Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Немишенная пострадиационная реакция "эффект свидетеля" у животных и растений

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Немишенная пострадиационная реакция "эффект свидетеля" у животных и растений"

На правах рукописи

ХАРЛАМОВ Владимир Александрович

НЕМИШЕННАЯ ПОСТРАДИАЦИОННАЯ РЕАКЦИЯ «ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ» У ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ

03.01.01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск-2013

3 О МАЙ ш

005060577

Работа выполнена в Обнинском институте атомной энергетики - филиале федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ».

Научный руководитель - доктор биологических наук

Суринов Борис Павлович

Официальные оппоненты:

- Иванов Александр Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией радиационной иммунологии и экспериментальной терапии радиационных поражений ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» ФМБА России;

- Ульяненко Лилия Николаевна, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории экономики и маркетинга ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» Россельхозакадемии.

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии.

Защита диссертации состоится 24.09.2013 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 249036, г. Обнинск Калужской обл., ул. Королева, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» Минздрава России.

Автореферат разослан « /6 » 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Геннадий Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

За последние десятилетия теория мишени, которая была одной из основополагающих концепций в теоретической радиобиологии, претерпела изменения в связи с выявлением так называемых немишенных эффектов, которые развиваются без непосредственного воздействия радиации на исследуемый объект. Наиболее известны: нестабильность генома и «эффект свидетеля» (ЭС) - в англоязычной литературе «bystander effect». Последний был впервые установлен как нарушение в необлученных клетках (клетки-«свидетели»), соседствующих с клеткой (клетка-«мишень»), облученной микропучком излучения (Н. Nagasawa, J. В. Little, 1992).

С каждым годом к фактам, которые могут быть отнесены к этому явлению, постоянно добавляются все более новые данные, получаемые на различных объектах. Показано, что подвергнутые воздействию ионизирующей радиации лабораторные мыши и крысы, или образцы их мочи, будучи помещенными в боксы с интактными особями, вызывают у них нарушения показателей крови и иммунитета (Б. П. Суринов и др., 1998-2012). Межорганизменный вариант ЭС описан и на рыбах (Е. М. Lyng et al., 2004; С. Mothersill et al., 2006). Явление, которое может быть квалифицировано как ЭС, обнаружено также и на растительных объектах - хранение в общем воздушном объеме облученных и необлученных семян сельскохозяйственных культур приводит к изменению начальных ростовых показателей последних (В. И. Левин, 2000; Е. К. Еськов, В. И. Левин , 2002).

Если на клеточном уровне ЭС, как предполагают, реализуется с участием растворимых метаболитов, то межорганизменный ЭС у животных или ЭС у семян растений по существующим представлениям реализуются за счет летучих выделений (ЛВ). Несмотря на то, что эти факты были выявлены на далеких друг от друга видах живых организмов, у них имеется и общее -и тот и другой эффекты проявляются дистанционно.

Ранее в исследованиях на животных было установлено, что ЭС может носить и обратный характер: интактные особи или их ЛВ при определенных условиях способны восстанавливать пострадиационные нарушения у облученных особей (Б. П. Суринов и др., 2008). Предполагалось, что подобное может иметь место и у растительных объектов.

На уровне межклеточных коммуникаций радиобиологический ЭС давно и подробно исследуется разными коллективами ученых, тогда как на межорганизменном уровне он представлен в единичных работах и нуждается в расширении исследований. Такие исследования имеют общебиологическое значение, так как на примере ионизирующей радиации раскрывают механизмы распространения последствий воздействия повреждающих факторов среди биологических объектов разного происхождения.

Необходимость расширения подходов к исследованию ЭС обусловлена значением его не только для теоретической радиобиологии, но и для выяснения последствий воздействия ионизирующей радиации в лечебных целях, прогноза экологических последствий в случае радиационных аварий и др.

Цель и задачи. Целью работы был анализ обусловленных летучими выделениями закономерностей немишенной пострадиационной реакции «эффект свидетеля» у животных и растений.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

— проанализировать и сравнить влияние летучих выделений облученных лабораторных мышей на антителогенез в селезенке и лимфатических узлах у интактных (необлученных) особей;

-оценить влияние естественных летучих выделений интактных мышей на антителогенез в селезенке и лимфатических узлах облученных особей;

— установить биологические эффекты совместного хранения и проращивания облученных семян с интактными в виде модификации начальных ростовых процессов;

— выявить общие закономерности «эффекта свидетеля» у животных и растений.

Научная новизна

Впервые предложены способы регистрации ЭС на межорганизменном уровне у мышей по модификации гуморального иммунного ответа в лимфатических узлах, а у семян растений — по изменению начальных ростовых процессов.

Впервые установлены основные закономерности эффектов пострадиационных ЛВ мышей на способность к гуморальному иммунному ответу в региональных лимфатических узлах у интактных особей-реципиентов.

Впервые показано влияние облученных воздушно-сухих семян сельскохозяйственных растений на интактные семена на стадии проращивания на едином субстрате.

Впервые сформулировано представление о том, что у животных и растений, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации, имеются близкие по дистанционным механизмам закономерности, которые соответствуют понятию об ЭС.

Теоретическая и практическая значимость работы. Установленные в работе закономерности свидетельствуют о возможности дистанционного распространения пострадиационных реакций у различных видов живых организмов. Следовательно, результаты диссертационной работы могут быть использованы для моделирования последствий техногенных катастроф и испытаний влияния различных факторов на биологические объекты. Часть исследований выполнена в рамках НИР «Зависимость от генотипа иммунных и поведенческих эффектов хемосигнализации у интактных и облученных животных» (№ госрегистрации 01200951615) и по гранту №09-04-97505

4

«Иммуномодулирующая хемосигнализация у животных как биологически целесообразный эффект при нарушениях радиационного и нерадиационного происхождения», финансируемого РФФИ и Правительством Калужской области.

Практическая значимость работы состоит в том, что результаты работы используются на практических занятиях по дисциплине «Радиационная иммунология» у магистрантов, обучающихся в Обнинском институте атомной энергетики - филиале НИЯУ МИФИ по направлению 020400.68 «Биология» по программе «Экспериментальная радиобиология».

Результаты работы имеют и фундаментальное значение, поскольку расширяют современный уровень представлений о немишенных эффектах ионизирующего излучения и демонстрируют дистанционные их механизмы на животных и растительных объектах.

