Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые аспекты процесса инфицирования корнейпшеницы ассоциативными микроорганизмами родаAzospirillum

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некоторые аспекты процесса инфицирования корнейпшеницы ассоциативными микроорганизмами родаAzospirillum"

л

' А***

На правах рукописи

Селиванов Николай Юрьевич

Некоторые аспекты процесса инфицирования корней пшеницы ассоциативными микроорганизмами рода АгоъриШит.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии Наук (ИБФРМ РАН г.Саратов).

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор В.В.Игнатов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заведующий лабораторией ВЛ.Панасенко, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник И.А.Дятлов.

Ведущая организация - Саратовский государственный университет ш Н.Г.Чернышевского, 410601, Саратов, Астраханская, 83.

Защита состоится " 27 " июня 1996г. в 10.00 час. на заседании диссертацио] ного совета Д074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочуз ном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул.Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ "Микроб".

Автореферат разослан "15 "мая 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических нау профессор Г.А.Корнеев.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение молекулярных биохимических основ взаимодействия растений с ризосферной микрофлорой является одной из основных фундаментальных проблем почвенной микробиологии. Важнейшим направлением в этой области биологии является исследование механизма инфицирования корней растений ризосферными микроорганизмами.

Этап инфицирования при взаимодействии растений и микроорганизмов во многом обеспечивает эффективность процессов фиксации азота и биосинтеза фитогормонов бактериями в симбиотическом и ассоциативном ризоценозах. Молекулярные механизмы процесса бактериальной инфекции у растений частично изучены на симбиотических (бобово-ризобиальный симбиоз) и патогенетических моделях, в то время как данные о механизме более широко распространенной ассоциативной инфекции практически отсутствуют.

В отличие от патогенной и симбиотической инфекций при ассоциативном взаимодействии не наблюдается формирования фенотипических симптомов (внешних проявлений инфекции) - некротических зон и клубеньков. В процессе колонизации ассоциативные микроорганизмы не проникают внутрь клеток, а колонизируют поверхность корня и межклеточное пространство. Однако, в литературе практически отсутствуют данные о процессах, происходящих в этом ком-партменте при ассоциативной инфекции. Наименее исследованной областью формирования ассоциативного ризоценоза является изучение компонентов поверхности бактерий и их функций в обеспечении эффективности процесса колонизации растения-хозяина.

В ряде работ показана существенная роль бактериальных липополисахаридов (ЛПС) и гликолитических ферментов в процессах распознавания и инфицирования растения-хозяина, однако, их роль при ассоциативном взаимодействии остается неясной.

Представляется важным исследование внеклеточных белков, продуцируемых растением при бактериальной инфекции. Наибольший интерес среди них представляют гликозидазы и семейство гидроксипролинбогатых белков (ГПББ), обеспечивающих распознавание и адаптацию растения к бактериальной инфекции.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось исследование молекулярных механизмов , обеспечивающих распознавание и эффективную колонизацию корней пшеницы ассоциативными микроорганизмами рода АгояркШит. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние колонизации ризосферными микроорганизмами растений пшеницы на состав белков клеточных стенок корней.

2. Исследовать специфичность изменения содержания гидроксипролинбогатых белков клеточной стенки при ассоциативной инфекции и определить количественные проявления эффекта при инокуляции различными штаммами А.ЪгазИепзе.

3. Исследовать влияние ассоциативной инфекции на спектр внеклеточных гликозидаз корней пшеницы.

4. Выяснить роль поверхностных полисахаридов А-ЬгаяНегке в процессе инфицирования растения-хозяина.

5. Исследовать изменение спектра внеклеточных белков А.ЪгазИепзе при взаимодействии с клеточной стенкой растения-хозяина.

Научная новшпа работы. В работе впервые показано влияние ассоциативной инфекции на индукцию адаптивных реакций в корнях пшеницы. Установлено, что уровень накопления ГПББ в клеточных стенках корней носит штамм-специфичный характер, зависит от компетентности штамма ассоциативного микроорганизма и может служить количественным параметром для оценки эффективности колонизации корней при ассоциативной инфекции. Выявлено штамм-специфичное увеличение активности внеклеточных ферментов в корнях при ассоциативной инфекции. Показано, что ЛПС является одной из детерминант- распознавания микроорганизма растением и его участие в индукции биосинтеза внеклеточных белков растения и увеличении активности гликолитиче-ских ферментов. Показана индукция у азоспирилл специфичных внеклеточных полнпептидов под воздействием препарата клеточной стенки корней пшеницы. Выявлена индукция внеклеточных гликолитических ферментов микроорганизмов под воздействием компонентов клеточных стенок растения-хозяина.

Практическая значимость работы. Проведенные исследования создают основу для разработки методов количественной оценки эффективности ассоциативных взаимодействий по проявлению ответных реакций растений, что чрезвычайно важно при разработке и применении экологически чистых бактериальных удобрений, основанных на использовании ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов.

Особое значение имеет возможность установления количественных оценок компетентности различных штаммов по отношению к злаковым растениям и выявление основных детерминант - ЛПС и внеклеточных гликозидаз, обеспечивающих их распознавание растением. Эти результаты делают возможным целенаправленное создание штаммов ассоциативных микроорганизмов, сочетающие высокую азотфиксирующую активность и специфичность инфицирования и колонизации корней злаков, что необходимо для повышения эффективности бактериальных удобрений.

Разработанные автором методы исследования внеклеточных белков растешп и микроорганизмов используются при проведении плановых НИР в лабораторш биохимии ИБФРМ РАН. Кроме того, методики выявления и анализа полипепти дов и полисахаридов, специфических для ассоциативного взаимодействия, при меняются в исследовательской практике лаборатории физической химии клеточ ных структур (ЛФХКС) ИБФРМ РАН.

