Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Необратимое взаимодействие гемоглобина человека с пиридоксаль-5-фосфатом

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Необратимое взаимодействие гемоглобина человека с пиридоксаль-5-фосфатом"

ШИШ^Л НАУК БЕЛАРУСИ Пискнут ¿отобиологии

на правах рукописи КОНОВАЛОВА ШША £ЛАДШ*РСША

¡120ЕРАТШ0Е ЗЗА1М0аЕ«1СТВИЕ Ш.ЮГЛ0ВША ЧЕЛОВЕКА ■ ~С ЛШЯ0Щ1й&--5-ФОСШШ

03.00.02 - биофизика

' ' ■ " . /

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой, степени, кандидата 'биологических, наук

Байона выполнена в. лаборатории биофизика Института биохимии Ж Беларуси.

Научные. руководители:; академик. Ж Беларуси, доктор ыедниак-„сшх. наук, профессор Сстровскки '£.1а. кандидат биологических паук, ведусь! научный сотрудник Степуро ¿1.-1-1.

Официальные оппонента: доктор биологических наук

Чершщкий Е.А.

кандидат Здзико-тхекатическкх наук • Хмельницкий А.И.

Ведущая, организация.-- Институт молекулярной." биологии .¡сл. '

В.А. Энгельгардта, Москва

Защита диссертации состоится " ' г * г1992 г. в

чч* ~

фе^

___часов на заседании. сшциялгазировзнного Совета но .защите

докторских диссертаций. Д.006.05.01 в Институте аотобпологии

N ** -

Ж Беларуси. (220723, Минск, уд. ¿.Скораны).

, < 1

С диссертацией. мокша ознакомиться, в библиотеке Института фотобиологии. Ж Беларуси

Авторефераг разослан " м1 1992 г.

Ученый, секретарь. специализированного совета, кандидат биологических: наук

ОБЩАЯ ХАВАКТЕРКСТЖА РАЕОШ

Актуальность тема. Имеется большое число физических е. химических факторов, вызывающих молекулярное повреждение балка, Молекулярное повреждение мохет быть, связано не только с окислением или модификацией функциональных групп биамакромолакулы. под действием ксенобиотиков., ионизирующего излучения» ультразву* , но так&е и с усилением включения низкомолекулярных соединений, в состав макромолекулы и образования адцуктав. Такие, реакции, наиболее- характерны дня альдегидов, и кетонов. Альдегида широко распространены в природа, являются, промежуточными, метаболитакх в кивотнш' и растительном, организмах а. при ряде, патологий, могут накапливаться в значительных концентрациях. Характерной, особенностью альдегидов является их способность наряду с образованием обратишь структур (оснований. Шиффа, полумеркалталвй.) необраги— мо взаимодействовать с, макромолекулами. Такие адпукты образуют и транспортные белки крови альбумин и. гемоглобин. .

Взаимодействие малых молекул с биомакромолеЕЗ-лша. обычно сопряжено с изменениями конформации биополимера, что ¡¡дает принципиальное значение для выполнения макромолекулой ее биологической функции. Как обратимая, так. и. необратимая модификация гемоглобина альдегидами изменяет его конформацшо, параметры ое-сигенации:, скорость- реакций, аутаокислениа. Процессы. аутоокисле-ния окси-гемоглобина сопровождаются генерацией кислородных свободных радикалов. Гемоглобин такке обладает высокой активностью в отношении разного рода лекарств, или. ксенобиотиков, что. также усиливает его окисление и образование активных форм кислорода. Генерация кислородных свободных радикалов может усиливать модификацию гемоглобина альдегидами. и. служить таким образом тестом, на неблагоприятную экологическую обстановку окружачЕай. сгганинм среды, на наличие и развитие патологических процессов в 'организме.

3 связи с этим является актуальным исследование ноокатимого взаимодействия альдегидов (на примера пиридоксаль-о^оо-фата и. ацэтальдегида) с гемоглобином, человека, а также лошади, и изучение возможных механизмов образования стабильных адцунтов при действии некоторых физически: факторов, (ультразвука, света) и в отсутствий какого-либо внешнего зсглаЛаггг.т.

Основной целью работы, является. изучения механизмов необратимого взаимодействия лиридатлзаль-Бг-фосфата (Шй) а гемоглсби-

2Ш! (Ев) "ШЛОВага.

Основные задача исследований. В работе были поставлены сдадутвдв экспериментальный задачи:

- исследование прдроды. хроадтогра^кческ:: наиболее систров ые-нсрно! ^раиош Не человека;

- дгучанде образования стайх^шшх ад^-ктов Eli' с lis человека

г. Не допели щш. тешовод иккубацЕи;

- изучение образования стайыьных аддуктав ЕЛ* с Нв человека г ав. .~r.7.r."f: под действием света;

-дгучедде образования сда&цтъннх аддуктов ацетальд&гдда с ILe человека под действием органически радикалов; -здредадение центров необратимой [¿од^/икаши: человека Научная, новизну,.

Из донорсдш крови, человека выделена jcaopaaa '¿ракгшя аз, ссд-ргащад необратимо связанный. ЕЛ£.