Методология и методы исследования. ЭС у мышей регистрировали по модификации антителогенеза (метод Каннингема) в селезенке и региональных лимфатических узлах у облученных и интактных особей, подвергавшихся взаимному воздействию ЛВ их мочи, у растений -по изменению начальных ростовых процессов проростков облученных семян и экспонированных с ними интактных семян.

Положения, выносимые на защиту:

1. Интактные и облученные животные способны дистанционно, взаимно модифицировать иммунную реактивность в селезенке и региональных лимфатических узлах за счет естественных или пострадиационных летучих выделений.

2. Интактные и облученные воздушно-сухие семена сельскохозяйственных растений при совместном их хранении или проращивании в ограниченной среде взаимно модифицируют начальные ростовые процессы за счет участия летучих метаболитов.

3. Определенное сходство обусловленных летучими метаболитами проявлений «эффекта свидетеля» у таких далеких биологических организмов, как животные и растения, демонстрирует общебиологический характер данного явления.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты диссертации опубликованы в 2 статьях в научных журналах, рекомендованных ВАК МОиН РФ, в 8 материалах сборников статей и конференций, докладывались и обсуждались на международных конференциях.

Конференции, на которых представлялись результаты работы:

- Third International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky «Modern Problems of Genetics, Radiobiology Radioecology and Evolution», Alushta, Ukraine, 2010.

— Техногенные системы и экологический риск, Обнинск, 2010, 2011,2012.

5

— Международная конференция «Окружающая среда и человек: друзья или враги?», Пущино, 2011.

— Международная научно-практическая конференция «Чернобыльские чтения», Гомель, Беларусь, 2012.

— Международная конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2012.

Диссертационная работа апробирована на научной конференции кафедры биологии Обнинского института атомной энергетики — филиала Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ», состоявшейся 7 июня 2012 г. (протокол № 9).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования. В работе были использованы лабораторные мыши и семена зерновых сельскохозяйственных растений. Половозрелых мышей-самцов гибридов (СВАхС57ВЬ/6)Р1 с массой тела 21-23 г. содержали в полипропиленовых боксах (по 5-7 особей) в условиях вивария. Воздушно-сухие семена сельскохозяйственных растений (пшеницы сортов Московская 39 и Памяти Федина, тритикале сорта Антей) в течение всего периода исследований хранили в лабораторных условиях. Семена (по 100 штук) помещали в пакеты из фильтровальной бумаги. В каждой серии экспериментов использовали семена, которые принадлежали одной партии, сроки хранения и проращивания были одинаковы.

Методика экспериментов на лабораторных мышах. Мышей гибридов (СВАхС57ВЬ/6)Р 1 подвергали воздействию у-излучения в дозах 1 или 4 Гр тотально на установке «Луч». Мощность источника (б0Со) излучения 0,4-0,6 Гр/мин. На время облучения животных помещали по 5-7 особей в камеру из оргстекла с отверстиями по периметру.

Образцы мочи, содержащие исследуемые летучие выделения (ЛВ), получали от доноров — интактных мышей или через 3 суток после воздействия радиации. Для этого использовали бумажные подстилки (лист фильтровальной бумаги), которые помещали на сутки под дополнительное сетчатое дно (решетку из нержавеющей стали) боксов для содержания животных. Подстилки, впитавшие в течение суток мочу мышей-доноров (5 особей), переносили под сетчатое дно боксов с реципиентами (по 7 особей в группе).

Для индукции системного (селезенка) или регионального (подколенные лимфатические узлы) первичного тимусзависимого гуморального иммунного ответа реципиентам вводили эритроциты барана (ЭБ), соответственно, внутрибрюшинно или в подушечку стопы задней лапы. Определяли число антителообразующих клеток (АОК) методом Каннингема и общее число клеток (клеточность) в селезенке или подколенных лимфатических узлах.

Методика экспериментов на семенах растений. Семена подвергали воздействию у-излучения 60Со (установка «Исследователь») в дозах 200, 400, 600 Гр при мощности дозы 25,0-30,0 Гр/мин.

Дистанционное (через общую воздушную среду) взаимовлияние облученных семян и интактных семян исследовали, помещая пакеты из фильтровальной бумаги с соответствующими семенами вплотную в картонную коробку. По завершении совместного хранения (1, 3, 6 месяцев) облученных и интактных семян, их проращивали в чашках Петри (по 25 семян из 100 проращиваемых) и на седьмые сутки определяли начальные ростовые процессы, оцениваемые по длине ростка и зародышевого корешка.

В следующей серии опытов облученные (400 Гр) воздушно-сухие семена проращивали вместе с интактными семенами в полипропиленовых контейнерах в двух вариациях - на общем или раздельном субстратах (промытый речной песок). Для этого облученные и интактные семена поочередно в 4 ряда по 10 штук (из 100 проращиваемых семян) укладывали в контейнер на увлажненный песок и накрывали пищевой полимерной пленкой. Раздельное проращивание осуществлялось с использованием водонепроницаемых желобков, наполненных песком. Семена проращивали на 10-е сутки после облучения. На седьмые сутки проращивания измеряли длину ростка и зародышевого корешка.

Эксперименты на животных и растительных объектах воспроизводили не менее чем в трех независимых сериях. Показатели выражали в процентах от необлучаемого (интактного) контроля.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ (^аййиса 6.0». Результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Значимость различий параметров оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Описанные ниже результаты содержат только статистически значимые данные.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммуномодулирующие эффекты пострадиационных и естественных JIB

у лабораторных мышей

Влияние пострадиационных ЛВ мышей на гуморальный иммунный ответ в селезенке и лимфатических узлах интактных особей После прямого воздействия на мышей ионизирующего излучения в дозе 4 Гр в течение достаточно длительного срока наблюдения (1-2 месяца) жизнеспособность животных не изменялась. Вместе с тем, через 3 суток после облучения (разгар лучевого поражения иммунной системы) имела место выраженная иммуносупрессия, выявляемая реакцией мышей на введение ЭБ. При этом в селезенке снижалась численность АОК до 52,2±0,9% и клеточность

7

до 54,0±1,4% относительно контроля (интактных мышей). В подколенных лимфатических узлах АОК не обнаруживались, а клеточность снижалась до 44,7±2,6%. Продуцируемые в течение 3-их суток такими животными с мочой пострадиационные JIB обладали следующими эффектами на иммунную систему интактных мышей.

