Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научные влияния физиологических параметров нормальной крови человека на ее оптические свойства в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Научные влияния физиологических параметров нормальной крови человека на ее оптические свойства в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне"

На правах рукописи

II {УЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ НОРМАЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ЕЕ ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА В ВИДИМОМ И БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москпа-19%

Работа выполнена в Институте Общей Физики Российской академии наук

Научные

руководи !ели: кандидат фнзико-матемашческих наук Лощеной В.Ii. доктор медицинских наук Александров М.Т.

Официальные

оппоненты: доктор физико-математических наук Добрсцов Г'. Е. (НИИ ФХМ ) доктор биологических наук Фирсов H.H. (РГМУ)

Ведущая

организация: Физический факультет Московского государе: вешим о университета им. М. В. Ломоносова

е- у

Защита диссертации состоится 5rLeoA/' 1996 г. п часов

на заседании диссертационного совета Д. 084. 66. 01 в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ и МП РФ по адресу: 117828, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ

Автореферат разослан 25 сентября 19% г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандида i биологических наук * ^ М.А М\рниа

ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальное п. icmm. Необходимость фундаментальною изучения он пгчеекпк свойслв кропи возникла по мере того как в биологии и медицине pu ¡пиналось применение светового н особенно лазерного излучения, для лечения и диагностики различных патологических состояний: облучение крови применяют сейчас при фотодипаммческой терапии злокачественных и паразитарных заболеваний кропи (Kessel D., 1993), при лазерной реканализации кровеносных сосудов (лазерная ангиопластика) (Kaplan M.D., Case R.B., 1985), внутрисосуднстй лазерной бпостимуляции (Корочкин М. и др.. 1975), световой диагноешк'е крови (Пси чару A., Reynolds L., Прнезжев A.B.. Шубочкин и др., 1975). Кроме roi о, кропь является одним из основных абсорбентов пидимого и блнжнеинфракраснот излучения в организме, поэтому изучение оптических свойст крови - Tío проблема, которая изучалась исследователями и других тканей и органов человека (Kessler M., Jacquc S., Тучин В., 1992).

Проведенный анализ литературы показал, что оптические исследования крови и разработка на их основе новых методов диагностики и лечения идут в разных странах уже более двадцати лет (Cheong W.-F., Prahl S.A..Тучин В.В., 1992), но вместе с тем, на сегодняшний день нет достаточно полных представлений о скегоиоглощаюших и спеторассенвающих свойствах крови: оптические парнмефы цельной крови, полученные исследователями из разных стран, различаются в 10-15 раз, что естественно затрудняет клиническое применение современных средств физической медицины и диагностики. Таким образом, на данный момент времени отсутствует необходимая метрология лазерного и ene юного воздействия на пациешов: не учитывается, какая часть энергии доходит ни какую 1лубипу н как излучение распределяется внутри облучаемого обьекта. )ia проблема рсчулярпо обсуждается на международных конференциях по лазерной медицине в России и за рубежом (Саратов 92-94, Barselona 95, Los Ausoles, 89-94 и др).

Для того, чтобы преодолеть имеющиеся трудности, необходимо приблнзшь изучение свойств крови in vitro к реальным физиологическим условиям счхудистт рила, что позволит метрологически адекватно решать вопросы клиническою применения лазерного излучения для диагностики и лечения широкого круза заболепанин. Представленное обоснование определяет как научное, так и практическое значение настоящей диссертационном работы.

Цель Ii задачи исследования. Целью данной работы является разработка жспериметально-георстичсской концепции исследований оптических свойств цельной крови, ее аппаратурное и методическое обеспечение, что даст

возможность изучать свойства крови in vitro в условиях, приближенных к реальным физиологическим и на основе выявленных закономерностей разработать метрологически обоснованные принципы клинического применения полученных результатов для фотодинамической терапии (ФДТ). В ходе рабош требовалось решить следующие задачи:

1. Теоретически обосновать и разработать экспериментальную установку для исследования оптических свойств крови, позволяющую определясь н контролируемо изменять те физиологические процессы, происходящие с кровыо в сердечно-сосудистом русле, козорые и основном определяю! ее ошнческне свойства.

2. Обосновать проблему создания тонких проточных слоев цельном крови для исследований ее оптических свойств в широком диапазоне, включая желто-зеленую область спектра и технически решить данную задачу, разработав специальную кювету.

3. Экспериментально установить и численно рассчитан, закономерности зависимостей изменений оптических характеристик цельной крови oí изменений ее гематокрита, скорости сдвига и уровня оксигенации для шести наиболее широко используемых в медицинской науке и практике длин поли : 48К, 5R7. йЗЗ. Л75. 805, 860 нм.

4. Апробировать выявленные закономерности на примере изучения фоюдинамической реакции в цельной человеческой крови с использованием фотосенсибилизатора тетрасульфированного фталоцианина адлюмииия (фотосенса), применяемого для фотодинамической терапии опухолей.

Научная новизна полученных результатов. Разработано amiapaiypiioc н методическое обеспечение исследований оптических свойств цельной крови, которое позволило приблизить изучение свойств кропи in vilio к реальным физиологическим условиям сосудистого русла.