Материалы диссертационной работы нашли применение на кафедре биохимш и биофизики СГУ при подготовке спецкурсов "Методы препаративной биохи мии" и "Биологически активные вещества", а также при подготовке курсовых \ дипломных работ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработка методов выявления и анализа внеклеточных белков растений I микроорганизмов, синтезируемых в процессе колонизации корней пшеницы ас социативными бактериями рода АгояртИит.

2. Выявление индукции синтеза гидроксипролинбогатых белков и группы вне клеточных гликолитических ферментов в корнях пшеницы в ответ на колониза цию (инфицирование) АюяртИит ЬгахИегде.

3. Обнаружение штаммовой специфичности в проявлении ответных реакций ; пшеницы, определяемой компетентностью штаммов АгозртИит к растению хозяину.

4. Выявление специфических внеклеточных полипептндов A.brasilense, синтезируемых в присутствии фрагментов клеточной стенки корней пшеницы.

5. Установление участия лнпополисахарида и индуцибельных гликозидаз A.brasilense в индукции адаптивных реакций растений при ассоциативной инфекции.

Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с планом НИР по теме: "Изучение молекулярных механизмов взаимодействия растений и микроорганизмов" (научный руководитель профессор В.В. Игнатов, N гос. регистрации 01890057691).

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на: VIII Eastern Europe symposium on biological nitrogen fixation-Nitrogenfix-92, Saratov, (Russia), 1992; Advanced research workshop on Azospirillum and related microorganisms, Sharvar, (Hungary), 1994; I-European nitrogen fixation conference, Szeged, (Hungary),1994; 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации, Москва,(Russia), 1995; 10-th International Congress on Nitrogen Fixation, St.Petersburg, (Russia), 1995; International Workshop on Associative interactions of nitrogen-fixing bacteria with plants, Saratov, (Russia), 1995; а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 108 страницах, иллюстрирована 7 рисунками и содержит 4 таблицы. Список использованных литературных источников включает 165 наименований.

Краткое содержание работы

Литературный обзор представлен в первой главе, где обсуждены проблемы взаимоотношений почвенных ризосферных микроорганизмов с растениями и рассмотрены возможные место и роль азоспирилл как ассоциативных азотфикса-торов в микробных ризоценозах. Обсуждены особенности строения клеточной поверхности ризосферных микроорганизмов, отмечены данные по генетике их углеводных детерминант. Проанализированы молекулярные механизмы распознавания и ответных реакций растений при различных бактериальных инфекциях. Обобщены данные исследований ассоциативных взаимоотношений растений и микроорганизмов.

Материалы и методы

В работе использовались культуры: Azospirillum brasilense CD, Sp 7, Sp 75, Sp 245; Azospirillum lipoferum Sp 43; Agrobacterium radiobacter 5Д-1; Escherichia coli К 12. Штаммы были получены из различных источников и хранились в группе гено-систематики ИБФРМ РАН. Основными объектами исследования были выбраны ассоциативные бактерии рода Azospirillum. В работе использовались штаммы, выделенные из различных ризоценозов. Штамм Sp 245 выделен из ризосферы пшеницы, Sp 7 и CD - из ризосферы и корней тропических растений ( Digitaria), штамм A.brasilense Sp 75 и A.lipoferum Sp 43 - из корней и зерен саратовской пшеницы. Был так же использован штамм Agrobacterium radiobacter 5Д-1 из поверхностно-стерилизованных корней пшеницы. Данный штамм выделен, ндентифнци-

рован и охарактеризован М.И Чумаковым. Также был использован неассоциативный микроорганизм - E.coli К 12.

Препарат ЛПС A.brasilense Sp 245 был выделен и очищен в лаборатории JIФХКС ИБФРМ РАН и предоставлен для работы Л.Ю.Матора.

В качестве растения-хозяина использовали 7-15 суточные растения пшеницы (Triticum aestivum) сортов: Саратовская 29 и Саратовская 57 , которые являются яровыми, гекса- и тетраплоидными пшеницами соответственно, а также сорт Мироновская 808 - озимый гексаплоид. Сортовые семена были получены из НИИСХ Юго-Востока г. Саратов.

Семена стерилизовали 2.5 % раствором хлорамина-Т 25 мин. После промывки водой семена раскладывали на чашки Петри с питательным агаром и помещали в термостат на 24°С. Через двое суток проросшие семена высаживали на 90 мм чашки Петри с 15 мл жидкой среды по 5 растений на чашку. Использовали два типа сред: с азотом (N+) и без азота (N-). Состав среды соответствует модификации М8280 среды Мурасиге-Скуга (Sigma chemical company), но концентрации нитрата калия и нитрата аммония были уменьшены в два раза. Растения выращивали при комнатной температуре (21-23°С) и естественном освещении.

Инокуляцию растений проводили бактериями на логарифмической стадии роста. Культуру выращивали на питательной среде следующего состава: триптон (10 г/л), пептон из сои (5 г/л), NaCl (5 г/л). Инокуляционная доза составляла 107 клеток на чашку с растениями. Концентрацию клеток определяли методом спек-тротурбидиметрии (Щеголев, 1988г.).

Внеклеточную жидкость выделяли по методике Parent & Asselin с модификациями . Корни нарезали на кусочки 7 мм длины и дважды промывали буфером для экстракции ( Трис-НС! 50 мМ pH 7.0 + 0.5 М сахарозы + 150 мМ LiCl). Залитые буфером для экстракции корни подвергались вакуумированию 3 раза по 30 с. Кусочки корней осушивались на фильтровальной бумаге, помещались в 12 мл пластиковую колонку (Bio-Rad), и центрифугировались 10 мин при 1000 g. После этого полученные образцы внеклеточной жидкости подвергали центрифугированию для осаждения бактерий и клеточных органелл 5 мин при 11000 g и хранили при -20°С.

Концентрацию белка в экстрактах определяли по методу Sedmak (1977) с использованием кумасси G-250 по калибровочной кривой с овальбумином в качестве стандарта.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили по Laemmli (1970). Использовали стандарты молекулярной массы MW-SDS-70L (Sigma).

