Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые характеристики L-лизин-2-монооксигеназы и создание аналитической системы на её основе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые характеристики L-лизин-2-монооксигеназы и создание аналитической системы на её основе"

ереванский ордена, трудового красного знамени государственный университет

На правах рукописи

ХАЧАТРЯН ГАРНИК ЭДУАРДОВИЧ

НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Ь-ЛИЗИН-2-1,ЮНООКСИГЕНАЗЫ И СОЗДАНИЕ АНАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ НА ЕЕ ОСНОВЕ

(03.00.04-Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1993 ' '

Работа выполнена в лаборатории биосенсоров Ереванского физического института.

Научный руководитель доктор биологических наук, ,

ведущий научный сотрудник А.Л.СИМОНЯН

Официальные оппоненты действительный член междуна-

родной инженерной Академии, доктор биологических наук Э.М.АКОПЯН

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Л.С.НЕРСЕСОВА

Ведущая организация Институт микробиологии

АН РА

Защита состоится 1993 г. в _часов на засе-

дании специализированного совета К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском Государственном Университете (375049, Ереван, ул. А.Манукяна 1, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университет;

Автореферат разослан ".¿J" iA<-&J>1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета -кандидат биологических наук.

-------------

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Огромный дефицит пищевого белка, проблема получения искусственной пищи делают задачу изучения метаболизма аминокислот весьма актуальной. Изучение ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, в настоящее время приобрело не только чисто научное, но и большое практическое значение, особенно с развитием методического арсенала инженерной эн-зимологии. Имеется в виду важное практическое следствие этих исследований: получение оптически чистых изомеров аминокислот и ряда дериватов некоторых из них путем микробиологического синтеза и полусинтетичёским путем, применяя для последней цели соответствующие иммобилизованные ферменты, а также такая перспективная отрасль, как биосенсоры.

Важность этих исследований связана, например, с актуальнейшей в настоящее время проблемой создания сбалансированных по аминокислотному составу кормов для животноводства. Известно, как высока доля незаменимой для млекопитающее аминокислоты L-лизина в подобных исследованиях. В связи с этим весьма актуальной становится и проблема создания экспрессных и точных методов определения концентрации аминокислот на всех стадиях их производства и применения. И очевидно, что при определении концентрации L-лизина, применение могут найти ферменты, участвующие в катаболизме лизина.

К числу таких ферментов, представляющих интерес как с теоретической, так и с практической точек зрения относится кндуци-бельный ферхзнт Ь-лизш-2-монооксигеназа, катализкруш!'.Я уникальный путь окисления L-лизина у бактерий видов Ps.fluorescens и Ps. put ida. Это олигомерный белок, обладающий аллостерическгст механизмом регуляции ферментативной активности и положительной кооперативность», отличающийся высокой специфичностью по отношению к Ь-лизшу. Последнее обстоятельство делает фермент в выспей степени привлекательным с точки зрения разработки пэтодкки ферментативного определения концентрации лизина в растворах.

Пель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлось изучение некоторых характеристик 1-лизмн-2-монооксиге-назц,- разработка метода и создание аналипяеекой скстелза для определения концентрации L-лизика в растворах.

В задачу работы входило: 1) сканирование доступных штаммов микроорганизмов видов Ps. fluorescens и Ps. put Ida - потенциальных источников фермента и выбор продуцента г,-лизин-2-монооксиге-

назы; 2) выделение, очистка и исследование основных характер стик фермента; 3) получение активного иммобилизованного препар та фермента: 4) разработка методики определения концентрац L-лизина в биологических жидкостях на основе лизкн-2-монооксиг назной реакции; 5) создание аналитической системы для экспрес анализа концентрации L-лизина, разработка методики определен L-лизина в промышленных условиях.

Научная новизна и практическая значимость работы: Вперв проведено исследование физико-химических и кинетических свойс очищенного фермента 1-лизин-2-моноокеигеназы из Pseudomonas р tlda. Получены новые данные, подтверждавшие гипотезу о характе эллостерической регуляции фермента. Впервые получен активный и мобилизованный препарат лизин-2-монооксигеназы. Впервые для ан. литических целей использована монооксигеназа и показана принц пиальная возможность определения L-лизина в жидких средах: культуральной жидкости ферментеров, жидком концентрате лизина др.

