Неканонические функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 у дрожжей saccharomyces cerevisiae

Валуев, Игорь Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неканонические функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 у дрожжей saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Неканонические функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 у дрожжей saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

ВАЛУЕВ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ФАКТОРОВ ТЕРМИНАДИИ ТРАНСЛЯЦИИ сКЬ1 И еЯР З У ДРОЖЖЕЙ ЗАССНАКОМУСЕЗ

СЕЕЕШ1АЕ

03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2003

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор М.Д. Тер-Аванесян Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор O.A. Донцова кандидат биологических наук A.B. Воротников

Ведущая организация: ФГУП ГосНИИ Генетика

Защита состоится 16 октября 2003 года в 11.00 на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Автореферат разослан «........»....................................2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время накапливаются данные, что один и тот же белок может образовывать несколько разных комплексов с другими белками и, соответственно, выполнять в клетке несколько разных функций. Благодаря этому происходит интеграция разных структур и процессов внутри клетки в единое целое. Данная работа посвящена доказательству того, что факторы терминации трансляции эукариот еЯР| и еЯРЗ представляют собой многофункциональные белки и помимо терминации трансляции осуществляют ряд других функций, в частности принимают участие в организации цитоскелета и регуляции клеточного цикла. Биосинтез белка является одним из фундаментальных биологических процессов. Соответственно этому, изучение белковых факторов, принимающих участие в этом процессе, играет немаловажную роль в понимании общих принципов организации биологических систем, а также имеет большое практическое значение. Для многих факторов, принимающих участие в синтезе белка показана роль в других внутриклеточных процессах. В этом отношении факторы терминации трансляции еЯР1 и еИРЗ практически не изучены. Большинство опубликованных данных относительно нетрансляционных функций еЮЧ и еЯРЗ носит косвенный характер.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании неканонических (нетрансляционных) функций факторов терминации трансляции е1Ш и еИРЗ у дрожжей ЗассИаютусея сеге\>тае. Согласно этому были поставлены задачи работы: 1) изучить фенотипические проявления нарушения функций генов 811145 и кодирующих белки

еИР! и еЯРЗ, соответственно; 2) выяснить, возникают ли фенотипические изменения вследствие дефекта терминации трансляции, или же они представляют собой результат нарушения нетрансляционных функций еМЧ и еИРЗ; 3) исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе неканонических функций факторов терминации трансляции.

Научная новизна результатов. Принципиально новым в данной работе является следующее: 1) Нам удалось отделить нетрансляционные аспекты функционирования eRFl и eRF3 от трансляционных. Поскольку нарушение терминации трансляции (т.е. биосинтеза белка) приводит к глобальным последствиям для физиологии клетки, такое разделение представляет собой непростую задачу. Именно невозможность четко отделить последствия нарушения трансляционной и нетрансляционной функций eRFl и eRF3 была основным недостатком ранее опубликованных работ. Мы показали, что уменьшение количества факторов терминации трансляции eRFl и eRF3 одинаково влияет на уровень сквозного прочтения стоп-кодонов, но оказывает разное воздействие на морфологию клеток, цитоскелет и клеточный цикл: снижение уровня экспрессии eRFl вызывает накопление непочкующихся одноядерных клеток с увеличенным содержанием ДНК (> 2С), а снижение экспрессии eRF3 приводит к нарушению цито- и кариокинеза, которое связано с повреждением тубулинового и а клинового цитоскелета. 2) Нам также удалось показать функциональное и физическое взаимодействие кодон-узнающего фактора терминации трансляции eRFl и легкой цепи миозина Mlclp, на основании чего мы предлагаем молекулярную модель участия eRFl в цитокинезе. Взаимодействие с компонентами цитоскелета ранее было продемонстрировано для факторов инициации и элонгации трансляции, но для факторов терминации трансляции до настоящего времени данные о непосредственном и имеющем функциональное значение взаимодействии с компонентами цитоскелета практически отсутствовали.

Практическая ценность работы. Изучение функций отдельных белков, таких как факторы терминации трансляции, может помочь пролить свет на общие принципы организации протеома, что имеет несомненный общебиологический интерес. Поскольку у эукариот факторы, принимающие участие в биосинтезе белка отличаются высокой консервативностью, можно ожидать и консервативность их нетрансляционных функций. В связи с этим, данные, полученные на S. cerevisiae, одном из наиболее простых

эукариотических организмов и наиболее изученных в молекулярно-биологическом отношении, могут стимулировать аналогичные исследования на культурах клеток человека. Возможно, что в результате подобных исследований могут быть обнаружены молекулярные механизмы, лежащие в основе некоторых заболеваний, этиология и патогенез которых до сих пор не известны.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: И съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, Россия, 1-5 февраля 2000 года), III съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 26 июня - 1 июля 2002 года), Meeting of International Research Scholars (Palm Cove, Australia, June 25-28, 2002), 2nd International Yeast Prion Symposium (Calistoga, USA, August 25-28, 2002), а также доложены на межлабораторном семинаре в ИЭК РКНПК МЗ РФ (Москва,10 июня 2003 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи и три тезисных сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов. «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 173 страницах и включает 26 рисунков, 4 таблицы и список литературы, содержащий 280 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе применяли стандаргные методы генетики дрожжей (Sherman et al., 1986), молекулярного клонирования (Sambrook et al., 1989), белкового электрофореза и иммуноблоттинга (Laemmli, 1970; Towbin et al., 1979). В качестве носителя для гель-фильтрации использовали сефакрил S-300 (Sigma). Для коиммунопреципитации использовали протеин-А-сефарозу CL-4B (Amersham). Определение активности сквозного

прочтения стоп-кодонов осуществляли с использованием измерительных плазмид, полученных в работе Stansfield et al. (1995). Эксперименты с использованием проточной цитофлуориметрии осуществляли по Sreenivasan and Kellogg (1999). Для флуоресцентной микроскопии использовали стандартные методы (Vanoni et al., 1983; Pringle et al., 1991; Pringle, 1991; Adams and Pringle, 1991) с небольшими модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание системы для изучения фснотипическнх последствий репрессии генов SUP4S и SVP3S

Чтобы изучить фенотипические проявления нарушения функций генов SUP45 и SUP35, кодирующих белки eRFl и eRF3, соответственно, мы использовали штаммы дрожжей, которые имеют делеции генов SUP45 (штаммы sl-H8 и sl-R-H8) или SUP35 (штаммы s2-H8, 18С-Н76 и S2-15G-H63) и содержат центромерные плазмиды, несущие SUP45 или SUP35-C под контролем промотора GAL1-CYC1. Это позволило нам репрессировать синтез продуктов генов SUP45 (eRFl) или SUP35-C (eRF3C) путем перенесения соответствующих штаммов с галакгозо-содержащей на глюкозо-содержащую среду. Мы использовали 5'-делеционную аллель SUP35-C, так как удаление или инактивация нативного промотора гена SUP35 активирует внутренний критический промотор, что приводит к появлению укороченного функционального продукта. Для более корректного сравнения со штаммами, содержащими делению гена SUP35 и имеющими на центромерной плазмиде аллель SUP35-C, мы получили штамм S1-R-H8, который помимо делеции гена SUP45 содержал в геноме аллель SUP35-C вместо SUP35 дикого типа. В качестве контролей во всех экспериментах по репрессии генов SUP35-C и SUP45 были использованы те же

штаммы, несущие центромерные плазмиды, которые содержали эти гены под контролем своих собственных промоторов.

В первую очередь мы предприняли попытку выяснить зависимость жизнеспособности клеток дрожжей штаммов sl-II8, sl-R-118 и s2-II8 от длительности репрессии генов SUP45 и SUP35. Для этого бьио использовано окрашивание клеток красителем метиленовым синим. Оказалось, что динамика гибели клеток для всех трех штаммов была примерно одинаковой, причем после 9 часов инкубации на среде, содержащей глюкозу, происходило значительное обогащение культуры мертвыми клетками (более 10%). Вследствие этого, в большинстве экспериментов, описанных ниже мы использовали 9 часовую инкубацию клеток на среде с глюкозой.

Поскольку после 9 часовой репрессии генов SUP45 и SUP35 наблюдалось значительное снижение жизнеспособности, то представляло интерес выяснить, во сколько раз при этом снижается количество факторов терминации трансляции. Для этого относительное количество изучаемых белков в штаммах sl-H8, s1-R-H8 и ч2-Н8 было определено с помощью иммуноблоттинга. Оказалось, что в использованной нами системе значительная гибель клеток (более 10%) наступает при снижении количества белков eRFl и eRF3C ниже 10% от уровня дикого типа.

Чтобы изучить зависимость супрессии нонсенс-кодонов от внутриклеточного количества eRFl и eRF3C была использована система плазмид для определения сквозного прочтения UAA, UGA и UAG /л vivo (Stansfield et al., 1995) в штаммах sl-H8, sl-R-H8 и s2-H8. Контрольная плазмида несет химерный ген PGKl-lacZ, в то время как стоп-кодон-содержащие плазмиды имеют встроенные в рамке в месте стыка генов PGK1 и lacZ стоп-кодоны UAA, IJAG и UGA, соответственно. Таким образом, об интенсивности сквозного прочтения этих ранних стоп-кодонов можно судить по активности р-галактозидазы, измеряемой в лизатах клеток. Во всех трансформантах уровень сквозного прочтения стоп-кодонов UAA, UGA и UAG значительно возрастал после переноса на среду с глюкозой.

Следует отметить, что репрессия SUP45 на фоне полноразмерного SUP35 приводила к повышению сквозного прочтения нонсенс-кодонов примерно в 3-6 раз по сравнению с таковой на фоне аллели SUP35-C. Несмотря на это, динамика гибели клеток была сходной в обоих случаях. Таким образом, можно предположить, что повреждение терминации трансляции не является основной причиной гибели клеток, и факторы терминации трансляции дрожжей могут иметь дополнительные жизненно необходимые функции. Об этом же свидетельствуют приводимые ниже результаты.

2. Уменьшение количества eRF3C приводит к изменениям морфологии клеток

Влияние уменьшения количества eRFl и eRF3C на морфологию клеток было исследовано с помощью световой микроскопии. Флуоресцентный краситель калькофлюор белый (calcofluor white) избирательно связывается с хитином, входящим в состав клеточной стенки дрожжей, что позволяет ею использовать для визуализации формы дрожжевой клетки (Cabib, 1975). Клетки штаммов s!-R-H8, s2-H8, 18С-Н76 и s2-15G-H63 после инкубации на среде с глюкозой (см. выше) были окрашены калькофлюором для изучения морфологии и подсчета соотношения почкующихся и непочкующихся клеток. Репрессия SVP45 не вызывала изменения морфологии, но уменьшала число почкующихся клеток. В то же время, репрессия SUP35-C повышала долю клеток с большими почками, а также приводила к появлению цепочек клеток, что отражав! нарушение цитокинеза. В дополнение к этому, репрессия SUP35-C значительно увеличивала размер клеток и изменяла их форму (Таблица 1).

Таблица 1. Доля различных типов клеток в условиях репрессии 8ЧР45 или

$иР35-С.

_Доля клеток каждого типа (%)_

Тип ЗиРЭ5-СчА 8иР35-С1

клеток ЗиР45\гЛ 311Р451 А в С А В С

Непочкующиеся 29 85 33 38 25 25 42 49

С маленькими почками 68 13 64 59 70 15 22 20

С большими почками 3 2 3 3 5 45 31 28

Цепочки клеток 0 0 0 0 0 15 5 3

Трансформанты штаммов, содержащих делецию ЭиР45 {зир45::Т11Р1) [81-Р?-Н8] или виРЗв (si^p35■.TRPÍ) [б2-Н8 (А), 18С-Н76 (В), 52-15С-Н63 (С)] выращивали в течение 9 часов на среде с глюкозой, затем собирали и окрашивали калькофлюором, флуоресцентным красителем, избирательно связывающимся с хитином клеточной стенки (чтобы дифференцировать клетки с большими почками и цепочки клеток от скоплений непочкующихся клеток). 5иР45Ы и 311Р35-СМ - трансформанты с центромерными плазмидами, несущими гены ЗС1Р45 и виРЗв-С под контролем своих нативных промоторов. ЗиР451 и ЭиРЗб-СХ - трансформанты с центромерными плазмидами, несущими гены ЗиР45 и ЗЦРЗб-С под контролем промотора вАИ-СУС1. Для каждого из вариантов было просчитано по 200 клеток.

