Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нестин в клетках головного мозга крыс (иммуногистохимическое исследование)

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Нестин в клетках головного мозга крыс (иммуногистохимическое исследование)"

На правах рукописи

ГИЛЯРОВ Александр Владимирович

НЕСТИН В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2008

003459260

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

Отеллин

Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Валькович Эрнест Иванович

Пузырев

Андрей Анатольевич

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Защита состоится « ¿Г» января 2009 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова 12, тел: (812) 234-6868, факс: (812)234-9489, e-mail: iem@iem.spb.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан «-¿Г>> 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

П. А. Дыбан.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитоскелет принимает непосредственное участие во всех внутриклеточных процессах. Одним из важнейших компонентов цитоскелета являются промежуточные фила-менты (ПФ). Они создают внутриклеточный каркас, обеспечивают упругость клетки, поддерживают упорядоченность расположения компонентов цитоплазмы, координируют связи между внеклеточным матриксом, цитоплазмой и ядром [Улумбеков, Челышев, 2007]. Несмотря на обширный литературный материал [Herrmann, Aebi, 2000, 2004; Strelkov et al., 2003; Goldman et al., 2008 и др.], посвященный ПФ, остается много нерешенных вопросов. В настоящее время известно более 50 белков промежуточных филаментов, которые разделяют на шесть классов, основываясь на сходстве в их аминокислотной последовательности [Cooper, 1997; Lendahl et al., 1990]. Одним из самых загадочных и малоизученных белков ПФ является нестин.

В настоящее время на нестин возлагаются большие надежды как на иммуноморфологический маркер нейральных стволовых/ про-гениторных клеток (НСПК). Для исследования стволовых клеток требуется наличие специфических маркеров, выявление которых необходимо не только для более глубокого понимания нейрогенеза, но и может быть полезным для разработки подходов к лечению различных заболеваний и состояний центральной нервной системы (ЦНС). До настоящего времени не существует маркеров, которые были бы специфичны для НСПК. На роль такого маркера претендует нестин. Однако противоречивые данные разных авторов не дают возможности однозначно считать нестин маркером НСПК.

Нестин был открыт в 1985 г. [Hockfield, McKay, 1985]. Ген нестинабыл охарактеризован в 1990 г. [Lendahl et al., 1990].

Известно, что нестин активно экспрессируется в клетках головного мозга млекопитающих в эмбриональный период онтогенеза [Hockfield, McKay, 1985; Dahlstrand et al., 1995]. В мозге взрослых животных нестин, напортив, почти не обнаруживается. Показано, что по мере дифференцировки нервной ткани синтез нестина подавляется [Zimmerman et al., 1994; Lothian, Lendahl, 1997], а в дифференцирующихся астроцитах и нейронах начинают экспрессироваться глиаль-ный фибриллярный кислый белок (GFAP) и белки нейрофиламентов, соответственно. Важно отметить, что при этом недостаточно разработанными остались вопросы о том, когда и в каких клетках происходит

смена ПФ. Изучению экспрессии нестина в раннем постнатальном периоде онтогенеза посвящено малое количество работ [Wie et. al., 2002]. Между тем, ранний постнатальный период является очень важным этапом онтогенеза - в этот период происходит адаптация к условиям внеутробной жизни. В головном мозге млекопитающих в этот период происходит ряд процессов (пролиферация, дифференци-ровка, миграция и др.), обуславливающих окончательное созревание нервной системы. У человека он длится 28 дней после рождения, у крыс - 14 дней.

В ЦНС взрослых млекопитающих нестин в норме обнаруживается только в небольшом количестве клеток в субвентрикулярной зоне боковых желудочков (SVZ) и зубчатой фасции (FD) гиппокампа [Cameron, McKay, 2001; Fukuda et al., 2003; Ernst, Christie, 2005; Ogita et al., 2005; Zecevic et al., 2005]. Однако при ряде патологических состояний наблюдается повышение экспрессии нестина. Одним из таких состояний является ишемия головного мозга. Ишемия — одно из наиболее распространенных и тяжелых поражений центральной нервной системы, характеризующихся острым развитием очаговой и общемозговой неврологической симптоматики. Появление нестина после ишемии ассоциируют с нейральными стволовыми клетками, предполагая, что при этом происходит замена погибших клеток новообразованными [Sharp et al., 2002; Не et al., 2005]. Тем не менее, на настоящее время в литературе нет однозначных данных, подтверждающих эту гипотезу.

Таким образом, изучение нестина актуально и имеет не только фундаментальное, но практическое значение.

Цель исследования: изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга крыс на отдельных этапах онтогенеза и после ишеми-ческого воздействия с помощью одного из наиболее совершенных методов - иммуногистохимии. В соответствие с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение пространственно-временного распределения клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза.

2. Характеристика нестин-иммунопозитивных клеток у взрослых интактных животных.

3. Определение морфологических типов и локализации нестин-иммунопозитивных клеток после ишемического повреждения ЦНС.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые показаны изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза. Продемонстрирована зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период.

Теоретическое и практическое значение исследования. Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований в области нейрогистологии. Полученные данные наглядно демонстрируют, что использование нестина как маркера нейральных стволовых клеток in situ возможно только при соблюдении ряда условий: обязательный учет морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетание методов световой и конфокальной микроскопии, использование других маркеров. Нестин не следует считать специфическим маркером нейральных стволовых клеток. Полученные данные могут быть использованы как при проведении научных экспериментов с применением иммуногистохимических методов, так и в качестве учебных материалов в курсах по нейроморфологии и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В пределах мозга существуют региональные различия в экспрессии нестина. Нестин-иммунопозитивные клетки в коре головного мозга и в гиппокампе выявляются на разных стадиях развития нервной ткани.

2. Транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах.

3. Нестин не является специфическим маркером нейральных стволовых/прогениторных клеток. Использование нестина, как маркера НСПК, возможно только с учетом морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на: XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологи (Санкт-Петербург, 2006), V Международной конференции по функциональной нейроморфологии

«Колосовские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, 2006), VIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), межинститутской конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург,

2007), IX конгрессе Международной ассоциации морфологов (Бухара,

2008), IV Международном междисциплинарном конгрессе «Нейро-наука для медицины и психологии» (Судак, 2008).

Диссертация апробирована на заседании отдела общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (25.09.2008).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 с. машинописного текста, содержит введение, четыре главы, основные выводы, 5 таблиц, 63 рисунка и 4 схемы. Список литературы включает 149 источников, из них 21 отечественных и 128 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Настоящая работа выполнена на 80 белых лабораторных крысах (Rattus norvegicus). Для исследования экспрессия нестина в ранний постнатальный период онтогенеза материалом служил головной мозг 34 крыс линии Вистар на 1 (п=5), 5 (п=7), 10 (п=8) и 14 (п=14) дни после рождения. В экспериментах с ишемией использовался головной мозг 37 половозрелых беспородных крыс-самцов на различных сроках после ишемии: 1 неделя (п=14), 2 недели (п=12) и 1 месяц (n=l 1).

В качестве контроля использовалось 9 половозрелых беспородных крыс, которые были разделены на две группы. Группа 1 (п=3) -половозрелые интактные животные. Группа 2 (п=6) — половозрелые ложнооперированные крысы (без пережатия сосудов).

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для изучения нестина в клетках ЦНС после ее поражения была выбрана упрощенная 2-х сосудистая модель общей ишемии головного мозга. Эта модель была разработана в Eklof и Siesjo в 1972 году [Eklof and Siesjo, 1972], и заключается во временном пережатии на 40 минут обеих общих сонных артерий и последующей реперфузией.

Для окраски срезов использовали гематоксилин, астровый синий и метод Ниссля.

Для выявления белков ПФ, маркеров пролиферации и типоспеци-фических маркеров разных клеток применялся метод иммуногистохи-мии. Использовались первичные антитела к нестину (клон Rat-401, BD Pharmingen, США), маркеру астроцитов - глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP, поликлональные, Dako, США), белку ПФ, с которым нестин образует гетерополимеры - виментину (клон V9, Immunon, США), маркеру зрелых нейронов антигену NeuN (клон А60, Chemicon, США), маркеру пролиферирующих клеток антигену PCNA (клон PC-10, Dako, США). Для выявления первичных антител были использованы 1 или 2-х ступенчатый (авидин-биотиновый) методы. Для визуализации пероксидазы использовали хромоген DAB+ (Dako. США).

Конфокальная микроскопия в настоящем исследовании использовалась для трехмерной реконструкции некоторых клеток с целью проследить ход их отростков, а также для изучения колокализации двух антигенов в пределах одной клетки. Исследования проводили на конфокальном лазерном микроскопе LSM5 Pascal и Leica TCS SPE.

Фотографирование осуществлялось с помощью светового микроскопа Leica DM 1000 и цифровой камеры DFC280 (Leica) и конфокальных микроскопов.

Для полуколичественной оценки выраженности иммуногистохи-мической реакции использовали относительную шкалу интенсивности иммунной реакции [Wie et al., 2002]. Реакцию определяли как высоко интенсивную (+++), средней интенсивности (++), низкой интенсивности (+), отрицательную (-).