Впервые создана экспериментальная установка, включающая оригинальный элемент (подана заявка на получение нагана "Проючная кювета для оптических исследований" N94037116 от 24 окт. 1994г.) для измерения оптических свойств цельной крови и контролируемого изменения ее физиоло! ических свойств (гематокрита, уровня оксигенации и скорости сдвига) в

условиях in—vitro—для_щгаточпыхедог». Установка позволяет определять

оптические свойства цельной крови в пнфоко^Г~спёкт7Шпэтгш^№Ш4иш^ зеленой до ближнеинфракрасной области спектра на одном и юм же образце. Экспериментально установлены зависимости изменений общо о. днафра! мального пропускания и диффузного отражения и рассчитанных на их основе

коэффициентов moi лощения, коэффициентов рассеяния и среднего косинуса угла рассеяния спета цельной кровыо для шести наиболее широко используемых в медицинской иаукс и практике длинах волн: 488, 587, 633, 675, 805, 860 им от изменений гематокрнта, скорости сдвига и уровня оксигенации исследуемой крови человека в условиях комплексной оценки исследуемых параметров на одном и том же образце. Установлено, что при повышении уровня оксигенации крови в ней происходи i увеличение светорассеяния. Обнаружены нелинейные изменения ко>ффициепта поглощения крови на 25-30% в зависимости от изменений скорости супин а ее по тока для 488 и 587 им. Па основе полученных оптико-физиологических закономерностей впервые экспериментально зафиксирован эффект дезоксигенацни крови при фотодниампческом воздействии in vitro.

11аучпо-нрактическое значение работы.

Предложен способ уменьшения экранирующего эффекта суммарною слоя крови, находящейся внутри ткани, заключающийся в предварительном охлаждении учасиса планируемого облучения.

Разработана« оригинальная проточная кювета с изменяемой толщиной слоя в пределах 10-1000 мкм без удаления образца из кюветы позволяет исследован, и воспроизводимо облучать моноклеточные и сверхтонкие проточные слон различных биоло! ичсскнх жидкостей и широком спектральном диапазоне.

Для получения наиболее устойчивых решений в пределах динамического диапазона проведенных измерений при определении оптических xapawepiicTiiK цельной крови с помощью метода моделирования статистических итераций Монте-Карло (ММСИ) п плоскопарадлелыюй кювете рекомендована оптимальная толщина зондируемого слоя цельной крови: 200 + 10 мкм. При использовании схемы измерения отражения для применяемых в клинике источников красного диапазона необходимо учитывать, что толщина зондируемого обьема цельной крови не превышает 300+50 мкм для артериальной и 150+50 мкм для венозной, что важно при спектроскопических исследованиях цельной крови, лазерной аш иопласгнке и флюоресцентной диагностике с использованием фотосенсибилизаторов.

Апробация работы: Материалы, изложенные в диссертации, докладывались па следующих конференциях, симпозиумах и семинарах: Всесоюзная конференция по новым методам контроля лазерного облучения крови и оценке эффективности лазерной юрапни. Новосибирск, 1990г.; International Symposium on Optica! Methods in Biomedical Diagnostics and Therapy. Саратов, 1992г.; Научно-практическая конференция "Современное сосюяние проблемы применения лазерной медицинской техники в клинической практике". Москва, 1992г.;

Biomedical Optics-Europe'93. Budapest, Hungary, 1993r.; Biomedical Optics-Europe'94. Lille, France, 1994г.; Семинар по лазерной медицине Международной Лазерной Ассоциации (ЛАС). Москва, 1995г.; Biomedical Opties-Europe'95. Barsclona. Spain, 1995г.; Семинар лаборатории лазерном биофизики, Физический факультет МГУ, Москва. 1995г.; Biomedical Optics-USA'96. San Jose. USA, 199(>г.; Приглашенная лекция в Physiology and Kardiology Institute of Erlangen University, Germany, 1996r.; International congress of Pholobiology-96, Vienna. Austria; Biomedical Optics-Europe'96. Vienna, Austria. По материалам рабсмы

опубликовано десять статен и подана одна заяпка на па i ein

Структура л объем дисссршцич. Диссертация акт um т введении, обзора литературы, описания материалов и методом, реп.и,шит и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литерапры п приложения. Содержание диссертации изложено на 165 страницах, иллюстрировано 54 рисунками и содержит 30 таблиц, из которых .две составлено по данным дшературы. Список литературы включает в себя J 56 наименований.

СОДЕРЖА!Ulli ДИССЕРТАЦИИ Глава |. Обзор литерапры. Кратко опнеывакчеи физиологические свойства крови и се компонентов, а также общие принципы биологической ошикп крови и основные фтические и мак-магические подходы к исследованиям и описанию получаемых данных.

Общепринятой современной иракшкон при описании процесса распространения света в биоложческих гкаммх. в том числе в крови, является использование теории переноса излучения, в рамках ко юрой поглощение и рассеяние свега средой достаточно полно определяется коэффициентом поглощения ((Ja), коэффициентом рассеяния (ps) и средним косинусом у( л а рассеяния g (Чандрасекар, Ван де Хыолп, 1961)..