В результате проведенных исследований осуществлен выб! продуцента Ь-лизин-2-монооксигеназы. Разработана методика bi№ ления и очистки лизин-2-мокооксигеназы. Разработана новая мен дика определения L-лизина в культуральной жидкости. Создана пр< точная аналитическая система на основе иммобилизованной L-лизга 2-монооксигеназы для безреагентного определения концентраш L-лизина практически на любом этапе его получения. На приме] Ь-лизин-2-монооксигеназы показана принципиальная возможное: применения в аналитических целях аллостерических ферментов, о( ладающих кооперативными свойствами, что существенно расширя! список ферментов, пригодных для применения в биосенсорах. Кро! того, возможно применение фермента в медицине, например, в кач< стве противоопухолевого препарата.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на IY Mej дународном симпозиуме "Использование иммобилизованных ферменте для получения пищи и в медицине" (Таллинн, 1984), I и II РеспуС ликанских конференциях по проблемам физико-химической биологии биотехнологии (Ереган, 1984, 1986), У Всесоюзном симпозиуме i инженерной энзимологии (Кобулети, 1985), Международном симпозиз ме "Ферменты в аналитике" (Ной-Бранденбург, ГДР, 1986), Междуне родном симпозиуме по аминокислотам (Ереван, 1986), Межцународнс симпозиуме "Химическая физика ферментативного катализа" (Тал линн, 1987), IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сел*

ского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований (Ереван, 1988), XIX конференции ФЕБО (Рим, Италия, 1989).

Испытания анализатора для определения концентрации L-лизкна проводились на Чаренцаванском, Тршольском и Обольсксм биохимзаводах, кафедре химической энзимологии МГУ, в Институте микробиологии им.А.Кирхенстейна АН Латвии, Научно-исследовательском ш-ституте антибиотжов и биотронсфсрмащш (Росток, Чехословакия).

Ка базе анализатора "ЛРСА" на Чаренцаванском заводе "ЛИЗИН" внедрен лабораторный регламент определения лизина.

ПубливдЩ511 по теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, четырех глав (I - обзор литературы, II - экспериментальная часть, III, IV - результаты исследований и обсуждение), выводов и указателя литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста и содерй-ит 24 рисунка л 12 таблиц. Библиография включает 106 наименований литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В работе было исследовано 12 игакмоэ гажроорганизмоз Рлс-и domoTvje fluorpocms и PvmvJ<znona¿ putíd'i.

Бесклеточный экстракт получали, разрушая клетки с помощью УЗДН-2Т /СССР/ в течение 8 гаи при 22 кГц и тске 28 мкА, при температуре не выше 16°С. Активность лизин-2-моноексигеназы (ЛМО) определяли амперсметрически (00-электрод), спектрофотомет-ричееки и потеншюметрически (СО,-электрод). Содержание белка определяли спектрс-фотомэтрически при 280 нм.

Отбор штамма-продуцента и накопление биокассы проводили на минимальной синтетической среде, содержащей 3 г/л L-лизин в качестве единственного источника углерода и азота при 27Ü.

Для очистки ЛМО бесклеточный экстракт обрабатывали сульфатом аммония (30 - 60% насыщения), после чего белковый раствор титровали 0,6 M уксусной кислотой до рН 4,8. После этого раствор немедленно центрифугировали, рН надосадочной жидкости доводили до 6,5 раствором 1 M KgHPO^j и повторяли обработку сульфатом аммония (35 - 55%). Для дальнейшей очистки применяли гель-фильтра-дао на колонке с сефадексом G-200 и гелъ-хроматографирование на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-50.

Молекулярную массу определяли методом гель-фильтрации на

колонке с сефадексом С-200. Молекулярную массу субъединиц фе мента определяли электрофорезом в присутствии -ОБ-Ка по мето Еланше, а также Вебера и Осборда. Электрофорез проводили при 8,6 в 7%-ном полиакриламидном геле при температуре £10°. Бел окрашивали раствором амидочерного 10Б в 7%-ной уксусной кислот Субстратное окрашивание выполняли в системе ФМС-НТС-лизин.