Б спитку tc vth-o показано, что гемоглобин человека, а такие додадп образует стабдльнке адукхы с IUS;.

Образование стайдлъного адцукта ШЕ с Ив человека д £б ло-^адд дрд длительно*! днкубацид в темноте протекает через перво-ндчалвнкд атад сбразованда мавду дервдчной. аыгногрудшй белка 1 альдегидной группой. лдганда основания .цплйная связь

дстср-го ыадленно взаимодействует с гакдазольныи тгп.7гутпм сосед-

д. -•а гистдддна. Установлен центр необратимой модификадии Ев че-

С^разсванке стабдльното аддукта Р^ с Нв человека's Нв ло— еддд при дндубазвг на. свету .протекает как реакция восстановления дьсдкс^. седзи сснованЕя Шшда. тидраткрованными электронами, фо-тззл-ектдгга^ыгд! ЕролщЕКчесшши амшшкнслотышш остатками белка игд македуд^лд лдданда.

¿сразсвгдге стабильного адцукса ацетальдегЕда с Нв человека в ультраззут.ДБса: пс-е протекает по свободно-радикальному механизму. Hps взаиысдедствди с рядккялягят сдирта, ЫДД* ш ШК>*

ТЬакггческаЕ данность работн. Б ходе доследование получены

, ксторде бкдь -риганены. ддн обьгсаениБ найшдае-

ото сл. пло ссразоваддя целого ряда :дд:эрн".у компонент Нв че-гзекд, сигарное долдчедтзс дотсрых в. вор^е дасддгает 5-10%

*дегс дсддчгстза Нв. Полученные результата расширяют предсгав-

ленда о возгга^чу ;,ге:сп;;тгз,удг необратимого взаимодействия dejaos с низксаюдевулярныш альдегидными соединениями., которые прг рада лагологиД .\uiyi накапливаться a органазаа в. значительных концентрациях. Ца основании полученных результатов образования адцуктов белок-альдегид под действием органических радикалов спирта, ЛАД', ЕЛ5* открывается возможность использовать, факт усиления модификации гемоглобина альдегидами как тает на неблагоприятную экологическую обстановку окружающей среда, на наличие и. развитие патологических процессов з организме.

Апробация работы. Материалы работы, были представлены и. докладывались на совместно:.: заседании лабораторий Института биохимии Ш. Беларуси, и кафедры биохимии Гродненского государственного медицинского института (IS83, IS6G, 1989, 1991 г.г.); на 1-е:-.: Всесоюзном биофизическом съезда (Москва, 13Б2), на 7-aü 1&здуна-родной. конференции "Еиохикиа я биофизика цдтохрома P—lbO" (Москва, Í99I), на УП1 Конференции по спектроскопии биополимеров (¡Харьков, IS9I).

Дубликат;?. По теле диссертации опубликована 3 fтячт.»^ Г статья, направлена в печать, 4 тезисов.

Объел и структура работы. Диссертация изложена на 14? страгниц зх -машинописного текста а включает введение, результаты, исследований а их обсуждение, заключение, выводи, ш- список, ютируо-мой. литературы, содержащей. 175 ссылок. Рабата иллюстрирована 33 рксункаш н 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ 2 iZTQSi ¡ХСЛЩШЖ

В работе использовала оксп-2в, выявленный. из донорской крова, человека, а такгз ::ет-2в кристаллически! лзодахлирован-нкй из zpasz логзди. Необратимую аода^акащш Яэ хосадя а человз-ка Е2ридоксаль-5-^1ос1атси осуществляли различной по лродсииз-телькссхп совместно! инкубацив! буферных или. болшх расгвороз. данн:гх соединений. В зависимости с« целей эксперимента инкубация растворов прсзодплась э темнота идя на свету. Посла инкубации избыток низкемолгкуларнога реаганта удалгли гель-4лльтра-^-аа. смеси через колонку (50»2 см) с сэ^эдаксаа <?-25. Для облучения смеси использовала naisy накаливания без «шетй-акьтра ;:сд~:остгх ICO Зг азг ртутнуэ ла^ду ДРГ-120. Расстояние сг центра источника света до лззета. с образцеа не срезывало 20 си, температура среды изменялась з пределах 5-7°С.

Обработку ультразвуком эодикх z. водао-сдиртсвнх раехзорез

Нз цроводаш на ультразвуковой терапевтической установке УТП-1 на частота 8В0 кГц. Усредненную по площади. интенсивность "ультразвука (2 Вт/см2) с излучающей, поверхности определяли по радиационному даглениш, измеренному прибором 11ЫУ-3. Раствор Яз во время ультразвуковой, обработки, охлавдался. струей проточноа вода. Альдегид, образующийся. при действии ультразвука на водные раствори этанола, определяли с похой&ю

на. Оптическую плотность анализируемого раствора после развития в аеи окраски, измеряли на длина водны. 550 ни. Включение радиоактивной. метки, связанной, с этанолом, в белок при действии ультразвука на водно-спиртовые растворы, гемоглобина определяли, измеряя радиоактивный, счет в белковых «фракциях после отделения низкоислекулярных соединений гель-фильтрацией. иа сеХадоксе £-25. Радиоактивность, проб определяли на счетчике "i.!ar:c-2" (США.), используя. дЕдасановнй сцинтплдятор.