При иммунизации ЭБ мышей (необлученных «свидетелей» лучевого эффекта) через 1 сутки после экспозиции с пострадиационными JIB в селезенке снижалась численность АОК до 71,0±6,1% (рис. 1) относительно контроля без изменения клеточности органа. Иммунизация мышей через 3 суток после экспозиции с JTB выявила уменьшение численности АОК до 53,0±2,0%, а клеточности селезенки- до 61,0±12,0.%. Через 7 суток после экспозиции с пострадиационными JIB исследуемые показатели иммунной реактивности мышей не отличались от контроля.

300 J-

250

Q

| 200 :-

I 150

о

* 100

-.р ;

50 ;-

о -1 з 7 Сроки иммунизации после экспозиции с Л В, сут

Рис. 1. Содержание АОК в селезенке и лимфатических узлах мышей-«свидетелей», иммунизированных в различные сроки после экспозиции с пострадиационными JIB.

Примечание: * — статистически значимое отличие от контроля; здесь и далее значимость различий параметров оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

В отличие от селезенки, в лимфатических узлах мышей-«свидетелей» иммунная реактивность не снижалась, а повышалась. Так, при иммунизации через 1 сутки после экспозиции с пострадиационными JIB численность АОК в лимфатических узлах увеличилась до 241,0±29,1% (рис. 1), а клеточность -до 158,0±13,2% от контроля. При иммунизации через 3 суток после экспозиции с JIB исследуемые показатели не отличались от контроля.

Приведенные выше данные характеризуют влияние пострадиационных JTB на развитие иммунного ответа с участием предшественников иммунокомпетентных клеток. Для определения чувствительности продуктивной фазы антителогенеза к эффекту пострадиационных JIB

мышей-«свидетелей» вначале иммунизировали ЭБ, а затем, через 2 и 7 суток, экспонировали с ЛВ интактных (контроль) или облученных (4 Гр) мышей (рис. 2).

Рис. 2. Содержание АОК в селезенке и лимфатических узлах мышей-«свидетелей», экспонированных с пострадиационными (4 Гр) J1B после иммунизации.

Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля.

Воздействие пострадиационных ЛВ на мышей-«свидетелей» через 2 суток после их иммунизации сопровождалось повышением численности АОК в селезенке до 137,0±9,8% относительно контроля (рис. 2). Экспозиция с такими же ЛВ через 7 суток после иммунизации увеличивала этот показатель до 158,0±12,7%, но снижала клеточность органа до 68,4±3,4%.

В лимфатических узлах мышей, экспонированных с пострадиационными ЛВ через 2 суток после антигенного стимула, численность АОК увеличивалась до 194,0±26,9%, а через 7 суток - до 211,0±22,2% (рис.2). Клеточность лимфатических узлов при этом не изменялась.

Таким образом, в ранние сроки после воздействия ионизирующей радиации в сублетальной (4 Гр) дозе мыши продуцируют ЛВ, которые в зависимости от срока относительно иммунизации и лимфоидного органа иммунитета обладают иммуносупрессивной (в селезенке) или иммуностимулирующей (в лимфатических узлах, а после введения антигена мышам также и в селезенке) активностью по отношению к интактным (необлученным) реципиентам - мышам-«свидетелям».

Стимуляция антителогенеза в селезенке и региональных лимфатических узлах облученных мышей воздействием JIB интактных особей

Объектом влияния естественных ЛВ служили мыши, которые через 3-е суток после воздействия радиации в дозе 1 Гр имели пониженные

250 х

*

2

7

Сроки экспозиции с ЛВ после иммунизации, сут

иммунологические показатели - снижение численности АОК в селезенке в 1,6 раза и клеточности в 1,3 раза относительно интактных мышей (контроль).

Экспонирование облученных в дозе 1 Гр мышей за 1 сутки до иммунизации (влияние на клетки-предшественники иммунного ответа) с естественными ЛВ повышало практически до уровня нормы (контроль) численность АОК в селезенке до 96,0± 11,0% и ее клеточность до 113,0±15,6 %(рис. 3).

140 т 120 100 80 60 40 20 0

( ** )

4-

( ** ]

Иммунизация через 1 сут после экспозиции с естественными ЛВ

♦ Котрояь

—I-

Экспозиция с естественными Л В

в течение 1 сут после иммунизации

Экспозиция с естественными ЛВ

через 3 сут после иммунизации

1Гр

1 Гр + естественные ЛВ

Рис. 3. Содержание АОК в селезенке у облученных мышей, экспонированных с естественными ЛВ.

Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля;

** - статистически значимое отличие от облученных мышей.

Экспонирование облученных мышей с естественными ЛВ в течение I -х суток после иммунизации (влияние на индуктивную фазу антителогенеза) повышало практически до нормы численность АОК в селезенке (104,8±10,0%).

Экспозиция облученных мышей через 3 суток после иммунизации (продуктивная фаза антителогенеза) с естественными ЛВ интактных мышей восстанавливала численность АОК до 74,8±8,7% от контроля (рис. 3). У облученных особей без экспонирования - 44,1 ±7,0%.

В региональных лимфатических узлах пострадиационное нарушение иммунитета при облучении мышей в дозе 1 Гр проявлялось в снижении численности АОК в 2,5 раза и клеточности в 1,8 раза относительно показателей в контроле — интактных особей (рис. 4).

Экспонирование облученных мышей за 1 сутки до иммунизации ЭБ с ЛВ интактных особей (воздействие на клетки-предшественники иммунного ответа) восстанавливало численность АОК в лимфатических узлах до 50,5±3,8%

от контроля, что существенно превышало показатель облученных мышей без экспонирования - 30,8±2,6% от контроля (рис. 4). При этом клеточность лимфатических узлов у экспонированных и облученных мышей не достигала уровня интактных мышей (контроль).

Воздействие на облученных мышей естественных ЛВ в течение 1 -х суток после иммунизации (индуктивная фаза иммунного ответа) не изменяло исследуемые показатели иммунного ответа в лимфатических узлах (рис. 4).

120

юо ;-

80 70 60

5 50 j 40 \ -

2 30 i-

с :

5 20 I-10 о

I

i I

I **) *

-ь

Иммунизация через 1 сут после экспозиции с естественными ПВ

* Контроль

Экспозиция с естественными ПВ

в течение 1 сут после иммунизации

Экспозиция с естественными ЛВ

через 3 сут поспе иммунизации

1 Гр

\ Гр + естественные ПВ

Рис. 4. Содержание АОК в лимфатических узлах облученных мышей, экспонированных с естественными ЛВ в разные сроки относительно иммунизации.

Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля;

** - статистически значимое отличие от облученных мышей.

Через 3 суток после иммунизации мышей (продуктивная фаза иммунного ответа) экспонирование с естественными ЛВ повышало количество АОК в лимфатических узлах до 55,0±2,2% от контроля (у облученных мышей без экспонирования - 37,2±1,6% от контроля (рис. 4).

Таким образом, согласно представленным результатам, интактные мыши с помощью естественных ЛВ способны стимулировать антителогенез в селезенке и региональных лимфатических узлах у облученных (1Гр) особей. Эффекты естественных ЛВ интактных мышей на облученных особей, в отличие от эффектов пострадиационнных ЛВ на интактных особей, практически не зависят от срока относительно иммунизации.

Радиационно-индуцированные дистанционные эффекты меиеду облученными и интактными семенами растений Эффекты и состав пострадиационных выделений воздушно-сухих семян, облученных в разных дозах

Воздействие ионизирующей радиации в дозах 200, 400 и 600 Гр на воздушно-сухие семена пшеницы (на примере сорта Московская 39) понижает их начальные ростовые процессы, что соответствует представлениям о пострадиационных нарушениях у этих объектов (В. И. Левин, 2000). Через 1 и 3 месяца после облучения длина ростка и зародышевого корешка была в несколько раз меньше по сравнению с контролем (интактными семенами).

У основного объекта нашего исследования — интактных семян, хранившихся (экспонированных) с облученными семенами (семена-«свидетели»), также имели место изменения начальных ростовых процессов, но они носили другой характер. Так, длина зародышевого корешка семян-«свидетелей» после совместного хранения в течение месяца с облученными в дозах 200 и 400 Гр семенами не уменьшалась, как у облученных семян, а статистически значимо увеличивалась до 119,1±3,8 и 117,0±3,1% от контроля. Длина ростка семян-«свидетелей», хранившихся с облученными в дозе 600 Гр семенами, напротив, была уменьшена до 83,8±2,4% от контроля.

Увеличение продолжительности до 3-х месяцев экспонирования семян-«свидетелей» с облученными в дозе 200 Гр семенами уменьшало длину ростка и зародышевого корешка до 93,1 ±2,8 и 89,6±2,8%. У семян, хранившихся с облученными в дозах 400 и 600 Гр семенами, длина ростка и зародышевого корешка была уменьшена до 79,0±2,9 и 78,3±2,7%, 77,6±1,5 и82,6±1,7%, соответственно. Зависимость от дозы радиации проявлялась только в виде тенденции.

Таким образом, совместное хранение семян-«свидетелей» с облученными семенами модифицирует их начальные ростовые процессы. При этом наблюдается более сложная зависимость от срока и дозы радиации, чем у семян, подвергнутых прямому воздействию радиации.

Изложенные выше результаты в основном подтверждают ранее описанные данные о том, что последствия влияния облученных семян пшеницы (на примере сорта Приокская) на интактные подобны прямому воздействию радиации (В. И. Левин, 2000). Считается, что такой эффект обеспечен выделением микроколичеств летучих газообразных соединений (Е. К. Еськов, В. И. Левин, 2002). Материалы, исключающие газообмен или хранение в условиях с пониженной положительной температурой, лишают способности облученным семенам влиять на интактные семена. В связи с этим исследовано изменение состава их газообразных выделений.

Определяемый газохроматографически состав пострадиационных и естественных летучих выделений воздушно-сухих семян (на примере тритикале «Антей») существенно различался. Влияние величины дозы (200, 400, 600 Гр) облучения на содержание JIB было найдено для альдегидов (гексаналь), кетонов (2-гептанон, 2-октанон, З-октен-2-он, 2-нонанон) и спиртов (1-октен-З-ол, бензиловый спирт, 2-этил-1-гексанол).

Модификация пострадиационного ответа у воздушно-сухих семян, хранившихся с облученными семенами Продемонстрированное выше влияние облученных семян на начальные ростовые процессы интактных семян обусловлено, очевидно, изменениями в метаболизме последних. В связи с этим возникает предположение о возможности модификации их радиочувствительности экспонированием с облученными семенами в общей воздушной среде.

При экспериментальной проверке такой гипотезы было установлено, что воздействие радиации (200 Гр за 1 сутки до проращивания) на семена, хранившиеся в течение 1-го месяца с облученными в дозах 200 Гр или 400 Гр семенами, сопровождается снижением пострадиационного ингибирования длины ростка и зародышевого корешка. Так, длина ростка и длина зародышевого корешка у семян, до прямого воздействия радиации экспонированных с семенами, облученными в дозе 200 Гр, составила соответственно 77,5±1,7 и 84,4±1,9%, а у экспонированных с облученными в дозе 400 Гр - 83,6±1,4 и 91,5±1,4% от контроля (интактных семян). У семян, хранившихся отдельно от облученных, эти же показатели после прямого воздействия радиации были меньше — 62,6±1,9 и 72,8±2,3% от контроля.

Аналогичные результаты были получены и при исследовании радиочувствительности семян, после 3-х месяцев совместного хранения с облученными в дозе 200 Гр семенами. У семян, хранившихся с облученными, а затем подвергнутых прямому воздействию радиации (200 Гр), длина ростка и длина зародышевого корешка составила 90,9±3,5 и 93,2±3,2% от контроля (интактных семян). Эти же показатели у семян, хранившихся отдельно от облученных, составляли 69,5±1,9 и 77,2±1,9% от контроля. Длина ростка семян, экспонированных с облученными в дозе 400 Гр, равнялась 79,9±1,3%.

Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о способности совместного хранения в общем объеме облученных семян пшеницы снижать чувствительность интактных семян к последующему воздействию радиации.

Стимулирующий эффект интактных на облученные семена Помимо описанных выше эффектов облученных семян злаковых культур на свойства интактных было обнаружено и обратное явление — способность интактных семян стимулировать начальные ростовые процессы у облученных семян, т.е. снижать последствия воздействия радиации.

Установлено, что хранение облученных воздушно-сухих семян (на примере гибрида ржи и пшеницы — тритикале сорта Антей) с интактными семенами повышает их ростовые процессы. Так, длина ростка у облученных в дозе 200 Гр семян после экспонирования в течение 1 месяца с интактными семенами была 19,4±0,4% от контроля. У облученных в той же дозе семян, но хранившихся отдельно - 18,1±0,4% от контроля.