В качестве носителя для иммобилизации ЛМО использовали с ликагель производства Ереванского института неорганических сс бентов. Аминирование силикагеля проводили методом Робинсона.

Для данных, : нузвдаюцихся в статистическом подтверждена рассчитывались стандартное отклонение, коэффициенты корреляцю вариации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУВДЕНИЕ 1. Выбор штамма-продуцента ЛМО.

Результаты изучения способности роста испытанных штам! приведены в таблице 1. Из таблицы видно явное преимущество ыт;

Таблица 1. Способность некоторых штаммов Ра. /Хиогезсепз и Ps.pu.tida к росту на жидкой синтетической лизин-содержащей среде и продуцированию ЛМО.

ш Штаммы* Выход Активность Продолж биомассы, ЛМО, Е/г роста г/л биомассы ч

1 Рз. fluorescens ВКМ В-1470 1,9±0,2 9,6±0,8 60

г Ps. fluorescens ВИ1 В-1471 <0,1 не определяется 60

3 Рз. fluorescens ВКМ В-1472 <0,1 не определяется 60

4 Рз. fluorescens ВКМ В-1473 нет - -

5 Рз. patláa ВКМ В-1458 2,9±0,3 27±1 40

6 Ps. puílúa ВКМ В-1459 нет - -

7 Рз. putíáa ВКМ В-1460 <0,1 не определяется 60

8 Рз. putlúa ВКМ В-1461 1,2±0,15 18±1,5 60

9 Рз. fluorescens 70/314 нет - -

10 Ps. fluorescens 71/405 2,8±0,3 20±1 48

11 Ps. fluorescens A-l 3,lí0,3 25±1 40

12 Рз. puttda А-2 нет - -

Примечание: Для номеров 1-10 см. "Каталог культур микрооргг низмов, поддерживаемых в учреждениях СССР", М. "Наука", 1981; номера 11 и 12 получены из час: ной коллекции А.Лишман (Рига).

мов с порядковыми номерами 5 и 11 перед остальными по выходу биомассы (г/л) и активности фермента (Е/г влажного веса), по которым они превосходили лучше литературные аналоги (Флашер, Нас-сей, 1974). Детальная проверка этих двух культур по двум параметрам: накоплению.биомассы и выходу активности (рис. 1), показало преимущество штамма й 5, который и был выбран в качестве продуцента фермента. На этот штамм (Рз.ри£?.сМЗКМВ~1458) было получено авторское свидетельство № 13104277 от 15.01.87 г.

Акт., Е/г 30

В.в., г/\ Акт., Е/г --Д4 30 г

24 28 32 36 40 44 24 28 32 36 40 44 48

Время, часы Время, часы

Рие.1. Рис.2.

Рис. 1. Сравнение дшамики изменения выхода биомассы (а) и активности (б) для штаммов Ж 5 (1) и № 11 (2)

Рис.2. Динамика изменения активности фермента на грамм злагсного веса при температурах 20±1° (1), 25±1° (2), 30±1° (3).

Результаты изучения зависимости активности фермента на еди-шцу влажного веса от температуры выращивания приведены на же.2. Из рисунка видно, что максимальное значение этого пара-¡етра достигается при температуре 25±1°. Для получения препара-■ивных количеств фермента был оптимизирован процесс накопления иомассы при выращивании культуры в 250 л ферментере. Усреднение данные ферментации приведены на рис.3, из которого видно, то лучшие характернойвеи по накоплению биомассы достигались при ырашивании штамма & 5 на среде с более низким начальным содер-анием лизина - 1,5-2.0 г/л с последующей подпиткой на 24-2В чау роста той же концентрацией лизша. Съем биомассы с единицы 5ьема среди при этом увеличивался в 1,5-2 раза. Повышался также ¿¡ход активности на единицу веса биомассы и сокращалась продол-

Рис.3. Сравнение основн параметров роста п проведении ферментации 250 л пилотной устаноЕ при начальной концентр ции лизина 3 г/л (а) 1,5-2 г/л с последуй; подпиткой (б). 1 - вы> биомассы; 2 - активное на грамм влажного веса: - утилизация лизина.