Электронные спектры, поглощения, образцов Еа после действия ультразвука, а такаа Нв, образовавшего аддукт с ¡Ш в процессе темпов oii инкубации или под действием сзета, сникали, на дзухлуче-' еых спектрофотометрах и РЬгКл - Е&г.гг" (Швеция) и " Spzccrd ¿1 40" ЩИ. Спектры испускания. и. возбуждения. флуоресценции регистрировали на спйнтрсфлуорииетре с монохроматическим возбужденней и регистрацией "fi/гшюг Bsmsun" (США). Спектры SEP.регистрировала на спектрометре ШР ERS-220 ЩП?).

Выделение е. количественное определение минорных и глазной компонент Ев проводили методом ион-об^еннои хроыатогра^ш (Dszy , Hiiismsn , 1969). В качестве полит,тарного носителя, использо-.ваяп ЕЙ-сеЩедекс С-25 емкостью 4,5т0,5 ыокв/г (Pharmacia Япз Chsrn't&is, Пвгпгя.).

•. ЕЕЗПШШ IL ах СШАИЗЕЕЕ

I. Выделение из донорское, гоови человека :днорнсй Стеакцпи

оесп—Нз , содержащей вовалентна связанный 2S. иатодоа наЕ-облгеннсп. хра;:атсгрг_пп. на 2И-се£адакса С-25 из образца окси-Ев донорской, крова человека заделан ряд минорных фракций, (рис. I).

Балок. неиденти^шцщованЕого пика I и^ает параметры ¿лус— . ресценции. характерные для. аддукта US или П1 с белкпг.:: паи возбуждении флуоресценщиг светом. ддинс2. волан. а= 2£в ни а.

Л = 320 .нм в спектрах (¿луоресцештип наблвдаатса. четко гыразйя— пая полоса флуоресценции с максимумом при 4С0 ни. (рис. 2).

0$чОш*

юо sao зоз ш)

Еис. I. Хромахографичвскоа разделение минорных (I, II, Щ) и главной. (А) компонент окси-На человека на КЦ-се^д.-^«я декса С-25.

Рис. 2. Спектры- флусраскзн-ш апо-Нв, выоедзега a процесса иол-оспенной хроматографии в начала прсфзла адэ-ши (пик I): (I) - Д-возд, » 2SS ни; (2) -^зззй. » £30 ни.

J50

Ш

При. диализз или кнслохксЗ. обработка аддутгт частично днсаосп^у-ет, о чем свидетельствует тцаньгевзо интенсивности ^лусресцан-Ц2и в полосе 400 ни.

'„'.сднфггацпа образца сксг-Е? чнлсзеха возрастахгг^а. изйыт-каз ES посредством. НаЖ^ и исследукыд хроматография на сафадекса nazaaazz увеличение 1-ого пгго» платках

содержание I-cu. ¿сакзг возрастало да Лкалйютш,

жщажзсь увеличение 1-ого пика при ион-обменной хроаатограуии. свежеприготовленной, смеси. Нв - ИМ. Однако г велду частично! диссоциации, прд элюции обратимого комплекса, образованного, посредством. основания. Шиффа, при: тех же избытках ЕЛ£ процент белка, шшадшего в. X-oít фракции. меньше, чем. в. предыдущем случае. Увеличение 1-ого ттит,-я при ион-обменпоц хроматографии наблюдалось ж после длительной темновой. инкубации Из и ЕВУ (бело:: предварительна отделялся от избытка лиганда гель-фильтрацией на се.Аа-дексе С-25). Содержание. 1-ой. фракции возрастало до 75% от всего балка, концентрация. ка связавшегося. Ш1У в данной, 'фракции не превышала двух'колой- ШЕЬ на моль белка, при любых избытках лиган-да.

Полученные результаты, указывают на возмо;дте образование ш. vivo стабильных аддуктов Нв с коферыентом,. присутствующим в. эритроцитах человека в концентрации. «-I0 нг/ыл. уплотненных эритроцитов. В связи: с атим, наш: дальнейшие исследования б^ли. поснящены. изучению механизмов, необратимого взаимодействия альдегидов, на примере ШЕа и. зцетальдегкда, с Нв человека и лошади, а такде локализации, центров обратимого и необратимого взаимодействия. ТТ.ЖБ с окси-Нв человека.

' Необратимое взаимодействие ПЛ5 с Нв лошади и человека при, темновой инкубации.