Рис.1. Основные представления о распространении отичсскою излучения в крови, существующие на основании предыдущих исследований: а) - нндикатрисса рассеяния излучения красною и ближнего ИК диапазона от одиночною эритроцита; б) картина pacnpociранения ими же излучения в толще цельной

крош1(Кс5.ч1сг М., 1992); в) схема рассмотренных в ММСИ процессов, происходящих с фотоном в кювете с цельной кровью: отражение от границ слоев, поглощение, рассеяние без и с выходом из слоя крови, преломление света (Ярославский И., 1994); г) световое зондирование агрегированной крови; л) световое зондирование дезагрегированной крови (одиночных эритроцитов в по1 оке): I - случаи зондирования, когда большинство эритроцитов в потоке развернуты к лучу фронтальной , широкой стороной, 2 - случай зондирования, когда клоки ориентированы в потоке по отношению к лучу боковой, узкой стороной.

Распределение интенсивности излучения внутри биоткани и на ее новермюеш яплясгся сложной функцией от п (показателя преломления) ра, [и, д данной биоткани, и параметров источника излучения: радиуса лазерного пучка м и его геометрического профиля (Тучин В.В., 1994). В настоящий момент в международной практике наиболее часто оптическое описание биологической среды лается именно в терминах теории переноса, как набор параметров {)1а, g¡: 1сорешчески зги параметры не зависят от характеристик конкретной жепернменталыюй установки, поэтому именно по ним сравнивают свои результат исследователи из разных стран и научных центров. Некоторые результант, полученные на настоящий момент по оптике крови приведены в таблице I.

Таблица 1. Краткий лтературный обзор данных по оптическим параметрам

цельной крови

им (1.1, ми ' мм'1 Физиологические характеристики крови Методы намерения и теоретическом □писания Автор, г од,ссылка

Г.75 а) 01 а)0.27 5) 2.43 а)149.2 5)147.6 а)0.995 5)0.995 а)оксиг99%, 111=41 5)оксиг 0% Пропускание и отражение в режим! однократного рассеяния, Теор. Ми А.Испмару 1978

Ша) б) «НОо) б) а|И 7 5)2.15 п)0 51 Ь]0 (и аЦЬ9.6 6)169 6 а)121.3 Щ121 3 3)0.985 6)0.985 а)0 98 б>0 9Н а)»ксиг9У° и, 1И=4| 5)оксш0% а)окснг99%., №=41 Л/окст ()% Измерения общего и ко плимированного пропускания гониофотометрия, Днффулюн. приближение Ж. ПЬейнке, А. Шепиард 1988 П Таерскн, 70

Г.ЗЗа) г>> XIII Я5«а) б) .0<>7 6)2.5 II 45 а)« 6 1)0 35 а)Э0 б)10 а)22.5 0)20 а)0 9К 5)0.98 а)0.98 Г.)0.9Х а)оксг99%,Ш=41-43 б)оксит <)"'. Дсоксигенирован. [1)оксг90%,1И=41-43 Л)окс||г 0"о Диффузное отражение и днффузнос пропускание, Мопте-Карло С. Жак, М. Кей)ер 1492

Пыводы нз а/шт м литературы:

I. С_\шествующие представления о взаимосвязи оптических и существенно влияющих на них физиологических свойств крови качественно выглядят с.тедпошнм образом: р., (1И, Ог-яа1); уи- ^ (Ш, я): (я) при фиксированном СО"-? с цветом показа!еле. (}И - ¡сматокрит, 0>-*а1 - оксигенация, я - скорость с 1Р.ш а (пропиюднля линейной скорости потока но радиусу сосуда)).

Количественная оценка степени влияния каждого из физиологических параметров на оптические характеристики на сегодняшний день отсутствует.

2. Из доступных литературных источников выявлено, что на сеюднятштпй день отсутствует полная база достоверных данных по оптическим параметрам светопоглощения и светорассеяния крови. Оптические показатели кропи, полученные исследователями из разных стран, различаются в 10-15 раз.

3. На основании современных данных литературы установлено, что оптические характеристики получены только для неподвижной крови, » то время как ¡n vivo кровь - нестационарная среда. Методические трудности отчасти связаны с технической проблемой создания тонких плоских пршочных слоев.

4. Применяемые раннее математические методы решения уравнения переноса, такие как многопотоковые теории и диффузионное приближение, не дают достаточно точного решения для нахождения оптических параметров поглощения и рассеяния крови. В настоящее время наиболее точным способом определения щ, Ms и g из измеренных показателей пропускания и отражения, по-видимому. является метод статистических итераций Монте-Карло (ММСИ).

В заключении обзора литературы, на основании вышесформулпрованных выводов, представлена теоретическая концепция планируемой экспериментальной работы по исследованию взаимосвязи гематокрита, уровня оксигснацни, скорости сдвига крови и ее оптических свойств.

Глава Н. Материалы н методы. Глава содержит описание экспериментальных методов варьирования физиологических свойств крови, а также методов регистрации се оптических и физиологических параметров на основании концепции, изложенной в обзоре литературы. Кратко представлены основные физические модели и математические методы, использованные в данной работе.

Разработанная экспериментальная установка ¡n vilro (Рис. 2) служит для измерения пропускания и отражения крови, изменяя прп этом какую-либо физиологическую характеристику: концентрацию крови (т.е. ее гемаюкрит и общую концентрацию гемоглобина), степень оксигенации Oj-sat и скорость циркуляции крови V (также соответственно и скорость сдвига s). При изменении одной физиологической характеристики все остальные физиологические параметры остаются неизменными,—Кроме того, благодаря орт иналт.ному техническому решению, была создана полностью разбирающаяся ироючная плоскопараллельная кювета, которая позволяет изменять толщину слоя находящейся в ней крови без удаления ее из кюветы в диапазоне 10-1000 мкм.

