Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые вопросы метаболизма бруцелл и патогенеза бруцеллеза

ВАК РФ 03.00.00, Биологические науки

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Резников, Б. Ф., Алма-Ата

— МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Ж КАЗАХСКОЙ ССР

Казахский научно-исследовательский ветеринарный

институт

Б.Ф.РЕЗНИКОВ

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ МЕТАБОЛИЗМА БРУЦШ И ПАТОГЕНЕЗА БРУЦЕЛЛЕЗА,

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -заслуженный деятель вауки КазСсР, доктор ветеринарных наук, профессор К.П.СТУДЕНЦОВ

АЛМА-АТА - 1С68 г

СОДЕРЖАНИЕ:

Стр.

Вв еде н и е ................................. 2

ГЛАВА 1. Изучение уреазвоа активности у бруцелл 1С 1* Активность уре^к р«ьньх штаммов бруцелл. Полуколичественный колориметрический метод

определения активности уреазы ........... 10

<2. Локализация уреазы в бактериальной клетке

бруцелл ................................. 39

3. Изучение ферментации бруцеллами мочевины.меченой радиоактивным изотопом углерода С*4 52

4. Изучение связи между ферментом карбоангид-

разой и усвоением бруцеллами углекислоты . 59

5» Взаимодействие эритроцитов и бруцелл ..... 76

б. Влияние совместных инъекций бруцеллизата с уреаэой на образование специфической аллер-

гии у морских свинок...................... 107

ГЛАВА П. Дезаминазная активность и вирулентность бруцелл ........................115

7. Изучение подщелачивания МШГГА в процессе роста и развития культур бруцелл ..........115

8. Зависимость вирулентности штаммов бруцелл от различного соотношения активности и* уреа8н и дезамиваа.........................134

9. Токсичность аммиака для здоровых морских свинок и зараженных различными штаммами бруцелл ...................................167

3 а к л ю ч е н и е .................................. 197

В ы во д ы..........................................212

Литература ..................................217

Приложения ..................................253

ВВЕДЕНИЕ,

В настоящее время заболевание бруцеллезом животных и людей имеет место на всех континентах генного вара. Поэтому вопросам бруцеллеза как и нашей стране, так и ва рубежом уделяется очень большое внимание*

За последние 25-30 лет усилиями таких ученых с сотруд-* никами, как П.Ф.Здродовский, С*Н.Вышелесский, П.А.Верши-лова, М.К.Шсковец, Е.и.Орлов, М.М.Ыв&нов, В.П.Рощин, К.П. Студенцов, П.П.Очкур, Г.П.Руднев, В.М.Красов, Н.Д.Бекле~ мипев, И.К.Каракудов, М.М.Ременцова, Н.Д.Анина-Радчекко, И.С.Новицкий, Е.А.Мезенчук, П.Н.Жованик, П.С.Уласевич, Н.В. Софронов, Б.Р.Узбекова и многих других, разрешен ряд коренных вопросов, относящихся к диагностике, патоморфологии, патогенезу, клинике, лечению, специфической профилактике, эпизоотологии и эпидемиологии бруцеллеза.

Однако, несмотря на имеющиеся достижения, проблема ликвидации бруцеллезной инфекции не является окончательно решенной. Одним ив основных тормозов в искоренении бруцеллеза является отсутствие надежных специфических средств его профилактики и терапии. Вопрос специфической профилактики и терапии не может быть разрежен без дальнейшего углубленного изучения вопросов метаболизма бруцелл и патогенеза бруцеллеза. Таким образом, борьба с бруцеллезом находится в тесной связи с познанием сложнейших взаимоотношений между макро- и микроорганизмами и внешней

средой.

В основе жизненного процесса лежит обмен веществ, составными звеньями которого являются многочисленные биохимические реакции, в подавляющем большинстве случаев катализируемые при помощи ферментов» Набор ферментов,которым располагает любая живая клетка, и относительная активность 8тих ферментов определяет последовательность и взаимосогласованность реакции обмена веществ, лежащих в основе всей организации живой материи во времени /А»И. Опарин, 1961/.

Фермент или енвим представляет собой биологический катализатор белковой природы, термолабильного характера, вырабатываемого растениями, животными и микроорганизмами, способный ускорять химическую реакцию, не расходуясь при «том во время процесса и не входя в состав образующихся продуктов.