3. Уменьшение количества еЯР1 приводит к нарушению клеточного

цикла

Чтобы охарактеризовать стадию клеточного цикла, на которой происходит гибель клеток дрожжей при уменьшении количества еЮЧ и еЯРЗС, мы использовали определение количества ДНК в штаммах вЬЯ-ГО и б2-Н8 при помощи проточной цитофлуориметрии (Рис. 1). Клетки контрольных штаммов, у которых был нормальный уровень еИР1 и еТ?РЗС, распределялись по двум пикам, отличавшимся в два раза по интенсивности флуоресценции (соответствуют количеству ДНК 1С и 2С). Пик 1С соответствует клеткам, находящимся в

на распределение клеток по фазам клеточного цикла.

Штамм б1-Н-Н8 (зир45:ТЯР1 8иР35-С) был трансформирован плазмидами рРЮа!-31)Р45, содержащей 811Р45 под контролем промотора вАИ-СУС1, или рР«3415-51)Р45 (в качестве контроля), содержащей ген ЭиР45 дикого типа. Штамм э2-Н8 (sop35.■:TRP'/) был трансформирован плазмидами рРба1-8иР35С, содержащей вС/РЗЭ-С под контролем промотора вАИ-СУС1, или рРЮ416-31)Р35С (в качестве контроля), содержащей ЗиРЭ5-С под контролем своего собственного промотора. После 9 часов инкубации на среде с глюкозой клетки были собраны и проанализированы с помощью проточной цитофлуориметрии. В каждом образце анализировали по 30000 клеток. Вертикальная ось - количество клеток, а горизонтальная ось - количество ДНК. еРР1«л и еИРЗС\лЛ - нормальные уровни экспрессии еЯР1 и еЯРЗС. еРР14 и еРРЗС! - подавление экспрессии еР?Р1 и еРРЗС.

фазе йь а пик 2С - клеткам, находящиеся в фазе Оз/М. Репрессия ЯиРЗЗ-С приводила к незначительному смещению в распределении по стадиям клеточного цикла в сторону 2С, что может быть следствием накопления клеток с большими почками (стадия митоза). В то же время, репрессия вызывала исчезновение пика 1С и приводила К появлению клеток,

содержащих ДНК в количестве более 2С. Так как в этом случае большинство клеток были непочкующимися и, как показано ниже, содержали только одно ядро, можно заключить, что часть таких клеток обладала ядром с повышенным содержанием ДНК.

4. Снижение уровня еШ^ЗС вызывает нарушение морфологии веретена деления

Описанные выше эксперименты продемонстрировали, что уменьшение количества еЩЧ приводит к изменению распределения клеток по содержанию ДНК, в то время как снижение уровня еИРЗС вызывает значительные изменения клеточной морфологии. Это побудило нас к изучению митоза в клетках штаммов з1-Я-Н8, я2-Н8 и 18С-Н76 с уменьшенным содержанием еШЧ или еЯРЗС при помощи окрашивания ДНК-специфичным флуоресцентным красителем ЭАР1. Сравнение штамма с уменьшенным содержанием еЯРЗС по сравнению с контролем или со штаммом с уменьшенным содержанием еЯР1 выявило значительные отличия. В то время как в контрольных клетках или в клетках с уменьшенным количеством сКЬ'1 не было обнаружено нарушений деления ядер и их распределения между материнской и дочерней клетками, только небольшая часть клеток с большими почками штаммов $2-Н8 и 18С-Н76, имевших сниженное количество еЯРЗС, демонстрировала нормально протекающий митоз. Большая же часть клеток подобного типа имела нарушения деления и расхождения ядер.

Рассмотренные эффекты уменьшения количества еКБЗС могут быть связаны с дефектами микротрубочек, которые необходимы у 5. ссгсу\к1аг как для миграции ядра в дочернюю клетку, так и для расхождения хромосом в процессе митоза. Мы попытались выяснить, действительно ли снижение уровня еИРЗС сопровождается повреждением тубулинового цитоскелета. Микротрубочки были визуализированы в клетках штаммов вЬЯ-Н8 и в2-Н8 с помощью моноклональных антител к а-тубулину дрожжей (любезно

ЭАР1

Тубулин

еРРЗС

еРРЗ(

Рисунок 2. Уменьшение количества еРРЗС нарушает расхождение ядер в митозе и вызывает дефекты структуры и ориентации митотического веретена.

Штамм э2-Н8 (зир35::ТЯР1) был трансформирован плазмидами рРОа1-!5иР35С, содержащей ЭиР35-С под контролем промотора вАИ-СУС1, или р!ЧС416-ЗиР35С (в качестве контроля), содержащей эОРЗб-С под контролем своего собственного промотора. После 9 часов инкубации на среде с глюкозой клетки были собраны и окрашены ДНК-связывающим красителем ОАР1 и моноклональными антителами к а-тубулину. Масштаб: 1см = 10 мкм. еЯРЗСмЛ - нормальный уровень экспрессии еКРЗС; еКРЗСф - подавление экспрессии еЯРЗС.

предоставлены Е. КагеепИ) и видоспецифических антител, конъюгированных с Р1ТС. Было обнаружено, что в условиях уменьшения количества еЯРЗС приблизительно 85% клеток с большими почками имели разнообразные нарушения митоза, выраженные во множественности митотических веретен и дефектах их структуры и ориентации. Только 10% клеток были лишены таких дефектов, тогда как 5% клеток с большими почками вообще не имели сформированного митотического веретена (Рис. 2). Подобные эффекты не были обнаружены в случае репрессии 5ЦР45: все непочкующиеся клетки, которые накапливаются при уменьшении количества еШ" 1, сохраняли нормальные астральные микротрубочки, отходящие от единственного полярного тела веретена. В то же время, клетки с маленькими и большими почками демонстрировали все стадии нормально протекающего митоза.

5. Уменьшение количества eRF3C вызывает деполимеризацию актина

Так как актин ифае-i существенную роль в поддержании морфолоши клеток и почковании, его распределение было изучено посредством окрашивания клеток штаммов sl-R-H8 и s2-H8 фаллоидином, конъюгированным с TR1TC. В нормальной экспоненциально растущей дрожжевой культуре у большей части клеток визуализируемый актин сконцентрирован в области верхушки растущей почки. Уменьшение количества eRF3C приводило к серьезному повреждению актинового цитоскелета: в некоторых клетках актин-специфичная флуоресценция была распределена диффузно, а в остальных практически полностью отсутствовала (Рис. 3). Поскольку фаллоидин способен связываться только с F-акгином, то отсутствие окрашивания говорит о том, что происходит деполимеризация актинового цитоскелета. Мы не обнаружили деполимеризацию актина при уменьшении количества eRFl. Однако, в этом случае имелось нарушение поляризации актинового цитоскелета, что согласуется с дефектом формирования почек.

6. eRFl и eRF3 входят в состав альтернативных белковых комплексов

eRFl и eRF3 образуют комплекс, осуществляющий терминацию трансляции, в состав которого могут входить и другие белки (например, Upflp). Различные фенотипические проявления репрессии генов SUP45 и SUP35 (см. выше) могут объясняться тем, что кодируемые ими белки eRFl и eRF3 не только взаимодействуют друг с другом, но и входят в состав альтернативных белковых комплексов. Чтобы проверить это, мы провели гель-фильтрацию лизатов клеток штамма 5V-H19 [pif]. Оказалось, что eRFl и eRF3 образуют по два мажорных внутриклеточных пула (Рис. 4). Один из них является общим для обоих

Рисунок 3. Уменьшение количества е!ЗРЗС вызывает деполимеризацию актинового цитоскелета.

Штамм э1-К-Н8 (зир45::ТЙР1 8иР35-С) был трансформирован плазмидами рИ6а1-ЭиР45, содержащей БиР45 под контролем промотора ЬаИ-СУС1, или рРЮ415-ЭиР45 (в качестве контроля), содержащей ген БиР45 дикого типа. Штамм э2-Н8 (зир35::ТИР1) был трансформирован плазмидами рР(За1-811Р35С, содержащей виРЗв-С под контролем промотора в АН-СУС1, или рЯС416-311Р35С (в качестве контроля), содержащей виРЗв-С под контролем своего собственного промотора. После 9 часов инкубации на среде с глюкозой клетки были собраны и окрашены конъюгатом фалл оидин-ТИ 1ТС. Масштаб: 1см = 10 мкм еГ^М и еЯРЗС\М -нормальные уровни экспрессии еЯР1 и еЯРЗС. еЯР1| и еИРЗС! - подавление экспрессии еЯР1 и еЯРЗС.

белков - ассоциированный с рибосомами пул (тяжелая фракция, свыше 1400 кДа, выходит в «пустом объеме» колонки). В то же время, не связанные с рибосомами еИЛ и еКРЗ обнаруживаются в разных фракциях (пики для еШЧ - 230 кДа и для еЯРЗ -100 кДа), причем, в случае еИР! молекулярная масса комплекса значительно превосходит молекулярную массу фактора терминации трансляции (49 кДа). На основании этих данных можно предположить, что большая часть еЯР1 и сЯРЗ, не связанных с рибосомами, входит в состав различных независимых белковых комплексов.

Пустой объем 1400)

Г 4 1

(>1400) 230 100 еКР1

«к»«»««* — — - ~ - — — ----- -<

I 5 1о 15 20 г! 30 35

еРРЗ

Рисунок 4. еИР1 и еИРЗ входят в состав альтернативных белковых комплексов.

Гель-фильтрация лизата, приготовленного из клеток штамма 5\/-Н19 [рвГ] еЯР1 и еЯРЗ в аликвотах собранных фракций определены с помощью иммуноблоттинга. Цифры внизу обозначают номера фракций. Цифры вверху обозначают молекулярную массу в кДА.

7. Ген мьс1 в мультикопийном состоянии супрессирует некоторые температурочувствительные мутации в гене 811Р45

Одним из способов поиска новых белков, взаимодействующих с факторами терминации трансляции, может быть клонирование генов, в мультикопийном состоянии супрессирующих температурочувствительные мутации в 811Р35 и 81!Р45. К настоящему времени использование этого подхода дало результат только для ЯС№45. Изогенные штаммы 330-0373-1*1023 и 330-0373-11210 (любезно предоставлены Ю. Черновым), содержащие температурочувствительные мутации в 5'11Р45, были трансформированы мультикопийной геномной библиотекой, полученной в нашей лаборатории В.В. Кушнировым на основе вектора рУН2. По способности расти при 36°С были отобраны 19 трансформантов штамма 330-0373-1*210 и 27 трансформантов штамма 330-0373-111023. Все трансформанты штамма 330-0373-1ш0 и 16 трансформантов штамма 330-0373-111023 содержали плазмиду с геном 5ОТ45, т.е. имела место генетическая комплементация. Девять плазмид, выделенных из

трансформантов штамма 330-0373-11] 023, содержали разные гены, кодирующие тРНКТугидс (7 плазмид с 677/'.? и 2 плазмиды с $иР4). Наконец, еще две плазмиды, выделенные из трансформантов штамма 330-1)373-1*1023, содержали разные, но перекрывающиеся вставки с геном МЬС1, кодирующим легкую цепь миозина. Последующее субклонирование подтвердило, что именно МЬС1 в этих вставках отвечает за мультикопийную супрессию.

Мутантная аллель ¡ир45г"011 была клонирована с помощью ПЦР и секвенирована. При этом выяснилось, что эта аллель несет двойную мутацию: С1п-»Н|".ч в положении 76 и 01п->5юр(11АА) в положении 77 (Ы-домен е!Ш). Наличие дополнительной нонсенс-мутации объясняет, почему были отобраны гены тРНКТугидс в качестве мультикопийных супрессоров данной мутации в исходном скрининге (за счет неканонического спаривания тРНКТугилс с ЧАЛ). По всей видимости, здесь мы имеем систему с обратной связью: наличие нонсенс-мутации приводит к синтезу короткого нефункционального продукта, что ведет к повышению уровня сквозного прочтения. Повышенный уровень сквозного прочтения, в свою очередь, вызывает частичное «протекание» нонсенс-мутации, что дает полноразмерный продукт, имеющий две аминокислотные замены (01п76-»Нк и С1п77-УГуг) и поддерживающий жизнь. Полноразмерный продукт, осуществляя терминацию трансляции, таким образом подавляет свой собственный синтез, в результате чет устанавливается некоторая равновесная (минимальная, но достаточная для поддержания жизни) концентрация еЯР1 в клетке. И действительно, сравнительный анализ количества белка еЯР1 в штамме 330-и373-Ш023 по сравнению с ЗЗО-РЗ73 (дикий тип) показал, чго оно значительно снижено (данные не приведены).