Измерения и подсчет клеток производились с помощью прилагающегося программного обеспечения Leica Application Suite

и программы Image J 1.38. Часть изображений обрабатывалась в графическом редакторе Adobe Photoshop CS2 version 9.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Экспрессия нестина в конечном мозге крыс в ранний постнатальный период онтогенеза

Первый день постнаталъного развития

На первый день постнатального развития (PI) нестин-иммунопозитивные (нестин+) клетки обнаруживаются в различных областях головного мозга. В двигательной коре больших полушарий располагаются нестин+ биполярные клетки с радиально направленными маловетвящимися отростками, клетки, в которых видны фигуры митоза, а также мигрирующие нестин+ клетки (клетки с "локомоторной" [по Borreil et al., 2006] морфологией: короткий лидирующий отросток, оканчивающимся структурой подобной конусу роста). Большое скопление нестин+ клеток имеется в SVZ боковых желудочков мозга (рис. 1а). В SVZ реакцию на нестин дают клетки обоих ее слоев: эпендимного и субэпендимного (SubE). От эпендимоцитов отходят длинные отростки, направляющиеся в белое вещество. В SubE располагаются нестин+ радиальные глиоциты, пролиферирующие и мигрирующие клетки. Другой формацией мозга, где наблюдается выраженная реакция на нестин, является гиппокамп (рис. 2а). Во всех слоях гиппокампа, кроме str. pyramidale, выявляются делящиеся не-стин+ клетки и отростчатые нестин+ клетки со сложным ветвлением. В sir. pyramidale обнаруживаются лишь радиально направленные отростки и тела биполярных клеток. В области формирующейся зубчатой фасции встречаются единичные нестин+ клетки округлой и звездчатой формы.

Виментин на PI выявляется в тех же областях, что и нестин. В двигательной коре обнаруживаются округлые, мигрирующие и звездчатые виментин-иммунопозитивные (виментин+) клетки и волокна, переходящие в белое вещество. Схожесть размеров и направления волокон, содержащих виментин, с волокнами, содержащими нестин, позволяет сделать предположение, что промежуточные филаменты в этих волокнах состоят из виментин-нестиновых ге-терополимеров. В SVZ боковых желудочков мозга окрашиваются эпендимоциты и клетки SubE, имеющие длинные маловетвящиеся радиально направленные отростки (рис. 16). BSVZHa3TOM сроке

иммунная реакция на виментин наиболее выраженная (табл. 1). В гиппокампе, напротив, определяются только единичные клетки с небольшим количеством отростков (рис. 26).

Таблица 1

Выраженность иммуногистохимической реакции на нестин, виментин и вРАР на различных сроках раннего постнаталыюго периода онтогенеза

Субвентрикулярная зона Гиппокамп Неокортекс

Нестин +++ +++ ++

Р1 Виментин +++ ++ ++

ОРАР + +/- -

Нестин +++ +++ ++

Р5 Виментин вРАР ++ + ++ + +

Нестин ++ ++ +

Р10 Виментин + + -

йРАР ++ ++ +

Нестин + + -

Р14 Виментин + +/- -

вРАР ++ ++ +

На сроке Р1 реакция на вРАР выражена слабо. Встречаются немногочисленные ОРАР-иммунопозитивные (вРАР+) клетки в 8У2 (рис. 1в). Единичные вРАР+ клетки также можно увидеть в ¿¡г. то1еси1аге гиппокампа (рис. 2в). В других областях мозга ОРАР не выявляется.

Пятый день постнатальногоразвития

На 5-й день постнатального развития (Р5) в двигательной коре головного мозга можно увидеть большое количество нестин+ клеток с радиально направленными отростками, а также безотростчатых клеток на различных стадиях митоза. По-прежнему интенсивная реакция на нестин выявляется в SVZ боковых желудочков мозга (рис. 1г): нестин4" эпендимоциты с длинными отростками, радиально расходящимися от желудочков вглубь мозга и клетки в БиЬЕ. Выраженная им-муногистохимическая реакция имеет место в гиппокампе (рис. 2г), где определяются множественные клетки с большим количеством

обильно ветвящихся отростков. Встречаются нестин+ делящиеся клетки. В str. pyramidale, кроме радиальных отростков, в отличие от PI, наблюдаются нестин+ клетки округлой и звездчатой формы.

На Р5 общая интенсивность иммуногистохимической реакции на виментин снижается (табл. 1). В двигательной коре головного мозга обнаруживается небольшое количество тонких волокон и редкие виментин+ клетки. По всей вероятности это сохраняющиеся нестин-виментин-иммунопозитивные волокна радиальных глиоцитов или же отростки мигрирующих нейробластов. В SVZ боковых желудочков мозга при выявлении виментина окрашивается вся эпендима и большинство клеток SubE (рис. 1д). По-прежнему сохраняется множество виментин+ клеток в SVZ, имеющих радиально направленные отростки. В гиппокампе относительно предыдущего срока выявляется больше виментин+ клеток с обильноветвящимися отростками. В str pyramidale обнаруживались лишь единичные волокна и редкие виментин+ клетки (рис. 2д).

К Р5 в двигательной коре головного мозге появляются первые аст-роцито-подобные, а также похожие на мигрирующие клетки, дающие положительную реакцию на GFAP. В SVZ боковых желудочков GFAP+-клетки локализуются преимущественно в латеральной части (рис. 1е). Здесь кроме мигрирующих клеток и части эпендимоцитов GFAP выявляется в отдельных радиально направленных отростках. В гиппокампе GFAP+ клетки по сравнению с предыдущим сроком представлены более широко: появляются единичные звездчатые клетки в области гиппокам-пальной фиссуры (рис. 2е). Большинство эпендимоцитов III желудочка GFAP-иммунопозитивны. Также GFAP появляется в SubE в клетках, образующих периваскулярные отростки. В других областях головного мозге GFAP не обнаруживается.

Таким образом, на сроках PI и Р5 в двигательной коре полушарий головного мозга и SVZ сохраняются нестин и виментин иммуно-позитивные клетки, которые являются либо радиальными глиоцита-ми, либо радиально мигрирующими из SVZ клетками с "локомоторной" морфологией, часть из которых на сроке Р5 начинает экспресси-ровать GFAP. А к моменту окончательного формирования гиппокам-па (Р5) выраженность иммунной реакции на нестин и виментин максимальна; появляются первые GFAP-иммунопозитивные астроциты.

Десятый день постнатальпого развития

На PIO наблюдается общее снижение интенсивности иммуногисто-химической реакции на нестин (табл. 1). В двигательной коре головного мозге выявляются тонкие нестин+ волокна с бусовидными утолщениями. В SVZ боковых желудочков реакцию на нестин дают некоторые эпен-димоциты и часть клеток SubE (рис. 1ж). В гиппокампе основная масса нестин4 клеток располагается в str. oriens и str. radiatum зоны CAI и str. moleculare и hilus FD (рис. 2ж).

Иммуногистохимическая реакция на виментин, как и нестин, на этом сроке Р10 становится менее распространенной. В двигательной коре головного мозга виментин+ клетки практически не выявляются - только тонкие бусовидные волокна. Сохраняется иммунореактивность эпендимы боковых и III желудочков (рис. 1з). В SubE виментин не выявляется. В гиппокампе определяются отдельные звездчатые клетки и большое количество их отростков срезанных поперечно (рис. 2з).

На Р10 реакция на GFAP становится интенсивнее по сравнению с предыдущими сроками (табл. 1). Выявляется большое количество мигрирующих и звездчатых клеток в белом веществе. Окрашиваются некоторые эпендимоциты и часть клеток SubE (рис. 1и). В гиппокампе (рис. 2и), как и на Р5, GFAP+ клетки представлены редкими отросчатыми клетками, расположенными преимущественно str. moleculare гиппокампа.

Четырнадцатый день постнатальпого развития

На 14-й день постнатального развития (PI 4) интенсивность иммунной реакции на нестин еще больше уменьшается относительно предыдущего изучаемого срока. В двигательной коре головного мозга можно проследить редкие тонкие радиально направленные отростки; встречаются и единичные звездчатые нестин+ клетки. В эпендимоцитах (рис. 1 к) уже не определяются длинные отростки, направленные к поверхности коры больших полушарий. В SubE иногда можно видеть округлые нестин4 клетки и клетки с короткими отростками. В гиппокампе (рис. 2к), как и на предыдущих сроках, нестин4 клетки располагались во всех слоях кроме str. pyramidale, однако наибольшее их количество располагается в области FD. В большинстве своем это отростчатые клетки, напоминающие по форме астроциты.

К Р14 выраженность иммуногистохимической реакции на виментин также значительно уменьшается (табл. 1). Виментин выявляется

только в эпендимоцитах и клетках, SubE прилегающих к эпендиме (рис. 1л). Кроме того, в гиппокампе преимущественно в области зубчатой фасции можно увидеть звездчатые виментин+ клетки с большим количеством отростков (рис. 2л).

На Р14 наблюдаются типичные GFAP+ астроциты в области соответствующей переднему миграционному пути, stria terminalis и во всех слоях гиппокампа (кроме str. pyramidale) (рис. 2м). В SVZ окрашиваются цитоплазма эпендимной глии и разнонаправленные отростки клеток SubE (рис. 1м). Четко определяются периваскулярные отростки астроцитов.

На всех изученных сроках раннего постнатального периода онтогенеза нестин выявлялся в клетках, образующих стенку капилляров мозга.