I Hmpsmiitt лшмяшякрпи Нахфавлшме по tima шя

Рис.2. Схема жспсрпмснгалыюй установки. Пояснения в тексте.

Как видно из Рис. 2 экспериментальная установка состоит из пяти i лапнмх часк-н: изолированною oí ашосфсрпот шмдуха смесителя I, кварцевой нроючной КЮВС1Ы 2, лвухлучепого спектрофотометра 3 с интегрирующей сферой 7 (МПACHI U-3400), перистальтического роликового насоса 4 и мембранного оксигенатора 5, соединенного с газовым баллоном 6. Все части контура циркуляции крови (1-2-4-5-1) соединены между собой эластичными трубками из силпконпшропанпон резины.

Длины волн, используемые для анализа оптических свойств крови, были выбраны из тех, что применяются либо в различных областях лазерной медицины (488, 633. 675, 860 им) (Kaplan M., Cheong VV„ Кару T., 1985-1992), либо важных для спектроскопическою анализа: изосбестические точки 587 и 805 нм.

Так как определение трех неизвестных параметров ps, g требует трех независимых измерений, то измеряли общее пропускание Tt, диффузное отражение Ril, а также диафрагмальное пропускание Tdr коллимированного пучка MHOI ослоиным плоским образцом (кровь в плоскопараллелыюй кювете).

Для расчета коэффициентов поглощения, рассеяния и среднего угла рассеяния из измеренных параметров применяли инверсный метод сташстических терраций Монте-Карло - статисшческое моделирование движения определенного количества фотонов. При этом в соответствии с ¡V, ps' и g', толщиной h' и показа 1елеч преломления iv каждого m i слоев среды фотон с определенной вероятностью может!Рис. 1в): а) рассеяться в пределах слоя; б) рассеяться и выйти из слоя; в) пройти через слой и не рассеяться (процесс преломления спета); г) oí разиться от поверхности слоя; д) поглотиться.

KpaiKHH а норитм расчета:

1. Tt. Tilr, Rd => {ц.,, (u, g¡1 методом Кубелка-Мунка;

2. Mi ||ia, |u, gi' методом Монте -Карлорассчитываются (Ti, Tdr, Rd¡';

3. Оценивается среднеквадратичное отклонение SS рассчитанных ¡Tt'.Tdr'.Rd'l от реально измеренных {Tt,Tdr,Rd};

4. Ксли SS меньше заданной погрешности, то расчет закапчнваскя. Если нет, то поиск в фазовом пространстве р.,, р,, g продолжается.

В рамках совместного научного сотрудничества данный алгоршм был реализован по представленным эксперимешальным и методическим материалам в виде программного обеспечения к.ф-м. наук Ярославским И.В.

Для определения скорости сдвига s, сек-1 в кювете была определена линейная скорость при различном расходе методом Допплеровскоп анемометрии в локуес оптического зондирования кюветы (Рис.3). Из рисунка видно, что при высоком расходе градиент линейных скоростей в области зондирования во фронтальной плоскости достаточно мал (40-44 мм/сек), полому им пренебрегают и считают среднюю линейную скорость (при данном расходе - 42 мм/сек) постоянной величиной. Такая ситуация существенно упрощает решение уравнение Навьс-Стокса и получение формулы для расчета s в данной кювете: s=3V/h (V -линейная скорость, h-толщина кюветы). Диапазон изменений скорое i и едшиа лежит в пределах, соответствующим условиям сосудистого русла ¡n vivo: 0 - 850 сек1.

hv

Направление глав по пока

Параллельно*направление

по отношению к гл»»мому потоку (О-цеитр 1Ю1«Ти),МИ

Перпендикулярное направление по отношению к глааному потоку (О-центр (и**гы), мм

44 4$

42 44 40 42

38-40 Э6-Э8 34 36 32-34 30-3 2

Рис, 3. Пространственное распределение линейных скоростей во фронтальной плоскости (па которую падает зондирующий пучок) кюветы с толщиной проточного слоя 130 мкм, полученное методом лазерной Допплеровской анемометрии. Стрелками показано направление падающего зондирующею

-гояученн

Обьектом исследований была цельная гепарппизироваипая кровь о г здоровых доноров и пациентов отделения кардиогерапии Московской Медицинской Академии. Разбавление осуществлялось фосфашым буфером, чтобы замедлить седиментацию. Во время измерений, кроме исследования

затннмосш J ft... ju, g|-s, кровь в установке была неподвижна. Гематокрпт определяли методом центрифугирования, оксигенация измерялась оксиметром, величины СОЭ и цветной показатель контролировались рутинным способом. Статистическую обработку данных проводили путем определения среднего арифметического и его дисперсии с последующим графическим сравнением рс»лы:мов (Львовский Е., 1988). Суммарная погрешность при установлении coonieicrmiH ко ¡ффициента поглощения, коэффициента рассеяния, среднего косинуса учла рассеяния и исследованных физиологических факторов крозн лежит в диапазоне +40-60%. Как показывает практика, наибольшую погрешность вносит дисперсия клинических анализов крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Кривые ослабления. Определение реальной глубины зондирования и оптимальной толщины слоя кропи для опшчсскнх исследовании.