Поскольку наличие двойной мутации затрудняет интерпретацию полученных результатов, мы проверили влияние мультикопийного МЬС1 на температурочувствительность, обусловленную двумя другими мутантными аллелями гена 51)Р45 (тр4516" и хир45'123"). Белки, кодируемые этими мутантными аллелями, также имеют аминокислотные замены в Г4-домене: Ьеи-^вег в положении 34 для еКР136в и Яег—>РИе в

положении 30 для eRFlsl23u. Мутантные варианты SUP45 были введены на центромерных плазм идах в инамм 33G-D373-A45, имеющий в геноме нулевую аллель гена SUP45. Оказалось, что мульгикопийпый MI.C1 супрессирует температурочувствительность, обусловленную sup4516'\ но не влияет на температурочувствительность, обусловленную ьир45'т".

8. Взаимодействие eRFl и Mlclp в лизатах клеток

В основе супрессии температурочувствительных мутаций в гене SUP45, обусловленной мультикопийным MLC1, может лежать физическое взаимодействием белков eRFl и Mlclp. Для проверки этой гипотезы мы провели ряд экспериментов по коиммунопреципитации Mlclp, eRFl и eRF3 в лизатах клеток штаммов 33G-D373 и sl-H8, которые были предварительно трансформированы мультикопийной плазмидой, кодирующей гибридный белок Mlcl-ЗНАр. Согласно опубликованным данным, Mlcl-ЗНАр имеет внутриклеточную локализацию, присущую Mlclp дикого типа (Воупе et al., 2000). Кроме того, сверхэкспрессия гибридного гена MLCI-3HA супрессировала температурочувствительность, обусловленную мутацией sup4516" (данные не приведены), т.е. химерная молекула Mlcl-ЗНАр сохраняет функциональные свойства Mlclp. Для преципитации eRFl и eRF3 были использованы поликлональные антитела к этим белкам; для преципитации Mlcl-ЗНАр были использованы моноклональные антитела к гемагглютинину человека. Оказалось, что как Mlcl-ЗНАр преципитирует вместе антителами к eRFl, так и наоборот, eRFl выделяется за антитела к гемагглютинину. Более того, Mlcl-ЗНАр взаимодействовал и с мутантной формой eRFl36ls в лизатах (выделение за антитела к eRFl), полученных из клеток штамма 33G-D373-A45, в котором центромерная плазмида с аллелью SUP45 дикого типа была замещена на центромерную плазмиду с мутантной аллелью. В то же время, нам не удалось обнаружить взаимодействия между Mlcl-ЗНАр и eRF3 (коиммунопреципитация с использованием как антител к eRF3NM, так и антител к

ё <

9 а

-eRF1

г z

V- «

£ fe

О) 0)

о о 0

В •«-М1с1 -ЗНАр

a-eRF1

_л__

С 1—И"и «С............<4-М1с1-ЗНАр

Рисунок 5. Взаимодействие eRF1 и М1с1 р в лизатах клеток.

Коиммунопреципитация MIclp, eRF1 и eRF3 в лизатах клеток штаммов, трансформированных мультикопийной плазмидой pVH2-MLC1-3HA, кодирующей гибридный белок М1с1-ЗНАр. А - Выделение eRF1 за антитела к гемагглютинину (a-НА) и eRF3NM (ct-eRF3NM) из лизатов штамма 33G-D373 В - Выделение М1с1-ЗНАр за антитела к eRF1 (a-eRF1) и eRF3NM (a-eRF3NM) из лизатов штамма 33G-D373. С - Выделение М1с1-ЗНАр за антитела к eRF1 (a-eRF1) из лизатов штамма 33G-D373-A45 (sup45:ADE2), содержащего либо плазмиду pRS315-SUP45 (кодирует белок eRF1 дикого типа, eRFIwt), либо плазмиду pRS315-sup4536,s (кодирует мутантный белок eRF138ls). О - Инкубация лизатов без антител с протеин-А-сефарозой (контроль).

гемагглютинину). Данные о коиммунопреципитации Miel-ЗНАр, eRFl и eRF3 приведены на Рис. 5. Так как eRFl выделяется за антитела к eRF3NM, а Mlcl-ЗНАр - нет, то можно предположить, что eRFl не может одновременно взаимодействовать с eRF3 и Mlclp, т.е. eRFl входит в состав как минимум двух (с eRF3 и с Mlclp) альтернативных белковых комплексов.

9. Сверхэкспрессия МЬС1 не влияет на эффективность терминации трансляции

Наиболее простое возможное объяснение эффекта мультикопийной супрессии МЬС1 температурочувствительных мутаций в гене ЪиР45 состоит в том, что комплекс еЮЧ:М1с1р играет какую-либо роль в терминации трансляции. Чтобы проверить эту гипотезу, мы ввели плазмиды для измерения интенсивности сквозного прочтения на основе [3-галактозидазы (см. выше) в штамм 33с-0373-гер13615 (замена в геноме 3(1Р45 дикого типа на мутантную аллель эир4536"), содержащий либо мультикопийную плазмиду с геном WZ.CZ, либо пустой вектор (отрицательный контроль), либо центромерную плазмиду с геном 811Р45 (положительный контроль). Оказалось, что сверхэкспрессия МЬС1 не влияет на эффективность сквозного прочтения стоп-кодонов как при пермиссивной, так и при непермиссивной температуре, т.е. не супрессирует нарушение терминации трансляции, вызываемое мутацией в гене $11Р45. Поскольку сверхэкспрессия МЬС1 супрессирует температурочувствителыюсть, обусловленную мутантной аллелью ¡ир4536а, но не супрессирует нарушение терминации, можно сделать вывод, что температурочувствительность в данном случае не является следствием повреждения терминации трансляции.

10. Сверхэкспрессия МЬС1 супрессирует нарушения цитокинеза, вызываемые мутацией эир45ш

Репрессия гена не вызывает изменения морфологии, но уменьшает число

почкующихся клеток (см. выше). Чтобы выяснить, будет ли мутация зир453/"" вызывать аналогичный эффект, мы использовали штамм 330-0373-Д45 (яир43::АОЕ2), в который были введены центромерные плазмиды либо с мутантной аллелью ¡ир451ба, либо с геном 511Р45 дикого типа. Оказалось, что выращивание трансформантов, содержащих $ир4536'\ при

пустой вектор Т

—¿7 -у , -с-

Рисунок 6. Сверхэкспрессия М1.С1 супрессирует морфологические нарушения, вызываемые мутантной аллелью зир45зва.

В штамм 330-0373-Д45 (зир45::АОЕ2) были введены плазмиды рРЭ315-8ир4536'5 (содержит мутантную аллель Бир4536к) или рН5315-31)Р45 (содержит аллель ёиР45 дикого типа). Далее в эти трансформанты были дополнительно введены мультикопийные плазмиды р\/Н2-М1.С1 (несет ген М1.С1) или р\/Н2 (пустой вектор в качестве контроля). Клетки выращивали при непермиссивной температуре (37'С) в течение 15 часов и затем фиксировали. М.С7Т - сверхэкспрессия М1С1. Масштаб. 1см = 17 мкм.

непермиссивной температуре (37°С) приводит к накоплению крупных клеток с удлиненными почками (Рис. 6). Последующая обработка литиказой (фермент, который действует на р-глюканы, входящие в состав клеточной стенки дрожжей, вызывая тем самым ее разрушение и разделение слипшихся клеток) показала, что имеет место нарушение разделения клеток и, следовательно, нарушение цитокинеза. Поскольку сверхэкспрессия М1С1 супрессирует температурочувствительность, обусловленную мутацией .•шр4536", возникает вопрос, будет ли эта сверхэкспрессия нормализовать морфологические изменения у мутантного штамма. С этой целью в данные штаммы были введены дополнительно мультикопийная плазмида с геном М1С1 или пустой вектор (в качестве контроля). Мы обнаружили, что свсрхэкспрессия

MLCI на фоне мутации sup4536" устраняет морфологические изменения, обусловленные данной мутацией при непермиссивной температуре (Рис. 6).

Для изучения того, как влияет мутация sup4536" на деление ядер, клетки дрожжей, полученные в условиях предыдущего эксперимента, окрасили йодидом пропидия (флуоресцентный краситель, связывающийся с ДНК). Оказалось, что для морфологически измененных клеток, содержащих мутантную аллель sup4536'\ характерна многоядерность. Как и в случае других изменений, сверхэкспрессия MLCI приводила к полной нормализации фенотипа.

11. Мутация sup4536a нарушает нормальную локализацию Mlclp

Согласно опубликованным данным, Mlclp имеет специфическую локализацию в клетке дрожжей: в процессе поляризованного роста он расположен преимущественно в области верхушки растущей почки и, во время цитокинеза, в зоне шейки почки, что отражает его ассоциацию с сократительным кольцом (Boyne et al., 2000; Shannon and Li, 2000). Приведенные выше результаты могут свидетельствовать о том, что мутантный eRFl36'5 может образовывать с Mlclp неактивный комплекс и, тем самым, препятствовать его нормальной локализации. Поскольку мутация sup4536" в мультикопийном состоянии приводит к более выраженным морфологическим дефектам по сравнению с центромерным вариантом (данные не приведены), для изучения локализации Mlclp мы использовали штамм 33G-D373-A45, содержащий мультикопийную плазмиду с мугантной аллелью sup4536" или с геном SUP45 дикого типа. Для изучения локализации Mlclp в этот штамм была дополнительно введена центромерная плазмида, кодирующая гибридный белок Mlcl-ЗНАр. Таким образом, полученные трансформанты содержали две копии гена MLC1: аллель дикого типа в геноме и MLC1-3HA на плазмиде. Дрожжи выращивали при непермиссивной температуре (37°С). Для флуоресцентной микроскопии использовали антитела к гемагглютинину и, затем, антитела, конъюгированные с F1TC и AlexaFluor. Наличие

дополнительной копии MLCI-3HA не супрессировало морфологические нарушения, вызываемые мультикопийным sup453r"° (данные не приведены). Оказалось, что на фоне этой мутантной аллели во всех из 100 просмотренных клеток с измененной морфологией гибридный белок Mlcl-ЗНАр был равномерно распределен между материнской и дочерней клетками. Таким образом, можно сделать вывод, что eRFl36K, образуя с Mlclp неактивный комплекс, нарушает его нормальную локализацию.

Согласно последним данным, Mlclp в процессе цитокинеза играет двойственную роль: участие как в формировании акто-миозинового кольца вместе с тяжелой цепью миозина класса II Myolp и опорным белком Iqglp, так и в образовании межклеточной перегородки между материнской и дочерней клетками совместно с тяжелой цепью миозина класса V Муо2р и Rab-ГТФазой Sec4p (Воупе et al., 2000; Shannon and Li, 2000; Wagner et al., 2002). Повреждение цитокинеза, вызываемое мутацией sup4536", сопровождается нарушением нормальной локализации Mlclp, что может быть благодаря нарушению как доставки Mlclp к определенным компартментам, так и его удерживания там. Однако, детали этого процесса на данный момент не ясны. Myolp не играет роли в локализации Mlclp (Воупе et al., 2000; Shannon and Li, 2000), более того, в отличие от делеции MLC1, делеция MYOI не является летальной (Watts et al., 1987). Также, Iqglp не требуется для нормальной локализации Mlclp; наоборот, Mlclp необходим для посадки Iqglp в области шейки почки (Воупе et al., 2000; Shannon and Li, 2000). Делеция IQ-доменов Муо2р, которая нарушала взаимодействие между ним и Mlclp, тоже не приводила к существенным изменениям во внутриклеточном распределении Mlclp (Stevens and Davis, 1998). Поскольку посадка многих белков в зоне шейки почки требует наличия септинов, то не удивительно, что мутации в одном из них (Cdcl2p) вызывали исчезновение Mlclp из этого компартмента; однако, его локализация в области верхушки растущей почки при этом не нарушалась (Воупе et al., 2000; Shannon and Li, 2000). Единственные факторы, приводящие к полной делокализации Mlclp, это дефект везикулярного транспорта (Wagner et al., 2002) и мутация в гене SUP45. Таким

образом, можно предположить, что eRFl необходим для посадки Mlclp на транспортные везикулы. Авторы последней работы (Wagner et al., 2002) также не исключают возможность существования адаптерного белка между Mlclp с одной стороны и Sec4p или Муо2р с другой. Однако, для подтверждения этой гипотезы необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. Уменьшение количества факторов терминации трансляции еКР1 и еЯРЗС одинаково влияет на уровень сквозного прочтения стоп-кодонов и жизнеспособность клеток, но оказывает разное воздействие на морфологию клеток, цитоскелет и клеточный цикл: снижение уровня экспрессии еГМЧ вызывает накопление непочкующихся клеток с увеличенным количеством ДНК (> 2С), а снижение экспрессии еИРЗС приводит к нарушению цито- и кариокинеза, которое связано с повреждением тубулинового и актипового цитоскелета.