Учитывая данные J. Dahlstrand [Dahlstrand et al., 1995] о связи экспрессии нестина с митотической активностью клеток следует заключить, что сразу после рождения такие области головного мозга как двигательная кора больших полушарий, гиппокамп и SVZ боковых желудочков еще не сформированы и там продолжаются такие процессы как пролиферация, миграция и дифференцировка. Другие области головного мозга к этому периоду уже сформированы, поэтому там нестин и не выявляется. Таким образом, полученные нами данные показывают, что проградиентное снижение синтеза нестина в ранний постнатальный период онтогенеза (Р1-Р14) связанно со степенью зрелости структур мозга.

Кроме того, на основании полученных нами данных можно сделать вывод, что существующая связь между экспрессией нестина и нейроногенезом различна в различных формациях мозга. Так в двигательной коре головного мозга нестин+/виментин+/ОРАР" клетки (предположительно нейробласты) выявляются на этапе формирования коры, а затем исчезают, а гиппокампе, напротив, нести н+/виментин+/ОРАР" клетки (предположительно глиобласты) появляются на этапе глиогенеза, когда нейронные слои уже сформированы.

Нестан Виментин GFAP

Рис. 1. Субвентрикулярная зона боковых желудочков мозга крысы. Pl, Р5, PIO, Р14 — дни постнатального онтогенеза. Иммуногисто-химическая реакция на нестин (а, г, ж, к); виментин (б, д, з, л); GFAP (в, е, и, м) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок — 50 мкм.

Нести н

Виментин

GFAP

•cAf; • ?с ал»

pi Л- ,

11.

1 • Л ' ' . '.i1.-.- ' •< V •

а ■

»ш

v ■ й £

Р5

, ! f ■ ,........ • '<

i:,4v ...„'Яг

-V «if-1 -" -.''Xi'>:;;

■VVí • '•"• <.

iri-V-^--л v> FD'-..

т^т-'ШШё ■- B

. 1 " '-i ■■ ' , *' " ,' ' , * .'■

r 'И /caí 4 : ■ ■ CA1 :■ \

se;'., ,o ■ : ■'••• i' <

P10

ÜS •: Л V- • i .

: л ' Г

•.'• Л'-• ''с*-',' • ' ;

i. ¿ • - я>

. 4 " "-ÍV' "V А-

....N-Л*. 'íí. .-»Y«!-

Ш шШш

P14 l ■

Рис. 2. Гиппокамп крысы. Pl, P5, PIO, P14 — дни постнатального онтогенеза. Условные обозначения: CAI — зона гиппокампа CAI, FD — зубчатая фасция. Иммуногистохимическая реакция на нестин (а, г, ж, к); виментин (б, д, з, л); GFAP (в, е, и, м) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок 50 мкм.

Рис. 3. Участки конечного мозга крыс в контроле (а) и через 2 недели после транзиторной общей ишемии (б-л). Изменения в гиппокамне (б, в, е, и), двигательной коре (г, ж, к) и субвентрикулярной зоне боковых желудочков (д, з, л). Стрелками обозначено изчезновение пирамидных нейронов CAI зоны гиппокампа. Окраска: толуидиновый синий по Нисслю (а, б), иммуногистохимическая реакция на нестин (в, г, д), виментин (е, ж, з) и GFAP (и, к, л) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок: а, б, г, е, и, к — 200 мкм, ж, з, л — 100 мкм, в, д — 20 мкм.

7

V V

§

л «у

ч

Ч

Г ,

V • /у*

Рис. 4. Колокализация нестина с ОРАР. Зеленый сигнал — нестин (фуоресцеина изотиоцианат), красный — СРАР (тетраметилродамин изотиоционат), пурпурный — ядра клеток (флуоресцентный аналог краситель Ниссля КеигоТгасе). —> — нестин-иммунопозитивная/ ОРАР-иммунонегативная клетка. Масштабный отрезок — 50 мкм.

Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных

Как показали наши исследования, у половозрелых контрольных животных в большинстве участков мозга в клетках нервной ткани нестин не экспрессируется, что соответствует данным других авторов. Слабоположительную реакцию на нестин дают эндотелиоциты капилляров. В SVZ пролиферативной зоне конечного мозга встречались единичные нестин+ клетки. В пролиферативной зоне гиппо-кампа (FD) клетки, содержащие нестин, в отличие отданных S. Fukuda с соавт. [Fukuda et al., 2003] нами обнаружены не были. В тоже время J. Dahlstrand (1995) указывает на то, что FD мРНК также нестина не определяется. Отсутствие реакции на нестин можно объяснить наличием в FD пролиферативно-немой зоны [Melvin et al., 2007]. Однако подобная разница в результатах не может трактоваться однозначно, т. к. эксперименты проводились с использованием различных методов, а, следовательно, необходимо проведение дополнительного исследования.

Виментин экспрессируется во всех эпендимоцитах, в области латеральной стенки боковых желудочков в клетках SubE, а также арахноэндотелиоцитами, клетками, формирующими поверхностную глиальную мембрану, в клетках стенок кровеносных сосудов и в единичных астроцитах.

Иммуногистохимическую реакцию на GFAP в контроле дают типичные астроциты, расположенные во всех областях конечного мозга. В SVZ эпендимоциты GFAP-иммунонегативны, тогда как клетки SubE, напротив, дают положительную иммунную реакцию на GFAP.

Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных после ишемии

В проведенных нами экспериментах транзиторная общая ишемия головного мозга приводила к дегенерация пирамидных нейронов гиппокампа, преимущественно зоны CAI (рис. 36). Иногда очаги деструкции локализовались двигательной коре головного мозга ипсилатерально очагу поражения в гиппокампе.

Ишемия головного мозга приводит к появлению нестин1" клеток как в области поражения (рис. Зв, г), так и вне его (рис. Зг). Через

неделю после ишемнческого поражения головного мозга в клетках, находящихся в области поражения обнаруживается выраженная им-муногистохимическая реакция на нестин.

По своей морфологии (наличие длинных разветвленных отростков, формирование частью отростков периваскулярных "ножек"; рис. Зв) эти клетки могут быть идентифицированы как астроциты, что доказывается данными, полученными с помощью конфокальной лазерной микроскопии (рис. 4). Встречаются также морфологически неидентифицируемые митотически делящиеся клетки. В гиппокампе нестин+ клетки располагаются преимущественно на месте погибших нейронов (рис. Зв). В двигательной коре головного мозга нестин+ клетки располагаются диффузно вокруг очага ишемического инфаркта (рис. Зг).

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о зависимости экспрессии нестина от времени прошедшего после ишемии. Через неделю после пережатия сосудов в очаге появляется большое количество нестин-иммунопозитивных клеток; затем экспрессия нестина увеличивается, достигая пика к 2 неделям, и снижается к 4-м неделям. Сходная динамика описана в работе У. 1л и М. СЬорр [1л, СЬорр, 1999]. Интересно, что количество пролиферирующих клеток в гиппокампе после общей ишемии также сначала увеличивается, а затем снижается [БЬагр е1 а1., 2002]. Принимая во внимание, что регуляция функций нестина осуществляется посредством преимущественно сс!с2-киназы, способствующей переходу из С2 в М фазу клеточного цикла [БаЬ^геп е1 а1., 2001], можно сделать предположение, что, по крайней мере, часть нестин+ клеток в гиппокампе после ишемии есть клетки новообразованные.

В БУг интенсивность реакции на нестин при ишемическом поражении увеличивается (рис. Зд). Через 1 неделю после повреждения часть эпендимоцитов, выстилающих боковые и III желудочки мозга обнаруживают иммунную реакцию на нестин. На 2-х недельном сроке положительную реакцию на нестин дают уже все эпенди-моциты и большинство клеток в БиЬЕ. Учитывая, что, во-первых, ишемия головного мозга приводит к увеличению интенсивности реакции на нестин и йРАР сначала в БиЬЕ, а затем и в эпендимном слое, во-вторых, по данным экспрессии маркера пролиферации РСЫА, новые клетки образуются также сначала в субэпендиме, а затем и в эпендимном слое, в-третьих, по представлениям

A.A. Стадникова с соавт. [Стадников, Шевелюк, 2006] основную роль в восстановлении утраченных клеток играют не стволовые клетки, а клетки значительно большей дифференцированности, в-четвертых, противоречия в данных различных авторов о локализации нейральных стволовых клеток в SVZ [см. обзор Викторов, 2001], можно предположить следующее. В эпендимном слое существует популяция стволовых клеток, которые в покое не делятся. В субэпендиме располагаются прогениторные клетки. Ишемия приводит к активации прогениторных клеток. Однако, вероятно, если их потенциала не хватает для полного восстановления, то задействуют-ся и стволовые клетки.

Мы отдаем себе отчет в том, что высказанное предположение о происхождении и дифференцировке клеток ЦНС во многом базируется на логических построениях и нуждается в специальном экспериментальном подтверждении.

Нестин как маркер нейральных стволовых клеток

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что нельзя любые нестин+ клетки однозначно считать стволовыми. При применении наиболее совершенного из существующих методов выявления колокализации двух (и более) антигенов - конфокальной лазерной микроскопии - можно заключить, что в большинстве своем нестин экспрессируется в астроцитах. На рис. 4 видно, что реакция на нестин является в тех же клетках, что и реакция на GFAP. При этом степень колокализации двух белков ПФ различна. Однако выявляются и HecTHH-iiMMVH0n03HTiiBHbie/GFAP-HMMyH0HeraTiiBHbie клетки (на рис. 4 отмечена стрелкой). Не смотря на то, что в указанной на рис. 4 клетке мы наблюдаем реакцию на GFAP, выраженность этой реакции не достаточна (расчет степени колокализации производился с помощью программы Leica Appication Suite со специальным плагином), чтобы можно было говорить о колокализации нестина и GFAP. По своей морфологии (размеры, отросчатая форма) их сложно отнести к нейронам или олигодендрогии. Также нельзя сказать, что это клетки сосудистой стенки, мигрирующие клетки или радиальные глиоциты. Поэтому нами высказывается предположение, что эти не-cthhVGFAP" клетки есть низкодифференцированные предшественники астроцитов (судя по отростчатой форме), хотя не исключено, что и предшественники нейронов.