На рисунке 4 представлены кривые уменьшения пропускания излучения изученных длин волн при возрастании толщины слоя крови от 30 до 450 мкм. Особенностью данных кривых является то, что они получены не путем разбавления крови, а изменением толщины слоя цельной крови в кювете на одном и том же образце.

(I 50 100 150 2 0 0 250 300 350 400 450!

Толщин» слоя кропи, мкм

Рис.4. Уменьшение общего пропускания в зависимости от увеличения толщины слоя цельной крови, llt-43; 02sat=99V

Исходя из представленных данных, ослабление интенсивности излучения в с раз для 633, 675, 805, 860 им происходит при толщине слоя 500+50 мкм, а для 488 и 5S7 пм - на глубине 70+10 мкм.

При превышении толщины слоя оксигеннрованной крови более 300 мкм значения диффу того отражения 633,675, 805, 860 выходят на плато (Рис.5).

0.0 8 0 07 О .ü 6 S 0 05 i? 0.04 5 0 03 0 0 2 (I О I

о

О 5 (I IО О 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0» 4 5 (I

'Г о л ш и к а с л о я . м к м

Рис.5. Выход на "плато" диффузного отражения при увеличении толщины слоя цельной кропи свыше 300 мкм. 111=43; í)2sat=99%.

Эго обозначает, что количество долетающих до фотодетекюра обратно рассеянных фотонов красного и ближнего ИК излучения из цельной крови с глубины более 300 мкм не регистрируется в пределах динамическою диапазона измерений. Фактически, 300 мкм для цельной оксигеннрованнон крови является максимальной глубиной реального зондирования отраженным светом для указанных длин волн в случае вышеописанной геометрии оптических измерений. Данная величина может измениться в зависимости от степени окешенацип крови: так для 633 им глубина зондирования венозной крови будет в 2 раза меньше, а для 805 им оааиется такой же.

I 0 2 0 6 2 5 0 10 0 Т О Л IU и и я с л о ■ крщн, ккч

а)

И I) 2 О О 2 5 0 миг 1 «о Т о л in и ч а с л о • крови, »»км

б)

.(. ! .1 - ¡MM

Рис.6. Стабилизация коэффициента поглощения а) и рассеянии б) 633 и R05 в зависимости от увеличения толщины слоя цельной крови. 111=43: 02sat=lM"».

В холе работы было проанализировано влияние толщины слоя на определяемые оптические параметры и пыясиепо, что наиболее устойчивые решения метода скипсшческих итеррацип (Монте-Карло) для исследованного красною и ближнею ИК излучения в пределах динамическою диапазона измерений получены при толщине слоя 200 ± 10 мкм. В качестве примера можно привес ni стабили шцию коэффициентов поглощения и рассеяния, представленных cooi не i с i венно на рпс.6 а и б дли 633 и 805 нм.

Аналогичная динамика лих показателей, а также среднего косинуса угла рассеяния имеется и для других изученных длин воли 675 и 860 нм.

Исходя из подученных результатов, можно заключить, что оптические параметры, подученные на слоях цельной крови тоньше 200 мкм, буду'! несколько завышены и для получения наиболее устойчивых решений в пределах динамическою диапаиша измерений при определении оптических характеристик цельной кропи с помощью метода моделирования статистических итераций Моше-Карло (ММС'И) в п.юскопараллсльной кювете рекомендуется создать слой 200 t 10 мкм.

2. Зкенеремеша.тьиап проверка пнимезм о редукции рассеянии при превышении и-машкрши кропи свыше 50%.

На основании проведенных исследований были получены результаты, нодтвержчающие iinioieiy об определяющем влиянии редукции рассеяния па увеличение оптической прозрачности крови при увеличении ее гематокрита свыше 50"НИсимару А.. 197,S).

Г t » a i л к р и т . %

а)

I Л ? 4 Л Г, 4 В 0

I г Ч I i о (, р И I ,

Г.)

Ь i i 8 0 5

К о

в)

1'пс.7. Изменения оптических свойств крови для 633 и 8U5 им. при увеличении ее гематокрита свыше 50 %: а) - увеличение сиетопропускания; Г») - увеличение коэффициента поглощения; в) - редукция коэффициента рассеяния. Толщина слоя 140 мкм, 02sat=99%.

На примере 633 и 805 им покашиа динамика полученных показа!елей пропускания, поглощения и рассеяния при увеличении Hl о i 16 до 67: увеличение светопропускания почти в 1.5 раза по сравнению с предыдущим значением (Рис. 7 а); непрерывный рост коэффициента поглощения (Рис. 7 б) в соответствии с увеличением концентрации крови и редукция коэффициента рассеяния при значениях гематокрита свыше 50 практически в 1.5 раза по сравнению с предыдущим значением, полученным при 111=50 (Рис 7 в). Результаты, аналогичные отраженный на рисунке 7, получены для других исследованных длин волн 675 и 860 им. При этом для А=488 и Х=587, 1де коэффпциеш noiлощения выше, чем коэффициент рассеяния, изменения пропускания и офажения определяются прежде acero изменениями концентрации гемшлобнпа крови и имеют линейный характер.