При приготовлении образцов для ДДС-фореза был использован метод соо-саждения белков и дезоксихолата в присутствии трихлоруксусной кислоты.

Содержание гидроксипролинбогатых белков определяли по количеству гид-роксипролина (ГП) в полимерах корней растений. Корни высушивали при 105°С для определения сухого веса, образцы измельчали и экстрагировали 5 мл 70 % этанола для удаления свободных аминокислот. Осадок после экстракции свободных аминокислот гидролизовали 6 н HCl 24 ч при 105°C, высушивали при 60°С, растворяли в 1.5 мл буфера для образца, анализировали аликвоты по 150 мкл на анализаторе AAA 339 (ЧССР) в цитрат-литиевой системе.

Получение препарата клеточной стенки корней пшеницы. Корни 4-х дневных проростков пшеницы измельчали в жидком азоте . Полученный материал последовательно экстрагировали 0.1 М Na-фосфэтным буфером pH 7.5, содержащим 0.2 М NaCl и 2 мМ метабисульфита натрия в течение 30-40 мин при +4°С; 3 М

раствором хлористого лития 40 мни; смесью хлороформ-этанол (1:1) 40 мин; этанолом и ацетоном по 20 мин. Полученный препарат КС сушили под вакуумом при комнатной температуре.

Определение гликозилгидролазной активности проводилось с использованием нитрофенил-производных а-маннозы, р-глюкозы, а- и р-галактозы. Длительность ферментативной реакции 1 ч при 30°С. Реакция останавливалась 0.2 М боратного буфера рН 9.8. Активность измеряли колориметрически по образованию продукта гидролиза - р-нитрофенола. За единицу активности принимали нКатал - количество фермента, которое гидролизует 1 нМ субстрата за 1 с при 30°С.

Определение эндогликолитической активности проводилось с использованием высокомолекулярных полисахаридных субстратов - пектина, КМ-целлюлозы, ламинарина, хитина. Активность определялась по скорости деградации полимеров. Реакцию проводили 2 ч при 37°С . Анализируемый образец содержал: 800 мкл буфера (цитрат натрия 50 мМ, рН 5,1), 200 мкл 0,2 % раствора субстрата и 50100 мкл исследуемого образца. Количество восстанавливающих Сахаров определяли арсеномолибдатным методом с использованием глюкозы в качестве стандарта.

Пульс-мечение белков в корнях пшеницы. Пятнадцать растений пшеницы помещали корнями в 10 мл среды содержащей 0,1 МБк/мл [!-14С] глицина на 1-5 ч, а затем переносили в раствор немеченного глицина (1 мМ) на один час. После этого использовали для получения экстрактов.

Флюорографию белков после ДДС-фореза проводили по стандартной методике с использованием дифенилоксазола (РРО) в качестве флюорохрома.

Полученные результаты и их обсуждение

1. Исследование влияния колонизации различными ризосфер-ными микроорганизмами на развитие корневой системы пшеницы

Как уже было отмечено, в отличие от процессов патогенной и симбиотн-ческой инфекций при взаимодействии растений с ассоциативными ризосферными микроорганизмами не наблюдается образования ярко выраженных морфогенных симптомов колонизации или инфицирования (образование некротических зон или клубеньков). Для первоначальной интегральной оценки совместимости выбранных нами ассоциативных микроорганизмов и растений мы исследовали влияние инокуляции различными штаммами на развитие корневой системы пшеницы. Проведенные эксперименты выявили различное воздействие штаммов на накопление сырой и сухой массы корней пшеницы сорта Саратовская 29 при 12 суточном совместном культивировании (таб.1).

Как видно из таблицы 1, только бактерии рода АгозртИгап вызывали стойкий положительный эффект - увеличение ростовых характеристик (сырой вес корней) и активацию биосинтетических процессов (накопление сухой массы корней пшеницы). Однако остается неясным, происходит ли обмен метаболитами дистанционно или опосредуется селективной колонизацией поверхности корней и их инфицированием. Процесс инфицирования предполагает наличие защитного или адаптационного биохимического ответа. Поэтому в исследованиях реакций растения на ассоциативную инфекцию мы сосредоточили основное внимание на двух реакциях - накоплении ГПББ в КС корней пшеницы и увеличении активности внеклеточных экзо- и эндогликозидаз растений.

Таблица 1

Влияние различных штаммов ризосферных микроорганизмов на развитие корневой системы пшеницы при 12-™ суточном совместном культивировании (среднее по 10 растениям)

Сырой вес корней Сухой вес корней

Варианты мг % мг %

Контроль 72.0±3.4 100 15.0±0.78 . 100

А. brazilense Sp 7 77.011.8 107 16.6±0.85 111

А. brazilense Sp 245 81.5±3.3 111» 18.9±1.05 126»

А. radiobacter 5-D1 67.5±2.б 94» 11.5±0.48 77*

E. coli KI2 60.0±3.2 83» 9.5±0.47 64»

Примечание: * - различия между выборками достоверны по критерию Фишера при 5 % уровне значимости (сравнение с контролем); доверительный интервал - 95%.

Проявление этих 2-х процессов характерно для различных типов инфекций: симбиотической и патогенной. Физиологическая роль первого - модификация КС вокруг инфекционной зоны и обеспечение толерантности клеток растений к микробиологическому окружению. Второй процесс опосредует распознавание и активацию защиты растений от микроорганизмов путем деградации полисахаридов клеточной поверхности партнеров с образованием олигосахаридов - индукторов защитных реакций растений и ингибиторов роста микроорганизмов.

2. Исследование влияния колонизации различными ризосферньши микроорганизмами на содержание гидроксипролинбогатых белков в корнях растений пшеницы

В экспериментах использовались различные штаммы микроорганизмов А-ЬгажИепБе Бр 7, Бр 245, А%тоЬасш1ит гасИоЪааег 5Д-1 - штаммы, выделенные из ризосферы тропических трав и пшеницы соответственно, причем, как было показано ранее, последний штамм оказывает отрицательное влияние на рост и развитие корней пшеницы. В качестве неспецифического контроля был использован штамм Е.соИ К12.