Взаимодействие нестина с другими белками промежуточных филаментов

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в ранний постнатальный период онтогенеза в клетках нервной ткани происходит смена профиля промежуточных филаментов: вместо вименти-на появляется GFAP. Такая перестройка ПФ происходит при непосредственном участии нестина. Известно, что ПФ в большинстве своем являются гетерополимерами, т. е. в их состав входят различные белки [Herrmann, Aebi, 2000]. В частности, нестин всегда кополимеризуется с твиментином [Herrmann, Aebi, 2000] или другими белками ПФ III класса, например, GFAP [Wie et al., 2002; Гиля-ров, Шмонин, 2007]. В соответствие с современными представлениями [Chou et al., 2003; Michalczyk, Ziman, 2005] нестин рассматривается как интегратор различных компонентов цитоскелета, необходимый для перестройки цитоплазматических компартментов делящихся и мигрирующих клеток. Кроме того, известно, что нестин участвует в транспортировке мономеров виментина [Michalczyk, Ziman, 2005].

Сопоставляя многочисленные данные, можно предположить следующий механизм изменения состава ПФ. В эмбриогенезе в малодифференцированных клетках нервной ткани ПФ состоят из виментина и нестина. При этом нестин взаимодействует с другими компонентами цитоскелета, обуславливая возможность перестройки ПФ при делении и миграции. Во время митоза происходит фосфорилирование обоих белков сс1с2-киназой [Chou et al., 2003], что приводит к диссоциации виментиновых филаментов. Новообразованные клетки, вступив на путь дифференцировки, начинают экспрессировать типоспецифические белки ПФ (GFAP, например). А роль нестина заключается в транспортировке белков ПФ (составляющих с ним гетеродимеры). Кроме того, нестиновые ПФ могут являться матрицей, на которой происходит смена одного белка ПФ на другой. Иллюстрацией к высказанным предположениям являются клетки субэпендимного слоя, которые сразу после рождения имеют следующий иммуногистохимический профиль - ПФ состоят из виментина и нестина, но не GFAP (не-cthh+/bhmchthh+/GFAP~), изменяющийся в процессе дифференцировки на нестин+/ОРАР+/виментин+ и, наконец, у взрослых животных - 0РАР+/нестин7виментин~.

Схематично:

нестин+ ОРАР" виментин+

нестин+ СРЛР' виментин+

нестин СРАР+ виментин

Транзиторная общая ишемия головного мозга также приводит к изменению состава ПФ в клетках конечного мозга крыс. В области поражения (гиппокамп и кора головного мозга) через 1-2 недели реперфузии появляется множество активированных астроцитов (рис Зи, к), ПФ которых наряду с ОРАР, содержат нестин ивименшн (рис. Зе, ж). В ответ на ишемичсскос повреждение в эпендимоциты начинают синтезировать нестин (рис. Зд) и ОРАР (рис. Зл), а затем снова становятся виментин+/нестин~/ ОРАР". Клетки 8иЬЕ изменяют свой состав ПФ следующим образом: из ОРАР+/нестин"/виментин" они становятся виментин+/нестин7 ОРАР+, а в отдаленный период после ишемии профиль белков ПФ в клетках БиЬЕ снова изменяется и они снова становятся ОРАР7нестин7виментин~.

Схематично:

нестин ОРАР+ виментин"

несгин+ СРАР+ вимен-тин+

нестин СРАР+ виментин"

(2)

Таким образом, изменения в составе ПФ в ранний постнатальный период онтогенезе аналогичны изменениям в отдаленные сроки после ишемии.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе нами получены новые данные об экспрессии белка промежуточных филаментов нестина клетками конечного мозга на отдельных этапах онтогенеза и после ише-мического воздействия.

Изучено пространственно-временное распределение клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза, и показано, что существует зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Кроме того, продемонстрированы изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза.

Определены морфологические типы и локализация нестин+ клеток после ишемического повреждения ЦНС и установлено, что тран-зиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах в очаге поражения и вне его. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период и установлен факт, что эти изменения носят сходный характер.

В соответствии с полученными данными можно заключить, что необходимо дальнейшее изучение нестина. Остается недоказанным предположение о том, что нестин+ клетки в гиппокампе являются глиобластами, а в коре головного мозга - нейробластами. Также необходимо уточнить направление дифференцировки выявленных не-стпн7СРАР~ клеток после ишемии головного мозга. Кроме того, еще предстоит выяснить, действительно ли в эпендимном слое боковых желудочков располагаются столовые клетки, а в 8иЬЕ - пролифери-рующие клетки-предшественники.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 05-04-49397.

выводы

1. В ранний постнатальный период онтогенеза нестин экспрессиру-ется в коре головного мозга, гиппокампе, субвентрикулярной зоне боковых желудочков в радиальных глиоцитах, астроцитах, низкодифференцированных делящихся клетках, мигрирующих клетках, эпендимоцитах и эндотелиоцитах. По мере созревания нервной ткани в конечном мозге крыс происходит снижение экспрессии нестина.

2. У взрослых интактных животных нестин экспрессируется в клетках субэпендимной области субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, менингоцитах, эндотелиоцитах.

3. После транзиторной общей ишемии головного мозга нестин экспрессируется в астроцитах в очаге поражения, клетках субэпен-димного слоя субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, эпендимоцитах, неидентифицируемых нестин-иммунопозитивныхЛлРАР-иммунонегативных клетках, эндотелиоцитах, менингоцитах.

4. В центральной нервной системе популяция нестин-иммунопозитивных клеток гетерогенна как в раннем постнаталь-ном периоде онтогенеза, так и у взрослых животных.

5. Нестин не следует рассматривать в качестве специфического маркера пролиферирующих клеток нейральной дифференцировки, поскольку, наряду с различными популяциями нейральных клеток, нестин экспрессируется в клетках стенки капилляров мозга.

6. С помощью выявления нестина, учета морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, а также сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров возможно определение популяции нейральных стволовых клетках in situ. Таким образом, нестин можно использовать для определения нейральных стволовых клеток в комбинации с другими методами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коржевский, Д. Э. Нестин в клетках головного мозга крысы после кратковременной общей ишемии / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Сб. тез. и лекций 13 Международного совещания и 6 школы по эволюц. физиологии. - СПб. : ВВМ, 2006. - С. 113.

2. Коржевский, Д. Э. Оптимизация метода иммуноцитохимического выявления нестина для парафиновых срезов головного мозга крысы / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров // Морфология. - 2006. -Т. 130. -№6.- С. 78-80.

3. Коржевский, Д. Э. Реверсия эмбрионального фенотипа глиаль-ных клеток под влиянием кратковременной общей ишемии головного мозга / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. - 2006. - Т. 129. -№ 2. - С. 48.

4. Гиляров, А. В. Нестин в клетках головного мозга крыс / А. В. Гиляров, А. А. Шмонин // Морфология. - 2006. - Т. 129. -№ 4. - С. 37.

5. Коржевский, Д. Э. Индукция синтеза нестина в части клеток головного мозга крысы под влиянием ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. - 2007. - Т. 131. -№ 1. - С. 23-26.

6. Гиляров, А. В. Нестин в клетках центральной нервной системы / А. В. Гиляров // Морфология. - 2007. - Т. 131. - № 1. - С. 85-90.

7. Гиляров, А. В. Источники нейральных стволовых клеток в ранний постнатальный период головном мозге крыс / А. В. Гиляров // Сб. тез. к научн-практич. конф. молодых ученых. - СПб.: издание МАПО, 2007.-С. 60.

8. Коржевский, Д. Э. Постишемическое изменение состава промежуточных филаментов в клетках гиппокампа крысы / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // Материалы XX Съезда Физиологического общества им. И. П. Павлова. - М„ 2007. - С. 278.

9. Гиляров, А. В. Реакция белков промежуточных филаментов в клетках центральной нервной системы крыс в ответ на ишемическое повреждение / А. В. Гиляров, А. А. Шмонин // Сб. тез. межинститут, конф. молодых ученых. - СПб. : Ин-т фи-зиол. им. И.П. Павлова РАН, 2007. - С. 28.

10. Коржевский, Д. Э. Отсутствие тенденции к восстановлению утраченной популяции нейронов области CAI гиппокампа в отделенные сроки после ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // Сб. Структурно-функциональные, нейрохимические и иммуно-химические закономерности асимметрии и пластичности мозга. -М.: Издательство «Икар», 2007. - С. 328-330.

11. Коржевский, Д. Э. Морфологические проявления локальной функциональной активации астроцитов, вызванной кратковременной общей ишемией головного мозга / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, В. Б. Косткин, В. А. Отеллин // Журн. эвол. биохим. и физиол. - 2007. - Т. 43. - № 5. - С. 423426.

12. Коржевский, Д. Э. Белки промежуточных филаментов в клетках нервной ткани / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // Морфология. - 2008. - Т. 133. - № 2. - С. 66.