2. Очистка и основные характеристики фермента.

Схема очистки лизш-2-монооксигеназы и достигнутые при э1 результаты приведены в таблице 2. Из таблицы видно, что сх-очистки, предложенная в настоящей работе, позволила, не прибе к кристаллизации, достигнуть степени очистки, сравнимой с луч литературным аналогом (Флашнер, Маесей, 1974,).

На рис.4 приведены результаты гель-фильтрации и ионообм ной хроматографии фермента. Молекулярная масса фермента, опре ленная методом гель-фильтрации, дала значение 230 кДа. Моле лярная масса субьедшдащ ЛМО, определенная по методике Вебер Осборна, составляет 67 кДа. Сопоставляя полученные данные мс заключить, что фермент представляет собой тетрамер, состоянии четырех одинаковых субъединиц. Ультрацентрифугирование показа . что ферментный препарат был гомогенен и шел константу седин тации 9,9 S, которая не изменялась в присутствии субстрата.

Электрофорез, проведенный с наиболее очищенным препарг фермента с удельной активностью 14,6, выявил кроме основной лосы еще две следовые. Проведение субстратного окрашивания п< зало отсутствие у этих полос лизинмонооксигеназной активноси

тательность процесса.

Время, часы

Таблица 2. Схема очистки Ь-лизин-2-монооксигеназы.

Этап очистки

Полное Отно-

поглощение ТА же шение

раствора при погло-

при 280 нм 460 нм щений

АКТИВНОСТЬ пол- удель- Выход>

ная, М.Е.

ная, Е/мг

Бесклеточный 34 135 710 48 2497 0,073 100

экстракт

После обработки 1 565 27 58 1048 0,67 42

сульфатом аммо-

ния и кислотой

После гель- 237 8,2 28,9 899 3,8 36

фильтрации,

G-200

После ионооб- 37,6 3 12,5 549 14,6 22

менной хромэ-

г+гггт* ТТО Д О lOl » М""'

сефадекс А-50

I L f ' М ¿ 1

'и/ ц^о

0ul——

О 10 20 30 40 50 Номер фракции

А280А.160 Акт, Е/мл -^230 ^460

6У tj ]30

4 j 3 a I 1.5 O

|

4 ¡ jso 1

3f ■// Л a

I fu' \ '. í

2 tf \ ! !1 И Uo v i 0.5

Акт, Е/мл .тО-1

¡U-

щ

!i I 3

'Л

0.3 + 0.2 0.1

• 2 у

IЛ V ч

-о

10 20 30 Номер фракции

Рис.4, а) Гель-Фильтрация ШО на колонке с сефадексом G-200 б) Ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-се-фадексом А-50 в градиенте (IJH4)2S04 (0-0,.3 Ы). 1,2 - поглсшение при длине волны 280 и 460 нм соответственно, 3 - активность фермента на 1 мл элюата

О

Зависимость активности ЛМО от рН изучали при трех значениях шцентраций лизина: 20, 2 и 0,2 мМ, с использованием 50 мМ ка-:кй-фосфатного и глицин-КОН буферов (рис.5).

Как видно из рис.5, при изменении концентраций лизина нас людается сдвиг значения рН оптимума. Видно таюке, что значеш скорости ферментативной реакции в калий-фосфатном буфере в пере крываемой области рН значительно превосходит его в глицин-КС буфере. Значение оптимума рН при 2 и 20 мМ находится в райоь 9,5. При концентрации лизина в 0,2 мМ максимальная скорость фе£ ментативной реакции регистрировалась в области 9-9,2.

-I

V, мкмольмнн 0.4г

0.3^

За

г Т

,1

•7

36

0.2г

У * 26

к- V

О.Ц I

16

Рис.5. Зависимость актиь ности лизин-2-монооксиге назы от рН в 50 мМ буфе ре: а - калий фосфатнок б - глицин-КОН; концент рации лизина: 1 - 20 м^ 2 - 2 мМ: 3-0.2 мМ.

