV Міжнародній конференції і клінічної ендокринології Європейської Федерації Ендокринологічних Досліджень (Італія. Турин, 1996; Польша, Иултуськ, 1997) на конференції “Міжнародні дні діабеїу” (Дніпрогіеіровські 1997), VII Українському біохімічному гїчді (Київ, 1997), на конференціях молодих вчених, наукових семінарах та засіданнях кафедри біохімії Львівського державного університету.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 5 статей та 6 іеч доповідей. . .

Структура та обсяг робот. Дисертація складається із вступу, ошяду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів та їх обговорення, заключения. висновків і списку літераіури і 274 найменувань. Робота викладена на N6 сторінках основного тексту, ілюстрована 36 малюнками і 24 таблицями.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Експерименти проводилися на шурух-самцях лінії Ніс гар вагою 120 - 150 і, які перебували на стандартному раціоні годівлі. Об’єктом досліджень.служила кров, печінка, моток, тонка кишка. -

Для дослідження біосингеїу иікотинамідних коферментів нікотинамід (НАм) іа нікотинову кислоіу (НК) вводили тваринам внутрішньочеревно і розрахунку ^ООмг/кг маси тіла. Спостереження велись проіяшм 24 год. •

Нкспериметалышй цукровий діабет моделювали шляхом внутрішньочеревного введення сгрентототоцину (фірми “Serva”) і розрахунку 7 мг/100 і маси тваорин. Рочвшок діабету контролювали за зростанням рівня ілюкопі, який визначали ! чюктчопкспдашнм метолом ' '

Для досліду брали тварин череч два тижні, з рівнем піюкочи 10-15 ммоль/л. Корегуючий вплив ІІЛм вивчали прн ного пну тріиніьом'ячевому введенні щурам ч розвиненою гіперглікемією в ничьких (терапевтичних 20 мг/Ікг маси) та високих лозах (200мі/|кі мас 1 щоденно протягом М днів.

Кислотні екстракти тканин готували іч щойно декаиіюваних тварин ча метолом C7ok R. і l.ampreclit W. (1970). Для визначення вмісту кофермеитів та метаболітів використовували ензиматичні метоли. Окислені форми NAI) і NADP в аліквотах хлорат них екстрактів визначали спектрофотометрично ча методом Slater Т. (1964) в модифікації В.М.Тслепиьопої (1968-1972). Пміст лактату в дослідних тканинах вичначали ча метолом Hohorst Н. (1970). Ннзнцчення концентрації піровиноградної кислоти в аліквотах екстракту тканин проводили ферментативним методом Czok R. і t.amprechl VV. (1970). Реакція йде до повного відновлення пірунагу в присутності надлишку NADU. Вміст малату вичначали ча методом Hohorst II. (1970). Для визначення концен (рації аиетоаііетагу використовували ензиматичний спектрофотометричний метод. Вміст (і-іідроксибутирату визначали за його окисленням в Р-гідроксипутираідегідрогеначиій реакції. Гірнтроїдні клітини отримували ч гепаринізованої крові шляхом центрифугування нри 3 тис. об./.чн. та проминання чабуференим фічіологічним розчином pH 7.4.

Фракціонування популяцій еритроїдних клітин в градієнті сахарози проводили ча методикою, розробленою Снчовою, Камеиською, Феденкоенм (1980) п модифікації Сибірної (1984). Отримані фракції збирали в центрифужні пробірки, відмивали від сахарочи і використовували для подальших досліджень.

Вміст гліко шльопаних білків (альбуміну і гемоглобіну) визначали колориметричним методом (Fliickiger.R. 1976). Спорідненість гемоглобіну до кисню визначали спектрофотометричним методом побудови кривих кисневої рівноваги (Іванов Ю.Г. 1975, Столяр О.В. 1979). Досліди проводились ч розчином гемоглобіну, оптична густина якого до лечокснгенашї складала 0.400-0,500 нри довжині хвилі 560 нм, що відповідає концентрації білка 4,5 ІО 'М - 5,010"М. Пміст 2,3-ДФГ п еритроцитах проводили иееизиматнчинм метолом в модифікації Гесса і Дера (¡974).

- Результати досліджень оброблялись статистично ч застосуванням критерію Сіьюдеша.