13. Гиляров А. В. Нестин и другие белки промежуточных филаментов в клетках головного мозга крысы / А. В. Гиляров // Сб. трудов 4-й Международного междисциплинарного конгресса. -М.: МАКС Пресс, 2008. - С. 99.

ЛР № 020496

Подписано в печать 16.11.2008 г. Заказ № 630 Формат бумаги 60 х 84/16. Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1,0

Типография ООО «ЛАДОГА», Санкт-Петербург, Выборгская наб., д. 29

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гиляров, Александр Владимирович

Список использованных сокращении

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспрессия нестина в конечном мозге крыс в ранний постнатальный период онтогенеза

1.1. Первый день постнатального развития

1.2. Пятый день постнатального развития

1.3. Десятый день постнатального развития

1.4. Четырнадцатый день постнатального развития

2. Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных

3. Экспрессия нестина в конечном мозге половозрелых животных после ишемии

3.1 Характеристика ишемического поражения

3.2 Экспрессия белков промежуточных филаментов (нестин, виментин, GFAP) в клетках головного мозга после ишемии

3.2.1 Нестин

3.2.2 Виментин и GFAP

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ

1. Нестин в раннем постнатальном периоде онтогенеза

2. Нестин в конечном мозге половозрелых животных

3. Экспрессия нестина клетками конечного мозга после ишемии

4. Нестин как маркер нейральных стволовых клеток

5. Взаимодействие нестина с другими белками промежуточных филаментов 120 Заключение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Нестин в клетках головного мозга крыс (иммуногистохимическое исследование)"

Актуальность темы

Цитоскелет принимает непосредственное участие во всех внутриклеточных процессах. Одним из важнейших компонентов цитоскелета являются промежуточные филаменты (ПФ). Они создают внутриклеточный каркас, обеспечивают упругость клетки, поддерживают упорядоченность I расположения компонентов цитоплазмы, координируют связи между внеклеточным матриксом, цитоплазмой и ядром [Улумбеков, Челышев, 2007]. Несмотря на обширный литературный материал, посвященный ПФ [Herrmann, Aebi, 2000; Strelkov et al., 2003; Herrmann, Aebi, 2004; Goldman et al., 2008 и др.], они остаются крайне малоизученными. В настоящее время известно более 50 белков промежуточных филаментов, которые разделяют на шесть классов, основываясь на сходстве в их аминокислотной последовательности [Cooper, 1997; Lendahl et al., 1990]. Одним из самых загадочных и малоизученных белков ПФ является нестин.

На нестин возлагаются большие надежды в качестве иммуноморфологического маркера нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК). Исследования в области стволовых клеток требуют наличия специфических маркеров, выявление которых необходимо не только для более глубокого понимания нейрогенеза, но и может быть полезным для разработки подходов к лечению различных заболеваний и состояний центральной нервной системы. До настоящего времени не существует маркеров, которые бы были специфичны для НСПК. На роль такого маркера предполагается нестин. Однако противоречивый характер данных разных авторов не дает возможности однозначно считать нестин маркером НСПК.

Нестин был открыт в 1985 г. [Hockfield, McKay, 1985]. Ген нестина был охарактеризован в 1990 г. [Lendahl et al., 1990].

Известно, что нестин активно экспрессируется в клетках головного мозга млекопитающих в эмбриональный период онтогенеза [Hockfield, McKay, 1985; Dahlstrand et al., 1995]. В мозге взрослых животных нестин, напортив, почти не обнаруживается. Показано, что по мере дифференцировки нервной ткани синтез нестина подавляется [Zimmerman etal., 1994; Lothian, Lendahl, 1997], а в дифференцирующихся астроцитах и нейронах начинают экспрессироваться глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и белки нейрофиламентов, соответственно. Важно отметить, что при этом недостаточно разработанными остались вопросы о том когда и где происходит смена ПФ. Изучению экспрессии нестина в раннем постнатальном периоде онтогенеза посвящено малое количество работ [Wie et al., 2002]. Между тем, ранний постнатальный период является очень важным этапом онтогенеза. В этот период происходит адаптация к условиям внеутробной жизни. У человека он длится 28 дней после рождения, у крыс — 14 дней. В этот период в головном мозге млекопитающих происходит ряд процессов (пролиферация, дифференцировка, миграция и др.), обуславливающих окончательное созревание нервной системы.

В центральной нервной системе (ЦНС) взрослых млекопитающих нестин в норме обнаруживается только в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой фасции гиппокампа [Cameron, McKay, 2001; Fukuda et al., 2003; Ernst, Christie, 2005; Ogita et al., 2005; Zecevic et al., 2005].

Однако при ряде патологических состояний наблюдается повышение экспрессии нестина. Одним из таких состояний является ишемия головного мозга. Ишемия — одно из наиболее распространенных и тяжелых поражений центральной нервной системы, характеризующихся острым развитием очаговой и общемозговой неврологической симптоматики. Появление нестина после ишемии ассоциируют с нейральными стволовыми клетками, предполагая, что при этом происходит замена погибших клеток новообразованными [Sharp et al., 2002; Не et al., 2005]. Тем не менее на настоящее время в литературе нет однозначных данных, подтверждающих эту гипотезу.

Таким образом, изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга млекопитающих актуально и имеет не только фундаментальное, но практическое значение.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга крыс на отдельных этапах онтогенеза и после ишемического воздействия с помощью одного из наиболее совершенного из существующих методов — иммуногистохимии. В соответствие с целью исследования были сформированы следующие задачи:

1. Изучение пространственно-временного распределения клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза.

2. Характеристика нестин-иммунопозитивных клеток у взрослых интактных животных.

3. Определение морфологических типов и локализации нестин-иммунопозитивных клеток после ишемического повреждения ЦНС.

Научная новизна

В настоящем исследовании впервые показаны изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза. Продемонстрирована зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В пределах мозга существуют региональные различия в экспрессии нестина. Нестин-иммунопозитивные клетки в коре головного мозга и в гиппокампе экспрессируются на разных стадиях развития нервной ткани.

2. Транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах.

3. Нестин является неспецифическим маркером нейтральных стволовых/прогениторных клеток. Использование нестина, как маркера НСПК, возможно только с учетом морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров.

Теоретическое и практическое значение исследования

Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований в области нейрогистологии. Полученные данные наглядно демонстрируют, что использование нестина как маркера нейральных стволовых клеток in situ возможно только при соблюдении ряда условий: обязательный учет морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, сочетание методов световой и конфокальной микроскопии, использование других маркеров. Нестин не следует считать специфическим маркером нейральных стволовых клеток. Полученные данные могут быть использованы как при проведении научных экспериментов с применением иммуногистохимических методов, так и в качестве учебных материалов в курсах по нейроморфологии и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических ВУЗов.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гиляров, Александр Владимирович

Выводы:

1. В ранний постнатальный период онтогенеза нестин экспрессируется в коре головного мозга, гиппокампе, субвентрикулярной зоне боковых желудочков в радиальных глиоцитах, астроцитах, низкодифференцированных делящихся клетках, мигрирующих клетках, эпендимоцитах и эндотелиоцитах. По мере созревания нервной ткани в конечном мозге крыс происходит снижение экспрессии нестина.

2. У взрослых интактных животных нестин экспрессируется в клетках субэпендимной области субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, менингоцитах, эндотелиоцитах.

3. После транзиторной общей ишемии головного мозга нестин экспрессируется в астроцитах в очаге поражения, клетках субэпендимного слоя субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, эпендимоцитах, неидентифицируемых нестин-иммунопозитивных/ GFAP-иммунонегативных клетках, эндотелиоцитах, менингоцитах.

4. В центральной нервной системе популяция нестин-иммунопозитивных клеток гетерогенна как в раннем постнатальном периоде онтогенеза, так и у взрослых животных.

5. Нестин не следует рассматривать в качестве специфического маркера пролиферирующих клеток нейральной дифференцировки, поскольку, наряду с различными популяциями нейральных клеток, нестин экспрессируется в клетках стенки капилляров мозга и других органах и тканях.

6. С помощью маркирования нестина, учета морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, а также сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров возможно определение популяции нейральных стволовых клетках in situ. Таким образом, нестин можно использовать как маркер нейральных стволовых клеток в комбинации с другими методами.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе нами получены новые данные об экспрессии белка промежуточных филаментов нестина клетками конечного мозга на отдельных этапах онтогенеза и после ишемического воздействия.

Изучено пространственно-временное распределение клеток, содержащих нестин, s в ранний постнатальный период онтогенеза, и показано, что существует зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Кроме того, продемонстрированы изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза.

Определены морфологические типы и локализация нестин-иммунопозитивных клеток после ишемического повреждения ЦНС и установлено, что транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах в очаге поражения и вне его. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период и установлен факт, что эти изменения носят сходный характер.

В соответствии с полученными данными можно заключить, что необходимо дальнейшее изучение нестина. Остается недоказанным предположение о том, что нестин-иммунопозитивные клетки в гиппокампе являются глиобластами, а в коре головного мозга — клетками-предшественниками нейронов. Специального исследования требует изучение путей миграции в гиппокампе. Также необходимо уточнить направление дифференцировки выявленных нестин-иммунопозитивных-GFAP-иммунонегативных клеток после ишемии головного мозга. Кроме того, еще предстоит выяснить, действительно ли в эпендимном слое боковых желудочков располагаются столовые клетки, а в субэпендимном — пролиферирующие клетки-предшественники.