Увеличение срока совместного хранения облученных семян с интактными семенами до 3 месяцев сопровождалось еще более выраженной стимуляцией роста проростков, но только в отношении семян, облученных в дозах 400 и 600 Гр. Длина зародышевого корешка у облученных в дозе 200 Гр семян и экспонированных с интактными семенами составляла 22,5±0,6% от контроля, у облученных в той же дозе семян, хранившихся отдельно от интактных - 24,8±0,9%. Семена, облученные в дозе 400 Гр и хранившиеся с интактными семенами, имели длину зародышевого корешка 26,7±1,3% от контроля, у отдельно хранившихся семян она составила 23,6±0,9%. Если у облученных (600 Гр) семян, хранившихся отдельно от интактных, длина зародышевого корешка составляла 19,8±0,6% от контроля, то после экспонирования 3 месяца с JIB интактных семян она увеличивалась до 24,4±0,6%.

Влияние интактных семян на хранившиеся с ними в течение 6 месяцев облученные семена несколько отличалось от вышеописанного. Так, у облученных в дозе 200 Гр семян, хранившихся 6 месяцев с интактными семенами, длина зародышевого корешка составляла 31,1±0,9% от контроля (у отдельно хранившихся семян - 27,7±0,9%). Семена, облученные в дозе 400 Гр и совместно хранившиеся (6 месяцев) с интактными семенами, не отличались начальными ростовыми процессами от облученных в той же дозе семян, хранившихся отдельно от интактных. Более заметным было влияние интактных семян на облученные в дозе 600 Гр семена. Длина зародышевого корешка таких облученных семян составляла 36,4±1,5% от контроля, у облученных в той же дозе семян, но хранившихся отдельно от интактных семян — 27,1±1,2%. Длина ростка составила 12,2±0,3% от контроля у первых и 11,0±0,5% у вторых.

Взаимовлияние облученных и интактных семян на стадии проращивания

На семенах пшеницы (на примере сорта Памяти Федина) установлено, что начальные ростовые процессы интактных семян (необлученных «свидетелей» лучевого эффекта), проращиваемых в общем воздушном объеме с облученными в дозе 400 Гр на раздельном или общем субстрате, отличались от интактных семян (контроль).

Модификация начальных ростовых процессов семян-«свидетелей», проращиваемых с облученными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном объеме, заключалась в снижении на 7-е сутки проращивания длины ростка и зародышевого корешка (рис. 5). Семена-«свидетели», проращиваемые с облученными семенами на общем субстрате и в общем воздушном объеме,

имели большую длину зародышевого корешка, чем в контроле — у интактных семян (рис. 5).

140 ц-

( **)

120

( **)

*

§ юо !-

о

*

»

*

I

И Длина ростка

„ Дпдаа зародьязевога " корешка

♦ Показатель в контроле

И

На раздельных субстратах в общем воздушном объеме

На общем субстрате в общем воздушном объеме

Рис. 5. Начальные ростовые процессы интактных («свидетели») семян пшеницы после совместного проращивания с семенами, облученными в дозе 400 Гр.

Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля;

** — статистически значимое отличие от семян-«свидетелей», проращиваемых с

облученными на раздельных субстратах и в общем воздушном объеме.

Показано, что различались и ростовые показатели у семян-«свидетелей», проращиваемых с облученными семенами на раздельном или общем субстрате и в общем воздушном объеме. Длина ростка и зародышевого корешка семян-«свидетелей», проращиваемых с облученными семенами на общем субстрате и в общем воздушном объеме, оказалась больше, чем у семян-«свидетелей», проращиваемых с облученными семенами на раздельном субстрате, но в общем воздушном объеме (рис. 5).

Далее исследовали влияние на начальные ростовые процессы семян пшеницы, облученных в дозе 400 Гр, после совместного проращивания с интактными семенами. Облученные семена, проращиваемые с интактными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном объеме, имели сниженную по сравнению с проращиваемыми отдельно облученными семенами (без воздействия интактных семян) интенсивность начальных ростовых процессов, оцениваемую по длине ростка и зародышевого корешка (рис. 6).

Сравнение ростовых показателей облученных семян, проращиваемых с интактными семенами на общем субстрате и в общем воздушном объеме, и облученных семян, проращиваемых с интактными семенами на раздельном субстрате и в общем воздушном объеме, показало увеличение длины ростка и зародышевого корешка у первых (рис. 6).

120 т 100 -80

40 35 30 25 20 15 10 5 0

[ **)

( ** ]

|

Длина роста

Длина зародышевого корешка

Паказатет? в контроле

Отдельно

На раздельных субстратах

На общем субстрате в общем воздушном объеме

воздушном объеме

Рис. 6. Начальные ростовые процессы семян пшеницы, облученных в дозе 400 Гр и проращиваемых с интактными семенами.

Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля;

** _ статисхически значимое отличие от облученных семян, проращиваемых с

интактными на раздельных субстратах и в общем воздушном объеме.

Таким образом, облученные воздушно-сухие семена пшеницы при совместном проращивании с интактными семенами той же культуры способны оказывать взаимное влияние на начальные ростовые процессы этих объектов. Выраженность и направленность влияния зависят от участия ЛВ, продуцируемых ими в общую воздушную среду, а также от выделения продуктов метаболизма в субстрат.

ВЫВОДЫ

1. Экспонирование интактных мышей (особи-«свидетели») с летучими выделениями облученных (4 Гр) мышей (особи-«мишени») до введения антигена угнетает способность к иммунному ответу в селезенке, но стимулирует его в лимфатических узлах. Воздействие пострадиационных летучих выделений после сенсибилизации антигеном значительно повышает антителогенез в обоих лимфоидных органах мышей-«свидетелей».

2. Воздействие естественных летучих выделений интактных мышей на облученных (1 Гр) сопровождается, независимо от срока иммунизации, восстановлением практически до нормы способности к антителогенезу как в селезенке, так и в лимфатических узлах.

3. Интактные воздушно-сухие семена пшеницы (семена-«свидетели») после хранения в течение 1 и 3 месяцев с облученными (200 или 400 Гр)

семенами (семена-« мишени») снижают свою чувствительность к последующему воздействию радиации в дозе 200 Гр.

4. Интактные воздушно-сухие семена злаковых (на примере гибрида ржи и пшеницы) стимулируют начальные ростовые процессы облученных в дозах 200, 400 и 600 Гр семян при совместном хранении в течение 1, 3 и 6 месяцев.

5. Интактные и облученные семена пшеницы при совместном проращивании способны оказывать взаимное влияние на их начальные ростовые процессы.