PFJY.ibl ATI! Д(Н ЛІДЖІ ill. І А ї\ ОМ (ЖОІЧ ННИ.

Для кращого розуміння механізмів регулюючої дії нікотинамідинх кофермснііи необхідно знати ti біохімічні перетворення, то лежать в основі процес} їх піосиїмез} і і’о ша л\

Виходячи з цього, на першому егапі роботи була досліджена тканинна

специфічність біосинтезу нікотинамідних коферменті в з метою виявлення

оптимальною попередника синтезу для тканин» печінки, мозку, слизової тонкої кишки, крові. . . •

І. Особлипосгі біосинтезу нікотинамідних коферменті» із двох ііонередніїків: нікотинаміду та нікотинової кислоти

Результати досліджень свідчать про існування чітко вираженої тканинної

специфічності біосинтезу нікотинамідних коферментів з різних попередників.

Відмінності у використанні нікотинаміду та нікотинової кислоти як попередників ніяображалися як в рівні синтезованих NADf та NADP\ так і в швидкості досягнення максимумів їх синтезу (рис.і. 1,1.2).

% 14)0,0 і

З 4 5

І. ІОЛ

л в

Рис. 1.1 Динаміка зміни вмісту NAD* в тканинах печінки (А) та мозку (В) щурів при »веденні нішпшаміду(-О-) та нікотинової кислоти(-' -)■

В тканині печінки біосинтез NAD* з нікотинаміду протікає в 2.0 - 2,5 рази інтенсивніше, ніж із нікотинової кислоти, при чому максимум синтезу досягається на 5 -6 год. експерименту і становить 3133,0 нмоль/г тканини. Цей факт можна пояснити існуванням двох незалежних шляхів біосинтезу NAD* а також обов'ячковнм попереднім дезамінуванням нікотинаміду в печінці. Поруч із цим, рівень NADP* досягає максимальної величини 118,0 нмоль/г тканини, що відповідає іросіашію на 31,8 %, в більш ранні терміни з наступним зменшенням . •

Слід відмітити, що при майже однаковому наростанні кількості NAD* з обох попередників в тканині мозку (на максимумі: з НАм - 352,0 нмоль/г тканини, з НК -375,5 нмоль/г тканини), максимум його біосинтезу з нікотинової кислої и досягається раніше, з наступним швилхим зниженням рівня, тоді як при біосинтезі з нікотииаміду високий рівень NAD* утримується досить тривалий час.

На відміну від цього рівень синтезованого з НАм NADP* є в 2 рази вищий, ніж

з НК і становить 42,3 нмоль/г тканини.

ми.« 120 0 1100.0 |*о.ч

І600 140.11

20.0

А

В

Рис.і'і Динаміка зміни вмісту NADP* в тканинах печінки (А) та мозку (В) щурів при введенні нікотинаміду(-0-) та нікотинової кислоти(-'!-).

Незначне збільшення (на 22 %) рівня NAD при введенні НАм в тканині топкої кишки статистично не достовірне. Проте, при введенні НК приріст синтезованої о NAD* становить 64,8%.

Для крові кращим попередником біосинтезу NAD* є НК, оскільки високий рівень синтезованого NAD* (85,1 - 93,0 нмоль/г тканини) спостерігається протягом

4 гої.

Отже по інтенсивності синтезу NAD* з НАм тканини можна рої гашу вази » наступному порядку: печінка, кров, мозєч. В слизовій тонкої кишки стимуляція синтезу NAD* з НАм відсутня. При введенні НК цей ряд дещо змінюєіься, і має наступний вигляд: печінка, кров, слизова тонкої кі'шки, мозок. Отримані дані свідчать про вмраж-ну тканинну специфічність біосинтезу NADP' з нікотинової кислоти та нікотинамілу, однак ріиень NADP*, синтезованого з І ІАм, є вищим, ніж з ііК.

2. Особливості метаболічних процесів при експериментальному стрентозотоцнновому діабеті

Дефіцит інсуліну, який мас місце при цукровому діабеті І типу, зумовлюй пониження утилізації глюкози периферичними, інсулінчутливими тканинами. За цих умов значні метаболічні зміни відбуваються в тканині печінки.