Изучение экспрессии нестина имеет большое как фундаментальное, так и прикладное значение для понимания процессов онтогенеза, дифференцировки стволовых клеток, адаптации и восстановления нервной ткани, и должно носить комплексный характер с использованием методов генетики, морфологии, молекулярной биологии и физиологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гиляров, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

1. Викторов, И. В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro / И. В. Викторов // Известия АН. Серия биологическая. — 2001. — № 6. — С. 646-655.

2. Гиляров, А. В. Изменение состава промежуточных филаментов в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза / А. В. Гиляров, Д. Э. Коржевский, В. А. Отеллин // Ж. эволюц. биохимии и физиол. — В печати.

3. Гиляров, А. В. Нестин в клетках центральной нервной системы /

4. A. В. Гиляров // Морфология. — 2007. — Т. 131. — №1. — С. 85-90.

5. Гистология: учеб. пособие / под ред. Э. Г. Улумбекова, Ю. А. Челышева. -~М. :ГЭОТАР, 2007.

6. Дыбан, А. П. Стволовые клетки в экспериментальной и клинической медицине / А. П. Дыбан, П. А. Дыбан // Мед. акад. журн. — 2002. — Т. 2. — №3. — С. 3-24.

7. Коржевский, Д. Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов гистологов / Д. Э. Коржевский. — СПб. : Кроф, 2005.

8. Коржевский, Д. Э. Иммуноцитохимическое выявление нейронов головного мозга помощью селективного маркера NeuN / Д. Э. Коржевский, Е. Г. Гилерович, Н. Н. Зинькова, И. П. Григорьев,

9. B. А. Отеллин // Морфология. — 2005. — Т. 128. — №5. — С. 76-78.

10. Коржевский, Д. Э. Оптимизация метода иммуноцитохимического выявления нестина для парафиновых срезов головного мозга крысы /

11. Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров // Морфология. — 2006. — Т. 130. — №6. — С. 78-80.

12. Коржевский, Д. Э. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях / Д. Э. Коржевский, И. П. Григорьев, В. А. Отеллин // Морфология. — 2006. — Т. 129. — №1. — С. 85-86.

13. Коржевский, Д. Э. Индукция синтеза нестина в части клеток головного мозга крысы под влиянием ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. — 2007. — Т. 131. — №1. — С. 23-26.

14. Коржевский, Д. Э. Реверсия эмбрионального фенотипа глиальных клеток под влиянием кратковременной общей ишемии головного мозга / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. —- 2006. — Т. 129. — №2. — С. 48.

15. Коржевский, Д. Э. Иммуноцитохимическое выявление астроцитов в срезах головного мозга в сочетании с окраской по Нисслю / Д. Э. Коржевский, В. А. Отеллин // Морфология. — 2004. — Т. 125. — №3. — С. 100-102.

16. Коржевский, Д. Э. Индукция синтеза нестина в части клеток головного мозга крысы под влиянием ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, О. В. Кирик, Т. Д. Власов // Морфология. — 2007. — Т. 131. — №1. — С. 23-26.

17. Коржевский, Д. Э. Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге эмбриона человека / Д. Э. Коржевский // Морфология. — 2000. — Т. 118. — №5. — С. 68-70.

18. Круглякова, Е. П. Нестин-экспрессирующие клетки в гиппокампе человека / Е. П. Круглякова, А. В. Хорвяков, Н. П. Шиханов, Г. М. МакКхан II, И. Ваэль, П. П. Кругляков, А. А. Сосунов // Морфология. — 2004. — Т. 126. — № 6. — С. 19-25.

19. Подгорный, О. В. Дифференцировка и поведение нейральных стволовых клеток человека в культуре ткани и при трансплантации в головной мозг крыс: автореф. дис. канд. биол. : защищена 07.06.2006 / О. В. Подгорный. — М., 2006.

20. Неврология / под ред. Самуэльс М. — М.; Практика, 1997.

21. Стадников, А. А. Стволовые клетки и репаративная регенерация в постнатальном онтогенезе млекопитающих / А. А. Стадников, Н. Н. Шевелюк // Морфология. — 2006. — Т. 30. — №6. — С. 84-88.

22. About, I. Nestin expression in embryonic and adult human teeth under normal and pathological conditions / I. About, D. Laurent-Maquin, U. Lendahl, T. A. Mitsiadis // American J. of Pathology. — 2000. — V. 157. —- №1. — P. 287-295.

23. Almqvist, P. M. Immunohistochemical detection of nestin in pediatric brain tumors / P. M. Almqvist, R. Mah, U. Lendahl, B. Jacobsson, G. Hendson // J. Histochem. Cytochem. — 2002. — V. 50. — №2. — P. 147-158.

24. Altman, J. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats / J. Altman, G. D. Das // J. Сотр. Neurol. — 1965. —V. 124.—№3. —P. 319-335.

25. Alvarez-Buylla, A. Identification of neural stem cells in the adult vertebrate brain / A. Alvarez-Buylla, B. Seri, F. Doetsch // Brain Res. Bull. — 2002. — V. 57. — №6. — P. 751-758.

26. Bohlen und Halbach, von O. Immunohistological markers for staging neurogenesis in adult hippocampus / vonO. Bohlen und Halbach // Cell Tissue Res. — 2007. — V. 329. — №3. — P. 409-420.

27. Bystron, I. The first neurons of the human cerebral cortex / I. Bystron, P. Rakic, Z. Molnar, C. Blakemore // Nature neuroscience. — 2006. — V. 9.7. —P. 880-886.

28. Cameron, H. A. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus / H. A. Cameron, R. D. McKay // J. Сотр. Neurol.2001.—V. 435. —№4. —P. 406-417.

29. Cattaneo, E. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor / E. Cattaneo, R. McKay // Nature. — 1990. — V. 347. — №6295. — P. 762-765.

30. Choi, В. H. Radial glia in the human fetal cerebrum: a combined Golgi, immunofluorescent and electron microscopic study / В. H. Choi, L. W. Lapham//Brain Res. 1978. — V. 148. — №2. —P. 295-311.

31. Chou, Y.-H. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis / Y.-H. Chou, S. Khuon, H. Herrmann, R. Goldman // Mol. Biol. Cell. — 2003. — V. 14. — №4. — P. 1468-1478.

32. Clarke, S. R. Reactive astrocytes express the embryonic intermediate neurofilament nestin / S. R. Clarke, A. K. Shetty, J. L. Bradley, D. A. Turner // Neuroreport. — 1994. — V. 5. — №15. — P. 1885-1888.

33. Cooper, G. M. The cell: a molecular approach / G. M. Cooper // Washington, D.C.: ASM Press. —1997.

34. Craig, C. G. Migrational analysis of the constitutively proliferating subependymal population in adult mouse forebrain / C. G. Craig, R. D'sa, С. M. Morshead, A. Roach, D. vanderKooy // Neuroscience. — 1999. — V. 93. —№3. —P. 1197-1206.

35. Dahlstrand, J. Expression of the class VI intermediate filament nestin in human central nervous system tumors / J. Dahlstrand, V. P. Collins, U. Lendahl // Cancer Res. — 1992. — V. 52. — №19. — P. 5334-41.

36. Dahlstrand, J. Characterization of the human nestin gene reveals a close evolutionary relationship to neurofilaments / J. Dahlstrand, L. Zimmerman, R. McKay, U. Lendahl // J. Cell Sci. — 1992. — V. 103. — P. 589-597.

37. Deshpande, M. Role of activated astrocytes in neuronal damage: potential links to HIV-1-associated dementia / M. Deshpande, J. Zheng, K. Borgmann, R. Persidsky, L. Wu, C. Schellpeper, A. Ghorpade // Neurotox. Res. — 2005.1. V. 7. — №3. — P. 183-92.

38. Doetsch, F. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain / F. Doetsch, I. Caille, D. A. Lim, J. M. Garcia-Verdugo, A. Alvarez-Buylla // Cell. — 1999. — V. 97. — №6. — P. 703-716.

39. Duggal, N. Nestin expression in reactive astrocytes following focal cerebral ischemia in rats / N. Duggal, R, Schmidt-Kastner, A. M. Hakim // Brain Res.1997. — V. 768. -№1-2. — P. 1-9.

40. Duprey, P. What can be learned from intermediate filament gene regulation in the mouse embryo / P. Duprey, D. Paulin // Int. J. Dev. Biol. — 1995. — V. 39. — №3. — P. 443-457.

41. Eklof, B. The effect of bilateral carotid artery ligation upon acid-base parameters and substrate levels in the rat brain / B. Eklof, В. K. Siesjo // Acta. Physiol. Scand. — 1972a. —V. 86. — №4. — P. 528-538.

42. Eklof, В. The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state of the rat brain / B. Eklof, В. K. Siesjo // Acta. Physiol. Scand. — 1972b. — V. 86. — №2. — P. 155-165.

43. Eng, L. F. Glial fibrillary acidic protein (GFAP): the major protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocytes / L. F. Eng // J. Neuroimmunol. — 1985. — V. 8. — №4-6, P. 203-214.

44. Engel, A. K. Postnatal development of vimentin-immunoreactive radial glial cells in the primary visual cortex of the cat / A. K. Engel, С. M. Mtiller // J. Neurocytol. — 1989. — V. 18. — №4. — P. 437-450.