При. длительной, темповой инкубации мет-Нв иди. адо-^îb лошади с 50-100-кратныии. избытками. ПМ происходит образование стабильных. аддуктов лиганда с белком. В У£-спектре поглощения белка, отделенного после инкубации, от избытка ндзкомолекулярпоги реа-' гента голь-^ильтрацией. на се^адексе 0-25, появляется дополнительная. полоса поглощения в. области SSÛ нм (р:;с. 3, кр;1вая 2). Спектр флуоресценции, ano-Ев, .образовавшего ковадентныИ адцукт с ша, содержит, кроме полосы, тршггощааовой. ¿дуоресценцпд с :.'лк-сзщыом. при S50 шл, спектральную составляющую в виде меча при 4С0 ем (рис. 4, кривая 2). В виде более четко выргденно! паюсы флуоресценция адаукта наблюдается прд я ЕааС<_ = 330 яг.;. указанны* избытков Ш2 реакция заканчивалась к 50-72 часам я. дальнейшая пндубацда не приводила к увеличении связ!гяач:тя с белком. ¡Максимальное количество цолекуд лиганда, взаимодействующих с мет-Нв иди апо-Нз досада с образованием стабильных адд/к-тов, равна дцут.-.. Константа скорости, реакции: зторего порядка

составила 1,4-Ю-4 М^'с"*.

Рис.3. Спектры, поглощения исходного аш~Нв (I); адо-Яз, модифицированного ШЕ> при. инкубации в темноте (2)'; аш-Нв, фатоошюленного матиленовои. синью, и мог-дифицираваннолго затем ЕЛЭ при-инкубации в темнота (3). Молярное соотношение белок-лиганд 1:200, продолнителъность инкубации 48 ^шссв. .

£00 л, мм

Рис.. 4. Спектры. флуоресценции.

ИСХОДНОГО £ДО-Нв, Япгга£ = = 293 нм (X); алс~5в, модифицированного П® при индубацш в темноте (Мдщ = 2,0):.

*ВОЗб. = 295 <2>'' ^БОЗб. ~

330 ни (3).

Образование стабильных аддуктоа наблюдалось и при длительно.;! инкубации апа-Зв с [14с]-ацеталъдегидом. В пользу этого свидетельствовало значительное включение радиоактивной, матки в. балок..

Появлений дополнительной, полоса поглощения с ьаксиазгаш ири 330 ем в УФ-слектра поглощения балка обусловлено образованием. . днкличесгдх продуктов типа замещенного альдамина, а на основания Пд$фа в гидрофобном, схружнт, бактеризующегося

иплд. на

Б

спактрш поташщанкЕ, ejs. sas: максимум. поглощения остается неизменный в присутствии 6-8 11 гуанидина. Циклические продеты типа аамещашшх альдимкнса образуются вследствие взаимодействия двой-вой связи основания Шиффа с нуклеаёильннмЕ стерически доступными ампновЕсдютшаи остаткам белка. Такими остатками являтся остатки ггствдвна, триптофана, лиаииа, тирозина и цпстеина. Избирательная модификация остатков тирозина, триптофана и цистеи-ка соответственно йодсм, «"-брэмсукцишидщом и фдусресцепнмерку-ргэдетатом есклотьет участие данных аминокислотных остатков в раакиин образования стабильных «дауктов, поскольку число моле-цгл IZ2>, связавшихся с белком в этом случае и в контроле, остается неизменный. Модификация ей гкстлдиношх остатков контрольного белка s белка, образовавшего аддукт с НПФ, лиазобензосуль-фскиплотоё (реактивом Пзулн) показывает б спектрах поглощения существенное (на IQ-IS?) уменьшение ео втором случае интенсивности поглощения диасотпрозанных гистидпноеых производных в области SSO нм, а такке лизиноекх сроизЕодных в области 363. нм. Участие имидазсльного кольца гиотидиыа в реакции взаимодействия с альдикинлой связью подтверждают и данные по предварительному фотоохисленпо тцстЕданонах. остатков в присутствии метилановой сини, поскольку, количество циклических продуктов, поглощающих в области 330 км, значительно уменьшалось (рис. 3, кривая 3). Основ: т>ясь на получаннкх данных, можно считать, что в необратимом связывании. HS с Ев лошади принимают участие остатки гис-ттттгнп, взаимодействующие с двойней связь» основания Шгзфа, образованной альдегидной группой Ш2> к аминогруппой лизин езого остатка балка.

Зри длительной темповой инкубации при комнатной температуре оксп-Ез человегг. с bö-кратнкмл избытках ШЭ такие происходит конденсация 1,5-2,0 молекул легенда с белком, при этом приблизительно 1,5 остатка лнганда приходилось на 2' z

0,4-0,5 - на 2 ct-цеии. Адгукт имеет абсорбционные и флуоресцентные свойства, ццвнгпчпые свойствам аддуита, образованного гаи дзшаЕьной инкубациЕ. Ев лошади и Ш2.

• Б случае скси-Ве человека оказалось возможным пдеатпфицп-ровать центрн. необратимого связи: ния Ш©, локализованные в ß-uenzx. Поскольку, необратимое взаимодействие включает в себа етадиг обратимого взаимодействия, были установлены, центры обратимого связывания KS с окси-Ёв путем, восстановления альдимпнной