Зростання рівня лактату, малату та зменшення концентрації пірувату, виявлене нами (табл.2.і), свідчать про гальмування гліколізу, що понижує утилізацію іліокози цією т.' шиною та активацію глюконеогенезу, яка веде до- посилення і інер1 тікемії. '

* Тек інця 2.1

Концетрація метаболітів в тканині печінки щурів при стрептозотоцниованому діабеті (мкмоль на Іг тканини, М±пт, п=10-12). ‘

Лактат Гііруват Малат ß-гідро- ксибутират Ацето- ацетат

Контроль 1,88±0,03 0,200±0,003 0,447*0,002 0,162±0,003 0,065*0,004

Діабет 3,7±0,І0* 0,МЗ±0,004* 0,6І2±0,0І* 1,970*0,09* 0,590±0,02*

* - вірогідність відмінностей даних у порівнянні з контролем (Р<0,05)

Переважання концентрації відновленого метаболіту нал окисленим t характерним і для ОБДГ-системи (табл. 2,1), хоча однонаправлемість змін обох інтермедіатів особливо відрізняє цю систему від інших і зумовлена значною активації;» розпаду ліпідів і кетогенезу прн діабеті.

Розрахунки значень співвідношення вільних NAD- та NADP-nap для різних компартментів гепатоцитів щурів при експериментальному діабеті демонструють зростання їх відновленості як в цитозолі так і в чітохондріях (рис. 2.1), Підвищення нідновленості NAD-nap власне с тим пусковим механізмом, що зумовлю« інгібування окислення і активацію синтезу de novo вуглеводів в пноконеогене <і Навіть невеликі зміни співвідношення NAD7 NADH зумовлюють напрям і ліцеральдегідфосфатдегідрогеназної реакції, де потік вуглецю швидко і ефективно переключається в напрямі гліколізу чи глюконеогенезу.

Гепатоцити належать до інсуліночутлиних клітин. Як прикла» шсуліноиечутливих клітин ми дослідили еритроцити та клітини мозку.

Власне з порушенням функціонування ерятроцктарноТ системи при цукровому ііабеті пов’язують розвиток ряду патологічних змін в', організмі, зокрема ііИМИКНЄННЯ гіпоксії. .

WOmCHlADO цитсллаама 1000.0

КЛСГ^СНіСШ) мгготонАР*

^СРМОТ-І<МДП

«00 1 8000 j

700.0 j

600.0 І

500.0 ’

400.0 і

:ооо І 2000 ;

100.0 ;

І ІІИ

Ії Si 5s sg

9.00

6.00

7.00 &00

6.00

4.00

3.00 200

і

Ні!

♦ ь

51

аі

Рис. 2.1 Співвідношення вільних МАОР*/7ЧАОРН, КАОТИАОН в цитозолі та мітохондріях печінки шурів.

Як інсулінчутливі клітини еритроцити є вільнопронихними для глюкози, навіть за умов дефіциту інсуліну. Зростання концентрації глюкози в еритроцитах посилює швидкість її утилізації. Результатом цього є зміни в концентрації метаболітів. Зростає вміст і лак і ату (від 1,73 до 5.1 мкмоль/г тканини), і пірувагу (від 0,168 н контролі до 1,231' мкмоль/г тканини при діабеті), проте з різною інтенсивністю. Внаслідок цього зменшується співвідношення вільних МАВ4/ ИАВН, що свідчить про зростання їх відновлюючих властивостей (від 874 в контролі до 408 при діабеті).

Аналогічні зміни мають місце і в тканині мозку. Інтенсифікація анаеробного типу гліколізу веде до зростання рівня лактату, однак на відміну від еритроцитів рівень пірувату знижується, очевидно За рахунок активації лактатдегідрогенази Внаслідок очевидного зниження активності малатдегідрогенази нами було виявлено зростання рівня магтгу (табл. 2.2).

Таблиця 2.2

Концентрації метаболітів в тканині мозку щурів (мкмоль на )г тканини, М±т,

п=10-І2).

Лактат Піруват Малат

Контроль 1,56±0,042 0,t58±0,005 0,327±0,035

Діабет 2,2±0,1* 0,П6±0,003* 0,4І5±0,012*

* - вірогідність відмінностей даних у порівнянні з контролем (Р<0,05) Відповідно до зміни стаціонарннх концентрацій метаболітів зменшується співвідношення вільних NAD’/ NADH та NADP7NADPH пар цитомлю (табл. 2.3).