успехи в изучении ферментов привели к созданию науки о ферментах - знзимологиж, находящейся на стыке биологических и физических наук, снзимология превратилась в настоящее время в большую, бурно развивающуюся отрасль знания с многочисленными ответвлениями, тесно связанную со многими науками, особенно с биохимией, физической химией, микробиологией, генетикой, ботаникой, патологией, токсикологией, физиологией и многими другими.

Особенно трудно переосенить значение «нзимологии в медицине и ветеринарии, где невозможно найти такой теоретический или практический участок, в разработке которого не играли бы существенную роль факты и подходы

современного учения о ферментах. Мн внаем теперь, - пишет академик А.Е.Ьраунштеин /1965/, - что генетические факторы, ответственные 8а наследственную передачу типа об-мена веществ и его приспособительную изменчивость,реализуют свое действие путем управления биосинтезом белков -ферментов. Знаем, что регуляция процессов обмена и физиологических функций в организме гармовами и другими гуморальными агентами, равно как влияния, оказываемые на эти процессы лекарственными веществами и ядами, микробными токсинами и антибиотиками, физическими факторами внешней среда и болезнетворными воебудителями, осуществляются путем прямых или косвенных воздействий атих агентов на ферменты и катализируемые ими реакции* В тонких различиях химического строения и свойств определенных ферментов мы находим выражение видовых особенностей организмов, в нарушениях биосинтеза или действия ферментов - исходное звено в патогенезе многих наследственных и других заболеваний*

До настоящего времени авторы многочисленных экспериментальных исследований по ферментам продолжают концентрировать свое основное внимание именно на химической стороне дела, "потому что она им ближе по специальности, потому что в атой области они чувствуют себя хозяевами, прочно стоящими на базе надежных, экспериментально установленных фактов" А»И.Опарин, 1961/. Нас же интересуют ферменты патогенных микроорганизмов как ключ к познанию патогенеза инфекционных болевней. Тем не менее, бее глубоких знаний химической природы ферментов и их роли в

химизме «ивой клетки нельзя определить место ферментов в патогенезе болезней. Поэтому достижения исследователей -химиков в области знвимологии трудно переоценить для врачей всех специальностей*

Относительно биохимических факторов, которые обусловливает соотношения между микроорганизмом-паразитом и мвгкро-оргааизмом-хозяжном, за последние десятилетия накошено большое количество сведений. Все хе в 9той области еще имеются многочисленные пробелы, не позволяющие до сих пор разработать физиологически обоснованную единую теорию, включающую также и интимный биохимический механизм многочисленных морфологических, бактериологических, серологических и клинических аспектов инфекционного процесса.

Понятие патогенности отображает специфические динамические соотношения, которые существуют между организмом-хозяином я паразитом* Что же касается паразита, патоген-ность отображает его способность использовать окружающую среду«*хо8яина в качестве питательной среды, а также свойство противодействовать совокупности защитных механизмов организма-хозяина. В то же время макроорганиэм^ховяин может считаться резистентным к инфекции, если он не представляет для паразита среду, благоприятствующую его развитию, или когда он обладает действенными защитными механизмами, ко-* торые могут предупредить, тормозить или подавить полностью потенциал размножения, метаболивм паразита /Л.Месробяну и Ь*Шунеску, 1963/.

На основании зтих соображений относительно патоген-ности Гарбером /Ш&6/ сформулирована гипотеза "питания •

торможения", относящаяся главным образом к размножению паразита и развертыванию его обменных процессов в организме-хозяине.

Утрата вирулентности одновременно с появлением метаболической недостаточности /зависимости/ является убедительным примером в атом отношении* Так, Бэкон и сотрудники /1950/ отметили, что гистидинзависящие мутаны Sa£»i typkosa. теряют вирулентность, которой обладает прототроф-ный штамм» 8ти "дефицитные" мутанты, вводимые мышам, уже не вызывают заболевания, но при добавлении гистидина вирулентность бактерий восстанавливается*

Фримэном /1951/ и Громаном /1955/ установлено анало-гичное явление, свойственное Got^n*£*<de cUpk ike ey у которых вщработка токсина обусловлена наличием железа и атмосферного кислорода* Дисфункция атих обменных путей была получена изменением катаболических систем путем ультрафиолетового облучения шаг же инфекции бетта-профагом*