6. Предполагается, что «эффект свидетеля» носит адаптационный характер, так как на межорганизменном уровне у животных и растений имеет место взаимовлияние и зависимость от состояния облученных «мишеней» и интактных «свидетелей». В пользу такого суждения свидетельствуют также отдельные данные литературы, полученные на клеточном уровне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ результатов исследований показывает, что в механизмах развития ЭС у животных и растений имеются общие закономерности. Во-первых, в том и другом случаях ведущее значение имеют летучие метаболиты, причем не только пострадиационные, но и естественные ЛВ. Во-вторых, как у семян сельскохозяйственных культур, так и у лабораторных мышей ЭС не ограничивается индукцией облученными объектами-«мишенями» нарушений исследуемых показателей у необлученных объектов-«свидетелей». Имеет место также и влияние интактных объектов на облученные. И, в-третьих, облученный объект и объект «свидетель» взаимно модифицируют свойства друг друга. Эти факты существенно уточняют распространенное представление об однонаправленности ЭС. Их необходимо учитывать при прогнозировании последствий радиационных аварий, планировании модельных экспериментов или испытаниях противолучевых средств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Харламов, В. А. Эффекты опосредованного влияния гамма-облученных семян пшеницы на интактные при совместном хранении / В. А. Харламов, Б. П. Суринов //Техногенные системы и экологический риск. Материалы докладов VII Региональной научной конференции. - Обнинск, 2010. - 4.2 -С. 86-91.

2. Kharlamov, V. A. Bystander effect between irradiated and not irradiated wheat seeds /V. A. Kharlamov, B. P. Surinov //Third International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky «Modern Problems of Genetics, Radiobiology Radioecology and Evolution»: Abstr. Papers by Young Scientists -Dubna: ЛШ,2010.-Р. 188-190.

3. Kharlamov, V. A. Bystander response in intact wheat seeds induced by the influence of y-irradiated ones N. A. Kharlamov //International conference «Men and Environment: Enemies or Friends?» Abstr. - Pushchino, 2011. - P. 300-301. (Харламов, В. А. Реакция свидетеля у интактных семян пшеницы на воздействие у-облученных /В. А. Харламов // Международная конференция «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» Материалы конференции -Пущино, 2011.-С. 178-180.)

4. Суринов, Б. П. Разнонаправленные эффекты пострадиационной хемосигнализации на иммунную реактивность мышей /Б.П. Суринов,

A. Н. Шарецкий, В. А. Харламов //Сборник научных работ лауреатов областных премий и стипендий. - Калуга: КГУ им К. Э. Циолковского, 2011. — Вып. 7.-С. 225-233.

5. Харламов, В. А. Влияние пострадиационных хемосигналов мышей на гуморальный иммунный ответ в региональных лимфатических узлах интактных реципиентов / В. А. Харламов, А. Н. Шарецкий, Б. П. Суринов //Техногенные системы и экологический риск. Материалы докладов VIII Региональной научной конференции - Обнинск, 2011. — Ч.З. — С. 93-96.

6. Шарецкий, А. Н. Влияние радиационно-индуцированных bystander хемосигналов мышей на гуморальный иммунный ответ в селезенке и лимфатических узлах интактных реципиентов / А. Н. Шарецкий,

B. А. Харламов, Б. П. Суринов // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2012. - Т 52. - №3. - С. 229-233.

7. Харламов, В. А. Модуляция гуморального иммунного ответа у интактных мышей, индуцированная воздействием хемосигналов облученных особей / В. А. Харламов, Б. П. Суринов //Материалы международной научно-практической конференции «Чернобыльские чтения-2012» - Гомель: ГУ «РНПЦ РМиЭЧ», 2012. - С. 94-96.

8. Суринов, Б. П. Иммуномодулирующий эффект естественных хемосигналов животных на особей с иммунодефицитным состоянием / Б. П. Суринов, А. Н. Шарецкий, В. А. Харламов, Ю. Н. Анохин //Сборник статей третьей Международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» — Санкт-Петербург, 2012. - Т.2. - С. 53-55.

9. Харламов, В. А. Пострадиационный эффект свидетеля как феномен межорганизменных коммуникаций / В. А. Харламов //Техногенные системы и экологический риск. Материалы докладов IX Региональной научной конференции. - Обнинск, 2012. - С. 94-98.

10. Харламов, В. А. Модификация радиационных нарушений у животных и растений естественными летучими выделениями / В. А. Харламов, Б. П. Суринов // Бюллетень Национального Радиационно-эпидемиологического регистра «Радиация и риск» - 2013. - Т. 22. - №1. - С. 62-69.

Заказ № 1013. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 Vi6. Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Харламов, Владимир Александрович, Обнинск

ОБНИНСКИЙ ИНСТИТУТ АТОМНОЙ ЭНЕРГЕТИКИ -ФИЛИАЛ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО АВТОНОМНОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЯДЕРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ «МИФИ»

На правах рукописи

04201361606

ХАРЛАМОВ ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ

НЕМИШЕННАЯ ПОСТРАДИАЦИОННАЯ РЕАКЦИЯ «ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ» У ЖИВОТНЫХ И РАСТЕНИЙ

Специальность 03.01.01 - «радиобиология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Суринов Борис Павлович

ОБНИНСК - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................4

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................9

1.1 Исследования «эффекта свидетеля» на модели клеточных культур...................9

1.1.1 Биологические реакции, реализующиеся через «эффект свидетеля».............11

1.1.2 Механизмы «эффекта свидетеля» в межклеточных взаимодействиях...........14

1.2 «Эффект свидетеля» на тканевом и органном уровнях.......................................18

1.2.1 Эффекты кластогенных факторов плазмы крови..............................................19

1.2.2 «Эффект свидетеля» «in vivo» у животных.......................................................21

1.3 «Эффект свидетеля» у организмов разных видов................................................23

1.4 Заключение к обзору литературы..........................................................................28

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................30

2.1 Объекты исследований...........................................................................................30

2.1.1 Лабораторные мыши. Условия содержания......................................................30

2.1.2 Семена злаковых культур. Условия хранения и проращивания.....................31

2.2 Методика проведения экспериментов на лабораторных мышах.......................32

2.2.1 Оборудование и реактивы...................................................................................32

2.2.2 Параметры воздействия ионизирующей радиации. Схемы экспериментов.. 32

2.2.3 Определение показателей гуморального иммунного ответа

на тимус-зависимый антиген в селезенке и лимфатических узлах..........................34