' Таблиця 2.3

Співвідношення вільних NADP7NADPH, NADVNADH в цитозолі клітин мозку

щурів, п=І0-12.

Контрол- Діабет Діабет + НАг 500мг/кг маси Діабет + НАм 20мг/кг маси Діабет + НАм 200мг'кг маси

NAJ7NADH (ЛДГ) 912,5 475 710,4 670,6 799,5

NADPVNADPH (МДГ) 0,016 0,009 0,013 0,012 0,014

Порівнюючи ці два типи клітин: гепатоцити, з одного боку і еритроцити та клітини мозку, з другого, які характеризуються різною чутливістю до інсуліну та проникністю глюкози, ми продемонстрували індивідуальність метаболічних змін, і по мають місце в процесі розвитку діабету. Проте редокс-стан нікотннамідних коферментів змінювався для всіх тканин олнонапрзвлено. •

3. Кнсіісво-траііспо[. гна функцій крові при цукровому діабеті Наслідком тривалої гіпсрлікемії, що має місце при цукровому діабеті с зростання рівня глікозильоваиих білків, зокрема гемоглобіну (рис. 3.1), то поряд з інтими факторами посилює розвиток гіпоксії. Оскільки глікознлювання ісмоглобіну - це тривалий процес, ми вважали за доцільне проаналізувати вмісі ІІЬАк » різних популяціях еритроцитів. Як і передбачалося, найвищий ступінь гліконшювання гемоглобіну ми відзначили для популяції, представленої старими сриіроішіами, які тривалий час знаходяїься в руслі крові. Найнижчий рівень НЬАіг Гп н у ПОПУЛЯЦІЇ молодих еритроцитів

И

Нвфржиюжм »мі Ctipf «ркгрс-ftr« , Гяжоімлммі*ний

«рмтроцитм вль^уым •

Рис. 3.1 Вміст глікозильованих білків кропі: ігмоглооіну та альбуміну щурів.

Позначення: по осі ординат - %

Активація гліколізу в еритроцитах веде до посиленого утворення і нагромадження побічного продукту - 2,3-ДФГ, «кий е модулятором спорідненості гемоглобіну до кисню. Результати наших досліджень (рис. 3.2) свідчать про значне (на 49,5 %) зростання рівня 2,3-ДФГ в еритроцитах щуріа, що в свою чергу впливає на швидкість гліколізу, пригнічуючи активність ферментів, необхідних для синтезу 2,3-ДФГ з глюкози. .

вивчення киснево-транспортної функції гемоглобіну показало, що при цукровому діабеті в умовах збільшеної концентрації 2,3-ДФГ, спорідненість гемоглобіну ло кигню, інм не менше підвищується.

2.3 Д«Г

НМ (?0 Н&» (ЮО

мг/кг мг/кг

WACV4} **СИ)

Рис. 3.2 Вміст 2,3-днфосфогліцсрату в еритроцитах щурі» Позначення: по осі ординат - вміст метаболіту в ммоль/л

Виявлений ефект є результатом взаємодії двох модифікуючих структуру ісмопобіну факторів: підвищення спорідненості гемоглобіну до кисню при піікозилюванні та внаслідок дезамідування аспарагіну і глутаміну р-ланцюга НЬАп. і зменшення ного спорідненості прй зростанні концентрації 2,3-ДФГ. Саме процес і лікозилювапня, як процес незворотньої модифікації гемоглобіну, і визначає кінцеве зростання його спорідненості, виявлене нами. (рис. 3.3). Тобто має місце їсув кривої дисоціації вліво і зменшення Р50 від 3,19 кПа в контролі, до 2,27 кПа у йабетичних щурів. .

too

90 60 70 , 60 50 40 ЗО 20 10 0

рО ,кПа 2

100 90 , <7

60 / /

70 ' І / / /

60 if

50 - - ij

40 ifI

зо • //і і 1

20 ч .■/ її

*0 І // I jy |i

о *—*■* P

0 12 3 4

рО ,кПа 2

і’ііс. 3.3 Криві дисоціаи'Т оксигемоглобіну еритроцитів периферичної крові щурів при сіреііго'ююциіювому діабеті Контроль - ( Діабет

Рис. 4.1 Вплив нікотинаміду на криві дисоціації оксигемоглобіну еритроцитів периферичної крові шурів

Діабет - (---), Діабет+НАм - (—)

4. Кіконіттідні коферменті* в корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті

Для обгрунтування застосування НАм при діабеті було досліджено зміни концентрації мепболітів, окисно-відновною стану NAD - та NADP - пар при його введенні контрольним щурам.