Так как кровь разбавляли не плазмой, а буферным раствором, то снижение концентрации фибриногена приводило к уменьшению агрегнротшпости эритроцитов, и, соответственно, к увеличению показателей светорассеяния кровью. Подробнее взаимосвязь агрегации и оптических параметров рассмотрена в следующей группе результатов.

Таким образом, с помощью экспериментальных и тсорсшчески рассчитанных результатов показано, что увеличение оптической прозрачности крови при увеличении се гематокрита свыше 50 % вызвано, прежде всего, уменьшением рассеяния света.

-—Iи дезагрегации крови, деформации и изменения

ориентации эритроцитов на оптические харак терно i икитсрови.-_______

При возникновении скорости сдвига свыше 100 сек1 происходит динамическая дезагрегация эритроцитов в потоке крови (Рис. 1 г и д), что оптически зарегистрировали как уменьшение пропускания н увеличение 0!ражения, причинами которых являются увеличение светорассеяния: увеличение

как коэффициент рассеяния, так и уменьшение среднего косинуса угла рассеяния (i.e. упшрсние ипдикатриссы рассеяния). Деформация эритроцитов уменьшает его сечение рассеяния (характеристике рассеяния от всей поверхности клетки). Полученные результаты в целом согласуются с предыдущими работами (H.I.KIose.E.Volger, 1972).

Тем не менее, обнаружено, чго появление и изменение ориентации эршроцншп при их движении » нотке кропи но отношению к плоскости зондирующею луча приводит к появлению сиеювой анизотропии крови и к нелинейному тмепенню коэффициента поглощения. Обнаруженный эффект имеет мест для излучения с длиной волны 488 п 587 им в тонких проточных слоях с толщиной 150 мкм. В зависимости от избранного направления светового зондирования движущихся эритроцитов в потоке крови (Рис.I д) изменяется не тлько сечение рассеяния, но и сечение поглощения (характеристика всех потерь интенсивности проходящего излучения внутри клетки) эритроцита. Так как сечение поглощения одною эритроцита максимально в случае, когда он развернуi в hoi оке широкой фронтальной плоскостью по отношению к зондирующему пучку (Рис.1 д1). то мри достаточно высокой величине коэффициента поглощения в стучле loiiKHX слоев 1акой эффект может привести к изменению самого мпффпцнета noi лощения, как суммы сечений поглощения эритроцитов, оказавшихся на пути зондирующего излучения (Рис. 8).

Рис 8. Нелинейные ишепения коэффициента поглощения цельной крови на 25-3(1% при увеличении скорое!и сдвига. Толщина слоя 140 мкм, 02-5а1=99%.

Максимальное по< лощение наблюдалось при скорости сдвига 135 сек1. Данный феномен имее! мечто б.тлюдаря так называемому "эффекту сита": тсмоглоОнн распределен в кропи неравномерно и в норме находится только втчри фшроннюи.

Исходя из теоретических предположений можно допусти., что глубина модуляции ко)ффициспта поглощения, т.е. разница между его максимальным и пачатьпым (для неподвижной крови! значением при близкой угловой ориентации

большинства эритроцитов относительно зондирующего пучка при сек ',

будет определяться соотношением между г еометрическим сечением его боковой и передней поверхности.

4, Влияние на оптические параметры крови изменения ее окешепации.

Основываясь на изменениях рассчитанных оптических парамс1ров, мы покачали, что увеличение оксигенации крови с 45 до 99 % приводит не только к изменениям коэффициента поглощения н соогпетстшш со спсмрамн ) емоГлобпна и окенгемоглобмна, но и к уменьшению средне! о косинуса и ла рассеяния исследованных длин волн на 2-5 % (Рис 9 а.б).

ООН О ото О 9 0 0 0 8X0 О Я 6 о О ИИ О « 2 0 0 8 0 0

7 О О 2 »• ».

а)

0 9 а 0 (V Я >1 и .1 Я о 0 8 4 0 в: 0 О ПО

-ь £

"Ч {4"

7 О

ОМ1,'.

г,)

Рис. 9. Уменьшение среднего косинуса угла рассеяния 633, 675, 805, 860 им при увеличении оксигенации цельной крови.

Установлено, что так как величина g определяется прежде всего размером п формой рассенвателя, то это позволяет сформулирован, гипотезу о том. что уровень оксигенации крови влияет не только на ее свегопо! лощающис, но н на светорассеивающие свойства, вследствие уменьшения среднею размера образующихся агрегатов. Таким образом, физиологически, ограничение размеров эритроцитариых агрегатов может быть вызвано увеличением одноименных

зарядов их мембран, и, соответственно, взанмооттажшштпем—клетк—нрн-оксигенации гемоглобина.

5. Использование полученных закономерностей, связывающих между собой оптические и фшноло! нческие скопсгиа кропи на примере фо година,мичсскон реакции фгалоцшшшш ал.номшшя (фотосенса) с нелмшн кровью.

Ь 1 5

5 0

К О

ч О

I о о

е> о

Реэ\лыап>1 регистрации изменении спектра общею пропускания преде кшлены на рисунке 10. Произведен расчет реальной удельной дозы облучения данного образца кропи, которая составила 80 Дж/см3.