2. Основная часть белков еМЧ и еИРЗ связана с рибосомами. еМЧ и еМ^, не связанные с рибосомами, входят в состав разных белковых комплексов.

3. Проведено клонирование мультикопийных супрессоров температурочувствительных мутаций в гене 81/Р45. Одним из таких супрессоров оказался ген МЬС1, кодирующий легкую цепь миозина.

4. Белки еЯР1 и М1с1р взаимодействуют друг с другом в лизатах клеток.

5. Температурочувствительная мутация ¡ир4536" приводит к накоплению многоядерных клеток с удлиненными почками. В основе этого эффекта лежит нарушение нормальной локализации М1с1р, по-видимому, за счет образования непродуктивных комплексов еШ^МЫр.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova М.В., Valouev I.A., Kushnirov V.V., Smiraov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. |/'i'/"] prion generation in yeast: characterization of the "strain" difference. Yeast 18:489-497 (2001).

2. Urakov V.N., Valouev LA., Lewitin Е.1., Paushkin S.V., Kosorukov V.S., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. and Ter-Avanesyan M.D. Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC Molecular Biology 2:9 (2001).

3. Valouev I.A., Kushnirov V.V., and Ter-Avanesyan M.D. Yeast polypeptide chain release factors eRFl and eRF3 are involved in cytoskeleton organization and cell cycle regulation. Cell Motil Cytoskeleton 52:161-173 (2002).

4. 11 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Санкт-Петербург, Россия, 15 февраля 2000. Валуев И.А., Левитин Е.И., Ураков В.Н. Новый белок-модулятор эффективности терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Тезисы докладов, 2:74-75.

5. 111 съезд Биохимического общества. Санкт-Петербург, Россия, 26 июня - 1 июля 2002. Валуев И.А., Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д. Факторы терминации трансляции eRFl и eRF3: роль в организации цитоскелета и регуляции клеточного цикла у дрожжей. Тезисы докладов, 5.

6. Meeting of International Research Scholars. Palm Cove, Australia, June 25-28, 2002. Ter-Avanesyan M.D., Valouev 1.А. Yeast prion-like translation termination factor eRF3 is involved in the control of cytoskeleton organization. Program and Abstracts, 45.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint ru e-mail: zakaz@stprint ru тел 939-3338 Заказ № 368, тираж 100 шт. Подписано в печать 10. 09.2003

P 14 3 2 О

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Валуев, Игорь Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. «ФАКТОРЫ ТРАНСЛЯЦИИ И ЦИТОСКЕЛЕТ».И

1. Факторы терминации трансляции эукариот.

1.1. Сравнительная характеристика терминации трансляции у Eubacteria, Archebacteria и Eukarya.

1.2. eRFl - эукариотический фактор терминации трансляции класса I.

1.3. eRF3 - эукариотический фактор терминации трансляции класса II.

1.4. Дополнительные факторы, принимающие участие в терминации трансляции у эукариот.

2. Особенности организации цитоскелета у дрожжей.

2.1. Тубулиновый цитоскелет.

2.2. Актиновый цитоскелет.

3. Взаимодействие факторов трансляции и компонентов цитоскелета

3.1. Факторы инициации трансляции и цитоскелет.

3.2. Факторы элонгации трансляции и цитоскелет.

3.3. Факторы терминации трансляции и цитоскелет.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неканонические функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 у дрожжей saccharomyces cerevisiae"

Основная цель постгеномной биологии состоит в понимании того, как информация, заложенная в линейной (т.е. одномерной) последовательности генов, реализуется в виде пространственно-временной (т.е. четырехмерной) сети белок-белковых взаимодействий. Секвенирование геномов организмов, стоящих на разных уровнях эволюционного развития, и, соответственно, имеющих разную степень сложности организации, привело к парадоксальному результату. Оказалось, что если степень сложности измерять количеством генов, то млекопитающие, состоящие из большого количества клеток и тканей и обладающие высокоразвитой нервной системой, лишь в пять раз сложнее чем одноклеточные грибы дрожжи и примерно в десять раз сложнее чем бактерия кишечная палочка. Таким образом, сложность организации по-крайней мере отчасти должна зависеть от способности продуктов генов образовывать разные комбинации друг с другом. И действительно, белки в подавляющем большинстве случаев функционируют в составе мультибелковых комплексов, причем один и тот же белок может образовывать несколько альтернативных комплексов с разными другими белками и, соответственно, выполнять в клетке разные функции. Такие многофункциональные белки получили в англоязычной литературе название «moonlighting proteins» (Jeffery, 1999), т.е. «белки-совместители». Постепенно у все новых и новых белков открываются дополнительные функции, и в конце концов может оказаться, что практически все белки относятся к разряду «moonlighting proteins». Более того, один и тот же белок может образовывать разные комплексы с другими белками в зависимости от клеточного компартмента, от стадии клеточного цикла, а у многоклеточных организмов - от типа клеток и тканей. Таким образом, парадигма классической молекулярной биологии «один ген - один белок - одна функция» подвергается значительной модификации. Вместо нее приходит понимание организации протеома как сложной пространственно-временной «паутины», сотканной из белок-белковых взаимодействий.

Данная работа посвящена доказательству того, что белковые факторы эукариот eRFl и eRF3, являющиеся главными участниками заключительной стадии биосинтеза белка -терминации трансляции, относятся к категории «moonlighting proteins». Биосинтез белка является одним из фундаментальных биологических процессов. Соответственно этому, изучение белковых факторов, принимающих участие в этом процессе, играет немаловажную роль в понимании общих принципов организации биологических систем, а также имеет большое практическое значение. Для многих факторов, принимающих участие в синтезе белка показана роль в других внутриклеточных процессах. В этом отношении факторы терминации трансляции eRFl и eRF3 практически не изучены. В связи с этим целью данной работы было частичное заполнение этого пробела в наших знаниях, т.е. изучение неканонических (нетрансляционных) функций белков eRFl и eRF3 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые являются одним из наиболее просто устроенных, а потому наиболее удобных для изучения эукариотических организмов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «ФАКТОРЫ ТРАНСЛЯЦИИ И ЦИТОСКЕЛЕТ»

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Валуев, Игорь Александрович

выводы

Уменьшение количества факторов терминации трансляции eRFl и eRF3C одинаково влияет на уровень сквозного прочтения стоп-кодонов и жизнеспособность клеток, но оказывает разное воздействие на морфологию клеток, цитоскелет и клеточный цикл: снижение уровня экспрессии eRFl вызывает накопление непочкующихся клеток с увеличенным количеством ДНК (> 2С), а снижение экспрессии eRF3C приводит к нарушению цито- и кариокинеза, которое связано с повреждением тубулинового и актинового цитоскелета.

Основная часть белков eRFl и eRF3 связана с рибосомами. eRFl и eRF3, не связанные с рибосомами, входят в состав разных белковых комплексов. Проведено клонирование мультикопийных супрессоров температурочувствительных мутаций в гене SUP45. Одним из таких супрессоров оказался ген MLC1, кодирующий легкую цепь миозина. Белки eRFl и Mlclp взаимодействуют друг с другом в лизатах клеток. Температурочувствительная мутация sup4536ts приводит к накоплению многоядерных клеток с удлиненными почками. В основе этого эффекта лежит нарушение нормальной локализации Mlclp, по-видимому, за счет образования непродуктивных комплексов eRFl36ts:Mlclp.

8. Заключение

В последнее время накапливаются данные, что один и тот же белок может образовывать несколько разных комплексов с другими белками и, соответственно, выполнять в клетке несколько разных функций. Благодаря этому происходит интеграция разных структур и процессов внутри клетки в единое целое. Целью данной работы являлось доказательство существования у белков eRFl и eRF3, которые известны как факторы терминации трансляции у эукариот, неканонических (нетрансляционных) функций. Согласно этому были поставлены задачи работы: 1) изучить фенотипические проявления нарушения функций генов SUP45 и SUP35, кодирующих белки eRFl и eRF3, соответственно; 2) выяснить, возникают ли фенотипические изменения вследствие дефекта терминации трансляции, или же они представляют собой результат нарушения нетрансляционных функций eRFl и eRF3; 3) исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе неканонических функций факторов терминации трансляции. Для реализации поставленных задач в качестве основных генетических инструментов были выбраны: 1) изучение последствий репрессии генов SUP45 и SUP35-Q, 2) изучение проявлений температурочувствительных мутаций в этих генах, а также поиск генов, в мультикопийном состоянии супрессирующих данные мутации.

Нам удалось показать, что уменьшение количества факторов терминации трансляции eRFl и eRF3 вследствие репрессии кодирующих их генов одинаково влияет на уровень сквозного прочтения стоп-кодонов, но оказывает разное воздействие на морфологию клеток, цитоскелет и клеточный цикл: снижение уровня экспрессии eRFl вызывает накопление непочкующихся одноядерных клеток с увеличенным содержанием ДНК (> 2С), а снижение экспрессии eRF3C приводит к нарушению цито- и кариокинеза, которое связано с повреждением тубулинового и актинового цитоскелета. Мы продемонстрировали, что eRFl и eRF3 образуют по два мажорных внутриклеточных пула. Один из них является общим для обоих белков - ассоциированный с рибосомами пул. Скорее всего, находясь в этом пуле, eRFl и eRF3 осуществляют терминацию трансляции. В то же время, основное количество eRFl и eRF3, не связанных с рибосомами, выходит в разных фракциях, и, следовательно, входит в состав разных белковых комплексов («нетрансляционный» пул). Можно предположить, что эти белковые комплексы выполняют в клетке разные функции. Чтобы выявить ранее неизвестные белки, которые могли бы входить в состав таких комплексов, был проведен поиск мультикопийных супрессоров температурочувствительных мутаций в гене SUP45. В результате поиска был клонирован ген MLC1, кодирующий легкую цепь миозина. Оказалось, что eRFl, в отличие от eRF3, и Mlclp физически взаимодействуют. Более того, было показано, что температурочувствительная мутация sup4536lb (Leu34—»Ser) в отличие от репрессии гена SUP45 приводит к накоплению многоядерных клеток с удлиненными почками. В основе подобного фенотипа лежит нарушение нормальной локализации Mlclp по-видимому за счет образования непродуктивных комплексов eRFl3(>ts:Mlclp. На основе полученных данных мы предложили молекулярный механизм участия комплекса eRFl :М1с1р в цитокинезе.

Принципиально новым в данной работе является следующее: 1) Нам удалось отделить нетрансляционные аспекты функционирования eRFl и eRF3 от трансляционных. Поскольку нарушение терминации трансляции (т.е. биосинтеза белка) приводит к глобальным последствиям для физиологии клетки, такое разделение представляет собой непростую задачу. Именно невозможность четко отделить последствия нарушения трансляционной и нетрансляционной функций eRFl и eRF3 была основным недостатком ранее опубликованных работ. 2) Также нам удалось показать функциональное и физическое взаимодействие кодон-узнающего фактора терминации трансляции eRFl и легкой цепи миозина Mlclp, что может указывать на функционирование eRFl в цитокинезе. Взаимодействие с компонентами цитоскелета ранее было продемонстрировано для факторов инициации и элонгации, но для факторов терминации до настоящего времени данные о непосредственном и имеющем функциональное значение взаимодействии с компонентами цитоскелета практически отсутствовали.

Изучение функций отдельных белков, таких как факторы терминации трансляции, может помочь пролить свет на общие принципы организации протеома, что имеет несомненный общебиологический интерес. Далее, поскольку факторы, принимающие участие в биосинтезе белка отличаются высокой консервативностью среди эукариот, можно ожидать и консервативность их нетрансляционных функций. В связи с этим, данные, полученные на S. cerevisiae, одном из наиболее простых эукариотических организмов и наиболее изученных в молекулярно-биологическом отношении, могут стимулировать аналогичные исследования на культурах клеток человека. Возможно, что в результате подобных исследований могут быть обнаружены молекулярные механизмы, лежащие в основе некоторых заболеваний, этиология и патогенез которых до сих пор не известны.