10 „11

рН

V, мкмольшш 0.18}-

г

0.06 /

?

0и/-,-,—

О 0.4 ' 0.8

Гб], мМ

1 /V, минмкмоль'

75 б

50 9 л

25 /

..__

-4 0 4 8 12 1 /Б, мМ

Рис.6. Зависимость скорости ферментативной реакции от кон центрации лизина, а - в прямых, б - в двойных обратных координа тах. Реакция инициировалась введением 75 пкмоль фермента.

Зависимость скорости реакции от концентрации кислорода хорошо лшеаризуетея в двойных обратных координатах. Зависимость ?.!& скорости от концентрации лизина описывается сигмоидной кривой (рис.6а) и при низких концентрациях лизина не линеаризуется (рис.66). Константы Михаэлиса для каждого из субстратов и максимальную скорость ферментативной реакции определяли при рН 9,2.

К.

л-4

М,

для кислорода оказалась в этих условиях равной 6,5-10 для лизина - 2,3-10~4 М. Максимальная скорость- реакции при этом составила 2400 моль/мин.

Для оценки кооперативности ЛМО зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента была представлена в координатах Хилла (рис.7а>. Из рисунка видно, что при низких концентрациях лизина (нияс1 0,4 мШ пн равен 3,1. Близкое значение было получено при обработке тех хсз данных разностным методом Курганова - 3,3 ± 0,5 (рис.76), Это подтверждает предположение о наличии скорее 4-х центров связывания для аллостерического ли-

ганда.

La

i f а

i ,/

l/v

12о|

!

i\ м ! \

-1

ВОг

40

\ \ LgM Lgyf

\ \

i i ,

-0.4 0 0.4

Ч [S]Q

-I -0.5 . .0

Lg LSJo

Рис.7. Определение коэффициента кооперативности:а - в координатах Хилла, б - методом Курганова.

3. Электрофоретичеекое поведение фермента.

Изучение электрофсрстического поведения ЛМО из Ps.puttda показало, что фермент мигрировал в геле единой полосой. При добавлении же в состав геля и электродного буфера L-лизина в концентрации 20 мМ наблюдалась смена места локализации фермента в столбике геля и образование перед основной полосой белка диффуз-

ной зоны, дакщей окраску при проведении субстратного окрашивания. Для выяснения природы диффузной зоны нами был проведен электрофорез в присутствии различных концентраций лизина (рис. 8). Уменьшение концентрации субстрата приводило к размыванию ос-

Рис.8. Поведение лизин-2-монооксигеназы при электрофорезе в. ПААГ в присутствии различных кон-центаций Ь-лиздаа (окрашивание амидочерным): а -20 мМ, б - 1 мМ, в - 0,1 мМ, в отсутствие субстрата.

А. Б В Г

новной белковой полосы и перераспределению фермента по всей зоне, вплоть до места локализации фермента в отсутствие субстрата (рис.8 г). Для объяснения этого язления следует иметь в виду, что в условиях проведения электрофореза (рН 8,6) Ь-лизин несет положительный заряд. Поскольку ЛМО 'является гомотропным ферментом, можно предположить, что в присутствии высоких концентраций лизина все большее число регуляторных центров оказывается заполненным лизином. Если при этом происходит блокирование отрицательных зарядов, то скорость миграции белка в геле долана существенно уменывгться. Это, по-видимому, и отражается на электро-фореграммах.

Подобное заключение хорошо согласуется с гипотезой Флашнер и Мл ссея о характере аллостерической регуляции лмо, согласно которой фермент в ходе каталитического акта не претерпевает значительных структурных изменений. Изменяется лишь конформация активного центра, в результате нейтрализации заряда аллостеричес-кого центра (ов), расположенного вблизи активного центра (ов)

4. Иммобилизация лизин-2-мснооксигеназы и ее применение в аналитической системе

Очищенный препарат ЛМО иммобилизовали на аминированном си-ликагеле с .помощью глутарового диальдегида. Иммобилизованный препарат с удельной активностью 84 Е/грамм носителя использовали при определении Ь-лизина в растворах.