45. Eriksson, J. Cytoskeletal integrity in interphase cells requires protein phosphatase activity / J. Eriksson, D. Brautigan, R. Vallee, S. Olmstedt, H. Fujiki, R. Goldman // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1992. — V. 89. — №22. —P. 11093-11097.

46. Ernst, C. Nestin-expressing cells and their relationship to mitotically active cells in the subventricular zones of the adult rat / C. Ernst, B. R. Christie // Eur. J. Neurosci. — 2005. — V. 22. — №12. — P. 3059-3066.

47. Frielingsdorf, H. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra / H. Frielingsdorf, K. Schwarz, P. Brundin, P. Mohapel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — V. 101. — №27. — P. 10177-10182.

48. Frojdman, К. The intermediate filament protein nestin occurs transiently in differentiating testis of rat and mouse / K. Frojdman, L. Pelliniemi, U. Lendahl, I. Virtanen, J. Eriksson // Differentiation. — 1997. — V. 61. — №4.— P. 243-249.

49. Fukuda, S. Two distinct subpopulations of nestin-positive cells in adult mouse dentate gyrus / S. Fukuda, F. Kato, Y. Tozuka, M. Yamaguchi, Y. Miyamoto, T. Hisatsune // J. Neurosci. — 2003. — V. 23. — №28. — P. 9357-9366.

50. Gage, F. H. Neurogenesis in the adult brain / F. H. Gage // J. Neurosci. — 2002. — V. 22. — №2. — P. 612-613.

51. Gage, F. H. Multipotent progenitor cells in the adult dentate gyrus / F. H. Gage, G. Kempermann, T. D. Palmer, D. A. Peterson, J. Ray // J. Neurobiol. — 1988. — V. 36. — №2. — P. 249-266.

52. Galli, R. Neural Stem Cells / R. Galli, A. Gritti, L. Bonfanti, A. L. Vescovi // Circ. Res. — 2003. — V. 92. — №6. — P. 598-608.

53. Goldman, R. D. Intermediate filaments: versatile building blocks of cell structure / R. D. Goldman, B. Grin, M, G. Mendez, E. R. Kuczmarski // Curr. Opin. Cell Biol. — 2008. — №1. — P. 28-34.

54. Guerri, C. Alcohol, astroglia, and brain development / C. Guerri, Renau-J. Piqueras // Mol. Neurobiol. — 1997. — V. 15. — №1. — P. 65-81.

55. He, Z. Hippocampal progenitor cells express nestin following cerebral ischemia in rats / Z. He, L. Cui, J. F. Meschia, D. W. Dickson, T. G. Brott, J. W. Simpkins, A. L. Day, M. McKinney // Neuroreport. — 2005. — V. 16. — №14. P 1541-1544.

56. Herrmann, H. Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular scaffolds / H. Herrmann, U. Aebi // Annu. Rev. Biochem. — 2004. — V. 73. — P. 749-89.

57. Herrmann, H. Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics / H. Herrmann, U. Aebi // Curr. Opin. Cell Biol. — 2000. — V. 12. — №1. — P. 19-90.

58. Hess, D. C. Bone Marrow as a source of endothelial cells and NeuN-expressing cells after stroke / D. C. Hess, W. D. Hill, A. Martin-Studdard, J. Carroll, J. Brailer, J. Carothers // Stroke. — 2002. — V. 33. — №5. — P. 1362-1368.

59. Hirokawa, N. Organization of mammalian neurofilament polypeptides within the neuronal cytoskeleton / N. Hirokawa, N. Glicksman, M. Willard // J. Cell Biol. — 1984. — V. 98. — №4. — P. 1523-1536.

60. Hisanaga, S. Structure of the peripheral domains of neurofilaments revealed by low angle rotary shadowing / S. Hisanaga, N. Hirokawa // J. Mol. Biol. — 1988. — V. 202. — №2. — P. 297-305.

61. Hockfield, S. Identification of major cell classes in the developing mammalian nervous system / S. Hockfield, R. D. G. McKay // J. Neurosci. — 1985. — V. 5. — №12. — P. 3310-3328.

62. Hoehn, B. D. Neurogenesis in rats after focal cerebral ischemia is enhanced by indomethacin / B. D. Hoehn, T. D. Palmer, G. K. Steinberg // Stroke. — 2005. — V. 36. — №12. — P. 2718-2724.

63. Hoffman, R. M. The pluripotency of hair follicle stem cells / R. M. Hoffman // Cancer Biol. Ther. — 2006. — V. 5. — №3. — P. 232-233.

64. Holmen, S. L. Essential role for Ras signaling in glioblastoma maintenance / S. L. Holmen, В. O. Williams // Cancer Res. — 2005. — V. 65. — №18. — P. 8250-8255.

65. Holmin, S. Adult nestin-expressing subependymal cells differentiate to astrocytes in response to brain injury / S. Holmin, P. Almqvist, U. Lendahl, T. Mathiesen // Eur. J. Neurosci. — 1997. — V. 9. — №1. — P. 65-75.

66. Holmin, S. Induction of astrocytic nestin expression by depolarization in rats / S. Holmin, C. von Gertten, A. C. Sandberg-Nordqvist, U. Lendahl, T. Mathiesen // Neurosci. Lett. — 2001. — V. 314. — №3. — P. 151-155.

67. Ни, X. S. Expression of nestin following focal cerebral ischemia-reperfusion in rats / X. S. Ни, D. M. Zhou, D. Zhou // Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. —2005. —V. 36. — №5. — P. 645-648.

68. Itoh, T. Isolation of neural stem cells from damaged rat cerebral cortex after traumatic brain injury / T. Itoh, T. Satou, S. Hashimoto, H. Ito // Neuroreport. — 2005. —V. 16. —№15. —P. 1687-1691.

69. Johansson, С. B. Identification of a neural stem cells in the adult mammalian central nervous system / С. B. Johansson, S. Momma, D. L. Clarke, M. Risling, U. Lendahl, J. Frisen // Cell. — 1999. — V. 96. — №1. — P. 25-34.

70. Kagstrom, E. Recirculation in the rat brain following incomplete ischemia /

71. E. Kagstrom, M. L. Smith, В. K. Siesjo // J. Cereb. Blood Flow Metab. — 1983. —V. 3. —№2. —P. 183-192.

72. Kaya, S. S. Expression of nestin after traumatic brain injury in rat brain / S. S. Kaya, A. Mahmood, Y. Li, E. Yavuz, M. Chopp // Brain Res. — 1999. — V. 840. -№1-2. — P. 153-157.

73. Kernie, S. G. Brain remodeling due to neuronal and astrocytic proliferation after controlled cortical injury in mice / S. G. Kernie, Т. M. Erwin, L. F. Parada // J. Neurosci. Res. — 2001. — V. 66. — №3. — P. 317-326.

74. Khelfaoui, M. Early neuronal and glial determination from mouse E10.5 telencephalon embryonic stem cells: an in vitro study / M. Khelfaoui,

75. F. Guimiot, M. Simonneau // Neuroreport. — 2002. — V. 13. — №9. — P. 1209-1214.

76. Kohno, H. Induction of nestin, Ki-67, and cyclin DI expression in Muller cells after laser injury in adult rat retina / H. Kohno, T. Sakai, K. Kitahara // Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. — 2006. — V. 244. — №1. — P. 90-95.

77. Ku, N.-O. Implications of intermediate filament protein phosphorylation / N.-O. Ku, J. Liao, C.-F. Chou, B. Omary // Cancer Metastasis. — 1996. — V. 15. —№4. —P. 11093-11097.

78. Kuroda, T. Nestin immunoreactivity in local neurons of the adult rat striatum after remote cortical injury / T. Kuroda, H. Nakamura, K. Itoh, W. R. Le, S. Yoshimura, K. Takenaka, N. Sakai // J. Chem. Neuroanat. — 2002. — V. 24. — №2. — P. 137-146.

79. Lendahl, U. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein / U. Lendahl, L. Zimmerman, R. D. McKay // Cell. — 1990. — V. 60. — №4. — P. 585-595.

80. Li, Y. Temporal profile of nestin expression after focal cerebral ischemia in adult rat / Y. Li, M. Chopp // Brain Res. — 1999. — V. 838. — №1-2. — P. 1-10.

81. Lin, R. C. Re-expression of the intermediate filament nestin in reactive astrocytes / R. C. Lin, D. F. Matesic, M. Marvin, R. D. McKay, O. Brustle // Neurobiol. Dis. — 1995. — V. 2. — №2. — P. 79-85.

82. Lothian, С. An evolutionarily conserved region in the second intron of the human nestin gene directs gene expression to CNS progenitor cells and to early neural crest cells / C. Lothian, U. Lendahl // Eur. J. Neurosci. — 1997.1. V. 9. —P. 452-462.

83. Luskin, M. B. Neuroblasts of the postnatal mammalian forebrain: their phenotype and fate / M. B. Luskin // J Neurobiol. — 1998. — V. 36. — №2.1. P. 221-233.

84. Maga, G. DNA polymerase epsilon interacts with proliferating cell nuclear antigen in primer recognition and elongation / G. Maga, U. Hiibscher // Biochemistry. — 1995. —V. 34. —№3. —P. 891-901.

85. Marvin, M. A rod end deletion in the intermediate filament protein nestin alters its subcellular localization in neuroepithelial cells of transgenic mice / M. Marvin, J. Dahlstrand, U. Lendahl, R. McKay // J. Cell Sci. — 1998. — V. 111. —P. 1951-1961.