Отримані д чіі свідчать, що посилення біосинтезу NAD веде до зростання пкнеленосгі вільних NAD - та NADP - пар, тісно спряженого зі змінами метаболізму н тканині печінки (зростає концентрація окислених і зменшується концентрація відновлених метаболітів дегідрогеназних систем!. 1

о

2 З

4

Слід зазначиш, шо кожна з дегідригеназних систем, які досліджувались (ЛД1 , МДГ, ОБДГ), індивідуально відповідали на введений НАм. Найбільш суттєвих змін зазнали концентрації інтермедіатів ЛДГ'-сиеіеми (рівень пірувату зріс на 30,5 %, і мінімальні значення лактату становили 62,8 % від контрольних всшічин).

Менш вираженими були "\ііни в МДГ-системі. Зменшення рівня малпу складало 20 %. .

Особливість ОЬДГ-снсї еми проявилась в одноиаправленій зміні метаболітів, хоча загальна тенденція (переважання окислених метаболітів н;п відновленими) зберігалася. В загальному рівень [ї-іілроксибумірату в світі мінімальній точці становив 67,9 % контрольної величини, а ацетоацетату-77 %.

Суттєве значення як в теоретичному, так і в прикладному аспекті маг виявлений нами гіпоглікемічний ефект нікотинаміду. Отримані дані свідчать, що НАм в дозі 500 мг/кг маси викликає значне (на 50%) але короткотривале (2 іод. експерименту) зменшення рівня глюкози, що може буї і: пояснене інтенсивним викидом інсуліну, стим; тьованим високими дозами нікотиі,аміду та сутн ьою активацією окислення глюкози в тканині,

Оскільки при цукровому діабеті окисно-відновний стан NAD(P) - пар суп то знижується, ми вважали доцільним застосування нікотинаміду як факюра цілеспрямованого посилення біосинтезу НАм - коферменті в та підвищення окисно-відновного стану вільних NAD(P) - пар. Дані проведених експериментів повнії по під і сердили висловлені припущення. . .

Нікотинамід викликав підвищення співвідношення вільних NAD*/ NADU т.-.і NADPVNADPH цитоплазми і мітохондрій у всіх тканинах в залежності від введено;' дози (рис. 2.1, табл. 2.2). Результатом такого впливу с. гальмування глюкон«иен^у в гепатоцитах та посилення окислення глюкози, що відображається мі концентраціях метаболітів дегідрогеназних систем (таб. 4.1).

. Таблтш 4.1

Вплив нікотинаміду (двотижневе введення) на вміст метаболітів вткбнині печінгті щурів прн етрептозотоциновому діабеті (мкмоль/г тканини Мііп п=8-Ї0>

Діабет Діабет+НАм(20мг/кг) Діабет ЖАм(200м

Лактат ' 3,7-0,10 2,8±0,3* 2,2і0,2*

Піруват 0,143±0,004 0,189±0,009* 0,196±0,01 *

Малат 0,612±0,008 0,552±0,012* 0,494±0,01*

Р-гідроксибутират 1,970±0,09 0.45ІА0.015* 0,341*0,008*

Ацетоацетат 0,590±0,02 0,165*0,005* 0.135±0,007*

* - вірогідність відмінностей даних у порівнянні з діабетом (Р<0,05)

Аналогічні зміни мають місце і в тканині мозку (табд. 4.2 ).