Для исследования динамики и уровня накопления ГПББ при различной специфичности взаимодействия определение проводили при длительном (12 суток) и коротком (2 суток) совместном культивировании растений с микроорганизмами. Данные приведены в таблице 2.

Значения содержания ГПББ в корнях пшеницы, полученные в наших экспериментах, несколько ниже представленных в литературе для большинства двудольных растений. Данный факт, очевидно, объясняется более низким уровнем содержания ГПББ у злаковых растений, а также маскирующим эффектом роста за счет значительного изменения сырой и сухой массы корней растения при совместном

культивировании. Это особенно выражено в 12 суточном эксперименте. При этом необходимо учитывать, что при ассоциативном взаимодействии колонизируется только часть (1/4-1/2) корня.

Таблица 2.

Влияние различных ризосферных микроорганизмов на содержание ГПББ в тканях корней пшеницы при совместном культивировании

2 суток 12 суток

Варианты Сухой вес корней, мг Содержание гидроксипро лина, нг/мг сухого веса % Сухой вес корней, мг Содержание гидроксипро лина, нг/мг сухого веса %

Стерильный конроль 14.40 748±38 100 15.05 717±40 100

А. ЬгаяНеже Бр7 13.93 724±32 103 16.60 810±54* 113

А. Ьгсткме Эр 245 15.47 1197±70 * 160 18.90 946±60* 132

А. тасИоЬШег 5Э-1 12.90 416+27» 55 11.50 675±34 95

Е. соИ К 12 13.93 718±36 95 9.50 2020±100» 283

Примечание: * - различия мезвду выборками достоверны по критерию Фишера при 5 % уровне значимости (сравнение с контролем); доверительный интервал - 95 %.

Наиболее интересны данные, полученные для штаммов Бр 245 и Бр 7. Так, А.ЬтшЫюе Эр 245 при кратковременном культивировании вызывал наибольшее накопление ГПББ в корнях пшеницы. Если анализировать данные,исходя из концепции распознавания при патогенной инфекции, то такая дифференциация ответа - быстрая и объемная экспрессия белков - характерна для взаимодействия устойчивого растения с компетентным штаммом микроорганизма, каким и является штамм Бр 245 для растений пшеницы. Интересно, что штамм Эр 7, выделенный из ризосферы тропических трав, вызывает медленное и незначительное накопление ГПББ - 113 % по сравнению с контролем при 12 суточном культивировании.

Результаты инокуляции пшеницы Е.соИ К 12 демонстрируют совершенно иную динамику. Она проявляется замедлением прироста сухой массы корней на первом этапе и последующим развитием некротических явлений, сопровождающихся значительным накоплением ГПББ при 12 суточном культивировании.

3. Исследование штаммовой детерминированности накопления ГПББ в корнях пшеницы при колонизации азоспириллами и гормональной

индукции

На следующем этапе нами были проведены углубленные исследования выявленной дифференциальной реакции растения на различные штаммы ассоциативной микрофлоры. В частности, было проанализировано влияние 4 штам-

мов рода Azospirillum: A.brasilense Sp 7, Sp 245, 75 и A.lipo/erum 43, а также различных концентраций этефона - эндогенного регулятора синтеза ГПББ в корнях пшеницы. Этефон нами был использован для выявления максимально возможного уровня накопления ГПББ, так как полученные нами данные накопления ГПББ в корнях пшеницы под влиянием инокуляции ассоциативными микроорганизмами оказались значительно более низкими по сравнению с приводимыми в литературе по патогенной инфекции, где этот эффект является 5-10 кратным.

В данном эксперименте исследовался синтез ГПББ у более взрослых 15-18 суточных растений в отличие от предшествующих экспериментов, где использовались 5-7 суточные растения. В связи с этим содержание ГПББ определялось через 48 и 72 ч после инокуляции. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Накопление ГПББ в корнях 12-суточных растений пшеницы сорта Саратовская 29 при инокуляции различными штаммами азоспирилл и гормональной индукции

48 часов 72 часа

Варианты Содержание ГП (нМ/мг сухого веса) % Содержание ГП (нМ/мг сухого веса) %

Контроль 6.68Ю.34 100 6.64±0.35 100

А. brasilense Sp 245 10.57±0.58 * 156 13.19±0.70* 199

А. brasilense Sp 7 6.54±0.34 98 7.51±0.40* 113

А. brasilense Sp 75 6.42±0.30 96 9.12±0.50* 137

A. lipoferum Sp 43 6.53±0.30 98 7.13+0.42* 107

Этефон 1.5 мг/л 10.17±0.56* 153 ND ND

Этефон 3.0 мг/л 14.41 ±0.70* 217 6.19+0.30* 93

Примечание: *- различия между выборками достоверны по критерию Фишера при 5 % уровне значимости (сравнение с контролем); доверительный интервал - 95 % ; N0 - не определяли.

Среди исследованных штаммов наиболее эффективными были А.ЬгобНош Бр 75 и £>р 245 - они вызывали увеличение содержания ГПББ в корнях на 37% и 99% соответственно по сравнению с контролем. Важно отметить, что оба штамма были выделены из ризосферы пшеницы и, возможно, именно это обстоятельство определяет эффективность их колонизации растения-хозяина. Во всех случаях содержание ГПББ увеличивалось в течение 72 ч, в то время как к 48 ч накопление ГПББ отмечено только при воздействии штамма Бр 245 и этефона.

Сравнение содержания ГПББ при воздействии специфичного штамма £р 245 и этефона позволяет предполагать, что колонизация корней пшеницы ассоциативными микроорганизмами способна вызывать накопление ГПББ близкое к максимальному.