2.3 Методика проведения экспериментов на семенах растений..............................35

2.3.1 Оборудование........................................................................................................35

2.3.2 Параметры воздействия ионизирующей радиации. Схемы экспериментов..36

2.3.2.1 Условия совместного экспонирования интактных и облученных семян злаковых культур...........................................................................................................36

2.3.2.2 Совместное проращивание облученных и интактных семян.......................37

2.4 Статистическая обработка результатов................................................................37

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................................38

3.1 Иммуномодулирующие эффекты пострадиационных и естественных летучих

выделений лабораторных мышей................................................................................38

3.1.1 Воздействие ионизирующей радиации на гуморальный иммунный ответ в селезенке и лимфатических узлах...............................................................................38

3.1.2 Влияние пострадиационных летучих выделений мышей на гуморальный иммунный ответ в селезенке интактных особей........................................................38

3.1.3 Влияние пострадиационных летучих выделений мышей на гуморальный иммунный ответ в региональных лимфатических узлах интактных особей..........40

3.1.4 Эффекты пострадиационных летучих выделений мышей

на антигензависимое рекрутирование циркулирующих лимфоцитов в региональные лимфатические узлы..........................................................................42

3.1.5 Стимуляция антителогенеза в селезенке и лимфатических узлах облученных

мышей воздействием летучих выделений интактных особей..................................43

3.2 Радиационно-индуцированные дистанционные эффекты между облученными и интактными семенами злаковых культур................................................................46

3.2.1 Дистанционные эффекты совместного экспонирования облученных

и интактных воздушно-сухих семян...........................................................................46

3.2.2 Эффекты и состав пострадиационных выделений воздушно-сухих семян, облученных в разных дозах..........................................................................................48

3.2.3 Модификация пострадиационного ответа у воздушно-сухих семян,

после экспонирования с облученными семенами......................................................51

3.2.4 Стимулирующий эффект интактных на облученные семена..........................53

3.2.5 Взаимовлияние облученных и интактных семян на стадии проращивания ..56

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................................61

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................70

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................■..........................................................71

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................72

ПРИЛОЖЕНИЕ А Результаты экспериментальных исследований в таблицах.....91

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Методика проведения газохроматографического анализа летучих выделений облученных семян злаков на примере тритикале...............102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования.

За последние десятилетия теория мишени, которая была одной из основополагающих концепций в теоретической радиобиологии, претерпела изменения в связи с выявлением так называемых немишенных эффектов, которые развиваются без непосредственного воздействия радиации на исследуемый объект. Наиболее известны: нестабильность генома и «эффект свидетеля» -в англоязычной литературе «bystander effect». Последний был впервые установлен как нарушение в необлученных клетках (клетки-«свидетели»), соседствующих с клеткой (клетка-«мишень»), облученной микропучком излучения [141].

С каждым годом к фактам, которые могут быть отнесены к этому явлению, постоянно добавляются все более новые данные, получаемые на различных объектах. Показано, что подвергнутые воздействию ионизирующей радиации лабораторные мыши и крысы или образцы их мочи, будучи помещенными в боксы с интактными особями, вызывают у них нарушения показателей крови и иммунитета [1, 6, 10, 11, 13, 26, 32-38, 46]. Межорганизменный вариант «эффекта свидетеля» описан и на рыбах [82, 111]. Явление, которое может быть квалифицировано как «эффект свидетеля», обнаружено также и на растительных объектах - хранение в общем воздушном объеме облученных и необлученных семян сельскохозяйственных культур приводит к изменению начальных ростовых показателей последних [8, 20].

Если на клеточном уровне «эффект свидетеля», как предполагают, реализуется с участием растворимых метаболитов, то межорганизменный «эффект свидетеля» у животных или «эффект свидетеля» у семян растений по существующим представлениям реализуются за счет летучих выделений. Несмотря на то, что эти факты были выявлены на далеких друг от друга видах живых организмов, у них имеется и общее - и тот и другой эффекты проявляются дистанционно.

Ранее в исследованиях на животных было установлено, что «эффект свидетеля» может носить и обратный характер: интактные особи или их летучие выделения, при определенных условиях способны восстанавливать пострадиационные нарушения у облученных особей [11, 38]. Предполагалось, что подобное может иметь место и у растительных объектов.

На уровне межклеточных коммуникаций радиобиологический «эффект свидетеля» давно и подробно исследуется разными коллективами ученых, тогда как на межорганизменном уровне он представлен в единичных работах и нуждается в расширении исследований. Такие исследования имеют общебиологическое значение, так как на примере ионизирующей радиации раскрывают механизмы распространения последствий воздействия повреждающих факторов среди биологических объектов разного происхождения.

Необходимость расширения подходов к исследованию «эффекта свидетеля» обусловлена значением его не только для теоретической радиобиологии, но и для выяснения последствий воздействия ионизирующей радиации в лечебных целях, прогноза экологических последствий в случае радиационных аварий и др.

Цель и задачи. Целью работы был анализ обусловленных летучими выделениями закономерностей немишенАой пострадиационной реакции «эффект свидетеля» у животных и растений.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

- проанализировать и сравнить влияние летучих выделений облученных лабораторных мышей на антителогенез в селезенке и лимфатических узлах у интактных (необлученных) особей;

-оценить влияние естественных летучих выделений интактных мышей на антителогенез в селезенке и лимфатических узлах облученных особей;

- установить биологические эффекты совместного хранения и проращивания облученных семян с интактнЫми в виде модификации начальных ростовых процессов;

- выявить общие закономерности «эффекта свидетеля» у животных и растений.

Научная новизна.

Впервые предложены способы регистрации «эффекта свидетеля» на межорганизменном уровне у мышей по модификации гуморального иммунного ответа в лимфатических узлах, а у семян растений - по изменению начальных ростовых процессов.

Впервые установлены основные закономерности эффектов пострадиационных летучих выделения мышей на способность к гуморальному иммунному ответу в региональных лимфатических узлах у интактных особей-реципиентов.

Впервые показано влияние облученных воздушно-сухих семян сельскохозяйственных растений на интактные семена на стадии проращивания на едином субстрате.

Впервые сформулировано представление о том, что у животных и растений, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации, имеются близкие по дистанционным механизмам закономерности, которые соответствуют понятию об «эффекте свидетеля».