86. Medina, R. J. Isolation of epithelial stem cells from dermis by a three-dimensional culture system / R. J. Medina, K. Kataoka, M. Takaishi, M. Miyazaki, N. H. Huh // J. Cell. Biochem. — 2006. — V. 98. — №1. — P. 174-184.

87. Meletis, K. Spinal cord injury reveals multilineage differentiation of ependymal cells / K. Meletis, F. Barnabe-Heider, M. Carlen, E. Evergren, N. Tomilin, O. Shupliakov, J. Frisen // PLoS Biol. — 2008. — V. 6. — №7.1. P. 182.

88. Melvin, N. Differential neurogenesis in the adult rat dentate gyrus: an identifiable zone that consistently lacks neurogenesis / N. Melvin, S. C. Spanswick, H. Lehmann, R. J. Sutherland // Eur. J. Neurosci. 2007. — V. 25. — №4. — P. 1023-1029.

89. Merkle, F. T. Radial glia give rise to adult neural stem cells in the subventricular zone / F. T. Merkle, A. D. Tramontin, J .V. Garcia-Verdugo, A. Alvarez-Buylla // PNAS. — 2004. — V. 101. — №50. — P. 17528-17532.

90. Michalczyk, К. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization / K. Michalczyk, M. Ziman // Histol. Histopathol. — 2005. — V. 20. — №2. — P. 665-671.

91. Mokry, J. Cerebral angiogenesis shows nestin expression in endothelial cells / J. Mokry, S. Nemecek // Gen. Physiol. Biophys. — 1999. — V. 18. — №1.1. P. 25-29.

92. Mokry, J. Nestin expression by newly formed human blood vessels / J. Mokry, D. Cizkova, S. Filip, J. Ehrmann, J. Osterreicher, Z. Kolar, D. English // Stem Cells Dev. — 2004. — V. 13. — №6. — P. 658-664.

93. Mujtaba, T. A common neural progenitor for the CNS and PNS / T. Mujtaba, M. Mayer-Proschel, M. Rao // Dev. Biol. — 1998. — V. 200. — №1. — P. 1-15.

94. Nakagawa, T. Localization of nestin in amygdaloid kindled rat: an immunoelectron microscopic study / T. Nakagawa, O. Miyamoto, N. A. Janjua, R. N. Auer, S. Nagao, T. Itano // Can. J. Neurol. Sci. — 2004.

95. V. 31. — №4. — P. 514-519.

96. Nakamura, T. Nestin expression after experimental intracerebral hemorrhage / T. Nakamura, G. Xi, Y. Hua, J. T. Hoff, R. F. Keep // Brain Research. — 2003.— V. 981. №1-2.— P. 108-117.

97. Parker, K. Morphological, immunocytochemical and flow cytometric in vitro characterisation of a surface-adherent medulloblastoma / K. Parker,

98. G. J. Pilkington // Anticancer Res. — 2005. — V. 25. — №6B. — P. 38553863.

99. Paxinos, G. The rat brain in stereotaxic coordinates /4 ed. / G. Paxinos, C. Watson // San Diego: Academic Press. — 1998.

100. V. 145. — №3. — P. 503-514.

101. Prunell, G. F. Inflammation in the brain after experimental subarachnoid hemorrhage / G. F. Prunell, N. A. Svendgaard, K. Alkass, T. Mathiesen // Neurosurgery. — 2005. — V. 56. — №5. — P. 1082-1092.

102. Salman, H. Subventricular zone neural stem cells remodel the brain following traumatic injury in adult mice / H. Salman, P. Ghosh, S. G. Kernie // J. Neurotrauma. — 2004. — V. 21. — №3. — P. 283-292.

103. Sarnat, H. B. Regional differentiation of the human fetal ependyma: immunocytochemical markers / H. B. Sarnat // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1992 V. 51. — №1. — P. 58-75.

104. Schlatt, S. Immunohistochemical localization of proliferating cell nuclear antigen as a tool to study cell proliferation in rodent and primate testes / S. Schlatt, G. F. Weinbauer // Int. J. AndroL — 1994. — V. 17. — №4. — P. 214—222.

105. Sharp, F. R. Neurogenesis following brain ischemia / F. R. Sharp, J. Liu, R. Bernabeu // Dev. Brain. Res. — 2002. — V. 134. — №1-2. — P. 23-30.

106. Smith, M. L. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia / M. L. Smith, R. N. Auer, В. K. Siesjo // Acta Neuropathol. — 1984a. -— V. 64. — №4. — P. 319-332.

107. Song, H. J. Neural stem cells from adult hippocampus develop essential properties of functional ens neurons / H. J. Song, C. F. Stevens, F. H. Gage // Nat. Neurosci. — 2002. — V. 5. — №5. — P. 438-445.

108. Strelkov, S. V. Molecular architecture of intermediate filaments / S. V. Strelkov, H. Herrmann, U. Aebi // Bioessays. — 2003. — V. 25. — №3. — P. 243-251.

109. Taylor, J. P. Transcription of intermediate filament genes is enhanced in focal cortical dysplasia / J. P. Taylor, R. Sater, J. French, G. Baltuch, P. B. Crino // ActaNeuropathol. (Berl.). —2001. — V. 102. — №2. — P. 141-148.

110. Terling, C. Expression of the intermediate filament nestin during rodent tooth development / C. Terling, A. Rass, T. Midsiadis, K. Fried, U. Lendahl, J. Wroblewski // Int. J. Dev. Biol. — 1995. — V. 39. — №5. p. 947-956.

111. Tohyama, T. Nestin expression in embryonic human neuroepithelium and in human neuroepithelial tumor cells / T. Tohyama, V. M. Lee, L. B. Rorke, M.Marvin, R.D. McKay, J. Q. Trojanowski // Lab. Invest. — 1992. — V. 66. — №3. — P. 303-313.

112. Toti, P. Nestin expression in normal adrenal gland and adrenocortical tumors / P. Toti, M. Regoli, G. Nesi, R. Occhini, S. Bartolommei, L. Fonzi, E. Bertelli // Histol Histopathol. 2005. — V. 20. — №4, p. 1115-1120.

113. Veselska, R. Nestin expression in the cell lines derived from glioblastoma multiforme / R. Veselska, P. Kuglik, P. Cejpek, H. Svachova, J. Neradil, T. Loja, J. Relichova // BMC Cancer. — 2006. — V. 6. — №1. — P. 32.

114. Voigt, Т. Development of glial cells in the cerebral wall of ferrets: direct tracing of their transformation from radial glia into astrocytes / T. Voigt // J. Сотр. Neurol. — 1989. —V. 289. — №1. — P. 74-88.

115. Yagita, Y. Differential expression of Musashil and nestin in the adult rat hippocampus after ischemia / Y, Yagita, K. Kitagawa, T. Sasaki, T. Miyata, H. Okano, M. Hon, M. Matsumoto // J. Neurosci. Res. — 2002. — V. 69. — №6. — P. 750-756.

116. Yamada, T. Vimentin immunoreactivity in normal and pathological human brain tissue / T. Yamada, T. Kawamata, D. G. Walker, P. L. McGeer // Acta. Neuropathol. — 1992. V. 84. — №2. — P. 157-162.

117. Yang, P. Expression of nestin and glial fibrillary acidic protein in injured spinal cord of adult rats at different time / P. Yang, X. He, J. Qu, H. Li,

118. B. Lan, P. Yuan, G. Wang // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. -— 2005. — V. 19. — №6. — P. 411-415.

119. Ying, Z. Expression of neural stem cell surface marker CD133 in balloon cells of human focal cortical dysplasia / Z. Ying, J. Gonzalez-Martinez,

120. C. Tilelli, W. Bingaman, I. Najm // Epilepsia. — 2005. — V. 46. — №11. — P. 1716-1723.

121. You, H. Immunohistochemical study of central neurocytoma, subependymoma, and subependymal giant cell astrocytoma / H. You, Y.I.Kim, S.Y.Im, H. Suh-Kim, S.H.Paek, S.H.Park, D.G.Kim, H. W. Jung // J. Neurooncol. — 2005. — V. 74. — №1. — P. 1-8.

122. Zecevic,N. Contributions of cortical subventricular zone to the development of the human cerebral cortex / N. Zecevic, Y. Chen , R. Filipovic // J. Сотр. Neurol. — 2005. — V. 491. —№2. — P. 109-1022.

123. Zhou, F. C. Moderate alcohol exposure compromises neural tube midline development in prenatal brain / F. C. Zhou, Y. Sari, T. Powrozek, C. R. Goodlett, Т. K. Li // Brain Res. Dev. Brain Res. — 2003. — V. 144. — №1.—- P. 43-55.

124. Zimmerman, L. Independent regulatory elements in the nestin gene direct trans gene expression to neural stem cells or muscle precursors / L. Zimmerman, B. Parr, U. Lendahl, M. Cunningham, R. McKay, B. Gavin, J. Mann,

125. G. Vassileva, A. McMahon // Neuron. —1994. — V. 12. — P. 11-24.

126. Zou, J. Upregulation of nestin, vimentin, and desmin in rat podocytes in response to injury / J. Zou, E. Yaoita, Y. Watanabe, Y. Yoshida, M. Nameta,

127. H. Li, Z. Qu, T. Yamamoto // Virchows Arch. — 2006. — V. 448. — №4. — P. 485-492.