Стандартизировав условия проведения реакции и построив предварительно градуировочную кривую можно на ее основе оценить концентрацию субстрата в пробе.

В случае ферментов, у которых зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имеет сигмоидный характер, зависимость величины сигнала анализатора от концентрации вводимого в анализатор субстрата также тлеет сигмоидный характер. При этом возникают сложности, связанные с получением и контролированием градуировочной кривой, поскольку невозможно предсказать точную форму кривой на основе одной-двух или трех градуи-ровочных точек.

Наиболее простым и потому наиболее приемлемым, на наш взгляд, путем для решения проблемы является кусочно-линейная аппроксимация градуировочной кривой. Очевидно, что как линейная аппроксимация методом наименьших квадратов, так и построение градуировочного графика на основе одной точки являются слишком лрпбл1Е':енны;ет (рис.9). Для отдельных же ее кусков можно получить достаточно приемлемые значения соответствия прямой.

Сигнал. мВ

' 200

400

О

Рис.9. Построение градуи-ровочных кривых для определения лизина:1 - на основе 1 точки в 33 мМ; 2 -на основе 1 точки в 60 мМ; 3 - линейная аппроксимация методом наименьших квадратов;4 - кусочно-линейная аппроксимация на основе 3-х точек (И ?ъ'.

О

20

[Лизин], мМ

40

60 44 мМ, 60 мМ);

В таблице 3 приведены данные по измерению концентрации Ь-лизина в диапазоне от 5,5 до 22 мМ. Обработка числовых данных

Таблица 3. Определение концентрации Ь-лизина в модельных растворах на основе дистиллированной воды.

Концентрация Ь-лизина, мМ

5,5 11,0 16,5 22,0

Величина сигнала кислородного электрода, мкА

0,30 1,13 2,0 2,63

методом наименьших квадратов показала, что зависимость величины тока кислородного электрода от концентрации лизина в этих условиях описывается корреляционной прямой:

1 = (0,143 ± 0,006)Х + (-0,45 ± 0,095)

с коэффициентом корреляции равным 0,994.

Применение микрокомпьютерной (микропроцессорной) техники сильно облегчает все вычислительные операции и позволяет без особых затруднений построить калибровочную кривую на основе любого числа точек.

.Сигнал, мВ

400Ь

300

200 г

10(Н О

8

^ \

\ \ \ \ \

Рис.10. Зависимость сигнала анализатора от рН в присутствии различных концентраций лизина: 1 -27,5 мМ: 2-44 мМ: 3 -55 мМ.

рН

10

9

Определение рН-оптимума действия иммобилизованного фермента

показало, что иммобилизованный фермент, по-видимому, менее лабилен, чем нативный, поскольку при всех испытанных концентрациях лизина рН-оптимум в 0,1 М универсальном буфере был равен 9,0 (рис.9). Практика показала, что в анализаторе "АРФА" целесообразнее использовать 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 8,0.

Известно, что величина сигнала анализатора, время отклика электрода и полное время анализа зависят от скорости протока. В таблице 4 приведены результаты измерений зависимости указанных параметров от скорости потока. В качестве наиболее оптимальной скорости для анализа лизина была выбрана скорость расхода рабо-

Таблица 4. Влияние скорости протока буфера на величину сигнала и время анализа.

Скорость протока, Величина сигнала Время отклика Полное время

(мл/час) электрода, (мВ) электрода, (с) анализа, (мин)

200 249,5±16,2 94,7±7,2 7,3±0,6

330 217±10,9 38,7±2,1 3,9±0,3

400 122,5±5,8 20,7±1,5 2,1±0,2

460 110±7,5 20,6±1,4 1,6±0,1

600 100,4±5,5 17,4±0,9 1,4±0,1

Сигнал, мВ

0 20 40 60

1, дни

чего буфера в 400 мл/час. При этой" скорости наблюдалось достаточно высокое значение сигнала электрода и небольшое время анализа. Измерения проводились в 50 мМ калий-фосфатном буфере рН 8,0, при концентрации лизина 10 мМ.