связи в стабильный вторичный амин посредством feBH^. Применение ряда методов: ион-обменной хроматографии, метода пептидных карт, аминокислотного анализа позволило установить в качестве одного из наиболее сильных центров, обратимого связывания ПЛФ с окси-Нв N-концевой вадин ,р-цепи. По ряду параметров адг дукт, образованный восстановлением посредством feEH^ альдимин-ной связи с участием аминогруппы Н-концевого вашша,. идентичен аддукту, образованному в процессе длительной инкубации. Tas, в спектрах флуоресценции изолированных .р-цепей, образовавшх в составе Ив адпукт с Ш3> путем длительной, инкубации п. путем, восстановления, альдиминной связи ЙаВЕ^, наблюдается практически, одинаковое уменьшение по сравнению с контрольной. >-цепью иате&-сивности тршхтофановой флуоресценции. Эффективность меахромофор-ной миграции энергии для J-цепи, образовавшей циклический, ад-дукт с ПЛФ, равна 0,58, для _р-цепи, образовавшей ковалентный аддукт с ШЕ> посредством NaBH^ - 0,65. Следует при этом отметить, что расстояние ыеаду хромофорами (фосфопиридоксиловын хромофором., связанным с N-кохщевым валином $-цепи посредством fíaEE.^, и триптофанилом-15), которое было определено, исходя иа значэ-ния эффективности миграции энергии (Е = 0,65) и критического радиуса миграции энергии (J?Q = 19,5 Á°) для донорно-акцепторной. пары, триптофан - пиридоксин-фосфат, не вполне соответствовало расстоянию меяду хромофорами, которое mqsho было оценить, исходе из вторичной структуры, ^-субъедкнвдн. Наиболее вероятной причиной такого несоответствия является высокая псдвигносзз фосфодирздоксилового таомофора не только за счет вращательной диффузии, но и за. счет значительной сегментальной, гибкости fi-конца .р-цепл (фосфопиридоксяловыи хромофор при зозйуздении. в длинноволновой полосе поглощения имеет низкую, степень поляризации флуоресценции: £ = 0,022).

Был. такге проведен флуоресцентный анатз. разделенных мат о-, дом пегшидных карт тригппгаескЕХ пептидов Нв после его дательной, инкубации с ШШ. Анатгиз показал наличие" слабо флуоресцирующего в области 400 ни пептида. Локализация пептида на пептидной карте близка к. локализации, пептида, образовавшего стабильный, аддукт с ПЕ6 по «t -'^-группе Бал-I ^-пепи вследствие восст?.новления альдиминной связи ПаШ^. В даннсв& пептиде ацитпи-игаггугтгв остат-ток гистидина, способный образовывать- циклический, аддзда: с двойной связью основания ШисЕфа, соседствует с -концевым вага-ном, аминогруппа которого, связывает Ш® с наибольшим сродством. При предварительном фотоокислении сингдетным кислородом гисти-

дановых. и ряда ароматических аминокислотных остатков белка в присутствии метиленовой сини, наряду с уменьшением интенслв-ностк флуоресценции в триптофан-содерзсащих пептидах наблюдали отсутствие флуоресценции в пептиде, ранее образовывавшем ад— дукх с ПШ.

Участие Й-ксшцевого ваш. я в стадии обратимого взашодеЛ— ствия,. а также гистндина-2 в стадии образования циклического адпукта окончательно подтвердили следующие эксперименты. Так, установленная в. ряде работ модификация л-аминогрупп. Вал-1.3-цепак окси-Нв глюкозо-6-фосфахом при длительной инкубации с ниц, а такие доказанная нами первоначальная модификация этих ^а остатков 1ШВ при восстановлении альдиминной связи КаВЦ^ препятствуют образованию, циклических аддукша окси-Нв с ЕШЬ. Кроме того, известно,' что ион двухвалентной меда образует с окси-Нв человека пи-дт.кий четырех-координационный комплекс с участием атомов азота «¿-аминогруппы М-концевого остатка вадина^Ь-цепи, азота соседнего гистидина и, предположительно, атомов азота гистидина-143 и -14Б второй, ^-субъеданицы- ЗШ?-сдектр иона меди указывает на ромбический характер, симметрии электрического поля, окружающего. катит меди (рис.5, Еривая X). Длительная темновая инкубация

Еис. 5. ЭПР-спектры. иона Са(ЗХ) а комплексе с исходным окси-Нв человека (I); в комплексе с продуктом конденсации ШЕЬ д окси-Нв ргдщ, = 1,0) (2); в комплексе с окси-Нв, модифицированным ШЕЕ посредством А!аШд = 4,5) (3).

[НвО^ =8-10"%, [Си250^ =

Частота СВЧ-излуче-ния 9,3 ГЕц, мощность 5 мВт.

окси-Нв и ШЕ$ приводит а трансформации ромбической симметрии электрического поля в аксиальную, причем наибольшее низко-польноз смещение претерпевает ^-еоставляндаа (щхнзая 2). Восстановление посредством Л'аЕЕ^ альдиминной связи, образованной альдегидной щуплой ДЕй и аминогруппой Й-ноацезсто валила, не изменяет фор^ау 2ПБ-спектра■ иона меди, (кривая 3). ЩЭ •связанна»* с окси-Нв только за счет образования основания

з «с-а^жсгруппод ¿ал-1, способствует аеболымау высокосааао-

:..у с;..ецс;1г:а ^у-сос^авлягхед савала катиона ыеда. а ЗПЕ-спактра»

Су^мфуя отд пине, :.:02Н0 заключить, что а образования гтабплыаз: сц,:укгов Ш с сксз-Ыз человека, в тешоха участвуют остатки ^-ксацевого валдн? и Гис-2 /-субьединвц Ез.