136

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Валуев, Игорь Александрович, Москва

1. Инге-Вечтомов С.Г. и Адрианова В.М. (1970). Рецессивные супер-супрессоры у дрожжей. Генетика 11, 103-115.

2. Adams,А.Е., Johnson,D.I., Longnecker,R.M., Sloat,B.F., and Pringle,J.R. (1990). CDC42 and C.DC43, two additional genes involved in budding and the establishment of cell polarity in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. Ill, 131-142.

3. Adams,A.E. and Pringle,J.R. (1984). Relationship of actin and tubulin distribution to bud growth in wild-type and morphogenetic-mutant Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 98, 934-945.

4. Adams,A.E. and Pringle,J.R. (1991). Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods Enzymol. 194:729-31., 729-731.

5. Adams,A.E., Shen,W., Lin,C.S., Leavitt,J., and Matsudaira,P. (1995). Isoform-specific complementation of the yeast sac6 null mutation by human fimbrin. Mol. Cell Biol. 15, 6975.

6. Adams,I.R. and KilmartinJ.V. (2000). Spindle pole body duplication: a model for centrosome duplication? Trends Cell Biol. 10, 329-335.

7. Amatruda,J.F. and Cooper, J. A. (1992). Purification, characterization, and immunofluorescence localization of Saccharomyces cerevisiae capping protein. J. Cell Biol. 117, 1067-1076.

8. Amatruda,J.F., Gattermeir,D.J., Karpova,T.S., and Cooper,J.A. (1992). Effects of null mutations and overexpression of capping protein on morphogenesis, actin distribution and polarized secretion in yeast. J. Cell Biol. 119, 1151-1162.

9. Andjelkovic,N., Zolnierowicz,S., Van Hoof,C., Goris,J., and Hemmings,B.A. (1996). The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor eRFl. EMBO J. 15, 7156-7167.

10. Arkov,A.L. and Murgola,E.J. (1999). Ribosomal RNAs in translation termination: facts and hypotheses. Biochemistry (Mosc. ) 64, 1354-1359.

11. Ayscough,K.R. and Drubin,D.G. (1996). ACTIN: general principles from studies in yeast. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:129-60. , 129-160.

12. Basu,J., Williams,B.C., Li,Z., Williams,E.V., and Goldberg,M.L. (1998). Depletion of a Drosophila homolog of yeast Sup35p disrupts spindle assembly, chromosome segregation, and cytokinesis during male meiosis. Cell Motil. Cytoskeleton 39, 286-302.

13. Beach,D.L., Thibodeaux,J., Maddox,P., Yeh,E., and Bloom,K. (2000). The role of the proteins Kar9 and Myo2 in orienting the mitotic spindle of budding yeast. Curr. Biol. 10, 1497-1506.

14. Bektas,M., Nurten,R., Gurel,Z., Sayers,Z., and Bermek,E. (1994). Interactions of eukaryotic elongation factor 2 with actin: a possible link between protein synthetic machinery and cytoskeleton. FEBS Lett. 356, 89-93.

15. Bektas,M., Nurten,R., Sayers,Z., and Bermek,E. (1998). Interactions of elongation factor 2 with the cytoskeleton and interference with DNase I binding to actin. Eur. J. Biochem. 256, 142-147.

16. Bertram,G., Bell,H.A., Ritchie,D.W., Fullerton,G., and Stansfield.I. (2000). Terminating eukaryote translation: domain 1 of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA. 6, 1236-1247.

17. Biggins,S. and Rose,M.D. (1994). Direct interaction between yeast spindle pole body components: Karlp is required for Cdc31p localization to the spindle pole body. J. Cell Biol. 125, 843-852.

18. Bishop,A.L. and Hall,A. (2000). Rho GTPases and their effector proteins. Biochem. J. 348 Pt2:241-55., 241-255.

19. Bobola,N., Jansen,R.P., Shin,Т.Н., and Nasmyth,K. (1996). Asymmetric accumulation of Ashlp in postanaphase nuclei depends on a myosin and restricts yeast mating-type switching to mother cells. Cell 84, 699-709.

20. Boeke,J.D., LaCroute,F., and Fink,G.R. (1984). A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance. Mol. Gen. Genet. 197, 345-346.

21. Bonneaud,N., Ozier-Kalogeropoulos,0., Li,G.Y., Labouesse,M., Minvielle-Sebastia,L., and LaCroute,F. (1991). A family of low and high copy replicative, integrative and single-stranded S. cerevisiae/E. coli shuttle vectors. Yeast 7, 609-615.

22. Borchsenius,A.S., Tchourikova,A.A., and Inge-Vechtomov,S.G. (2000). Recessive mutations in SUP35 and SUP45 genes coding for translation release factors affect chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 37, 285-291.

23. Boyne,J.R., Yosuf,H.M., Bieganowski,P., Brenner,C., and Price,C. (2000). Yeast myosin light chain, Mlclp, interacts with both IQGAP and class II myosin to effect cytokinesis. J. Cell Sci. 113 Pt 24:4533-43., 4533-4543.

24. Bradford,M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248254.

25. BrockerhoffS.E., Stevens,R.C., and Davis,T.N. (1994). The unconventional myosin, Myo2p, is a calmodulin target at sites of cell growth in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 124, 315-323.

26. Brown,C.M. and Tate,W.P. (1994). Direct recognition of mRNA stop signals by Escherichia coli polypeptide chain release factor two. J. Biol. Chem. 269, 33164-33170.

27. Buckingham,R.H., Grentzmann,G., and Kisselev,L. (1997). Polypeptide chain release factors. Mol. Microbiol. 24, 449-456.

28. Bullitt,E., Rout,M.P., KilmartinJ.V., and Akey,C.W. (1997). The yeast spindle pole body is assembled around a central crystal of Spc42p. Cell 89, 1077-1086.

29. Cabib,E. (1975). Molecular aspects of yeast morphogenesis. Annu. Rev. Microbiol. 29:191214, 191-214.

30. Cabib,E., Drgonova,J., and Drgon,T. (1998). Role of small G proteins in yeast cell polarization and wall biosynthesis. Annu. Rev. Biochem. 67:307-33, 307-333.

31. Carr-Schmid,A., Valente,L., Loik,V.I., Williams,Т., Starita,L.M„ and Kinzy,T.G. (1999). Mutations in elongation factor ip, a guanine nucleotide exchange factor, enhance translational fidelity. Mol. Cell Biol. 19, 5257-5266.

32. Caskey,C.T., Forrester,W.C., Tate,W., and Ward,C.D. (1984). Cloning of the Escherichia coli release factor 2 gene. J. Bacteriol. 158, 365-368.

33. Chavatte,L., Frolova,L., Kisselev,L., and Favre,A. (2001). The polypeptide chain release factor eRFl specifically contacts the s(4)UGA stop codon located in the A site of eukaryotic ribosomes. Eur. J. Biochem. 268, 2896-2904.

34. Chavatte,L., Seit-Nebi,A., Dubovaya,V., and Favre,A. (2002). The invariant uridine of stop codons contacts the conserved NIKSR loop of human eRFl in the ribosome. EMBO J. 21, 5302-5311.

35. Cheney,R.E. and Mooseker,M.S. (1992). Unconventional myosins. Curr. Opin. Cell Biol. 4, 27-35.

36. Chernoff,Y.O., Galkin,A.P., Lewitin,E„ Chemova,T.A., Newnam,G.P., and Belenkiy,S.M. (2000). Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein. Mol. Microbiol. 35, 865-876.

37. Chi,К., Jones,D.V., and Frazier,M.L. (1992). Expression of an elongation factor ly-related sequence in adenocarcinomas of the colon. Gastroenterology 103, 98-102.

38. Chial,H.J., Rout,M.P., Giddings,T.H., and Winey,M. (1998). Saccharomyces cerevisiae Ndclp is a shared component of nuclear pore complexes and spindle pole bodies. J. Cell Biol. 143, 1789-1800.

39. Chial,H.J„ Stemm-Wolf,A.J., McBratney,S., and Winey,M. (2000). Yeast Eaplp, an eIF4E-associated protein, has a separate function involving genetic stability. Curr. Biol. 10, 15191522.

40. Cox,B.S. (1971). A recessive lethal super-suppressor mutation in yeast and other psi phenomena. Heredity 26, 211-232.

41. Craigen,W.J., Lee,C.C., and Caskey,C.T. (1990). Recent advances in peptide chain termination. Mol. Microbiol. 4, 861-865.

42. Czaplinski,K., Majlesi,N., Banerjee,T., and Peltz,S.W. (2000). Mttl is a Upfl-like helicase that interacts with the translation termination factors and whose overexpression can modulate termination efficiency. RNA. 6, 730-743.

43. Czaplinski,K., Weng,Y„ Hagan,K.W., and Peltz,S.W. (1995). Purification and characterization of the Upfl protein: a factor involved in translation and mRNA degradation. RNA. 1, 610-623.

44. Dagkesamanskaya,A.R. and Ter-Avanesyan,M.D. (1991). Interaction of the yeast omnipotent suppressors SUP1(SUP45) and SUP2(SUP35) with non-mendelian factors. Genetics 128, 513-520.

45. Dente,L., Cesareni,G., and Cortese,R. (1983). pEMBL: a new family of single stranded plasmids. Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655.

46. Dharmawardhane,S., Demma,M., Yang,F., and Condeelis,J. (1991). Compartmentalization and actin binding properties of ABP-50: the elongation factor-la of Dictyostelium. Cell Motil. Cytoskeleton 20, 279-288.

47. Dick,Т., Surana,U., and Chia,W. (1996). Molecular and genetic characterization of SLC1, a putative Saccharomyces cerevisiae homolog of the metazoan cytoplasmic dynein light chain 1. Mol. Gen. Genet. 251, 38-43.

48. Didichenko,S.A., Ter-Avanesyan,M.D., and Smirnov,V.N. (1991). Ribosome-bound EF-la-like protein of yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 198, 705-711.

49. Donaldson,A.D. and Kilmartin,J.V. (1996). Spc42p: a phosphorylated component of the S. cerevisiae spindle pole body (SPD) with an essential function during SPB duplication. J. Cell Biol. 132, 887-901.

50. Dontsova,M., Frolova,L., Vassilieva,J., Piendl,W., Kisselev,L., and Garber,M. (2000). Translation termination factor aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBS Lett. 472, 213-216.

51. Drees,В., Brown,С., Barrell,B.G., and Bretscher,A. (1995). Tropomyosin is essential in yeast, yet the TPM1 and TPM2 products perform distinct functions. J. Cell Biol. 128, 383392.

52. Drubin,D.G., Miller,K.G., and Botstein,D. (1988). Yeast actin-binding proteins: evidence for a role in morphogenesis. J. Cell Biol. 107, 2551-2561.

53. Dunn,A.Y., Melville,M.W., and Frydman,J. (2001). Review: cellular substrates of the eukaryotic chaperonin TRiC/CCT. J. Struct. Biol. 135, 176-184.

54. Durso,N.A. and Cyr,R.J. (1994). A calmodulin-sensitive interaction between microtubules and a higher plant homolog of elongation factor-la. Plant Cell 6, 893-905.

55. Ebihara,K. and Nakamura,Y. (1999). C-terminal interaction of translational release factors eRFl and eRF3 of fission yeast: G-domain uncoupled binding and the role of conserved amino acids. RNA. 5, 739-750.

56. Eby,J.J., Holly,S.P., van Drogen,F., Grishin,A.V„ Peter,M., Drubin,D.G., and Blumer,K.J.1998). Actin cytoskeleton organization regulated by the РАК family of protein kinases. Curr. Biol. 8, 967-970.

57. Edmonds,В.Т., Murray,J., and Condeelis,J. (1995). pH regulation of the F-actin binding properties of Dictyostelium elongation factor la. J. Biol. Chem. 270, 15222-15230.

58. Edmonds,B.T., Wyckoff,J., Yeung,Y.G., Wang,Y., Stanley,E.R., Jones,J., Segall,J., and Condeelis,J. (1996). Elongation factor-la is an overexpressed actin binding protein in metastatic rat mammary adenocarcinoma. J. Cell Sci. 109, 2705-2714.

59. Epp,J.A. and Chant,J. (1997). An IQGAP-related protein controls actin-ring formation and cytokinesis in yeast. Curr. Biol. 7 , 921-929.