X, н и

Рпс. 10 Спектр пропускания крови с растворенным фотосенсом до и после лазерпою облучения (671 им; 80 Дж/см-1). Концентрация фотосенсибилизатора -0.01 Mi/мл. Ht=40, 02sat=99%. Толщина слоя крови 450 мкм. Минимумы пропускания соотетвуют пику поглощения использованною фоюсенснбилпзаюра. Изменение вида кривой после облучения в целом соответствует спектральным изменениям, характерным для процесса деокешенации крови в данном диапазоне длим волн.

Проведенный эксперимент по фотодпнамической реакции фталоцнаннна аллюмпппя с цельной кровыо продемонстрировал специфические изменения измеряемых (i.e. пропускания и отражения) и рассчитываемых (т.е. коэффициентов по| лощения, рассеяния и среднего косинуса утла'рассеяния) оптических свойств крови с растворенным фогоссисибилнзлтором фотосснсом после лазерного облучения длиной волны 671 им in viiro.

Общая каршна изменений измеренных и рассчитанных параметров нредаавлена в облике 2. В скобках указан статистический разброс параметров. Знаком + или - показаны, соответственно, относительное увеличение или уменьшение оптических характеристик по сравнению с таковыми для иеоблученной крови.

Таблица 2. Относительные изменения оптических параметров фоюсенсибилпзнрованпой цельной крови после лазерного облучения с >.=671 им

}., IIM Ti(I0%) Ril(2()%) ц,(4(>%) ц,(20'%) 8(4%)

600 -70";, -1150"н + 100"« -13" „ + 11%

633 -50% -300"/.. + 185':,, +2% +4.3%

671 -33",. -100% + 123"» + 1.4% +2.6%

675 -26" „ -100% +94",, + 1% + 1.3"/,.

S05 -6.8"„ -7.9 + 2" 1, + 1% +3.4%

Из представленой таблицы видна, что оптические показатели но] лощения существенно растут для всех длии волн, за исключением 805 им, в то время как коэффициент рассеяния практически не меняется, а изменения среднего косинуса угла рассеяния не превышают 4.3% для 633, 671, 675, 805 им.

В результате исследования, на основе полученных значений и закономерностей влияния физиологических свойств крови на се ошичеекпе сно/ктва, установлен эффект деокешенацни облучаемой аргериалмюй кропи до веношых значений, что подтверждает существующие предположения об участии растворенного кислорода в данной фотодинамической реакции (Steiner R., Лощенов В., 1993).

11а основе полученных результатов разработаны конкретные клинические рекомендации по проведению фотодинамической процедуры для увеличения ее эффекпшносп! и преодоления оптическою барьера п поверхностных кровесодержащих тканях и верхних слоях опухоли, возникающего при деокенгенацип крови в результате фотодинамического воздействия. Предложено изменить идеологию фотодинамической лазерной обработки опухоли: если сейчас уничтожение новообразования мягких (т.е. кровосодержащих) тканей веде1ся с поверхности вглубь, то имеет смысл проводин, это в обратном порядке: разрушать в первую очередь глубоколежащие слои опухоли. Достичь этого можно, уменьшая поглощение в поверхностных слоях за счет эффекта вазокопстрикции при предварительном местном охлаждении предполагаемого места облучения. Это позволит более эффективно воздействовать на новообразование как с точки зрения утилизации кислорода при фотрдинамическом воздействии, так н с точки зрения предотвращения оптического барьера для лазерного облучения опухоли. Увеличение зондирующего обьема при измерении отражения света от облучаемой биологической ткани за счет уменьшения поглощения света кровыо, содержащейся в ней, позволит более полно осуществлять контроль за проведением процедуры ФДТ. Кроме того, дополнительным преимуществом данного подхода является эффект местного обезболивания.

Данное предложение внедрено в клиническую практику Онкологического Центра АМН России и Московской Медицинской Академии им. Сеченова, что -ползнсрждшй_гаогветспующ|тмп актами о внедрении.

Созданную аппаратуру и методику для \1оделированн^шттттчссктпгевойегв--

крови можно использовать с целыо скрининга различных меюдов фотодннамичеекой терапии. Мониторинг уровня оксигенацин в облучаемой ткани в принципе позволяет точно установить момент начала и окончания процедуры фотодннамичеекой терапии.

выводы

1. Рафаботама экспериментальная установка, включающая оригинальный >лсмсш (подана заявка на получение патента "Проточная кювета для оптических исследований" N94037116 от 24 окт. 1994г.) для измерения оптических свойств цельной крови н контролируемою изменения ее физиологических свойств fiCMaioicpina, уровня окспгснапин и скорости сдвига) в условиях in vitro для нротчпых слоев, приближенных к реальным физиологическим условиям С01ЛДИСНЧ0 русла. Уааповка позволяет опреде лять оптические свойства цельной крови и широком снекфалыюм диапазоне от зеленой до ближней инфракрасной области спектра на одном и том же образце.

2. В условиях комплексной оценки исследуемых параметров на одном и том же nñpaine эксперпмешалыю установлены зависимости изменений общего, диафраг малмки о пропускания и диффузною отражения н рассчитанных на их основе ко)ффнциен!оп поглощения, коэффициентов рассеяния и среднего косинуса yi:ia рассччишя encía цельной кровыо для шести наиболее широко используемых в медицинской пачке п практике длинах волн: 488, 587, 633, 675, 805, 860 им от щчснснпн iсмаюкрнia, скорости сдвша и уровня окситенации исследуемой кропи человека

3. Усыновлено относшслыюс влияние iсмаюкрша, скорости сдвша и уровня окешенации цельной крови п пределах исследованных диапазонов их |имсн'.-ннй па оптические параметры кронп для изученных длин волн.