При хранении микрореактора с иммобилизованным ферментом при температуре 5° в течение 3-х месяцев сохранялось не менее 90% исходной активности. При функционировании в течение 30 дней при рабочей температура 25° исходная активность уменьшалась на 30%. За этот промежуток времени в среднем выполнялось около 1000 анализов. За следук>хие 30 дней остаточная активность иммобилизованного фермента уменьшалась до 50% от исходной (рис.11).

Таблица 5. Сравнение специфичности определения Ь-лизина анализатором "АРМ" и ферментным электродом.

Относительная активность (%)

Аминокислота ------

"АРФА" (ЛМО) Ферментный электрод

(Ь-лизин-а-оксидаза)

Ь-лизин 100 100

Ь-орнитин 1 25

Ь-фенилаланин 0 11

Ь-аргинш 0 8,1

Ь-пролин 0 не определено

Ь-изолейщш 0

Ь-валин 0

Ь-серин 0

Результаты изучения субстратной специфичности представлены в таблице 5, в которой, для сравнения, приведены данные из работы Рометта и др. (Ног.еи е1 а1., 1934), где авторы проводили аналогичные определения для иммобилизованного фермента Ь-лизин-а-оксидазы. Видно, что аналитическая система реагирует на Ь-ли-зин с очень высокой избирательностью.

В таблице 6 представлены сравнительные данные по определению концентрации лизина в культуральной жидкости пилотных установок при микробиологическом получении лизина в условиях института микробиологии им. А.Кирхенштейна АН Латвии. Из таблицы видно, что результаты, полученные с помощью анализатора "АРФА", хорошо коррелируют с данными, полученными методами, традиционно

используемыми в лабораторных условиях.

Таблица 6. Определение концентрации L-лизина в ферментационной жидкости.

Метод анализа

Номер пробы "АРФА" Газо-жидк. хроматография Электрофорез Химический

1. 16,0 17,5 20,0 -

о 16,5 18,2 22,5 -

3. 20.5 22,4 22,9 -

4. 28,5 26,5 28,0 -

5. 20,5 21,9 20,4 -

6. 12,8 12,0 15,2 -

7. 26,9 - - 25,8

8. 46,8 - - 45,7

9. 70,4 - 69,3 67,5

10. 21 ,4 - 21,7 20,0

И . 80,6 - 79,5 78,5

12. 54,2 - 53,2 -

Коэффициент корреляции в случае сравнения:

АРФА - газо-жидкостнаг. хроматография - 0,995;

АРФА - электрофорез - 0,997;

АРФА - химический метод - 0,998.

При пятикратном определении одной пробы с помощью анализатора "АРФА" коэффициент вариации не превышал 6% при концентрациях ниже 22 мМ, и 3,5% - выше.

На описанный выше способ определения концентрации L-лизина получено авторское свидетельство № 1387417 от 08.12.87.

ВЫВОДЫ

1. Из коллекций культур микроорганизмов, хранящихся в учреждениях СНГ (СССР), найдены две культуры с высокой Ь-лизин-2-монооксигеназной активностью, лучшая из которых: Ps.put ida ВКМ В-1458Д, выбрана в качестве продуцента ЛМО. Выход активности при этом составляет примерно 30 Е/г влажной биомассы.

2. Разработана методика выделения и очистки фермента, дающая высокий выход фермента, при меньшем количестве операций.

3. Показано, что ЛМО из Ps.put lúa ВКМ В-1458Д по основным физико-химическим и кинетическим параметрам не отличается от

фермента из Ps. fluorescens АТСС 11250.

4. Показано, что поведение фермента в ходе диск электрофореза в ПААГ позволяет считать правомерной гипотезу Флашнер и Массея, согласно которой аллостерическим центром ЛМО может служить заряженная область на белке вблизи активного центра, блокирование которой приводит к активации фермента.