Следует отметить, что при одинаковом количестве сзязанннх с Кб молекул лпганда, кзантовьш. выход ^флуоресценции аддукта, образованного путем длительной инкубации, значительна ни^а квантового выхода ..луоресценцдл аддукта, образованного еосстзг-псЕлендем аль^такниОА связи посредством МаШ^. Модельная система позволила сопоставить относительные квантовка выходы, ^х/оресценцид циклического аддухта ШЬЬ-п:стадин^ образованного совместно! ;л-нусациеД а ааацокясдота (£:1С0) в течение неско^клх часов, и адд^ктов ^сс^оидридоксивзалдаа и ^ос^апира-доксидгистнддна, образованных посредством. НаШ^. В качества стандарта применялся шгридоксдн-^осрат, для которого в латера-туре сообщено значение абсолютного квантового ^кхадд (табл. I).

Дддукт

ццндаческзш. адвдвх ШЕ5—гистдднн.

|1ос:^опирлдоксилгистидия пиридоксиа-^осфат

а»

ш2-

0,37

8,7 6,9

4,5 + 0,2

Табл. I.

Таким образом, квантовый выход 1лусресценцдз циклического ад-дукта почти з 20 раз нине квантового титул, -¡лусресценцдг ад-дукта, образованного восстановлением, альддмдннод сзязг НгЖл. Существенный вклад в тушение йлусресцендзи знссдт хыидазольнаа. группа ггстцднда.

£ербратпмая

'Я ив чзлозака

п^рддок—

саль-5—Icclaso:.; под действием света.

Образование козалентинх аддуктсз LLi с Нэ лсдадг а че-тзз»*-ка значительна ускоряется. при идкубаддд на свету. Таz, 1,5 ча~ соз интенсивного солучандя раствора сксз-£з человека з сжсг с. (I:SG) а дгадазона аадгдтх з улыра^ислЕтсад световых

волн достаточно д™ появления в УФ-спектре поглощения белка дополнительного поглощения в области 330 нм. Для ало- или кет-Нв дптятги реакция образования стабильных адлуктов с ИШ> на свету (цри облучении раствора светом обычной лампы накаливания без светофильтра) заканчивалась к 24-30 часам. Ые менее шести молекул, лиганда при этом образовало стабильный аддукт с апо-Ев и не менее двух — с мет-Нв. Ыет-Нв человека также при -инкубации на свету образует аддукты с Ш®, однако, в меньшем, по сравнению,с окси-Нв человека количестве. Количество стабильных адцуктов такке уменьшается в присутствии метиленовой сиш? - сильного акцептора электронов к возрастает при замене растворенного в воде кислорода газообразным азотом.

Интенсивность флуоресценции .аддукта, образованного при инкубации на свету, сопоставима с интенсивностью флуоресценции адвукта, образованного вследствие восстановления двойной связи основания Еиффа КаШ^, Существенное различие квантовых выходов флуоресценции для адауктов. с Нв лошади и человека, образованных инкубацией на свету и в темноте, позволяет говорить о различии дачных аддуктов, т.е. о разных механизмах реакций, приводящих к их образованию.

Еа основе полученных результатов мохно сделать вывод о возможности восстановления атгьдиминной связи в стабильный вторичный амин гидратированными электронами, фотоэхектируемыми под действием света как ароматическими аминокислотными остатками белка, так и молекулами лиганда.

В модельной системе мы. оценили электронакцепторные свойства двойной связи основания Шиффа по эффективности захвата электрона и ее зависимости от расстояния менду электроном и его акцептором. С этой целью сравнили для триптофана и глицил.— триптофана способность основания Шиффа, образованного аминогруппами этих соединений и альдегидной группой валерианового альдегида, изменять вероятность первичной фотохимической реакции флуорофора, сопровождающейся экектированием электрона при его взаимодействии в возбужденном состоянии с. акцептором. Графическая зависимость тушения флуоресценции триптофана и глицшъ-тгпптофана от концентрации альдегида в координатах Штерна— $сдъмера ояидетельствует об одновременном динамическом и статическом механизме тушеная флуоресценции (рис. 6). йлуоресцен-ция ацетил-триптофана, не образующего комплекс основания Шиффа, тущихся только в результате диффузионных столкновений, что поз-

воляет рассчитать константу динамического тушения: Ь.^^ -12,5 1Г . Эффективности статического тушения флуоресценции

í.-I

S-D

Feo. 6.. Тушение флуоресценции ацетил-триптофана (I), глицил-триптофана ¡2) и триптофана (3) залериа-новым альдегидом в координатах Итерна-Фольмера.

350 ни.

чт

*возб. = 2SS вх* лтзег.