Таблиця 4.2

Вплив нікотннаміду на вміст метаболітів в тканині мозку щурів з експериментальним діабетом (мкмоль/г тканини М ± ш, п=8-10)

Лактат Піруват Малат

Діабет 2,20 ± 0,16 0,116 ± 0,003 0,415 ± 0,008

Одноразове введених НАм

Діабет + НАм (500 мг/кг масі.) 1,75 ± 0,08* 0,138 ± 0,002* 0,354 ± 0,006*

Довготривале введення НАм

Діаоет + НАм (20 мг/кг маси) 1,83 ± 0,09 0,134± 0,005* 0,365 ± 0,005*

Діабет + НАм (200 мг/кг маси) і.бі^ 12* 0,146 ± 0,007* 0,341 ± 0,007*

* - вірогідність відмінностей даних у порівнянні з діабетом (Р<0,05)

Двотижневе введення НДм в дозі 20 та 200 мг на кг маси приводило до змін концентрацій метаболітів ЛДГ'-сисими еритроцитів в зале жності від введеної дози: рівень Лсіктату становив - 3,6 мкмоль на г тканини, та 2,5 мкмоль на г тканини при введені 20 і 200 мг на кг маси відповідно; рівень пірувату становив - 0,205 та 0,187 мкмоль на 1 г тканини відповідно.

Суттєве значення має виявлений нами гіпоглікемічний ефект НАм при цукровому діабеті. Показано, що в основі механізму зниження рівня глюкози крові при експериментальному діабеті лежить зміна стаціонарних концентрацій метаболітів і окисно-відновного стану NAD-riap, викликана введенням НАм

. В основі корегуючої дії НАм може лежаш і його інгібуючий ефект на нолі-АДР-рибозо-синтетазу (полімеразу), в результаті чого суттєво знижується никористання NAD* на синтез годі-АДР-рибози, що маг позитивний вплив на функціональний стан р-клітин.

Нормалізуючий в їлив високих та терапевтичних доз НАм продемонстровано еюсовно кненево-транеп »ртиої функції крові. Зменшенім рівня глікозильопаного гемоглобіну в к; ові іабетичних тварин (рис. 3.1) веде до зсуву кривої дисоціації вправо, збільшення Р50 (рис. 4.1), шо свідчить про зменшення спорідненості НЬ до О; і полегшення віддачі кисню в тканини. Крім того нами ішгвлено зменшення

концентрації 2,3-ДФГ (рис. 3.2), як наслідок зміни шіутрішіїьоеритрошпаріюго pH, спряженого і дезоксигенаціею НЬ і зсувом кислотно-основної рівноваги крові.

Сумуючи результати проведених експериментів, вважаємо, то нікотинамід як гіпоглікемічний фактор і попередник НАм-коферментів, є перспективним засобом корекції метаболічних змін та попередження розвитку ускладнень цукрового діабету.

1ШСІІОІЖИ.

1. Обгрунтована роль нікотинамідиих кофермеїггів в корекції порушень киснево-транспортної системи крові та внутрішньоклітинного метаболізму при експериментальному стрептозотошінивому діабеті.

2. Встановлена чітко виражена тканинна специфічність інтенсивності і динаміки біосингезу нікотинамідних коферментів з різних попередників. Для тканини печінки і мозку кращим попередником є нікотинамід, для крові і слизової тонкого кишківника - нікотинова кислота.

3. Інтенсифікація біосинтезу NAD* га зростання окисно-відновного стану

нікотинамідних коферментів при введенні НАм зумовлюють зміну концентрації іитермедіаіів (зростаг вміст окислених та зменшується вміст відновлених метаболітів) ряду дегідрогенаїних систем: лактатдегідрогеназної,

малатдегідрогеиазної та окенбутиратдегідрогеназної.

4. Порівняння двох типів клітин, які характеризуються різною чутливістю до інсуліну і проникністю глюкози, свідчать Про інливідухіьність змін метаболізму в процесі розвитку діабетичної патології. В гепатоцитах, внаслідок обмеженого проникнення глюкози, гальмується її окислення та активується її біосинтез -глюкогенез та інтенсифікується ліноліз. В еритроцитах і тканині мозку відбувається активація ферментів гліколізу та посилення окислення глюкози.

5. При цукровому діабеті зростаг вміст глікозильованого гемоглобіну, що підвищує спорідненість НЬ до Ог, навіть за умови чростаючого вмісту 2,3-ДФГ.

6. Введення НАм в фізіологічних та високих дозах має чітко виражений гіпоглікемічний та корегуючий вплив иа обмінні процеси в тканинах щурів:

- Зростає окисно-відновний стан NAD(P)-nap як наслідок змін концентрацій окислених і відновлених метаболітів дегідрогеназних систем.