4.Исследование хозяйской специфичности взаимодействия азосхшрилл с растениями пшеницы

Для выявления видовых особенностей накопления ГПББ у пшеницы при инокуляции ассоциативными штаммами были исследованы три сорта с различными физиолого-биохимическимн характеристиками: Саратовская 29, Саратовская 57 и Мироновская 808. Растения указанных сортов были инокулированы штаммами A.brasilense Sp 7 и Sp 245. Содержание ГПББ определяли через 48 ч и 72 ч (рис.1).

□ 48 часов EJ72 часа

С29 М 808 С29 М808 С57

Sp 7 Sp 245

Рис 1. Влияние инокуяяцни A. brasilense Sp 7 и Sp 245 на содержание ГПББ в корнях различных сортов пшеницы ; С 29 - Саратовская 29; С 57 - Саратовская 57; М808 - Мироновская 808; % от контроля.

Содержание ГПББ в корнях стерильных растений различалось незначительно - 6,16 - 6,80 нМ ГП на I мг сухого веса и было несколько выше у Саратовской 57 -7,15 нМ ГП на 1 мг сухого веса, что, очевидно, отражает генотипические особенности этого сорта - тетраплоида АВ с увеличенным синтезом белков.

В тоже время полученные данные показывают значительные отличия в синтезе ГПББ у исследованных сортов и видов пшеницы в наших экспериментах при выращивании на водной безазотистой среде и инокуляции различными по компетентности штаммами азоспириллы.

Нами выявлено увеличение содержания ГПББ при колонизации корней микроорганизмами рода Azospirillum у всех исследованных сортов. Увеличение составило 105 % - 202 % от контроля. Результаты демонстрируют сортовые различия в накоплении ГПББ как по уровню индукции, так и по штаммовой специфичности. Кроме того, обнаружены различия и в динамике ответной реакции. Так, для озимой пшеницы Мироновской 808 максимум содержания ГПББ наблюдался уже через 48 ч после инокуляции, в то время как у Саратовской 29 и Саратовской 57 накопление происходит более равномерно и наибольшие значения были отмечены через 72 часа.

При этом обнаруживается хорошо выраженная штаммовая селективность взаимодействия азоспирилл с яровым и озимым фенотипами пшеницы. Так, инокуляция штаммом Sp 245 вызывает более значительный эффект у яровых пшениц, а "непшеничный" штамм Sp 7 вызывает лишь кратковременный эффект у озимой

пшеницы Мироновская 808. Это, очевидно, объясняется различием физиолого -биохимических характеристик двух фенотипов пшеницы, но не определяется сортовыми характеристиками рассматриваемых сортов.

Таким образом, мы можем заключить, что колонизация тканей корня пшеницы ассоциативными бактериями A.brasilense вызывает накопление ГПББ в КС, что является одной из характерных реакций растений на бактериальную инфекцию.

5. Исследование влияния колонизации A.brasilense на спектр гликолитических ферментов в апопласте корней пшеницы

Как уже упоминалось, гликолитические ферменты играют основную роль в распознавании и запуске ответных реакций растений при бактериальной инфекции путем деградации полисахаридов клеточной поверхности партнеров с образованием олигосахаридов - индукторов защитных реакций растений и ингибиторов роста микроорганизмов.

В данном разделе работы мы исследовали активность экзо- и эндогликозидаз апопласта корней растения пшеницы. Учитывая важную роль экзогликозидаз в обеспечении и регулировании метаболитических и физиологических процессов как внутриклеточно, так и на тканевом уровне, мы рассматривали группу этих ферментов как возможных регуляторов ответов растения на воздействия внешней среды.

На рисунке 2 приведены изменения активностей экзогликозидаз в апопласте корней после инокуляции A.brasilense Sp 245 и Sp 7.

Рис 2. Изменение активностей экзогликозидаз в апопласте корней пшеницы сорта Саратовская 29 при ифицировании клетками А Ьга^Иете ; 72 часа после инокуляции

Нами показано, что инокуляция 7-Ю-суточных растений пшеницы этими штаммами вызывает значительные изменения спектра экзогликозидаз в апопласте корней пшеницы. Среди исследованных ферментов наибольшие изменения активности отмечены для а-галактозидазы и Р-галактозидазы. Инокуляция "непшеннчным" штаммом Бр 7 на безазотистой среде вызывала наибольшее увеличение активности - 50 % для. а-галактозидазы и 120 % для Р-галактозидазы. Этот эффект в значительно меньшей степени отмечен также на среде с азотом-20 и 17 % соответственно. В этих условиях азот оказывает ингибирующее влияние на эффективность колонизации при ассоциативном и снмбиотическом взаимодействиях. В противоположность этому, инокуляция штаммом Бр 245 вызывала менее выраженный эффект при взаимодействии на безазотистой среде -18 % для а-галактозидазы и 100 % для р-галактозидазы. Однако, при инокуляции на среде с

а Ман а Глю а Гал р Гал Безазотистая среда

а Ман а Глю а Гал р Гал Среда с 30 мМ NH4N03

азотом отмечается значительное снижение активности индуцибельных ферментов - 30 % для сс-галактозидазы и 50 % для Р-галактозидазы. Вероятно, это снижение активности является следствием ингибирования ферментов специфическими поверхностными структурами клеток бактерий либо их протеолитической деградацией.

В данном случае мы можем предположить, что именно эти ферменты являются распознающими компонентами в системе внеклеточных экзогликозидаз. Обращает на себя внимание различная степень индуцибельности ферментов на среде с азотом и без него, что-подтверждает литературные данные о снижении эффективности симбиотических и ассоциативных взаимодействий под воздействием оптимального количества доступного для растений азота, вследствие которого и снижается потенциал распознающей системы.

Вместе с тем, помимо трофического аспекта взаимодействия, очевидно, большую роль играет и распознавание растением бактериальной инфекции по классической схеме "хозяин-патоген" (хозяин - несовместимый ассоциант), что может быть причиной различной степени индукции специализированных гликозидаз различными по совместимости ассоциантами.