триптофана и ггладомралго^ана существенно рааапаетса:

""Три а 71)25 М-1 и Щт-Тй'л ** 21,5 Щ этаи' ^-оясталтп. образования основания Шпффа с альдегидом для обоих флуорофоров

достаточно близки: К,

ас

180 М'

(-1

Рассчитанный гначшу.и гшс-

тант статического тушения флуоресценции, в сравнении a kohcs

той ассоциации комплекса отранарт вероятности фотохимических превращении обоях флуорофоров. Для триптофана и глхшдл-тршдш-фана,. образовавших кокшгггс основания Шиффа с валериановым агьг-дагидсм,. вероятности фотохимической, реакции равны соответственно 0,35 и 0,12. Увеличение расстояния на 4,3 А0 (ш пели.) в' глицил-триитофане. мгзэду двойной связью основания Шифха. п. фсуо-рофорсм привело к. трехкратному уменьшению вероятности. ^охсескх-чзсксй решки, а, следовательно, и трехкратному умекьаенга. вероятности загзгта аяектрсна его акцептором - двойной связью основания Цифра.

4. Необратимая модификация Ев человека ацетальдегидом под действием органических вадикалоз

Ври действии на водно-спиртовые растворы, океи- или. мзт-Нв человека гидроксильных радикалов, образуемых з. процесса ультразвуковой кавитации воды,, наряду с изменением окислительного.

состояния нона гемового железа наблюдали образование альдегида и включение его в состав белковой макромолекулы. Продукт взаимодействия Ев и этанола в ультразвуковом поле устойчив к кислотного гидролизу и элюируется з процессе а\:инокислотного анализа в виде отдельной, щракадш в прокрутке мекду временами выхода гистидина и аргинина. Добавление ацетальдегида к Нв с последующим восстановительным алкилированием NaBH^ дает такой же по времени удерживания пшс в спектре аминокислотного анализа. Количество включенных в состав Нв продуктов сонолиза спирта зависит от продолжительности воздействия ультразвука на водно-спиртовой раствор белка.

Поскольку, ультразвуковая кавитация б водных растворах сопровождается распадом возбужденных молекул воды на радикалы Е" и (Ж*, а также образованием гидратирсванных электронов, в качестве одного аз механизмов взаимодействия, приводящего к образованию стабильных адауктов альдегида с Ив в ультразвуковом поле, можно рассматривать восстановление двойной связи основания Шиффа гидратированныш алектронами.

Двойная связь основания Шифра восстанавливается также в стабильный вторичный амин в реакции взаимодействия с оргаличес-IX..т. свободными радикалами, поскольку, образование стабильные: еддгтав альдегид-белок возрастает в присутствии! органических соединений ЙДЕЕ.или HIS, явлетоетхся эффективными иерехватчика-кислородных свободных радикалов. О возможности. образования органических радикалов спирта, ÜAZ' или ШЭ' и их участия з реакции восстановления двойной связи основан г,я üsitLa с вщщо^ель-ствует также реакция восстановления иона Fe (III) kst-Hj-, действием органических соединений: спирта, Ь'ЛНЕ или ES.

Так, в атмосфере СО или f»v, при действии уштразвуга на водные растворы мех-йв. иен железа Ре(III) мет-Нз только частично восстанавливается в eüh Fe ill) соответственно кгрбокси- ш дааоксс-Цз (рис. 7, кривая 2). Ьосстансглгнг-е мет-Ев происходит в'соответствии о реакциями I и 2:

FtilU) + Z'—-FeOD-r пТ (I)

Ре (III) -г —II) (2)

у<•-.:.равнозесие евпдетелютвует о наличии, конкурент-нищ грсиесссз, ъ первую очередь, сс стороны радикалов СЕ', при-т"—т-т е. u'-ислаиию во с станавл е:-; к ого гемазого железа. В ирисув-гт? оханала, К'г.тпг равновесие сдвигается в сторону

ш

увеличения содержания восстановленной ¿opiai На и при болтах, концентрациях указанных соединении, наблюдали практически, полное восстановление генового железа (кривая. 3).

Рис. 7. Изменений спектра поглощения мет-Ha при воздействии ультразвука на. водный раствор мет-йв а атмосфера азота: I - исходный мет-На; 2 - посла воздействия ультразвука, смесь Met- а .дезскси-Ыз; 3 - посла воздействия ультразвука а присутствии этанола (форма спектра соответствует клр-бокси-Нз). Мощность ультразвука 2 Зт/см2. Кощснтрацдаг * мет-На. - 2*1£Г^ М» этанола -■■¿-,1,7 tí. Продолжительность зсь-действия, ультразвука 30 мин.

спирта,, восстанавливая, ион ^а(ТТТ) мет—Нв, окисляется до альдегида (реакция 3), радикал. tfAi* окисляется до ЙАД?"» радикал ПК* - до фосфопирадоксозо! кислота.

Ре(III) + CEg-CHCH —--С%-СШ Fa(II) (3)

Количество альдегида, образовавшегося в ультразвуковая пола а зодно-спиртова'л растворе мет-äa, достаточна высоко. 3 то sa время, такое sa по длительности воздействие ультразвука на бод-на-схкгртсвый растзор в отсутствие мет-Нз сопровождается образованием следовых количеств альдегида. Таким образом» существенный вклад в образование альдегида йносит рэанцзя восстановления, мет—Lia радикалам:' спирта, и, вероятно» реакция восстановления радикалами спирта двойной, саязи основания £i*<¿a, образованной, аминогруппе! балка а. альдатадсаи

¿53 630

3 Ii ь с л ы.

i.. <-а донорской креви человека гиделен :сд~р;^зцгя необратима связанный.