- Зменшення кількості глікозильованого гемоглобіну і 2,3-ДФГ веде до нормалізації киснево-транспортної функції крові і збільшення !’50.

С IlliCOlí ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

І Великим 1.1.11, Бурлу H.A.. Обросопа И.Г., Бироиг Н.В., Федык М.Я. Коррсі ируюшый іффскт ішкотшіамнда на процессы тликозирования іемоглобина (іри сірептоюііьіііопом диабете у крыс, // Вогір. мед. химии. -1995.-

1.41 ,№і- С.36-38. ..

2. Федик М.Я., Великим М.М., Забабуріна М.Л., Оліярник О.Д. Динаміка біосинтезу нікоіішамілних коферменіів ч нікотинової кислоти та нікотинаміду у тканинах щурів. Н Укр. біохім. журнал - 1996, №2.-С.29-33.

3. Великий М.М.. Обросова І.Г., Фсдик М.Я., Бурда В.Ф., Гурська Н.І. Регуляція клітинного метаболізму нікоімііамідмимм коферментами при річних типах ексгіерименіалміот ліабеїу. // Вісник Львівського університету. Механізми біол. дії іонізуючої радіації та ексіремальних факторів. - 1992. - і.22. С.82-95.

4. гІ>елпк М.Я., Забабуріиа : M.JI. Тканинна специфічність біосинтечу

нікотинаміддинуклеотиду із нікотинаміду та нікотинової кислоти у щурів. // Вісник Львівського університету. Механізми біол. дії радіації та інших екстремальних факторів навколишнього середовища. -1994,- т.23, С.99-103.

5. Бурда В.Ф., Великий M.M., Обросова І.Г.. Фелик М.Я., Дудок К.П, Вилив нікотинаміду на процеси глікозилювання гемоглобіну при стреиточогоциновому діабеті. // Вісник Львівського університету. Механізми біол. дії радіації та інших екстремалі,них факюрів навколишнього середовища. -1994.- т.23. С.104-110.

6. Великий Н і 1. Фсдык М.Я. Тканевая специфичность биосинтеза никотинамидныч коферментоп. И Течйсы докл. Всесоюзном конференции “Клиническая витамино.ютия”.-Москва.-1991 .-С.41.

7. Бурда В.Ф., Великий М.М., Сибірна И.О., Феди к М.Я., Обросова І.Г. Структурно-функціоиальниіі стан ернтрону при цукровому діабеті. // Матеріали 1 Українського біохімічного з’їзду.-Кнїв.-1992.-С.І14

R. Fedyk M.Y., Oliyarnyk O.D., Mahnevych T.R. Effect of nicotinamide on hemoglobine glycosylation and antioxidant defensive enzymes in erythrocytes of streptozotocin diabetic rats. // 4,t' International Student's Sei. Conf. - Gdansk (Poland). - 1996. - P.S.

9. Великий H.H., Бурда O.A., Федык М.Я., Выгнан Г.Л. Использование ннконшамнда в коррекции процессов шикозилирования белков при диабете // Тезисы конф."Патогенез, клиника и фармакотерапия чидокринопатий",-Харьков.-І995.-С.7-8.

10.Великий М.М., Федик М.Я., Козпцькнн З.Я., Махнсвич Т.Р. Дослідження участі нікотинаміду в корекції метаболічних порушень при експериментальному етреиточотоциновому діабеті у шурів. // Тезисы доклада конф. “Международные чим дилбе та".-Днепропетровск,-1997, вып.2.-C.37-3 8,

ІІ.Федик М. Я., Курда В. А., Махневич Т. 1*., Великий О. М. Роль процесів глікозидюнання н киснево-транснортніГі функції кроні при цукровому діабеїі Вплив нікоіинаміду.// Матеріали VII Українського біохімічного і”їіду. - Київ. -1997,4. III.- C. 162-163.

АНОТАЦІЯ

ФЕДИК М.Я. 11 іконі ми мідні коферменті! в корекції метаболічних порушень мри експериментальному сгрептожгоциновому діабеті у шурін.-Руконне. . . -

Дисертація на здобу пя наукового ступеня канлидіна біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія.- Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна ПАН України, Київ, 1098.