Теоретическая и практическая значимость работы. Установленные в работе закономерности свидетельствуют - о возможности дистанционного распространения пострадиационных реакций у различных видов живых организмов. Следовательно, результаты диссертационной работы могут быть использованы для моделирования последствий техногенных катастроф и испытаний влияния различных факторов на биологические объекты. Часть исследований выполнена в рамках НИР «Зависимость от генотипа иммунных и поведенческих эффектов хемосигнализации у интактных и облученных животных» (№ госрегистрации 01200951615) и по гранту № 09-04-97505 «Иммуномодулирующая хемосигнализация у животных как биологически целесообразный эффект • при нарушениях радиационного

и нерадиационного происхождения», финансируемого РФФИ и Правительством Калужской области.

Практическая значимость работы состоит в том, что результаты работы используются на практических занятиях по дисциплине «Радиационная иммунология» у магистрантов, обучающихся в Обнинском институте атомной энергетики - филиале НИЯУ МИФИ по направлению 020400.68 «Биология» по программе «Экспериментальная радиобиология».

Результаты работы имеют и фундаментальное значение, поскольку расширяют современный уровень представлений о немишенных эффектах ионизирующего излучения и демонстрируют дистанционные их механизмы на животных и растительных объектах.

Методология и методы исследования. «Эффект свидетеля» у мышей регистрировали по модификации антителогенеза (метод Каннингема) в селезенке и региональных лимфатических узлах у облученных и интактных особей, подвергавшихся взаимному воздействию летучих выделений их мочи, у растений - по изменению начальных ростовых процессов проростков облученных семян и экспонированных с ними интактных семян.

Положения, выносимые на защиту:

1. Интактные и облученные животные способны дистанционно, взаимно модифицировать иммунную реактивность в селезенке и региональных лимфатических узлах за счет естественных или пострадиационных летучих выделений.

2. Интактные и облученные воздушно-сухие семена сельскохозяйственных растений при совместном их хранении или проращивании в ограниченной среде взаимно модифицируют начальные ростовые процессы за счет участия летучих метаболитов.

3. Определенное сходство обусловленных летучими метаболитами проявлений «эффекта свидетеля» у таких далеких биологических организмов, как животные и растения, демонстрирует общебиологический характер данного явления.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертации опубликованы в 2 статьях в научных журналах, рекомендованных ВАК МОиН РФ, в 8 материалах сборников статей и конференций, докладывались и обсуждались на международных конференциях.

Конференции, на которых представлялись результаты работы:

- Third International Conference, Dedicated to N. W. Timofeeff-Ressovsky «Modern Problems of Genetics, Radiobiology Radioecology and Evolution», Alushta, Ukraine, 2010.

- Техногенные системы и экологический риск, Обнинск, 2010, 2011, 2012.

- Международная конференция «Окружающая среда и человек: друзья или враги?», Пущино, 2011.

- Международная научно-практическая конференция «Чернобыльские чтения», Гомель, Беларусь, 2012.

- Международная конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 2012.

Диссертационная работа апробирована на научной конференции кафедры биологии Обнинского института атомной энергетики - филиала Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ», состоявшейся 7 июня 2012 г. (протокол № 9).

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Исследования «эффекта свидетеля» на модели клеточных культур

Радиобиологическая теория «мишени» предполагает, что эффект радиации достигается высвобождением энергии излучения непосредственно в чувствительную «мишень» клетки, например, ДНК [28, 122, 123, 178]. Исходя из ее принципов, количество попаданий, а значит и число пораженных «мишеней» в определенном диапазоне доз должно быть прямо пропорциональным дозе облучения.

Впоследствии установлено, что эффекты радиации могут проявляться в клетках, в том числе, не являющихся непосредственной «мишенью» воздействия. Такие эффекты обозначены как немишенные, одним из них и является эффект, известный как «эффект .свидетеля» или «bystander effect». Он заключается в способности облученных радиацией биологических объектов влиять на жизнедеятельность соседствующих с ними интактных, необлучавшихся. Этот эффект вызывает не только ионзизирующая радиация, но и высокотемпературное [85] и химическое [57, 68, 108] воздействия.

К настоящему времени сформировалось несколько методологических подходов, позволяющих моделировать в культуре клеток «эффект свидетеля»: воздействие на культуру исследуемых клеток пучками (или микропучками) ионизирующих частиц и перенос культуральной среды от облученных клеток к необлучавшимся.

В одном из первых подобных исследований описано, что облучение рентгеновскими лучами (35 мГр) питающей клетки (не способна делиться, но сохраняет способность к метаболизму) в культуре клеток линии HeLa стимулирует рост соседних необлученных клеток [152]. Основополагающие исследования «эффекта свидетеля» появились значительно позже и принадлежали Н. Nagasawa и J. В. Little, которые в 1992 г. изучали индукцию сестринских хроматидных обменов в монослойной культуре клеток яичника китайского

хомячка, облученных а-частицами [141]. Авторы наблюдали повышенную частоту сестринских хроматидных обменов в 30 % клеток после облучения культуры в дозе 0,31 мГр, при которой а-частицы попадают не более чем в 1 % ядер клеток. Эти данные подтверждены в исследованиях на фибробластах легких человека в 1996 г. [55]. Предполагалось, что эффект связан с секрецией облученными клетками цитокинов или > других факторов, приводящих к нарушению регулирования окислительного метаболизма в необлучавшихся клетках [121, 142].

Существенный недостаток облучения широким пучком ионизирующих частиц заключался в невозможности рассмотреть в отдельности эффекты в облученных и необлучавшихся клетках. Преимущество микропучков излучения в том, что с их помощью можно воздействовать на единичные клетки в популяции, т.е. исследовать эффекты в клетках, которые не облучались, но присутствовали на момент облучения. О. V. Ве1уакоу с соавторами сообщили, что облучение микропучком ионов гелия (1-15 треков) одной клетки в культуре фибробластов человека вызывало повреждения хромосом в сотне соседних необлученных клеток [87]. Впоследствии совершенствование установок для облучения позволило воздействовать микропучками частиц на отдельные клетки или участки клетки, например цитоплазму [126, 165].

Следующий методологический подход - перенос культуральной среды от облученных клеток к ранее необлучавшимся клеткам. Обычно его используют для редкоионизирующего излучения. Обнаружено, что среда инкубирования нормальных или злокачественных эпителиальных клеток, подвергавшихся воздействию у-излучения (0,01-5 Гр), при переносе к необлучавшимся снижала их клоногенную способность [134]. Другая разновидность подхода: инкубирование двух популяций клеток - необлученной и о