2. Грл. ^тигельной 2

¿гакцгя Г5г.сглс<?1ш.,

-£-фосфата связываются, с гемоглобином человека необратимо в результате взаимодействия, альдиминной связи с соседним в. поли-паптидаой цели, остатком, гистидина. Стадия обратимого- взаимодействия протекает а участием аминогруппы М-концевых валшюв ß-субъадиниц гемоглобина. Модифицированный гемоглобин имеет измененные спектральные характеристики.

3. По данным. ЭПВ-спектроскопин электрическое поле, катиона меда., связанного с. гемоглобином человека, имеет ромбическую симметрию. Образование стабильных адцуктов гемоглобина человека с пиридоксаль-5-фосфатом при длительной темповой инкубации. изменяет ромбическую симметрию электрического поля катиона меда на аксиальную. Обратимое связывание пиридоксаль-5-фосфата а гемоглобином посредством образования основания Шиффа или образование ковалентных аддуктон посредством МаВЕ^ не изменяет параметры. ЭПР-спактра комплекса катиона меда с белком.

4. -Пра инкубации, на свету двойная связь основания Шиффа,

. образованная первичными, аминогруппами-Нв лошади и человека и . альдегидной, группой щрадоксагь-5-фосфата, восстанавливается а стабильный, вторичный, амин гидратированными электронами, фо--юаяекшруемшс молекулой, лиганда или. ароматическими, аминокислотными. остатками белка. Адаукх имеет спектральные свойства, идентичные свойствам, адцукта, образованного восстановлением апълтагонннх связей посредством. ЫаШ4, но отличающиеся от свойств аддукта, образованного вследствие протекания темновых реакций.

5. Органические радикалы спирта, НАД'* ДЕЗ* восстанавливают ион Ре (III) шт-йв в ферра-форку, а такаа усиливают образование ковалентных аддуктов. альдегида с белком. •

Основное содержание диссертации изломана, в. следующих работах:

1. Степуро ИЛ., Солодунов A.A., Ыптянок Н.В. Механизм взаимодействия Ш1ридоксаль-5~фосфат.а с гемоглобином шпаытных эритроцитов-, человека // Тез. 1-ого Всесоюзного биофизического съезда. - Москва, 1982. - т.1, с.ЗО.

2. Степуро ПЛ., Митянок. Н.В. Механизм взаимодействия

■ пиридоксаяь-5-iоciiara и. ацетальдегида с адо-гемоглобинсм. Конкуренция. за маета связывания, с геминоп// Еиохимня.-1Э83. - т.4£, Ш. - С. S92.

3. Степуро E.H., Ыитянпк R.B., Игнатанкг» В.А. ¡Ъсдадсваг-

IT

¡ins адпуктоз ш1Г'1Щ0ксаль-5-|.'0сфзл:а с гемогдобаисы. галсвксй .'¿.луоресценташм методом // Тез. Всесоюзного симпозиума "Ь£оде:.и1Гс:.^несцезщдя. в медицина а сельском хозяйства". -Ташкент, %АЫ"Г 1957. - С.149.

4. Стспуро 11.Г.., ¡Iniarc-'tKo В.Л., Коновалова Ы.З. 1з1!стдда улыраззука на воднне и водно-сддртсвыа раствори мат-гемоглобина // ¿урн. 1лз. химии.. - ISS8. - т. £2, Д 2. - С. 441.

5. Хгнатенко J.A., Коновалова. Н.З., Стелуро ii.il.» Гардноз. i3.A., Арабед С..'.'.., Егорова Г.Д., Соловьев К.Я. действие ультразвука на ¿ерра±.армц гемоглобина чплавзка // дура. рдз. химии. - 1988. - т. S2, .4 9. - С. 24£В.

о. Stspuro I.I., Konovalovu Н.7. Hola off oxyhemoglobin and nethercoglobin in protection aqaiMC. hydro 27I end argnsis free radicals in. erythrocytes // 7-th International conference "3iochemiotry and Biophysics of cytochroos P-450, Struetm-a and function, bio technological and ecological asp acta". - ISоесо<я, 1991. - p.- 129.

7. Коновалова H.3., Солодунов. А.А., ТыЕандс A.C., Степуро il.ii. Козадентная. модификация. гемоглобина д сдвороточнс— г j альбумина карбоадльннмз. сседплениниз. под действие; еззха // Тез. ЛИ Конференции до сдектрсслодид. бдополдмагса. -Харьков, 1991. - С.123.

8. Степуро И.И., Коновалова Н.Э. Ееонздмагпчесдсо eocss&~ невленда мет-ila под денстзиеи раддкадоз -'АЛ', ггнерируедс: в присутствии. ЙДД1 2 сале! Ре(Ц). Аахгсасляатшэ <дзс2стза. :.:ет-5з // Едофдзика» - IS9I.-" т.25, si2L.fi О^ззазддна в mrazs).