Дисертацію присвячено питаниям корегуючої дії нікогинамідних кофермент при інсулііпалежному діабеті. D дисертації викладено теоретичне та експериментальне обгрунтування ролі ніконшамідних коферменііп в реіуляшї внутрішньоклітинного метаболізму в нормі та при патології.

Встановлено існування чітко вираженої тканинної специфічності іа особливостей біосинтезу МАм-коферментів з двох основних попередників: нікотннаміду та нікотинової кислоти. Продемонстровано пріоритеїнісіь глікозилювання гемоглобіну в порівнянні і модифікуючою дією 2.3ДФГ в ¡міні киснево-транспортної функції крові при цукровому діабеті. Показана залежнісіь корегуючої дії.НАм від лози та тривалості введення.

Результати праці лають змогу зробити висновок про доиідьіпеїь використання нікотннаміду в комплексній терапії з метою корекції метаболічних порушень для попередження ускладнень при цукровому діабеїі.

Ключові слова: нікопінамід, меіаболічні порушення, інсу тіїишіежниіі діабет, шкотинамідні кофермент, глікозильоїтнин гемоглобін.

АННОТАЦИЯ

ФК.ДЬІК М.Я. Ник'пііінамиднме кпфермени.і в коррекции метаболических, нарушении при іксперпмеигйльном стренннотоцимовом диабете у.крыс,- Рукопись. .

Диссеріация на соискание ученой счепени кандидата биологических наук но специальности 03.00.04 - биохимия.- Институт биохимии им.А.В.Палладнна ИЛИ Украины, Киев, 1998. •

Диссертация посвящена вопросам коррегируюшего действия никотинамидных коферментов при инсулинзависимом диабеїе. В дпссеріанни изложено теоретическое II экспериментальное обоснование роли никошнамилн.мч коферменюв в регуляции внутриклеточного метаболизма и норме и при и,по юі им

Установлено существование четко выраженной тканевой специфичности и особенностей биосинтеза НАм-коферментов из двух основных предшественников: ннкотшшмпда и никотиновой кислоты. Продемонстрирована приоритетность пшко нитрования гемоглобина но сравнению с модифицирующим действием 2,3 ДФГ » изменении кислород-транспортной функции крови при сахарном диабете. Покачана зависимость корригирующего действия НАм от поты и длительности введении.

Результаты работы дают возможность сделать вывод о целесообразности использования ннкопшамида в комплексной терапии с целью коррекции метаболических нарушений и профилактики осложнений при сахарном диабете.

Ключеныс с.нша: Никотинпмид, метаболические нарушения,

мпсулшпаннснмый диабет, ннкотинамидные коферменты, гликозилированый гемоглобин.

SUMMARY

FEDYK М. Nicotinamide соси/vines in correction of the metabolic disturbances (luring tbc experimental diabetes mellitus in ruts. - Manuscript

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality

03.00.04 - biochemistry.- A.V. Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998. .

The thesis is devoted to the questions of the corrective action of the nicotinamide coenzymes during the insulin dependent diabetes. Theoretical and experimental grounding of the role of the nicotinamide coenzymes in the regulation of the intracellular metabolism in norm and in pathology is presented in the paper.

The existence of distinctly expressed tissue specifics and the peculiarities of biosynthesis of NAm coenzymes from the two main precursors: nicotinamide and nicotine acid was clearly established. The priority of the hemoglobin glicosylation in comparison to the modification activity of 2,3DI:G in change of oxygen-transport function of blood during diabetes mellitus was demonstrated’ The dependence of the correcting activity of NAm clud dose and duration of application was shown. . "

The results of the paper give an opportunity to make a conclusion about the appropriateness of usage of nicotinamide m complex therapy with the purpose of correction of metabolic transgressions and proph) brtics of complications during the diabetes mellitus. ’

Key words: nicotinamide, metabolic transgressions, insutin-dependant diabetes, nicotinamide coenzymes, glicosylation hemoglobin.

ПІдпясано до друку 16.03.98. Форинт 60х84Д6. Папір друн.И.. Друк офсотн. Уиовн.друк.арк. І,*. Обл.-вил.ерк. 1,4. Уиова.фарб.відб. 1,5. їярая 100. Заи, 35.

Іізгаянно-офсвша лабораторія Львівського двржуяїверсрг« і їй. Івана Фрянка. 290602 і..Львів, вул.Університетська, •