В отличие от рассмотренных выше экзогликозидаз в литературе больше внимания уделяется эндогликозидазам, обладающих защитными функциями в частности, хитнназе и Р-1,3-глюканазе. Мы подошли к исследованию индукции этих сигнальных и защитных ферментов с точки зрения существования единых процессов распознавания и защиты растения от бактерий при различных типах микробиологической инфекции и исходили из того, что индукция защитных ферментов различается количественно, но не качественно, т.е. инфицирование более вирулентного микроорганизма вызывает более выраженный защитный ответ в более короткий период времени.

Нами было проведено исследование изменения ферментативной активности эндогликозидаз, выделенных из апопласта корней - хитиназы, целлюлазы, пекти-назы и Р-1,3-глюканазы.

На рисунке 3 представлена диаграмма изменения активностей эндогликолити-ческих ферментов в апопласге при инфицировании целыми клетками азоспирилл и обработке препаратом ЛПС штамма Эр 245.

Впервые было показано, что, как в ответ на инокуляцию целыми клетками штаммов СО и Бр 245, так и в ответ на обработку растений только препаратом ЛПС, возрастает активность внеклеточных хитиназы и целлюлазы. Активность пектиназы и Р-1,3-глюканазы во всех случаях изменяется незначительно. Причем, как и в предыдущем эксперименте с экзогликозидазами, наибольшее увеличение активности целлюлазы и хитиназы вызывал "непшеничный" штамм ¿О. Важно отметить, что 48 часовая обработка корней препаратом ЛПС Эр 245 в концентрации 50-500 мкг/мл также вызывает увеличение активности индуцибельных ферментов целлюлазы и хитиназы, однако выраженность эффекта в 1.5-2.5 раз меньше, чем при колонизации целыми клетками. При оценке этого эффекта необходимо учитывать, что препарат ЛПС воздействует только на поверхность корня в отличие от целых клеток бактерий, способных колонизировать его внутреннее межклеточное пространство.

Таким образом, принимая во внимание сходность ответных реакций растений, инокулированных бактериальными культурами и обработанных только препаратом ЛПС можно, по-видимому, говорить о непосредственном участии ЛПС азо-

спирилл в запуске этих реакций у растений при установлении ассоциативных взаимодействий пшеницы с данными микроорганизмами.

мкМ/мин/мл 0,5

0,4

0,3

0,2

0,1|-

0

□ Контроль ОЛПС

□ Эр 245 В СО

пектиназа р 1,3-глюканаза целлюлаза хитиназа

Рис 3. Изменение активностей эвдогликошпических ферментов в апопласте корней пшеницы, инокулированных целыми клетками Л.ЬгшИепзе СО, Эр245 и обработанных препаратом ЛПС штамма ЭР 245, 48ч после обработки

Исходя из того, что индуцибельные гликолитические ферменты апопласта участвуют в распознавании микроорганизмов растением, мы предполагаем, чтс ЛПС бактерий азоспирилл является одной из поверхностных детерминант механизма распознавания партнера при ассоциативном взаимодействии, однако, дл* формирования полноценного ответа необходимы дополнительные эффекторы присутствующие на поверхности или продуцируемые в среду целыми клетками бактерий.

Кроме того, анализ индукции эндогликолитических ферментов апопласта как потенциальных факторов устойчивости растения показывает, что при распознавании ассоциативных микроорганизмов происходит их увеличение только на 3080 %, что значительно ниже наблюдаемого при патогенной инфекции ( 100300 %).

6. Исследование внеклеточных полипептидов А.ЬгаяНете, синтезируемых при ассоциативном взаимодействии

Для идентификации обнаруженных изменений в составе бежов апопластг растений, а также выявленных внеклеточных бактериальных белков, синтезируе мых при инфицировании и колонизации тканей корня, мы исследовали изменение полипептидного спектра белков апопласта корней, инокулированных А-ЬгсиНегае.

Однако изменения, выявляемые методом ДДС-электрофореза, носят в основ ном количественный характер. Можно отметить, что инокуляция штаммом Бр 24' вызывает большее накопление бежов и этот эффект более выражен при взаимо действии на среде без азота (рис 4).

С целью исследования изменения интенсивности биосинтеза внеклеточных по липептидов в процессе инфицирования корней и увеличения чувствительносп

метода идентификации мы применили способ радиактивной пульс-метки с использованием [1-14С]-глицина.

Было показано, что при 48 часовой инокуляции клетками Л.ЬгскЦете Бр 245 и при аналогичной по продолжительности обработке препаратом ЛПС этого штамма увеличивается интенсивность биосинтеза внеклеточных полипептидов в апо-пласте корня пшеницы. Интенсивность включения метки при инокуляции клетками была несколько выше, чем при обработке препаратом ЛПС и составляла 160 и 130 % от контроля соответственно. Однако, электрофоретический анализ меченых полипептидов не выявил появления новых специфических полипептидов. Как и в предыдущем случае были отмечены лишь количественные изменения спектра полипептидов (рис 5).

Возможной причиной такого результата может быть слишком короткое время взаимодействия, когда количество бактериальных> клеток, колонизировавших внутренее пространство корня, еще невелико и биосинтез растительных белков значительно превышает продукцию микробных.

В следующих экспериментах длительность колонизации была увеличена

КДа

664336-

й:

2014-

1 2 3 4 5 6

Рис 4. ДЦС-элекгрофорез белков апопласта, выделенных из корней: 1,4 - стерильных растений

2,5-расгений инокулированных А.ЪпиНепзг Зр245

3,6 -растений инокулированных А. ЪгсяИете Эр 7

1,2.3 -среда с 30 мМ МШКОз

4,5,6 -1*1" - среда без азота

81 - маркеры молекулярного веса

до четырех суток после инокуляции A.brasilense Sp 245 и исследовано влияние этефона на биосинтез белков апопласта корней 7-дневных проростков пшеницы (рис 6). В этом случае инокуляция индуцировала появление в спектре белков апопласта трех новых полипептидов с ММ 13,16 и 39 кДа, а этефон не вызывал качественных изменений в составе белков.

Однако, на данном этапе не ясным оставался вопрос о происхождении этих полипептидов, синтезируются ли они микроорганизмом или это растительные белки? Последующие исследования индукции внеклеточных белков бактерий, специфичных для ассоциативного взаимодействия проводили в модельных условиях in vitro. Для этого был получен препарат клеточной стенки корней 4х дневных растений пшеницы. Препарат клеточной стенки суспендировали (10 мг/мл) в минеральной среде N- с добавлением малата Na 0,5 г/л в качестве источника углерода ( малат был необходим для обеспечения роста культуры, т.к., очевидно, бактерии Azospirillum не способны поддерживать рост за счет утилизации полимеров КС пшеницы). Бактерии выращивались в данной среде в течение 1-4 суток при 30°С. Последующий электрофоретический анализ показал, что при выращивании азоспирилл в присутствии препарата клеточной стенки, полученного из корней пшеницы, происходят значительные изменения спектра внеклеточных

А Б В А Б в г

Рис 5. Влияние инокуляции целыми клетками и Рис б. Полипептидный спектр белков апопласт 48 часовой обработки препаратом ЛПС корней пшеницы на 4-е сутки после инокуляци А-ЬгазИегие Эр 245 на биосинтез внеклеточных целыми клетками аэоспирилл и обработки эк белков в корнях пшеницы; Флюорография фоном; Флюорография электрофореза [1-'К ДДС-элекгрофореза [1-"С] глицин-меченкых глнцин-меченных белков, вьщеленных из апс белков, вьщеленных из алопласта корнем: пласта корней:

А -стерильных растений; А - стерильных растений;

Б-инокулированных целыми клетками; Б,Г-растений, обработанных этефоном в кон-

В-обработанных препаратом ЛПС (50 мкг/мл). центрацнн 1.5 и 3.0 мг/л соответственно;

В- растений инокулированных А.ЬгазИете Бр 24!

полипептидов бактерий (Рис 7).

При этом наблюдается индукция или значительное увеличение биосинтеза полипептида с ММ 29-30 кДа, кроме того у штамма Бр 245 при выращивании на среде с азотом появляется еще один полипептид с ММ 26 кДа. Синтез микроорганизмами новых полипептидов может свидетельствовать об индукции синтеза специфических бактериальных белков непосредственно компонентами матрикса клеточной стенки корней пшеницы.

Одновременно отмечается почти полное исчезновение большинства других белковых полос. Это изменение, очевидно, является следствием адсорбции белков компонентами КС растения. Причем, этот процесс может быть как неспецифическим, так и селективным, в частности, для белков, обладающих гликолитическон активностью.

Последнее предположение подтверждается исследованием активности внеклеточных гликозидаз у АгозриШит в процессе культивирования с препаратом КС. Так, при культивировании А.ЬгачИете Бр 245 на безазотнстой среде с препаратом КС на 2 сутки в среде отмечается индукция Р-глюкозидазной и Р- галактозндаз-ной активностей, причем, большая часть этих ферментов была ассоциирована - с

осадком КС и поверхностью бактериальных клеток (таб 4).

В результате проведенных исследований показано, что инфицирование корней пшеницы азоспириллами вызывает индукцию ответной реакции растения, которая заключается в значительном увеличении содержания гидроксипролинбогатых белков в клеточных стенках колонизированных тканей. Наблюдаемые количественные различия в проявлении этого эффекта определяются различной компетентностью штаммов азоспнрилл к растению-хозяину. Выявлена различная эффективность колонизации А.Ьгаякгке сортов ярового и озимого фенотипов пшеницы.

Мы считаем, что накопление ГПББ, наблюдаемое при инокуляции А.ЬгазИепяе, является адаптивной реакцией, обеспечивающей толерантность растения к колонизации тканей корня ассоциативными микроорганизмами.

Важно отметить, что при ассоциативной,инфекции А.ЬгаяЦете, в корне растения

КДа

6643362924-

20 -14-

а А Б В Г

Рис 7. Влняние препарата клеточной стенки корней пшеницы на спектр внеклеточных белков азоспнрилл; ДДС-эяектрофорез белков, продуцируемых клетками А. ЪгазИепзе Яр 245 при выращивании на жидкой минеральной среде, содержащей: А - 30 мМ ЫН«МО};

Б - 30 мМ NHll^'Oí +■ 5 0 мг/мл препарата клеточной

стенки корней пшеницы; В - среда без азота;

Г - среда без азота +10 мг/мл препарата клеточной

стенки корней; 81- маркеры молекулярного веса отмечается селективная индукция внеклеточных гликозидаз, причем, этот процесс затрагивает различные по субстратной специфичности группы ферментов экзо- и эндогликозидазы.

Первая группа ферментов, предположительно, осуществляет терминальную деградацию полисахаридов с образованием моносахаридов. Вторая - расщепляет полисахаридные цепи с образованием олигосахаридных фрагментов, некоторые из которых (в зависимости от состава) выполняют роль индукторов или регуляторов ответных реакций растений, обеспечивая механизм распознавания и адаптации растения к бактериальной инфекции. Совокупность активностей этих двух групп ферментов создает динамическую систему образования и деструкции физиологически активных олигосахаридов в межклеточном пространстве растения. Обработка поверхности корней препаратом ЛПС Бр 245 также вызывает увеличение активности эндогликозидаз - целлюлазы и хитиназы, однако выраженность эффекта в 1.5-2.5 раз меньше, чем при колонизации целыми клетками. При инфицировании пшеницы А-ЬгаяНете повышается интенсивность биосинтеза внеклеточных полипептидов в апопласте корня, что подтверждается увеличением

Таблица

Активность внеклеточных гликолитических ферментов А.Ьгаякюе Бр 245 при культивировании с препаратом клеточных стенок корней пшеницы,

нкат/мл

р-глюкозидаза Р-галактозидаза

Варианты 24 часа 72 часа 24 часа 72 часа

Контроль (Среда И- + КС) 0.000 0.000 0.000 0.000

супернатант (Среда И-) 0.000 0.033 0.033 0.083

супернатант (Среда И-+КС) 0.133 0.366 0.083 0.483

Клетки (Среда И-) 0.033 0.067 0.000 0.000

Клетки (Среда И-+ КС) 2.333 4.000 0.500 1.500

интенсивности включения радиоактивной метки в белки апопласта. Принимая вс внимание сходство ответных реакций растений, инокулированных бактериями I обработанных только препаратом ЛПС можно, по-видимому, говорить о непо средственном участии ЛПС азоспирилл в запуске таких реакций у растений пр! установлении ассоциативных взаимодействий пшеницы с данными микроорга низмами.

Специфичность колонизации пшеницы А.Ьтаякпзе подтверждается появлени ем в процессе взаимодействия в апопласте корня растения нескольких новы: полипептидов (ММ 39,16 и 13 кДа).

Взаимодействие клеток азоспирилл с препаратом клеточной стенки корне! пшеницы на минеральной среде также вызывает индукцшо биосинтеза специфи ческих внеклеточных полипептидов. Однако, эти вновь синтезируемые полипеп тиды (ММ 29 и 26 кДа) отличаются от выявляемых в апопласте. Обнаруженны изменения спектра экстраклеточных белков азоспирилл сопровождаются появле нием Р-галактозидазной и р-ппокозидазной активности, ассоциированной с по верхностью бактериальных клеток.

Возможная биологическая роль внеклеточных гликозидаз бактерий может за ключаться в обеспечении специфической адсорбции бактерий на полисахаридно! матриксе клеточных стенок растения, а также в процессинге полисахаридно] части ЛПС бактерий с образованием более физиологически-активной и доступ ной для рецепции растением полисахаридной структуры.

Выводы

1. Впервые показано, что колонизация ассоциативными бактериями род АгоэртИшп вызывает накопление гидроксипролинбогатых белков в клеточны стенках корней пшеницы.

2. Установлено, что различия в уровне накопления ГПББ в корнях определяются компетентностью штаммов азоспирилл к растению-хозяину. Колонизация наиболее эффективным штаммом Sp 245 вызывала 2-х кратное увеличение содержания ГПББ.

3. Установлено, что индукция внеклеточных гликолитических ферментов в корнях пшеницы при инфицировании бактериями Azospirillum носит штамм-специфичный характер. Максимальный эффект вызывал штамм Sp 7, не специфичный для ризосферы пшеницы. Основными индуцибельными ферментами являются а- и Р-галактозидазы, целлюлаза и хитиназа.

4. Показано участие ЛПС A.brasilense в индукции биосинтеза внеклеточных белков корней пшеницы и увеличении активности гликолитических ферментов.

5. Показана индукция специфических внеклеточных полипептидов A.brasilense в присутствии препарата КС растения-хозяина. Предположительно, белки обладают Р-галактозидазной и р-глюканазной активностью.

6. Предполагается, что ЛПС и внеклеточные гликозидазы A.brasilense являются детерминантами распознавания при инфицировании растения-хозяина.

Список публикаций по теме диссертации

1. Selivanov N.Yu., Morozov A.N., Stadnik G.I., Ignatov V.V. Induction of extracellular proteins in the process of interaction of wheat with assotiative microorganisms II Proc.Nitrogenfix-92 Saratov 1992, P.53.

2. Stadnik G.I., Ignatov V.V., Selivanov N.Yu., Iosipenko A.D. and Sergeeva E.I.

Interaction between the partners of association "Wheat Azospirillum brasilense Sp 245" // NATO AS1 SERIES HI, VOLUME: Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Phisiology, Ecology., 1994, P.271-278.

3. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchogolev S. Immunological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interactions. II NATO ASI SERIES HI, VOLUME: Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Phisiology, Ecology., 1994, P.377-382.

4. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchogolev S. Immunological properties and evaluation of the involvement of bacterial lipopolysaccharides in Azospirillum contact interactions. // Abstract, NATO Advanced research workshop on Azospirillum and related microorganisms, Sharvar, Hungary, 1994, P. 10.

5. Ignatov V.V., Antonyuk L.P., Iosipenko A.D., Selivanov N.Yu., Sergeeva E.I., Stadnik G.I. Interaction between the partners of association "wheal-Azospirillum brasilense Sp 245". // Abstract, NATO Advanced research workshop on Azospirillum and related microorganisms, Sharvar, Hungary, 1994, P.8.

6. Игнатов В.В.,Антонюк Л.П., Стадник Г.И., Иосипенко А.Д.,Иосипенко О.А.,

Селиванов Н.Ю. Физиолого-биохимические аспекты ассоциативных отношений азоспириллы со злаками. // Тезисы доклада на 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации, Москва, 1995, -С.6.

7. Selivanov N.Yu., Ignatov V.V. Responses of wheat roots to Azospirillum brasilense

colonization. International Workshop on Associative interactions of nitrogen-fix. bacteria with plants: Abstr. Saratov, Russia, 1995, P.36.

8. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchogolev S. On the

involvement of lipopolysaccharides in bacteria-plant contact interactions for nitrogen fixing associative bacteria of the genus Azospirillum. II Proc. of the 10-th International Congress on Nitrogen Fixation, St.Petersburg, (Russia), 1995. P.340.

9. Матора Л.Ю., Соловова Г.К., Серебренникова О.Б., Селиванов Н.Ю., Щеголев

С.Ю. О роли липополисахаридов бактерий при их контактных взаимодействиях с растениями для ассоциативных азотфиксаторов рода Azospirillum.li Тезисы доклада на 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации, Москва. 1995, С.58.

Подписано к печати 30 .04.96. Объем 0.83 п.л. Тираж 100. Заказ N 6.

Отпечатано в ИБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13.