5. Разработана методика иммобилизации фермента, позволяющая получить активный препарат с сохранением не менее 10% исходной активности, изучены некоторые физико-химические свойства иммобилизованной ЛМО.

6. Впервые получен активный препарат иммобилизованной внутренней монооксигеназы с сигмоидной кривой насыщения по основному субстрату, при этом иммобилизация не приводит к изменению характера кривой насыщения.

7. Показана возможность применения ЛМО в аналитических целях.

8. Разработана проточно-инясекционная аналитическая система для безреагентного определения концентрации I-лизина в различных биологических з:с:дкостях.

9. Разработана методика проведения анализа L-лизина в лабораторных и промышленных условиях и проведены испытания аналитической системы в полупромышленных и промышленных условиях.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш., Мкртчян H.H., Симонян А.Л. Выделение, очистка и иммобилизация лизин-2-монооксигеназы is Pseudomonas putida. Y Всесоюзный симпозиум по инженерной энзимо-логии, Кобулети, 1985, стр.26.

2. Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С.ID., Авакян Ц.М. Некоторые тенденции в развитии современных методов анализа ажио-кислот, Еполог.ж.Армении, Т.39, $ 7, стр.555-563, 1986.

3. Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С. 12., Авакян Ü.M., Хачатрян Т.В. Pseudomonas put lúa БКМ В-1458 - штамм-продуцент Ь-лизин-2-монооксигеназы. А/с Й1310427, 1987.

4. Хачатрян Г.Э., Казарян Т.Р., Симонян А.Л. Влияние п-хлор-меркурибе-нзоата на Ь-лизин-2-монооксигеназу из Pseudomonas sp. Биолог.2£.Армении, Т.40, >;> 3, стр.219-223, 1987.

5. Slmonlan A.L., Razarían Т.Е., Khachatrlan G.E. Peculiarities oí kinetic behaviour and transformatIon of catalitlc activity of L-lyslne-2-momoxygeiiase. Abstracts of Intern. Simp. Che-

mical Physics of Enzyme Catalysis, Tallinn, 1987, p.80.

6. Симонян А.Л., Хачатрян Г.Э., Татикян С.Ш., Авакян Ц.М. Способ определения L-лизина. А/с № 1387417, 1987.

7. Бадалян И.Э., Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л. Некоторые свойства иммобилизованной на силикагеле лизин-2-монооксигеназы. Тезисы докладов IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований", Ереван, 1988, стр.142.

8. Агабабян A.A., Aeikhh Ц.М., Буюкян С.П., Дургарьян К.С., Ка-рапетян А.В., Симонян А.Л., Татикян С.Ш., Хачатрян Г.Э. Автоматизированная система определения концентрации лизина с помощью ферментного анализатора "АРФА-Л1", Биолог.ж.Армении, Т.41. № 4, стр.294-297. 1988.

9. Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л., Выделение, очистка и некоторые характеристики Ь-лизин-2-монооксигеназы из Рзеийотопаз putl-сia, Биохимия, т.53, Вып.8, стр. 1256-1265, 1S88.

Ю.Казарян Т.Р., Хачатрян Г.Э., Симонян А.Л. Влияние эффекторов на кинетическое поведение лизин-2-монооксигеназы. Тезисы докладов IY Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований", Ереван, 1988, стр.140.

ll.Simonian A.L., Khachatrlan G.E., Tatlklan S.Sh.. Avaklan Ts. M. Specific and rapid determination of L-lyslne concentration by flow-through enzyme analyzer. Abstr.book. FEBS 19-th meeting, Rome, 1989, p.TU 482.

12.Slmonian A.L., Khachatrlan G.E., Tatlklan S.Sh.. Avaklan Ts. M., Badallan I.E. A flow-through enzyme analyzer for determination of L-lyslne concentration. Biocens.& Bloelectr., v. 6, No.2, p.93-99, 1991.

Техническии_оелакто£_А^С^Абрамян

Подписано в печать ЦД'5#9? Офсетная печать. Зак. тип N 136

Формат 80x^4x16 Тираж 90 ' окэ.

Отпечатано в Ереванском физическом институте Ереван 36, у л, Бр. Алиханьян 2