60. Eurwilaichitr,L., Graves,F.M., Stansfield,I., and Tuite,M.F. (1999). The C-terminus of eRFl defines a functionally important domain for translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Microbiol. 32, 485-496.

61. Farkasovsky,M. and Kuntzel,H. (2001). Cortical Numlp interacts with the dynein intermediate chain Pacllp and cytoplasmic microtubules in budding yeast. J. Cell Biol. 152, 251-262.

62. Field,C.M. and Kellogg,D. (1999). Septins: cytoskeletal polymers or signalling GTPases? Trends Cell Biol. 9,387-394.

63. Ford,S.K. and Pringle,J.R. (1991). Cellular morphogenesis in the Saccharomyces cerevisiae cell cycle: localization of the CDC11 gene product and the timing of events at the budding site. Dev. Genet. 12, 281-292.

64. Freistroffer,D.V., Pavlov,M.Y., MacDougall,J., Buckingham,R.H., and Ehrenberg,M. (1997). Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16, 4126-4133.

65. Frolova,L., Le,G., X, Zhouravleva,G., Davydova,E., Philippe,M., and Kisselev,L. (1996). Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA. 2 , 334-341.

66. Frolova,L., Seit-Nebi,A., and Kisselev,L. (2002). Highly conserved NIKS tetrapeptide is functionally essential in eukaryotic translation termination factor eRFl. RNA. 8, 129-136.

67. Frolova,L.Y., Merkulova,T.I., and Kisselev,L.L. (2000). Translation termination in eukaryotes: polypeptide release factor eRFl is composed of functionally and structurally distinct domains. RNA. 6, 381-390.

68. Furukawa,R., Jinks,T.M., Tishgarten,T., Mazzawi,M., Morris,D.R., and Fechheimer,M. (2001). Elongation factor 1(3 is an actin-binding protein. Biochim. Biophys. Acta 1527, 130140.

69. Gachet,Y., Tournier,S., Millar,J.В., and Hyams,J.S. (2001). A MAP kinase-dependent actin checkpoint ensures proper spindle orientation in fission yeast. Nature 412, 352-355.

70. Gagny,B. and Silar,P. (1998). Identification of the genes encoding the cytosolic translation release factors from Podospora anserina and analysis of their role during the life cycle. Genetics 149, 1763-1775.

71. Geiser,J.R., Sundberg,H.A., Chang,B.H., Muller,E.G., and Davis,T.N. (1993). The essential mitotic target of calmodulin is the 110-kilodalton component of the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 13, 7913-7924.

72. Geli,M.I. and Riezman,H. (1996). Role of type I myosins in receptor-mediated endocytosis in yeast. Science 272, 533-535.

73. Geli,M.I., Wesp,A., and Riezman,H. (1998). Distinct functions of calmodulin are required for the uptake step of receptor-mediated endocytosis in yeast: the type I myosin Myo5p is one of the calmodulin targets. EMBO J. 17, 635-647.

74. Philippsen,P., Davis,R.W., and Johnston,M. (2002). Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 418, 387-391.

75. Gietz,R.D., Schiestl,R.H., Willems,A.R., and Woods,R.A. (1995). Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS- DNA/PEG procedure. Yeast 11, 355360.

76. Gietz,R.D. and Woods,R.A. (2002). Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350:87-96., 87-96.

77. Glover,J.R., Kowal,A.S., Schirmer,E.C., Patino,M.M., Liu,J.J., and Lindquist,S. (1997). Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of PS1*., a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell 89 , 811-819.

78. Goodson,H.V. and Spudich,J.A. (1995). Identification and molecular characterization of a yeast myosin I. Cell Motil. Cytoskeleton 30, 73-84.

79. Govindan,B., Bowser,R., and Novick,P. (1995). The role of Myo2, a yeast class V myosin, in vesicular transport. J. Cell Biol. 128, 1055-1068.

80. Grentzmann,G., Brechemier-Baey,D., Heurgue,V., Mora,L., and Buckingham,R.H. (1994). Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91, 5848-5852.

81. Gungabissoon,R.A., Khan,S., Hussey,P.J., and Maciver,S.K. (2001). Interaction of elongation factor la from Zea mays (ZmEF-la) with F-actin and interplay with the maize actin severing protein, ZmADF3. Cell Motil. Cytoskeleton 49, 104-111.

82. Haarer,B.K., Lillie.S.H., Adams,A.E., Magdolen,V., Bandlow,W„ and Brown,S.S. (1990). Purification of profilin from Saccharomyces cerevisiae and analysis of profilin-deficient cells. J. Cell Biol. 110, 105-114.

83. Haarer,B.K., Petzold,A„ Lillie.S.H., and Brown,S.S. (1994). Identification of MY04, a second class V myosin gene in yeast. J. Cell Sci. 107, 1055-1064.

84. Haarer,B.K., Petzold,A.S., and Brown,S.S. (1993). Mutational analysis of yeast profilin. Mol. Cell Biol. 13, 7864-7873.

85. Hasek,.!., Kovarik,P., Valasek,L., Malinska,K., Schneider,J., Kohlwein,S.D., and Ruis,H. (2000). Rpglp, the subunit of the Saccharomyces cerevisiae eIF3 core complex, is a microtubule-interacting protein. Cell Motil. Cytoskeleton 45, 235-246.

86. He,F., Brown,A.H., and Jacobson,A. (1997). Upflp, Nmd2p, and Upf3p are interacting components of the yeast nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol. Cell Biol. 17, 1580-1594.

87. Hildebrandt,E.R. and Hoyt,M.A. (2000). Mitotic motors in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta 1496, 99-116.

88. Hill,К.L., Catlett,N.L., and Weisman,L.S. (1996). Actin and myosin function in directed vacuole movement during cell division in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 135, 1535-1549.

89. Holtzman,D.A., Yang,S., and Drubin,D.G. (1993). Synthetic-lethal interactions identify twonovel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 122, 635-644.

90. Hou,C.L., Tang,С., Roffler,S.R„ and Tang,Т.К. (2000). Protein 4.1R binding to eIF3-p44 suggests an interaction between the cytoskeletal network and the translation apparatus. Blood 96,147-153.

91. Hovland,R., Hesketh,J.E., and Pryme,I.F. (1996). The compartmentalization of protein synthesis: importance of cytoskeleton and role in mRNA targeting. Int. J. Biochem. Cell Biol. 28, 1089-1105.

92. Inagaki,Y. and Doolittle,W.F. (2001). Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res. 29, 921-927.

93. Inagaki,Y. and Ford,D.W. (2000). Evolution of the eukaryotic translation termination system: origins of release factors. Mol. Biol. Evol. 17, 882-889.

94. Inoue,H., Nojima,H., and Okayama,H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.

95. Ito,K, Ebihara,K., and Nakamura,Y. (1998). The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA. 4, 958-972.

96. Ito,K., Ebihara,K., Uno,M., and Nakamura,Y. (1996). Conserved motifs in prokaryotic and eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93, 5443-5448.

97. Ivanov,V., Beniaminov,A., Mikheyev,A., and Minyat,E. (2001). A mechanism for stop codon recognition by the ribosome: a bioinformatic approach. RNA. 7, 1683-1692.

98. Jacobson,A. and Peltz,S.W. (1996). Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells. Annu. Rev. Biochem. 65:693-739., 693-739.

99. Jakobsen,C.G., Segaard,T.M., Jean-Jean,O., Frolova,L., and Justesen,J. (2001). Identification of a novel termination release factor eRF3b expressing the eRF3 activity in vitro and in vivo., Mol. Biol. (Mosk) 35, 672-681.

100. Janosi,L., Ricker,R., and Kaji,A. (1996). Dual functions of ribosome recycling factor in protein biosynthesis: disassembling the termination complex and preventing translational errors. Biochimie 78, 959-969.

101. Jansen,R.P. (1999). RNA-cytoskeletal associations. FASEB J. 13, 455-466.

102. Janssens,V. and Goris,J. (2001). Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem. J. 353, 417-439.

103. Jean-Jean,О., Le,G., X, and Philippe,M. (1996). Is there a human PSf.? C. R. Acad. Sci. Ill 319, 487-492.

104. Jeffery,C.J. (1999). Moonlighting proteins. Trends Biochem. Sci. 24, 8-11.

105. Jensen,M.A., True,H.L., Chernoff,Y.O., and Lindquist,S. (2001). Molecular population genetics and evolution of a prion-like protein in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 159, 527-535.

106. Johnson,D.I. (1999). Cdc42: An essential Rho-type GTPase controlling eukaryotic cell polarity. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 , 54-105.

107. Johnston,G.C., Prendergast,J.A., and Singer,R.A. (1991). The Saccharomyces cerevisiae MY02 gene encodes an essential myosin for vectorial transport of vesicles. J. Cell Biol. 113, 539-551.

108. Kandl,K.A., Munshi,R., Ortiz,P.A., Andersen,G.R., Kinzy,T.G., and Adams,A.E. (2002). Identification of a role for actin in translational fidelity in yeast. Mol. Genet. Genomics 268, 10-18.

109. Karamyshev,A.L., Ito,K., and Nakamura,Y. (1999). Polypeptide release factor eRFl from Tetrahymena thermophila: cDNA cloning, purification and complex formation with yeast eRF3. FEBS Lett. 457, 483-488.

110. Karpova,T.S., Lepetit,M.M., and Cooper,J.A. (1993). Mutations that enhance the cap2 null mutant phenotype in Saccharomyces cerevisiae affect the actin cytoskeleton, morphogenesis and pattern of growth. Genetics 135, 693-709.

111. Kaur,K.J. and Ruben,L. (1994). Protein translation elongation factor-la from Trypanosoma brucei binds calmodulin. J. Biol. Chem. 269, 23045-23050.

112. Kervestin,S., Frolova,L., Kisselev,L., and Jean-Jean,O. (2001). Stop codon recognition in ciliates: Euplotes release factor does not respond to reassigned UGA codon. EMBO Rep. 2, 680-684.

113. Kikuchi,Y., Shimatake,H., and Kikuchi,A. (1988). A yeast gene required for the Gl-to-S transition encodes a protein containing an A-kinase target site and GTPase domain. EMBO J. 7, 1175-1182.

114. KilmartinJ.V. and Adams,A.E. (1984). Structural rearrangements of tubulin and actin during the cell cycle of the yeast Saccharomyces. J. Cell Biol. 98, 922-933.

115. Kilmartin,J.V., Dyos,S.L., Kershaw,D., and Finch,J.T. (1993). A spacer protein in the Saccharomyces cerevisiae spindle poly body whose transcript is cell cycle-regulated. J. Cell Biol. 123, 1175-1184.

116. King,C.Y., Tittmann,P., Gross,H., Gebert,R., Aebi,M., and Wuthrich,K. (1997). Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 94, 6618-6622.

117. Knop,M. and Schiebel,E. (1997). Spc98p and Spc97p of the yeast y-tubulin complex mediate binding to the spindle pole body via their interaction with Spcl Юр. EMBO J. 16, 6985-6995.

118. Koch,G., ТапакаД., Masuda,T., Yamochi,W., Nonaka,H., and Takai,Y. (1997). Association of the Rho family small GTP-binding proteins with Rho GDP dissociation inhibitor (Rho GDI) in Saccharomyces cerevisiae. Oncogene 15, 417-422.

119. Kohrer,K. and Domdey,H. (1991). Preparation of high molecular weight RNA. Methods Enzymol. 194:398-405., 398-405.

120. Kuhn,U. and Pieler,T. (1996). Xenopus poly(A) binding protein: functional domains in RNA binding and protein-protein interaction. J. Mol. Biol. 256, 20-30.

121. Kurasawa,Y., Hanyu,K., Watanabe,Y., and Numata,0. (1996). F-actin bundling activity of Tetrahymena elongation factor la is regulated by Ca2+/calmodulin. J. Biochem. (Tokyo) 119, 791-798.

122. Kuriyama,R., Savereide,P., Lefebvre,P., and Dasgupta,S. (1990). The predicted amino acid sequence of a centrosphere protein in dividing sea urchin eggs is similar to elongation factor (EF-la). J. Cell Sci. 95, 231-236.

123. Kushnirov,V.V., Kochneva-Pervukhova,N.V., Chechenova,M.B., Frolova,N.S., and Ter Avanesyan,M.D. (2000). Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica. EMBO J. 19, 324-331.

124. Kushnirov,V.V., Ter Avanesyan,M.D., Telckov,M.V., Surguchov,A.P., Smirnov,V.N., and Inge-Vechtomov,S.G. (1988). Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene 66, 45-54.