На коэффнциак генлошеиия 633 и 675 им наиболее сильное влияние оказываем уровень окчигенации крови. Для остальных длин волн поглощение свеса кровью опрсделяася прежде всего величиной гематокрита. Па коэффициент рассеяния оказывают близкое но значению влияние уровень гематокрита и скорость сдвша шчока крови На средний косинус угла рассеяния максимальное в зияние оказывает ! сма i отри г.

4. При повышении уровня окешенации крови до 90 '".> и выше в ней происходит уменьшение среднего косинуса утла рассеяния света па 2-5"ú для 633, 67Я 8(15, ХМ) им. ')io позволяет предположить, чю уровень окешенации крови влняе| па се свешрассснвагощпе ciun'icuui вследствие уменьшения среднею ра ¡мера K.'ieiочных ai peí а тов.

5. Обнаружены изменения коэффициента поглощения крови на 25-30% в janHCMMOci и ом! iMcneiniií скоросч и сдвига ее по i ока для 488 и 587 им: увеличение, достижение максимума при скорости сдвша 135 сск1, а затем уменьшение практически до первоначальных значений. Данный феномен может являться

следствием появления и изменения ориентации эритроцитов при их движении в потоке крови.

6. Экспериментально показано, что для длин волн красного и ближнего ПК диапазона при увеличении гематокрига свыше 50 % пропускание света кровыо увеличивается, а рассеяние уменьшается. Это хорошо согласуется с теорией Исимару Л. об определяющем влиянии редукции рассеяния на увеличение оптической прозрачности крови при высоких значениях гематокрита.

7. Используя разработанную нами установку, было изучено действие лазерного облучения в присутствии фоюсенсибилизатора тстрасульфированного фталоцианина аллюминия (фотосенса) на оптические свойава крови. Установлен эффект уменьшения оксигенации крови до значений ниже венозных. Это приводит к снижению пропускания действующего света (671 им) в цельной крови па 30-50"».

8. Предложен способ уменьшения экранирующею эффект суммарною слоя крови, находящейся внутри ткани, заключающийся в предварительном охлаждении участка планируемого облучения. Метод внедрен в клиническую практику Онкологического црнтра РАМН и ММА им. Сеченова.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Дуплик А.Ю "Оценка коэффициента пропускания крови при воздействий лазерного излучения с длиной волны 0.63 и 0.89 мкм.", сборник "Актуальные вопросы лазерной медицины" Москва, МОНИКИ, с. 29-32, 1990.

2. Дуплик АЛО. Александров М.Т. Андреев Е.М. "Исследование коэффициента пропускания кровью лазерного излучения с длиной волны 0.63 мкм,0.85 мкм, 0.96 мкм в зависимости от некоторых физических факторов состояния крови", сборник "Современные методы контроля лазерного облучения крови и оценки эффективности лазерной терапии" Новосибирск, СО АН СССР, cip 24-25, 1990.

3. Дуплик А.Ю. Гордеев 10.Н. Ярославский П.В."Расчет средней облученноеэт крови для внутривенной лазерной терапии", сборник "Современное состяние проблемы применения лазерной медицинской техники в клинической пракиже",

4. 1, Москва, РГМУ, стр. 87-89, 1992.

4. Александров М.Т. Дуплик А.Ю. "Способ определения к-мперагурной готовности криокоисервированной донорской кропи для переливания", еборппк "Современное состояние проблемы применения лазерной медицинской техники в клинической практике", ч.2, Москва, РГМУ. стр. 178-180, 1992

5. Douplick A Y. Gordeev Y.N. Yaroslavsky l.V. "Calculation of Specific Power Density of blood for Intra-Venous Low-Level Laser Therapy", SPIE-Proceeding Vol.1981, USA, p.240-244, 1993.

6. Douplick A.Y. "The use of the concept of Specific Power Density" for parametrisation of Low Level Laser Irradiation.", SPIE-Proc., Vol. 2086, USA, p. 308-311, 1994.

7. Douplick A.Y. Yaroslavsky l.V. Loschenov V. В., Alexandrov M. Т., Sirkin A. L. "Identification of spectroscopic parameters of whole blood depending on its physiological properties" SPIE-Proc., Vol. 2326, USA, p. 319-325. 1995.

8. N.L. Torshina, V.B. Loschenov, A. Starotovnikov, A.Yu. Douplik, A.M. Posypanova "Investigation of phtalcianine Al. photosensitizer and blood interaction". SPIE-Proc.. Vol. 2325, USA, p. 389-390, 1995.

9. Douplik Alexandre J., Loschenov V.B. , "Identification of spectroscopic and optical parameters of whole blood depending on its concentration and lay er thickness". SPIE-Proc.. Vol. 2624, USA, p. 165-176, 1995.

10. Douplik Alexandre J. .Loschenov Victor B. "Identification of optical parameters of the whole blood depending on its oxygenation level". SPIE-Proc.. Vol.2678, USA. p. 548-555, 1996.