С целью изучения отношений между обменными признаками и патогенностью бактерий, помимо метода использования метаболически дефектных мутантов, многими исследователями было осуществлено также параллельное изучение биохимических признаков вирулентных штаммов по сравнению с авирулентными штаммами определенного вида бактерий*

Так, у pedis вирулентность штаммов сочета-

ется с рядом биохимических свойств: выработка токсина, кап» сула и антигены /которые создают резистентность к фагоцитозу/, выработка пигментов, способность синтезировать пурины, чувствительность к глюкозе и необходимость развития

в присутствии ионов Са"м",$**+, 2л** /Сур га л ла, 1960/. Штаммы, культивируемые при +5°С, не обладают вирулентностью и ни одним и8 вышеперечисленных признаков,

Наибольшее патогенетическое вначение имеют ферменты патогенных микробов, несвойственные животному органивму и подавляющие самые разнообразные защитные приспособления макроорганжвма* Так, коагулаза, обнаруженная у патогенных видов золотистого стафилококка, яе участвует непосредственно в процессах выработки бактериальных лизинов, а только предупреждает фагоцитов путем изменения консистенции среды* В присутствии систем, тормозящих образование фибриногена /гепарин, цитрат/, или же в дефибринированной крови, коагулазоположительные бактерии подвергаются сильному фагоцитированию. /Дюти и Лоренц,1952/.

слиае и Балдовин-Агапи /1958/ установили наличие стрептокиназы или стрептококковый фибринолизин, который освобождается в окружающую среду в особенности вирулентными штаммами гемолитического стрептококка А, С, .

Другим специфическим для процесса бактериального распространения фактором является гиалуронидаза или фактор инвавии - энзим, освобождаемый некоторыми микроорганизмами в тканях, подвергшихся инвазии* Гидролитическое действие этого »нзима осуществляется в отношении гиалуроновой кислоты, представляющей собой компонент основного вещества соединительной ткани* При этом вязкость среды значительно снижается, что создает возможность распространения инфекции* При подкожном введении вирулентных бактерий вместе с гиалуронидазой последняя способствует увеличению зоны

инфекции и ускоряет летальный эффект /Л.Месробяну и Ь. Пвунеску, 1963/.

При га8овои гангрене оказывает влия-

ние на живой органивм за счет гемолитического действия лецитинааы, расцепляющей лецитины кровяной плазмы и эритроцитов с образованием диглицеридов жирных кислот и фос-фохолина. При атом же заболевании имеет существенное значение коллагенава данного микроба, расщепляющая коллаген с нарушением структуры тканей. как и дру-

гие ввды, относящиеся к бациллам газовой гангрены, обладают декарбоксплавами, имеющими не малое значение в патогенезе болезни потому, что некоторые ферменты этой группы образуют весьма токсические амины: гистамин, агматин, фениле тиламин, тирамин, путресцин, кадаверин /Е.М.Губарев, И.К.Грабенко, Ю.В.Галаев и Н. А. Кобзарь, 1959/.

В пользу ферментативной природы токсинов Ь.р&^ыл.^^ J. оесСипа&йЫ говорит тот факт, что при инкубировании сухих токсинов в термостате усиливалась их гемолитическая и летальная активность. Повышение температуры инкубации в термостате вело к снижению или инактивации токсинов /С*П.1ак,19б5/.

Благодаря успехам ферментологии удалось глубже выяснить природу газообразования при эмфизематозном карбункуле, причины расплавления тканей с превращением их в кровянистую жидкость от воздействия сЛ. h¿*t* fyf ¿£¿±3 /й.й.Коляков, 1965/.

Таким образом, на основании изложенных отдельных примеров можно сказать, что главным фактором в вовникно-

вении инфекционно-патологического процесса являются продукты жизнедеятельности микроорганизмов, а характер инфекции аависит от типа обмена веществ возбудителя, катализируемого специфическими ферментами*

В предлагаемой диссертационной работе мы делаем попытку обобщить доступные нам литературные данные, которые приводятся в соответствующих разделах, относительно биохимических факторов вирулентности у бруцелл и делаем анализ результатов собственных исследований по активности некоторых ферментов у штаммов бруцелл разного вида и различной вирулентности.

При этом мы не ставили перед собой задачу исследования химического состава или структуры ферментов и не занимались детальным анализом кинетики или механизма ферментативного действия. В нашей работе мы рассматриваем некоторые вопросы, касающиеся активности ферментов, локализации в микробной клетке и роли в метаболизме бруцелл, а так же делаем попытку свявать образование первичных продуктов под действием ферментов бруцелл в организме-хозяине с функциями других ферментов и тканей организма хозяина, обратив особое внимание на связь между активностью ферментов и вирулентностью бруцелл и на некоторые биохимические подходы к изучению патогенеза оруцеллеэа.

Глава 1>

ИЗУЧЕНИЕ УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У БРУЦЕЛЛ.

1. АКТИВНОСТЬ УРЕАЗЫ РАЗНЫХ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ. ПОЛУКОЛИ-ЧЕСТВЕННШ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЩЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ УРЕАЗЫ.

О б 8 о р литературы, Уреава /карбомид-амидо-гидрола8а, шифр 3.5.1.5~К/ представляет собой гамма-глобулин с молекулярным весом 480000. Она катализирует единственную реакцию - гидролитическое расщепление мочевины с образованием углекислоты и аммиака. Уреава распространена среди некоторых растений, плесневых грибов и многочисленных видов патогенных и непатогенных микроорганизмов. Но зтот фермент редко обнаруживается в животных организмах и то лишь в ничтожных количествах / в желудочном соке млекопитающих/, когда уреаза не может проявлять токсического действия. Токсичность кристаллической растительной уреавы очень высока благодаря разложению мочевины в организме с образованием значительных количеств аммиака /Д.В. Самнер, Г.Ф.Сомерс,\948; М.Диксон, е.Уз66,1966/.

Значение уреазы как патогенетического фактора при инфекционных заболеваниях было впервые обнаружено в отношении чумы людей. Н.Н.Ивановский, Е.М.Губарев и М.Н.Голов /1930/ установили существенное увеличение остаточного азота в крови морских свинок, зараженных чумой. При ©том авторы отметили, что одна только степень увеличения остаточного азота в первом же периоде болезни может служить прогностическим признаком: чем больше увеличение, тем быстрее гибнет животное. Е.М.Губарев и Чернобаев /1933/

выяснили, что увеличение остаточного а8ота при чуме происходит за счет аммиачно-мочевинной фракши /раздельного определения аммиака и мочевины не проводилось/. Позднее H.H.Ивановский /1955/ доказал не только увеличение аммиака в крови и тканях животных, зараженных чумой, но и положительное лечебное действие от совместного введения растворов глютаминовой кислоты и аденовинтри-фосфорной /АТф/. .

В связи с ©тим Е.М.Губарев и Н.Н.Ивановский /1958/ сообщают, что чумой заболевают только те животные, у которых главная масса аммиака выделяется ввиде мочевины. Животные, выделяющие аммиак ввиде мочевой кислоты, невос-преимчивы к чуме. Однако, не все животные с указанным типом обмена веществ заболевают чумой* Например, невос-преимчивы к этому заболеванию собаки и в значительной степени кошки. Что касается грызунов - носителей чумной инфекции в природе, то была установлена параллельность восприимчивости животных зтой группы к чуме и их устойчивости к аммиаку: животные наименее устойчивые к аммиаку являются и наименее резистентными к чуме.

Брауде и Сименс кал /i960/ показали, что уреава Ры--z&4c£ci обладает нефротоксичноетью и является патогенным фактором пиелонефритов, так как создает щелочную реакцию в почцах /15,2/, приводящую к некрозу почечного тубуляр-ного впителия и осаждению фосфорнокислого магний-аммония

в виде камней. Клетки того же вида, убитые ацетоном, который не угнетает уреазу, обладают патогенностью, свойственной живым клеткам, оаражение клетками Е. аой не

вызывает аналогичных патологических изменений, так как уреазы у этих клеток нет.

Учитывая роль уреазы как патологического фактора в течении других заболеваний, Е.М.Губарев, И.К.Грабенко, Ю.В.Галаев и Н.А.Кобварь /1959/ нашли огромное увеличение количества аммиака в крови больных бруцеллезом людей, в несколько раз превышающее норму. Введение глетами-новой кислоты и АТФ в лечебных доэах вело к резкому снижению аммиака в крови, увеличению числа лейкоцитов, уменьшению или исчезновению болей и по