125. Laemmli,U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

126. Le Goff,X., Zemlyanko,0., Moskalenko,S., Berkova,N., Inge-Vechtomov,S., Philippe,M., and Zhouravleva,G. (2002). Mouse GSPT2, but not GSPT1, can substitute for yeast eRF3 in vivo. Genes Cells 7, 1043-1057.

127. Le Goff,X., Philippe,M., and Jean-Jean,O. (1997). Overexpression of human release factor 1 alone has an antisuppressor effect in human cells. Mol. Cell Biol. 17, 3164-3172.

128. Lee,L., Tirnauer,J.S., Li,J., Schuyler,S.C., Liu,J.Y., and Pellman,D. (2000). Positioning of the mitotic spindle by a cortical-microtubule capture mechanism. Science 287, 2260-2262.

129. Lew,Y., Jones,D.V., Mars,W.M., Evans,D., Byrd,D., and Frazier,M.L. (1992). Expression of elongation factor-ly-related sequence in human pancreatic cancer. Pancreas 7, 144-152.

130. Li,R. (1997). Beel, a yeast protein with homology to Wiscott-Aldrich syndrome protein, is critical for the assembly of cortical actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 136, 649-658.

131. Lin,L., Holbro,T., Alonso,G., Gerosa,D., and Burger,M.M. (2001). Molecular interaction between human tumor marker protein pi50, the largest subunit of eIF3, and intermediate filament protein K7. J. Cell Biochem. 80, 483-490.

132. Lippincott,J. and Li,R. (1998). Sequential assembly of myosin II, an IQGAP-like protein, and filamentous actin to a ring structure involved in budding yeast cytokinesis. J. Cell Biol. 140, 355-366.

133. Liu,G„ Grant,W.M., Persky,D., Latham,V.M., Jr., Singer,R.H., and Condeelis,J. (2002). Interactions of elongation factor 1 alpha with F-actin and P-actin mRNA: implications for anchoring mRNA in cell protrusions. Mol. Biol. Cell 13, 579-592.

134. Liu,G., Tang,J., Edmonds,В.Т., Murray,J., Levin,S., and Condeelis,J. (1996). F-actin sequesters elongation factor la from interaction with aminoacyl-tRNA in a pH-dependent reaction. J. Cell Biol. 135, 953-963.

135. Liu,H.P. and Bretscher,A. (1989). Purification of tropomyosin from Saccharomyces cerevisiae and identification of related proteins in Schizosaccharomyces and Physarum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 90-93.

136. Long,R.M., Singer,R.H., Meng,X., Gonzalez,!, Nasmyth,K., and Jansen,R.P. (1997). Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA. Science 277, 383-387.

137. Lozupone,C.A., Knight,R.D., and Landweber,L.F. (2001). The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr. Biol. 11, 65-74.

138. Lykke-Andersen,J., Shu,M.D., and Steitz,J.A. (2000). Human Upf proteins target an mRNA for nonsense-mediated decay when bound downstream of a termination codon. Cell 103, 1121-1131.

139. Maderazo,A.B., He,F., Mangus,D.A., and Jacobson,A. (2000). Upflp control of nonsense mRNA translation is regulated by Nmd2p and Upf3p. Mol. Cell Biol. 20, 4591-4603.

140. Magdolen,V., Drubin,D.G., Mages,G., and Bandlow,W. (1993). High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS Lett. 316, 4147.

141. Manning,B.D., Barrett,J.G., Wallace,J.A., Granok,H., and Snyder,M. (1999). Differential regulation of the КагЗр kinesin-related protein by two associated proteins, Ciklp and Viklp. J. Cell Biol. 144, 1219-1233.

142. Manning,B.D. and Snyder,M. (2000). Drivers and passengers wanted! the role of kinesin-associated proteins. Trends Cell Biol. 10, 281-289.

143. Marcotte,E.M., Pellegrini,M., Thompson,M.J., Yeates,T.O., and Eisenberg,D. (1999). A combined algorithm for genome-wide prediction of protein function. Nature 402, 83-86.

144. Marschall,L.G., Jeng,R.L., Mulholland,J., and Stearns,T. (1996). Analysis of Tub4p, a yeast y-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J. Cell Biol. 134, 443-454.

145. Marschall,L.G. and Stearns,T. (1997). Cytoskeleton: anatomy of an organizing center. Curr. Biol. 7, R754-R756.

146. Martin,H., Mendoza,A., Rodriguez-Pachon,J.M., Molina,M., and Nombela,C. (1997). Characterization of SKM1, a Saccharomyces cerevisiae gene encoding a novel Ste20/PAK-like protein kinase. Mol. Microbiol. 23 , 431-444.

147. McMillan,J.N. and Tatchell,K. (1994). The JNM1 gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae is required for nuclear migration and spindle orientation during the mitotic cell cycle. J. Cell Biol. 125, 143-158.

148. Merkulova,T.I., Frolova,L.Y., Lazar,M., Camonis,J., and Kisselev,L.L. (1999). C-terminal domains of human translation termination factors eRFl and eRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett. 443, 41-47.

149. Mikuni,0., Ito,K., Moffat,J., Matsumura,K., McCaughan,K., Nobukuni,T., Tate,W., and Nakamura,Y. (1994). Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 91, 5798-5802.

150. Miller,R.K., Cheng,S.C., and Rose,M.D. (2000). Bimlp/Yeblp mediates the Kar9p-dependent cortical attachment of cytoplasmic microtubules. Mol. Biol. Cell 11, 2949-2959.

151. Moon,A. and Drubin,D.G. (1995). The ADF/cofilin proteins: stimulus-responsive modulators of actin dynamics. Mol. Biol. Cell 6, 1423-1431.

152. Moon,A.L., Janmey,P.A., Louie,K.A., and Drubin,D.G. (1993). Cofilin is an essential component of the yeast cortical cytoskeleton. J. Cell Biol. 120, 421-435.

153. Moore,R.C. and Cyr,R.J. (2000). Association between elongation factor-la and microtubules in vivo is domain dependent and conditional. Cell Motil. Cytoskeleton 45, 279292.

154. Moore,R.C., Durso,N.A., and Cyr,R.J. (1998). Elongation factor-la stabilizes microtubules in a calcium/calmodulin-dependent manner. Cell Motil. Cytoskeleton 41, 168-180.

155. Moreau,V., Madania,A., Martin,R.P., and Winson,B. (1996). The Saccharomyces cerevisiae actin-related protein Arp2 is involved in the actin cytoskeleton. J. Cell Biol. 134, 117-132.

156. Muhua,L., Karpova,T.S., and Cooper,J.A. (1994). A yeast actin-related protein homologous to that in vertebrate dynactin complex is important for spindle orientation and nuclear migration. Cell 78, 669-679.

157. Mulholland,J., Preuss,D„ Moon,A., Wong,A., Drubin,D., and Botstein,D. (1994). Ultrastructure of the yeast actin cytoskeleton and its association with the plasma membrane. J. Cell Biol. 125, 381-391.

158. Munshi,R., Kandl,K.A., Carr-Schmid,A., Whitacre,J.L., Adams,A.E., and Kinzy,T.G. (2001). Overexpression of translation elongation factor 1A affects the organization and function of the actin cytoskeleton in yeast. Genetics 157, 1425-1436.

159. Namy,0., Hatin,I., Stahl,G., Liu,H., Barnay,S., Bidou,L., and Rousset,J.P. (2002). Gene overexpression as a tool for identifying new trans-acting factors involved in translation termination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 161, 585-594.

160. Naqvi,S.N„ Zahn,R„ Mitchell,D.A., Stevenson,B.J., and Munn,A.L. (1998). The WASP homologue LasI7p functions with the WIP homologue End5p/verprolin and is essential for endocytosis in yeast. Curr. Biol. 8, 959-962.

161. Neff,N.F., Thomas,J.H., Grisafi,P., and Botstein,D. (1983). Isolation of the P-tubulin gene from yeast and demonstration of its essential function in vivo. Cell 33, 211-219.

162. Nishitani,H. and Lygerou,Z. (2002). Control of DNA replication licensing in a cell cycle. Genes Cells 7, 523-534.

163. Osman,M.A. and Cerione,R.A. (1998). Iqglp, a yeast homologue of the mammalian IQGAPs, mediates cdc42p effects on the actin cytoskeleton. J. Cell Bio! 142, 443-455.

164. Osman,M.A., Konopka,J.B., and Cerione,R.A (2002). Iqglp links spatial and secretion landmarks to polarity and cytokinesis. J. Cell Bio! 159, 601-611.

165. Palecek,J., Hasek,J., and Ruis,H. (2001). Rpglp/Tif32p, a subunit of translation initiation factor 3, interacts with actin-associated protein Sla2p. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 1244-1250.

166. Patino,M.M., Liu,J.J., Glover,J.R., and Lindquist,S. (1996). Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science 273, 622-626.

167. Paushkin,S. V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1996). Propagation of the yeast prion-like PSf. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor. EMBO J. 15, 3127-3134.

168. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1997a). In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science 277, 381-383.

169. Paushkin,S.V., Kushnirov,V.V„ Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (1997b). Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation. Mol. Cell Biol. 17, 2798-2805.

170. Pencil,S.D., Toh,Y., and Nicolson,G.L. (1993). Candidate metastasis-associated genes of the rat 13762NF mammary adenocarcinoma. Breast Cancer Res. Treat. 25, 165-174.

171. Pincheira,R., Chen,Q., Huang,Z., and Zhang,J.T. (2001). Two subcellular localizations of eIF3 pi70 and its interaction with membrane-bound microfilaments: implications for alternative functions of pl70. Eur. J. Cell Biol. 80, 410-418.

172. Pocklington,M.J., Johnston,L., Jenkins,J.R., and Orr,E. (1990). The omnipotent suppressor SUP45 affects nucleic acid metabolism and mitochondrial structure. Yeast 6, 441-450.

173. Pringle,J.R. (1991). Staining of bud scars and other cell wall chitin with calcofluor. Methods Enzymol. 194:732-5., 732-735.

174. Pringle,J.R., Adams,A.E., Drubin,D.G., and Haarer,B.K. (1991). Immunofluorescence methods for yeast. Methods Enzymol. 194:565-602., 565-602.

175. Prusiner,S.B. (1998). Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95, 13363-13383.

176. Pruyne,D. and Bretscher,A. (2000a). Polarization of cell growth in yeast. I. Establishment and maintenance of polarity states. J. Cell Sci. 113, 365-375.

177. Pruyne,D. and Bretscher,A. (2000b). Polarization of cell growth in yeast. II. The role of the cortical actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113, 571-585.

178. Pruyne,D.W., Schott,D.H., and Bretscher,A. (1998). Tropomyosin-containing actin cables direct the Myo2p-dependent polarized delivery of secretory vesicles in budding yeast. J. Cell Biol. 143, 1931-1945.

179. Reck-Peterson,S .L., Provance,D.W., Jr., Mooseker,M.S„ and Mercer,J.A. (2000). Class V myosins. Biochim. Biophys. Acta 1496, 36-51.

180. Rose,A.B. and Broach,J.R. (1990). Propagation and expression of cloned genes in yeast: 2-microns circle-based vectors. Methods Enzymol. 185:234-79., 234-279.

181. Rose,M.D., Novick,P., Thomas,J.H., Botstein,D., and Fink,G.R. (1987). A Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromere-containing shuttle vector. Gene 60, 237-243.

182. Sambrook,J., Fritsch,E.E., and Maniatis,T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press).

183. Santos,B. and Snyder,M. (1997). Targeting of chitin synthase 3 to polarized growth sites in yeast requires Chs5p and Myo2p. J. Cell Biol. 136, 95-110.

184. Santoso,A., Chien,P., Osherovich,L.Z., and Weissman,J.S. (2000) Molecular basis of a yeast prion species barrier. Cell 100, 277-288.

185. Sass,M.D., Caruso,C.J., and Axelrod,D.R. (1969). Evaluation of stored blood viability by methylene blue reduction. J. Lab Clin. Med. 73, 744-752.

186. Schatz,P.J., Pillus,L., Grisafi,P., Solomon,F., and Botstein,D. (1986a). Two functional a-tubulin genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae encode divergent proteins. Mol. Cell Biol. 6, 3711-3721.

187. Schatz,P.J., Solomon,F., and Botstein,D. (1986b). Genetically essential and nonessential a-tubulin genes specify functionally interchangeable proteins. Mol. Cell Biol. 6, 3722-3733.

188. Schiebel,E. (2000). y-tubulin complexes: binding to the centrosome, regulation and microtubule nucleation. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 113-118.

189. Schneider,B.L., Yang,Q.H., and Futcher,A.B. (1996). Linkage of replication to start by the Cdk inhibitor Sicl. Science 272, 560-562.

190. Seit-Nebi,A., Frolova,L., and Kisselev,L. (2002). Conversion of omnipotent translation termination factor eRFl into ciliate-like UGA-only unipotent eRFl. EMBO Rep. 3, 881886.

191. Shanina,N.A., Ivanov,P.A., Chudinova,E.M., Severin,F.F., and Nadezhdina,E.S. (2001). Translation initiation factor eIF3 is able to bind with microtubules in mammalian cells. Mol. Biol. (Mosk) 35, 638-646.

192. Shannon,K.B. and Li,R. (1999). The multiple roles of Cyklp in the assembly and function of the actomyosin ring in budding yeast. Mol. Biol. Cell 10, 283-296.

193. Shannon,K.B. and Li,R. (2000). A myosin light chain mediates the localization of the budding yeast IQGAP-like protein during contractile ring formation. Curr. Biol. 10, 727730.

194. Shepherd,J.C., Walldorf,U., Hug,P., and Gehring,W.J. (1989). Fruit flies with additional expression of the elongation factor EF-1 alpha live longer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 7520-7521.

195. Sherman,F., Fink,G.R., and Hicks,J.B. (1986). Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press).

196. Shestakova,E.A., Motuz,L.P., and Gavrilova,L.P. (1993). Co-localization of components of the protein-synthesizing machinery with the cytoskeleton in Go-arrested cells. Cell Biol. Int. Rep. 17, 417-424.

197. Shestakova,E.A., Motuz,L.P., Minin,A.A., Gelfand,V.I., and Gavrilova,L.P. (1991). Some of eukaryotic elongation factor 2 is colocalized with actin microfilament bundles in mouse embryo fibroblasts. Cell Biol. Int. Rep. 15, 75-84.

198. Sheu,Y.J., Santos,В., Fortin,N„ Costigan,C., and Snyder,M. (1998). Spa2p interacts with cell polarity proteins and signaling components involved in yeast cell morphogenesis. Mol. Cell Biol. 18, 4053-4069.

199. Shiina,N., Gotoh,Y., Kubomura,N., Iwamatsu,A., and Nishida,E. (1994). Microtubule severing by elongation factor la. Science 266, 282-285.

200. Sloat,B.F., Adams,A., and Pringle,J.R. (1981). Roles of the CDC24 gene product in cellular morphogenesis during the Saccharomyces cerevisiae cell cycle. J. Cell Biol. 89, 395-405.

201. Slobin,L.I. (1980). The role of eucaryotic factor Tu in protein synthesis. The measurement of the elongation factor Tu content of rabbit reticulocytes and other mammalian cells by a sensitive radioimmunoassay. Eur. J. Biochem. 110, 555-563.

202. Sobel,S.G. and Snyder,M. (1995). A highly divergent y-tubulin gene is essential for cell growth and proper microtubule organization in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 131, 1775-1788.

203. Spang,A., Courtney,I., Fackler,U., Matzner,M., and Schiebel,E. (1993). The calcium-binding protein cell division cycle 31 of Saccharomyces cerevisiae is a component of the half bridge of the spindle pole body. J. Cell Biol. 123, 405-416.

204. Spang,A., Courtney,I., Grein,K., Matzner,M., and Schiebel,E. (1995). The Cdc31p-binding protein Karlp is a component of the half bridge of the yeast spindle pole body. J. Cell Biol. 128, 863-877.

205. Sreenivasan,A. and Kellogg,D. (1999). The elml kinase functions in a mitotic signaling network in budding yeast. Mol. Cell Biol. 19, 7983-7994.

206. St Johnston,D. (1995). The intracellular localization of messenger RNAs. Cell 81, 161-170.

207. Stansfield,!., Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1995a). A mutant allele of the SUP45 (SAL4) gene of Saccharomyces cerevisiae shows temperature-dependent allosuppressor and omnipotent suppressor phenotypes. Curr. Genet. 27, 417-426.

208. Stansfield,!., Eurwilaichitr,L., Akhmaloka, and Tuite,M.F. (1996). Depletion in the levels of the release factor eRFl causes a reduction in the efficiency of translation termination in yeast. Mol. Microbiol. 20, 1135-1143.

209. Stansfield,I., Kushnirov,V.V., Jones,K.M., and Tuite,M.F. (1997). A conditional-lethal translation termination defect in a sup45 mutant of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem. 245, 557-563.

210. Stearns,T. (1997). Motoring to the finish: kinesin and dynein work together to orient the yeast mitotic spindle. J. Cell Biol. 138, 957-960.

211. Stevens,R.C. and Davis,T.N. (1998). Mlclp is a light chain for the unconventional myosin Myo2p in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 142, 711-722.

212. Stevenson,L.F., Kennedy,B.K., and Harlow,E. (2001). A large-scale overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae identifies previously uncharacterized cell cycle genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 3946-3951.

213. Tanaka,K. and Takai,Y. (1998). Control of reorganization of the actin cytoskeleton by Rho family small GTP-binding proteins in yeast. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 112-116.

214. Taniguchi,S., Miyamoto,S., Sadano,H., and Kobayashi,H. (1991). Rat elongation factor la: sequence of cDNA from a highly metastatic fos-transferred cell line. Nucleic Acids Res. 19, 6949.

215. Tate,W., Greuer,B., and Brimacombe,R. (1990). Codon recognotion in polypeptide chain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor 2. Nucleic Acids Res. 18, 6537-6544.

216. Tatsuka,M., Mitsui,H., Wada,M., Nagata,A., Nojima,H., and Okayama,H. (1992). Elongation factor-la gene determines susceptibility to transformation. Nature 359, 333-336.

217. Terrak,M., Otterbein,L.R., Wu,G., Palecanda,L.A., Lu,R.C., and Dominguez,R. (2002). Crystallization, X-ray characterization and selenomethionine phasing of Mlclp bound to IQ motifs from myosin V. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58, 1882-1885.

218. Terrak,M., Wu,G„ Stafford,W.F., Lu,R.C., and Dominguez,R. (2003). Two distinct myosin light chain structures are induced by specific variations within the bound IQ motifs-functional implications. EMBO J. 22, 362-371.

219. Tikhomirova,V.L. and Inge-Vechtomov,S.G. (1996). Sensitivity of sup35 and sup45 suppressor mutants in Saccharomyces cerevisiae to the anti-microtubule drug benomyl. Curr. Genet. 30, 44-49.

220. Towbin,H., Staehelin,T., and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 76, 4350-4354.

221. True,H.L. and Lindquist,S.L. (2000). A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature 407, 477-483.

222. Uchida,N., Hoshino,S., Imataka,H., Sonenberg,N., and Katada,T. (2002). A novel role of the mammalian GSPT/eRF3 associating with poly(A)-binding protein in Cap/Poly(A)-dependent translation. J. Biol. Chem. 277, 50286-50292.

223. Urakov,V.N., Valouev,I.A., Lewitin,E.I., Paushkin,S.V., Kosorukov,V.S., Kushnirov,V.V., Smirnov,V.N., and Ter Avanesyan,M.D. (2001). Ittlp, a novel protein inhibiting translation termination in Saccharomyces cerevisiae. BMC. Mol. Biol. 2, 9.

224. Urbero,B., Eurwilaichitr,L., Stansfield,I., TassanJ.P., Le,G., X, Kress,M., and Tuite,M.F. (1997). Expression of the release factor eRFl (Sup45p) gene of higher eukaryotes in yeast and mammalian tissues. Biochimie 79, 27-36.

225. Vanoni,M., Vai,M., Popolo,L., and Alberghina,L. (1983). Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156, 1282-1291.

226. Vojtek,A., Haarer,B„ Field,J„ Gerst,J., Pollard,T.D., Brown,S., and Wigler,M. (1991). Evidence for a functional link between profilin and CAP in the yeast S. cerevisiae. Cell 66, 497-505.

227. Vojtek,A.B. and Cooper,J.A. (1995). Rho family members: activators of MAP kinase cascades. Cell 82, 527-529.

228. Wagner,W., Bielli,P., Wacha,S., and Ragnini-Wilson,A. (2002). Mlclp promotes septum closure during cytokinesis via the IQ motifs of the vesicle motor Myo2p. EMBO J. 21, 6397-6408.1.170

229. Wang,W., Czaplinski,K., Rao,Y., and Peltz.S.W. (2001). The role of Upf proteins inmodulating the translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBO J. 20, 880-890.

230. Wasserman,S. (1998). FH proteins as cytoskeletal organizers. Trends Cell Biol. 8, 111-115.

231. Watts,F.Z., Shiels,G., and Orr,E. (1987). The yeast MYOl gene encoding a myosin-like protein required for cell division. EMBO J. 6, 3499-3505.

232. Weiss,R.B., Murphy,J.P., and Gallant,J.A. (1984). Genetic screen for cloned release factor genes. J. Bacteriol. 158, 362-364.

233. Weng,Y., Czaplinski,K., and Peltz,S.W. (1996). Identification and characterization of mutations in the UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not mRNA turnover. Mol. Cell Biol. 16, 5491-5506.

234. Wickner,R.B., Masison,D.C„ and Edskes,H.K. (1995). PSI. and [URE3] as yeast prions.1. Yeast 11, 1671-1685.

235. Wickner,R.B„ Taylor,K.L., Edskes,H.K„ Maddelein,M.L., Moriyama,H., and Roberts,B.T. (2000). Prions of yeast as heritable amyloidoses. J. Struct. Biol. 130, 310-322.

236. Wiese,C. and Zheng,Y. (1999). 7-tubulin complexes and their interaction with microtubule-organizing centers. Curr. Opin. Struct. Biol. 9, 250-259.

237. Wilson,P.G. and Culbertson,M.R. (1988). SUF12 suppressor protein of yeast. A fusion protein related to the EF-1 family of elongation factors. J. Mol. Biol. 199, 559-573.

238. Winey,M., Hoyt,M.A., Chan,C., Goetsch,L„ Botstein,D., and Byers,B. (1993). NDC1: a nuclear periphery component required for yeast spindle pole body duplication. J. Cell Biol. 122, 743-751.

239. Winter,D.C., Choe,E.Y., and Li,R. (1999). Genetic dissection of the budding yeast Arp2/3 complex: a comparison of the in vivo and structural roles of individual subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96 , 7288-7293.

240. Xie,X., Harrison,D.H., Schlichting,I„ Sweet,R.M., Kalabokis,V.N., Szent-Gyorgyi,A.G., and Cohen,C. (1994). Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 A resolution. Nature 368, 306-312.

241. Yamaguchi,R. and Newport,J. (2003) A role for Ran-GTP and Crml in blocking re-replication. Cell 113, 115-125.

242. Yang,F., Demma,M., Warren,V., Dharmawardhane,S., and Condeelis,J. (1990). Identification of an actin-binding protein from Dictyostelium as elongation factor la. Nature 347, 494-496.

243. Yang,S., Ayscough,K.R., and Drubin,D.G. (1997). A role for the actin cytoskeleton of Saccharomyces cerevisiae in bipolar bud-site selection. J. Cell Biol. 136, 111-123.

244. Yin,H., Pruyne,D., Huffaker,T.C., and Bretscher,A. (2000). Myosin V orientates the mitotic spindle in yeast. Nature 406, 1013-1015.

245. Zadorskii,S.P., Sopova,I.V., and Inge-Vechtomov,S.G. (2000) Prionization of the Pichia methanolica SUP35 gene product in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetika (Mosk) 36, 1322-1329.

246. Zheng,Y., Cerione,R., and Bender,A. (1994). Control of the yeast bud-site assembly GTPase Cdc42. Catalysis of guanine nucleotide exchange by Cdc24 and stimulation of GTPase activity by Bem3. J. Biol. Chem. 269, 2369-2372.

247. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю М.Д. Тер-Аванесяну за внимательное, терпеливое руководство и помощь в работе.

248. Очень признателен О.А. Донцовой (МГУ) за предоставленные плазмиды, Ю. Чернову (Georgia Institute of Technology) за предоставленные штаммы дрожжей и Е. Karsenti (EMBL) за предоставленные антитела.

Информация о работе

Валуев, Игорь Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.25

Диссертация

Неканонические функции факторов терминации трансляции eRF1 и eRF3 у дрожжей saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы