Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение влияния физиологических параметров нормальной крови человека на её оптические свойства в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение влияния физиологических параметров нормальной крови человека на её оптические свойства в видимом и ближнем инфракрасном диапазоне"

РГБ ОД

1 О ОН! 1996

На правах рукописи

ДУПЛИК АЛЕКСАНДР ЮРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ НОРМАЛЬНОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НЛ ЕЕ ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА В ВИДИМОМ И БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-19%

Работа выполнена в Институте Общей Физики Российской академии наук

Научные

руководители: кандидат физико-математических наук Лощенок В.Ь доктор медицинских наук Александрой М.Т.

Официальные

оппоненты: доктор физико-математических наук Добрецов Г. Е. (ПИИ ФХМ ) доктор биологических наук Фирсоп Н.Н. (РГМУ)

Ведущая

оршкшция: Физический факультет Московского тсударовешки о университета им. М. В. Ломоносова

Чащита диссертации состоится " "__1996 г. в____часов

на заседании диссертационного совета Д. 084. 66. 01 в Научно-исследовагельском институте физико-химической медицины МЗ и МП РФ по адресу: 11782В, Москва, ул. М. Пироговская, д. 1А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ФХМ

Автореферат разослан 25 сентября 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандида I биологических наук

М.Л М\рнна

ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальное п> темы. Необходимость фундаментальною изучения опшчеекмч свойств кропи возникли по мере того как в биологии и медицине развивалось применение светового и особенно лазерного излучения, для лечения и дм;иносгики различных патологических сосгояннй: облучение крови применяют сейчас при фогодииамической терапии 'шокачестпенных и паразитарных шболевапий кропи (Kessel D., 1993), при лазерной реканализащш кровеносных сосудов (лазерная ангиопластика) (Kaplan M.D., Case R.B., 1985), пну iрнсосуднстой лазерной биостимуляции (Корочкин М. и др., 1975), спеговон диагностике крови (Иснмару A., Reynolds L., Приезжев A.B.. Шубочкнн и др., W5) Кроме roi о, кровь является одним из основных абсорбентов видимою и блнжнеинфракрасною тлучения в организме, поэтому изучение оптических свойств крови - но проблема, коюрая изучалась исследователями и других тканей и органон человека (Kessler M., Jacque S., Тучин В., 1992).

Проведенный анализ литературы показал, что оптические исследования крови и разработка на их основе новых методов диагностики и лечения идут в разных странах уже более двадцати лет (Cheong W.-F., Prahl S.А..Тучин В.В., 1992), не) имеете с тем, на cei одняипиш день пег дост аточно полных представлении о смеюиог.тошакчцнх п светорассенвающих свойствах крови: оптические парамефы цельной крови, полученные исследователями из разных стран, различаются в 10-15 раз, что естественно затрудняет клиническое применение современных средств физической медицины и диагностики. Таким образом, па данный моменг времени отсутствует необходимая метрология лазерного и ene юного воздействия на пациешов: не учитывается, какая часть энергии доходит па какую глубину и как излучение распределяется внутри облучаемого обьекта. ')|н проблема регулярно обсуждается на международных конференциях по лазерной медицине в России и за рубежом (Саратов 92-94, Barcelona 95, Los Ausoles, 89-94 и др).

Для того, чтобы преодолеть имеющиеся трудности, необходимо прнбмнзпн. изучение свойств крови in vitro к реальным физиологическим условиям ечнуднеют русла, что позволит метрологически адекватно решать вопросы клиническою применения лазерного излучения для диагностики и лечения широкого крута заболеваний. Представленное обоснование определяет как научное, так н практическое значение настоящей диссертационной работы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка женернмешалыю-теоретической концепции исследований оптических свойств цельной крови, ее аппаратурное и методическое обеспечение, что даст

возможность изучать свойства крови in vitro в условиях, приближенных к реальным физиологическим и на основе выявленных закономерностей разработать метрологически обоснованные принципы клинического применения полученных результатов для фотодинамической терапии (ФДТ). В холе рабоп.1 требовалось решить следующие задачи:

1. Теоретически обосновать н разработать экспериментальную установку для исследования оптических свойств крови, позволяющую определяй, и контролируемо изменять те физиологические процессы, происходящие с кровыо в сердечно-сосудистом русле, коюрые п основном определяю! ее ошпческис свойства.

2. Обосновать проблему создания тонких проточных слоев цельной крови для исследований ее оптических свойств в широком диапазоне, включая желто-зеленую область спектра и технически решить данную задачу, рафаботав специальную кювету.

3. Экспериментально установить и численно рассчитан, закономерности зависимостей изменений оптических характеристик цельной крови oí изменений ее гематокрита, скорости сдвига и уровня окенгенацин для шести наиболее широко используемых в медицинской пауке и практике длин волн : 488, 587. 633. 675. 805, 860 им.

4. Апробировать выявленные закономерности па примере изучения фотодинамической реакции в цельной человеческой крови с использованием фотосенсибилнзатора тетрасульфированпого фталонпанина аллюмпния (фотосенса), применяемою для фотодинамической терапии опухолей.

Научная новнзна полученных результатов. Разработано аппаратное и методическое обеспечение исследований оптических свойств цельной крови, которое позполило приблизить изучение свойств крови in vilio к реальным физиологическим условиям сосудистого русла.

Впервые создана экспериментальная установка, включающая оригинальный элемент (подана заявка на получение патеша "Проточная кювета для оптических исследований" N94037116 от 24 окт. 1994г.) для измерения оптических свойств цельной крови и контролируемого изменения ее физиологических свойств (гематокрита, уровня окенгенацин и скорое i и сдвига) в условиях in vitro для проточных слоев. Установка позволяю определять оптические свойства цельной крови в широком спектральном диапазоне от зеленой до блнжнсннфракрасной области спектра tía одном и юм же образце. Экспериментально установлены зависимости изменений общею, диафра! малыюго пропускания и диффузного отражения н рассчитанных на их основе

коэффициент» поглощения, коэффициентов рассеяния и среднего косинуса угла рассеяния света цельной кровью для шеста наиболее широко используемых в медицинской науке и практике длинах волн: 488, 587, 633, 675, 805, 860 им от тменеиий гематокрита, скорости сдвига и уровня оксигенации исследуемой крови человека п условиях комплексной оценки исследуемых параметров на одном н том же образце. Установлено, что при повышении уровня оксигенации крови в ней происходиI увеличение светорассеяния. Обнаружены нелинейные изменения ко >фф|щисмта поглощения крови па 25-30 % в зависимости от изменений скорости едшпа ее потока для 488 и 587 км. Па основе полученных оптико-физиологических закономерностей впервые экспериментально зафиксирован эффект дезоксигенации кропи при фо тодинамическом воздействии in vitro.

Научно-практическое значение работы.

Предложен способ уменьшения экранирующего эффекта суммарною слоя крови, находящейся внутри ткани, заключающийся в предварительном охлаждении участка планируемого облучения.

Разработнпая оригинальная проточная кювета с изменяемой толщиной слоя п пределах 10-1000 мкм без удаления образца из кюветы позволяет несдедопа п. и воспроизводимо облучать мопоклеточные и сверхтонкие проточные слои различных Ghojioi ичсских жидкостей в широком спектральном диапазоне.

Для получения наиболее устойчивых решений в пределах динамического диапазона проведенных измерений при определении оптических характеристик цельной крови с помощью метода моделирования статистических итераций Монте-Карло (ММСИ) в пдоскопаралдслыюй монете рекомендована оптимальная тодшнна зондируемого слоя цельной кропи: 200 ± 10 мкм. При использовании схемы измерения отражения для применяемых в клинике источников красного диапазона необходимо учитывать, что толщина зондируемого обьема цельной крови не превышает- 300+50 мкм для артериальной и 150+50 мкм для венозной, что важно при спектроскопических исследованиях цельной крови, лазерной аш поплаешке и флюоресцентной диагностике с использованием фо I осенснбилизаторов.

Апробация работы: Материалы, изложенные в диссертации, докладывались на следующих конференциях, симпозиумах и семинарах: Всесоюзная конференция но полым мечодам контроля лазерного облучения крови и оценке эффективности лазерной icpanmi. Новосибирск, 1990г.; International Symposium on Optical Methods in Biomedical Diagnostics and Therapy. Саратов, 1992г.; Научно-практическая конференция "Современное сосюянне проблемы применения икорной медицинской техники в клинической практике". Москва, 1992г.;

Biomedical Optics-Europe'93. Budapest, Hungary, I993r.; Biomedical Optics-Europe'94. Lille, France, 1994г.; Семинар по лазерной медицине Международной Лазерной Ассоциации (ЛАС). Моеква, 1995г.; Biomedical Optics-Europe'95. Barselotia. Spain, 1995г.; Семинар лаборатории лазерной биофизики, Физический факультет МГУ, Москва, 1995г.; Biomedical Optics-USA'96. San Jose. USA. 199(«.; Приглашенная лекция в Physiology and (Cardiology Institute of Erlangen University, Germany, !996r.; International congress of Pluilobiology-96, Vienna. Austria; Biomedical Optics-Europe'96. Vienna, Austria. По материалам рабош

опубликовано десять статей и пола на одна чая л к л на па ich i

Структура п <i6i.cm диссертации. Диссертация соеюш in введения. обзора литературы, описания материалов н методов. рсз\ n.iaioii и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Содержание диссертации изложено на 165 страницах, иллюстрировано 54 рисунками и содержит it) таблиц, из которых две составлено по данным лигерагуры. Список литературы включает в себя 156 наименовании.

СОДЕРЖАНИИ ДИССЕРТАЦИИ Глава I. Обзор литературы. Кратко описываюки физиологические свойства кропи и се компонентов, л также общие принципы биологической ошикп крови и основные физические и мак'машчсскнс подходы к исследованиям и описанию получаемых данных.

Общепринятом современной практикой при описании процесса распространения света в биоло1 ических тканях, в зом числе в кропи, является использование теории переноса излучения, в рамках которой поглощение и рассеяние света средой достаточно полно определяется коэффициентом поглощения (¡та), коэффициентом рассеяния (ps) и средним косинусом узла рассеяния ц (Чандрасекар, Ва» де Хыожч, 1961)..

□

□ И И □ El

Рис. I. Основные представления о распространении оптическо! о излучения в кропи, существующие па основании предыдущих исследований: а) - инднкатрисса рассеяния излучения красною и ближнею ИК диапазона от одиночного ipiirporurra; б) картина распространения чих о же излучения в голше цельной

крови( Kessler М, 1992); в) схема рассмотренных в ММСИ процессов, происходящих с фотоном в кювете с цельной кровью: отражение от границ слоев, поглощение, рассеяние без и с выходом из слоя крови, преломление света (Ярославский И., 1994); г) световое зондирование агрегированной крови; д) свеюнос зондирование дезагрегированной крови (одиночных эритроцитов в потоке): 1 - случай зондирования, когда большинство эритроцитов в потоке разнери) гы к лучу фронтальной , широкой стороной, 2 - случай зондирования, когда клетки ориентированы в потоке па отношению к лучу боковой, узкой стороной.

Распределение интенсивности излучения внутри биоткани и на ее иоиермюеш являемся сложной функцией от п (показателя преломления) рз, цз, д данной биоткани, и параметров источника излучения: радиуса лазерного пучка о> и его геометрического профиля (Тучин В.В., 1994). В настоящий момент в международной практике наиболее часто оптическое описание биологической среды дается именно в терминах теории переноса, как набор параметров {(1а,

юорешчеекм зги параметры не зависят от характеристик конкретной жепериметадышй установки, поэтому именно по ним сравнивают свои результаты исследователи из разных стран и научных центров. Некоторые результат, полученные на настоящий момент по оптике крови приведены в таблице I.

Таблица I. Краткий лшературиый обзор данных по оптическим параметрам

цельной крови

км иа, мм 1 ММ"1 Физиологические характеристики крови Методы намерения и теоретического описания Лвтор, [од.ссылка

Г.75 л) 0) а) 0.27 о) 2.43 а)149.2 5)147.6 а)0.М95 б)0.995 а)оксиг99%, 111=41 5)оксиг 0% Пропускание и отражение я режим< однократного рассеяния,Теор. Ми А.Исммару 1978

Ша) б) SO(la> 0> а)<1 7 б)2 15 п)051 5)0 67 а) 169 6 б)169.6 а)121.3 5)121.3 ¡1)0.985 6)0.985 а)0.98 5)0 98 а)оксиг99%. Ж=41 б)окснг0°в а)оксит99%, Ht=41 5)оксиг 0% Намерения общего и ко ллимнровамного пропусками» гониофотометрня, Диффулюн. приближение Ж. Штейнке, Л. Шепиард 19X8 В Гверски.7()

63.1а) 5) SH! Х50а) С» а)(1 7 0)2.5 II 45 а)0 6 Г>)0 35 а)30 5)10 а)22.5 5)20 а)0 98 5)0 48 а)0.98 5)0.98 а)оксг99%,П|=41 -43 5)оксиг 0% Дсоксш енировам. я)оксг99%,11|=41-43 *>)очсш 0"« Циффупюе отражение и диффузно( пропускание, Монте-Карло С. Жак, М. Кен (ер 1992

Выводы Н! аналша литературы:

I. Существующие представления о взаимосвязи оптических н существенно влияющих на них физиологических свойств крови качественно выглядят следующим образом: цл (Ht, Oj-sal); ps (Ht, s): g=g (s) при фиксированном СО') ü цветном показаicjie. (Ht - гематокрнт, СЬ-sat - окенгеиацпя, s - скорость сунна íi'pon шодпая линейной скорости потока но радиусу сосуда)).

Количественная оценка степени влияния каждого из физиологических параметров на оптические характеристики на сегодняшний день отсутствует.

2. Из доступных литературных источников выявлено, что на сеюдияшний день отсутствует полная база достоверных данных по оптическим параметрам светопоглощения и светорассеяния крови. Оптические показатели крови, полученные исследователями из разных стран, различаются в 10-15 раз.

3. На основании современных данных литературы установлено, что оптические характеристики получены только для неподвижной крови, в то время как in vivo кровь - нестационарная среда. Методические трудности отчасти связаны с технической проблемой создания тонких плоских проточных слоев.

4. Применяемые раннее математические методы решения уравнения переноса, такие как многопотоковые теории и диффузионное приближение, не дают достаточно точного решения для нахождения ошическнх иарамефоп поглощения и рассеяния крови. В настоящее время наиболее точным способом определения ца, ц* и g из измеренных показателей пропускания и отражения, по-видимому, является метод статистических итераций Монте-Карло (ММСИ).

В заключении обзора литературы, на основании вышесформулпрованных выводов, представлена теоретическая концепция планируемой зксперпмсталыюй работы по исследованию взаимосвязи гематокрита, уровня оксигснацпи, скорости сдвига крови н ее оптических свойств.

Глава II. Материалы и методы. Глава содержит описание экспериментальных методов варьирования физиологических cboücib кропи, а также методов регистрации ее оптических н физиологических параметров на основании концепции, изложенной в обзоре литературы. Кратко представлены основные физические модели и математические методы, использованные в данной работе.

Разработанная экспериментальная установка in vitro (Рис. 2) служит для измерения пропускания и отражения крови, изменяя при этом какую-либо физиологическую характеристику: концентрацию крови (т.е. ее гемаижрт и общую концентрацию гемоглобина), степень оксигенации 02-sat и скорой ь циркуляции крови V (гакже соответственно и скорость сдвига а). При изменении одной физиологической характеристики все остальные физиологические парамегры остаются неизменными. Кроме того, благодаря орш инальному техническому решению, была создана полностью разбирающаяся проючная плоскопараллельная кювета, которая позволяет изменять толщину слоя находящейся в ней крови без удаления ее из кюветы в диапазоне 10-1000 мкм.

Как видно in Рис. 2 экспериментальная установка состоит из пяти главных часки: изолированною о г a i мосфсрною воздуха смеси геля I, кварцевой протчной KioBci ы 2, двухлучепого спектрофотометра 3 с интегрирующей сферой 7 (11ПАС111 1'-34()0). перистальтического роликового насоса 4 и мембранного оксигенатора 5, соединенного с газовым баллоном 6. Все части контура циркуляции кропи (1-2-4-5-!) соединены между собой эластичными трубками из сплпконпшроваппои ренты.

Длины волн, используемые для анализа оптических свойств крови, были выбраны из тех, что применяются либо в различных областях лазерной медицины (488, 033, 675, 860 им) (Kaplan M.,Cheong \V„ Кару Т., 1985-1992), либо важных для снектроскопическчн о анализа: изосбестические точки 587 и 805 нм.

Так как определение трех неизвестных параметров ра, g требует трех независимых измерении, то измеряли общее пропускание Tt, диффузное отражение Rd, а также диафрагмальное пропускание Tdr коллимироваппого пучка MH01 ослойным плоским образцом (кровь в плоскопараллелыюй кювете).

Дчя расчета коэффициентов поглощения, рассеяния и среднего угла рассеяния из измеренных параметров применяли инверсный метод ста!истических итеррацип Монте-Карло - статистическое моделирование движения определенного количества фотонов. При этом в соответствии с ца', ¡.и' и g', толщиной h' н показателем преломления п1 каждого из i слоев среды фотон с определенной пероямюаыо может(Рис. 1в): а) рассеяться в пределах слоя; б) рассеяться и выйти ш слоя; п) пройти через слой и не рассеяться (процесс преломления света); г) oí разиться от поверхности слоя; д) поглотиться.

Кражнй алюригм расчета:

I. Tt. Tdr. Rd ¡p.,, (ц, g}1 методом Кубелка-Мунка;

2 Iii íu.g}1 методом Мойте-Карло рассчитываются {Tt, Tdr, Rd}1;

3. Оценивается среднеквадратичное отклонение SS рассчшанных {Tt'.Tdr'.Rci1} от реально измеренных {Tt,Tdr,Rd};

4. Если SS меньше заданной погрешности, то расчет закапчнвасая. Если нет , то поиск в фазовом пространстве ц„, р5, ц продолжается.

В рамках совместного научного сотрудничества данный . алгоршм был реализован по представленным экспериментальным и методическим материалам в виде программного обеспечения к.ф-м. паук Ярославским И В.

Для определения скорости сдвига s, сег1 в кювете была определена линейная скорость при различном расходе методом Допплеровской анемометрии в локусе оптического зондирования кюветы (Рис.3). Из рисунка видно, чю при высоком расходе градиент линейных скоростей в области зондирования во фронтальной плоскости достаточно мал (40-44 мм/сек), поэтому им пренебрегают и считают среднюю линейную скорость (при данном расходе - 42 мм/сек) постоянной величиной. Такая ситуация существенно упрощает решение уравнение Навье-Стокса и получение формулы для расчета s в данной кювете: s=3V/h (V -линейная скорость, h-толщина кюветы). Диапазон изменений скорое i и сдвша лежит в пределах, соответствующим условиям сосудистого русла ¡n vivo: 0 - 850 сек1.

hv

□ 46 ■ 44

□ 40-42

щ за-40 азбэв

□ 34 36 »31-3» азо-32

Рис. 3. Пространственное распределение линейных скоростей во фронтальной плоскости (па которую падает зондирующий пучок) кюветы с толщиной проточного слоя 130 мкм, полученное методом лазерной Допплеровской анемометрии. Стрелками показано направление падающего зондирующею излучения

Обьектом исследований была цельная гепарипнзированная кровь от

здоровых доноров и пациентов отделения кардпотерапин Московской

Медицинской Академии. Разбавление осуществлялось К-Ыа фосфатным буфером,

чтобы замедлить седиментацию. Во время измерений, кроме исследования с-

зампспмосш {ц.,, fu, g}-s, кровь в установке была неподвижна. Гематокрит определяли методом центрифугирования, оксигенация измерялась оксиметром. величины СОЭ п цветной показатель контролировались рутинным способом. Статистическую обработку данных проводили путем определения среднего арифметического и его дисперсии с последующим графическим сравнением рсмулмаюв (Львовский Е., 1988). Суммарная notрешпость при установлении cooiBciciBii» коэффициента поглощения, коэффициента рассеяния, среднего косинуса утла рассеяния и исследованных физиологических факторов крови лежит в диапазоне +40-60";,. Как показывает практика, наибольшую погрешность вносит дисперсия к типических анализов крови.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Кривые ослабления. Определение реальной глубины зондирования и оптимальной толщины слоя крови для оптических исследований.

Па рисунке 4 представлены кривые уменьшения пропускания излучения изученных длин волн при возрастании толщины слоя крови от 30 до 450 мкм. Особенностью данных кривых является то, что они получены не путем разбавления крови, а изменением толщины слоя цельной крови в кювете на одном и том же образце, i

о 9

о я

(I 7 g 0 6 5 1) 5 £ <> -1

« 3

0 2

0.1 (I

Толщ и и а слоя крови, мкм

Рис.4. Уменьшение общего пропускания в зависимости от увеличения толщины слоя цельной крови, lit-43; 02sat=99" i..

Исходя из представленных данных, ослабление интенсивности излучения в с раз для 633, 675, 805, 860 им происходит при толщине слоя 500+50 мкм, а для 488 и 58" им - на глубине 70+10 мкм.

При превышении толщины слоя окешеннрованной крови более 300 мкм значения днффузпою отражения 633,675,805, 860 выходят на плато (Рис.5).

О 5 О 10 0 I 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 .151) 411(1 4 5 0

Т о л III и II а слоя, м к м

Рис.5. Выход на "плаю" диффузного отражения при увеличении ю.нппны слоя цельной кропи свыше 300 мкм. Н1=43; С)2на1=99". о.

Эго обозначает, что количество долетающих до фотодетскзора обратно рассеянных фотонов красного и ближнего ИК излучения из цельном крови с глубины более 300 мкм не регистрируется в пределах динамическою диапазона измерений. Фактически, 300 мкм для цельной окснгенированпои крови является максимальной глубиной реального зондирования отраженным светом для указанных длин волн в случае вышеописанной геометрии оптических измерений. Данная величина может измениться в зависимости от степени оксшспации кропи: так для 633 им глубина зондирования венозной крови будет п 2 раза меньше, а для 805 им оаанетсл т акой же.

0 50 100 НО 200 2 5 0 5 00 .1 ? О 4 л » 4 50

I олщ о н| глы1 к р и вн. ч к ад

а)

Т Л Л »1 И Н I ело* крляк.чкч

б)

Рис.6. Стабилизация коэффициента поглощения а) и рассеяния б) (»33 и 805 в зависимости от увеличения толщины слоя цельной крови. 111=43: ()25а1=9<)'\,.

В ходе работы было проанализировано влияние толщины слоя на определяемые он i ичсскпе парамсчры н выяснено, чю наиболее уетйчпвые решения меюда сташстических игеррапий (Монте-Карло) для исследованного красною и ближнею ПК излучения в пределах динамическою диапазона и)мерепий получены при толщине слоя 200 ± 10 мкм. В качестве примера можно нрпвсст стабилшлцпю коэффициентов поглощения и рассеяния, представленных соо< Bcici вснно на рпс.6 а и б для 633 и 805 им.

Аналогичная динамика лих показателей, а также среднего косинуса угла рассеяния имеется и для других изученных длин воли 675 и 860 им.

Исходя из подученных результатов, можно заключить, что оптические парамефы, полученные на слоях цельной крови тоньше 200 мкм, буду) несколько завышены и для получения наиболее устойчивых решений в пределах динамического диапазона измерений при определении оптических характеристик цельной крови с помощью метода моделирования статистических итераций Моще-Карло (MMC'II) п плоскопарадлельноп кювете рекомендуется создать слой 20(1 ) К) мкм.

2. Чкснеремен 1:1.план проверка пикие si.i о редукции рассеяния при прет.иштнш и'М'.покри ia кропи ein,нпс 50%.

Па основании проведенных исследований были получены результаты, паипоржчающие iniioieiv ой определяющем влиянии редукции' рассеяния иа мк'лнчение оптической про фачностн крови при увеличении се гемакжрнта свыше 50%<Псимару А., 197,S).

J И 6 4 Ь 0

i í « i г «к (i и i ,

г»

и

В)

Рпс.7. Изменения оптических свойств крови для 633 и 805 им. при увеличении се гематокрита свыше 50 %: а) - увеличение светопропускания; б) - увеличение коэффициента поглощения; в) - редукция коэффициента рассеяния. Толщина слоя 140 мкм, O2sat=99"/o.

На примере 633 и 805 им покатана динамика полученных поката гелей пропускания, поглощения и рассеяния при увеличении Ш oí 16 до 67: увеличение светопропускания почти в 1.5 раза по сравнению с предыдущим значением (Рис. 7 а); непрерывный рост коэффициента поглощения (Рис. 7 б) в соответствии с увеличением концентрации крови и редукция коэффициента рассеяния при значениях гематокрпга свыше 50 практически в 1.5 раза но сравнению с предыдущим значением, полученным при 111=50 (Рис 7 в). Результаты, аналогичные отраженным на рисунке 7, получены для других исследованных длин волн 675 и 860 им. При этом для Х=488 и Х=587, ¡де коэффициент поглощения выше, чем коэффициент рассеяния, изменения пропускания и офажения определяются прежде всего изменениями концентрации icmoi лоГшна крови и имеют линейный характер.

Так как кровь разбавляли не плазмой, а буферным раствором, то снижение концентрации фибриногена приводило к уменьшению агрегирован! юсти эритроцитов, и, соответственно, к увеличению показа гелей светорассеяния кровью. Подробнее взаимосвязь агрегации и оптических параметров рассмотрена в следующей группе результатов.

Таким образом, с помощью экспериментальных п тсорсжчески рассчитанных результатов показано, что увеличение оптической прозрачности крови при увеличении се гематокрита свыше 50 % вызнано, прежде всего, уменьшением рассеяния света.

3. В лияние агрегации и дезагрегации крови, деформации и изменения ориентации эритроцитов на оптические характеристики крови.

При возникновении скорости сдвига свыше 100 сек1 происходит динамическая дезагрегация эритроцитов в потоке крови (Рис. 1 г и д), что оптически зарегистрировали как уменьшение пропускания н увеличение отражения, причинами которых являются увеличение светорассеяния: увеличение

как коэффициент рассеяния, так и уменьшение среднего косинуса угла рассеяния (I с. упшреипе индикатриссы рассеяния). Деформация эритроцитов уменьшает его сечение рассеяния (характеристике рассеяния от всей поверхности клетки). Полученные результаты в целом согласуются с предыдущими работами (Н. .1. КI ose, П. Vol ger, 1972).

Тем не менее, обнаружено, что появление и изменение ориентации эртронитов при их движении » нотке крови но отношению к плоскости зондирующею луча приводит к появлению световой анизотропии крови и к нелинейному изменению коэффициента поглощения. Обнаруженный эффект имеет мест для излучения с длиной волны 488 и 587 ям в тонких проточных слоях с толщиной 150 мкм. В зависимости от избранного направления светового зондирования движущихся эритроцитов в потоке крови (Рис.1 д) изменяется не т.мько сечение рассеяния, но и ееченне поглощения (характеристика всех потерь интенсивности проходящего излучения внутри клетки) эритроцита. Так как сечение поглощения одного эритроцита максимально в случае, когда он разверни п потке широкой фронтальной плоскостью по отношению к зондирующему пучку (Рис 1 д1), то при достаточно высокой величине коэффициента поглощения в случае тнкнх слоев такой эффект может привести к изменению самого коэффициент поглощения, как суммы сечений поглощения эритроцитов, ока швшихся на пути зондирующею излучения (Рис. 8).

Рис 8. Нелинейные тмсиения коэффициента поглощения цельной кропи на 25-3(1% при увеличении скоросш сдвига. Толщина слоя 140 мкм, 02-ва1=99%.

Максимальное поглощение наблюдалось при скорости сдвига 135 сек1. Данный феномен имее! мен о Плаюдаря так напиваемому "эффекту сита": [смоглобни распре 1елеи г» кропи неравномерно и в норме находится только внуфп >рп фонтов.

Исходя пз гсоретческих предположений можно допустим», что |дубина модуляции ко)ффицис>иа поьтощенпя, т.е. разница между его максимальным и нача п.ним (для неподвижной кропи! значением при близкой угловой ориентации

большинства эритроцитов относительно зондирующего пучка при $=135 сек1, будет определяться соотношением между геометрическим сечением его боковой и передней поверхности.

4. Влияние на оптические параметры крови изменении ее оксшсиашш.

Основываясь на изменениях рассчитанных оптических парамемров, мы показали, что увеличение оксигенации крови с 45 до 99 % приводит не только к изменениям коэффициента поглощения к соответствии со спектрами юмоиюбииа и окси!емоглобина, но и к уменьшению среднею косинуса утла рассеяния исследованных длин волн на 2-5"о (Рис 9 а,б).

а)

0 9 4 0 ----

0 9 П 0

0 8 X "

<> 8 И

0 8 4 0

0 & 2 О

о я о в

-ч й

б)

Рис. 9. Уменьшение среднего косинуса угла рассеяния 633, 675, <405, 860 им при увеличении оксигенации цельной крови.

Установлено, что так как величина g определяется прежде всею рашером н формой рассеивателя, то тго позволяет сформулирован, гипотезу о том, что уровень окешенации крови влияет не только на ее свегопоглощающие, по и на светорассенвающие свойства, вследствие уменьшения среднею размера образующихся агрегатов. Таким образом, физиоло! ичеекп. ограничение размеров эритроцитарных агрегатов может быть вызвано увеличением однонмеиных зарядов их мембран, и, соответственно, взаимоотталкиванием клеток- при оксигенации гемоглобина.

5. Использование полученных закономерностей, связывающих между собой оггшчсскис и фнзиолоипескис своисша крови на примере фошднпамичсскои реакции фга.тоцпашша аллшминнн (фотоссиса) е цельной кровью.

Ь 7 5

£

Результат репарации измекеиин спектра общею пропускания представлены на рисунке 10. 11роизведеп • расчет реальной удельной дозы облучения данного образца крови, которая составила 80 Дж/см3.

Рис. 10 Спскф пропускания крови с растворенным фотосепсом до и после лазерной» облучения (671 им: 80 Дж/см1). Концентрация фотосенсибилизатора -0.01м|/мл. Ilt=40, 02sal=99%. Толщина слоя крови 450 мкм. Минимумы пропускания соогвегсзвуют пику поглощения использованною фсиосеисмби низа тора. Изменение вида кривой после облучения в целом соо1вегствуез спск! ральным изменениям, характерным для процесса леокешенпцнп крови в данном диапазоне алии волн.

Проведенный эксперимент гю фотодинамической реакции фталоцианина аллюминпя с цельной кроимо продемонстрировал специфические изменения измеряемых (i.e. пропускания и отражения) и рассчитываемых (т.е. коэффициентов ihm лощения, рассеяния и среднего косинуса угла рассеяния) оптических свойств крови с растворенным фотсснснбилизатором фотосепсом после лазерного облучения длиной волны 671 им in vitro.

Общая кармпш изменений измеренных и рассчитанных параметров предсктлепа в тблице 2. В скобках указан статистический разброс параметров. Знаком + или - показаны, соответственно, относительное увеличение или уменьшение оптических характеристик по сравнению с таковыми для необлученноп крови.

Таблица 2. Относительные изменения оптических параметров фоюсепсибилтироваппой цельной крови после лазерного облучения с >.=671 им

X, им 11(10"/',,) Utl(20%) М40%) 11,(20%) «(4%)

601) -70" -1150"'» + 160",, -13% + 11%

633 -50" о ■300% + 185':,. +2% +4.3%

671 -33"« -100% + 123% + 1.4% +2.6%

675 -26" „ -100% +94",, + 1% + 1.3%

805 -6.8" „ -7.9 + 2" и + 1% + 3.4" о

Iii представленой таблицы видно, что опшчсскпс поката гели поглощения существенно растут для всех длин воли, та исключением 805 им, в то время как коэффициент рассеяния практически не меняется, а изменения среднего косинуса утла рассеяния не превышают 4.3% для 633, 671, 675, 805 им.

В результате исследования, на основе полученных значений и закономерностей влияния физиологических свойств крови на се опшчсскпс свойства, установлен эффект деокеш енацин облучаемой артериальной крови до венозных значений, что подтверждает существующие предположения об участии растворенного кислорода в данной фотодинамической реакции (Steiner R., Лощснов В., 1993) .

На основе полученных результатов разработаны конкретные клинические рекомендации по проведению фотодинамической процедуры для увеличения ее эффектвносги и преодоления оптическою барьера в поверхностных кровееодержаших тканях и верхних слоях опухоли, возникающею при деокенгенации крови в результате фотодинамического воздействия. Предложено изменить идеологию фотодинамической лазерной обработки опухоли: если сейчас уничтожение новообразования мягких (т.е. кровосодсржащпх) тканей ведется с поверхности вглубь,то имеет смысл проводин, это в обратном порядке: разрушать в первую очередь глубоколежащие слои опухоли. Достичь этого можно, уменьшая поглощение в поверхностных слоях за счет эффекта ватоконстрнкции при предварительном местном охлаждении предполагаемого места облучения. Это позволит более эффективно воздействовать на новообразование как с точки зрения утилизации кислорода при фотрдинамическом воздействии, так и с точки зрения предотвращения оптического барьера для лазерного облучения опухоли. Увеличение зондирующего обьема при измерении отражения света от облучаемой биологической ткани за счет уменьшения пог лощения света кровыо. содержащейся в ней, позволит более полно осуществлять контроль за проведением процедуры ФДТ. Кроме того, дополнительным преимуществом данною подхода является эффект местного обезболивания.

Данное предложение внедрено в клиническую практику Онкологического Центра АМН России и Московской Медицинской Академии им. Сеченова, что подтверждено соответсвующими актами о внедрении.

Созданную аппаратуру и методику для моделировании оптических свойств крови можно использовать с целыо скрининга различных меюдов фотодинамической терапии. Мониторинг уровня оксигенации в облучаемой ткани в принципе позволяет точно установить момент начала и окончания процедуры фотодинамической терапии.

выводы

1. Ра<работана экспериментальная установка, включающая оригинальный i.'icMcm (полана заявка на получение патента "Проточная кювета для оптических исследований" N94037116 от 24 окт. 1994г.) для измерения оптических свойств цельной кропи и контролируемого изменения ее физиологических свойств Немаюкрта, уровня окешенации и скорости сдвига) в условиях in vitro для iipoi очных слоев, приближенных к реальным физиологическим условиям сосудиспч о русла. Уаапонка позволяет определять оптические свойства цельной крови и широком спекфалышм диапазоне от зеленой до ближней инфракрасной области спектра на одном и том же образце.

2. 15 условиях комплексной оценки исследуемых параметров на одном и го.м же оПрашс экспериментально установлены зависимости изменении общего, днафра) мальпгчо пропускания и диффузпот отражения и рассчитанных на их основе кчпффнцпенгоп iioiлощения, коэффициентов рассеяния и среднего косинуса yi.'ia рассччишя encía цельной кровью для шести наиболее широко используемых в медицинской науке и практике длинах волн: 4X8, 587, 633, 675, 805, 860 нм от п 1МСНСНИЙ iсма юкрша. скорости сдвш а п уровня оксигенацин исследуемой крови человека

í Ус1аноплсно относи ic'iuioe влияние i смшокрита, скорости сдвш а и уровня окешенации цельной крови в пределах исследованных диапазонов их шмсп'.'иип на оптические параметры крови для изученных длин волн.

Па ко >ффш|ПС111 гни лощения 633 и 675 им наиболее сильное влияние окатываем уровень оксигенацин крови. Для оаальных длин воли поглощение света кровью определяйся прежде всего величиной гематокрита. На коэффициент рассеяния оказывают близкое по значению влияние уровень гематокрита и скорос! ь сдвш а потока крови На средний косинус угла рассеяния максимальное илпяппс оказынас! i суш i окр и т.

4. При повышении уровня окешенации крови до 90 и выше и ней ироисчочи! уменьшение среднею косинуса узла рассеяния света на 2-5% для 633, 675, 8Н5. 860 нм. "По позволяем предположи!ь, чю уроиеш. окешепацип крови в.тпяс! па ее свсюрассеившошпе свойства вследствие уменьшении среднею ра '.мера клемочныл ai регатов.

5. Обнаружены изменения коэффициента noiлощения крови на 25-30"в (авнснмосш oí изменений скорости сдвига ее по i ока для 4X8 и 587 нм: увеличение, достижение максимума при скорости сдвш а 135 сек1, а затем уменьшение нракшчески до первоначальных значений. Данный феномен может явля!ься

следствием появления и изменения ориентации эритроцитов при их движении в потоке крови.

6. Экспериментально покачано, что для длин волн красною и ближнею ИК диапазона при увеличении гематокрита свыше 50 % пропускание света кровыо увеличивается, а рассеяние уменьшается. Это хорошо согласуется с теорией Исимару Л. об определяющем влиянии редукции рассеяния на увеличение оптической прозрачности крови при высоких значениях гематокрита.

7. Используя разработанную нами установку, было изучено действие лазерного облучения в присутствии фогосенсибилизатора тетрасульфированпого фталоциаинна аллюмииия (фотосенса) на оптические свойства крови. Установлен эффект уменьшения оксигенации крови до значений ниже венозных. Эго приводит к снижению пропускания действующего света (671 нм) в цельной крови па 30-50"о.

8. Предложен способ уменьшения экранирующею эффект суммарною слоя крови, находящейся внутри ткани, заключающийся в предварительном охлаждении участка планируемою облучения. Метод внедрен в клиническую практику Онкологического центра РАМН и ММА им. Сеченова.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Дуплик А.Ю "Оценка коэффициента пропускания кропи при воздействий лазерного излучения с длиной волны 0.63 и 0.89 мкм.", сборник "Актуальные вопросы лазерной медицины" Москва, МОНИКИ, с. 29-32. 1990.

2. Дуплик А.Ю. Александров М.Т. Андреев Е.М. "Исследование коэффициента пропускания кровью лазерного излучения с длиной волны 0.63 мкм,0.85 мкм, 0.96 мкм в зависимости от некоторых физических факторов состояния крови", сборник "Современные методы контроля лазерного облучения крови и оценки эффективности лазерной терапии" Новосибирск, СО АН СССР, ар 24-25, 1990.

3. Дуплик А.Ю. Гордеев IO.H. Ярославский И.В."Расчет средней облу ченцо;, крови дтя внутривенной лазерной терапии", сборник "Современное сосюяиие проблемы применения лазерной медицинской техники в клинической пракшке", ч.1, Москва, РГМУ, стр. 87-89, 1992.

4. Александров М.Т. Дуплик А.Ю. "Способ определения кмперагурной готовности криоконсервированнои донорской кропи для переливания", сборник "Современное состояние проблемы применения лазерной медицинской техники в клинической практике", ч.2, Москва, РГМУ, стр. 178-180, 199?

5. Douplick A.Y. Gordeev Y.N. Yaroslavsky I.V. "Calculation of Specific Power Density of blood for Intra-Venous Low-Level Laser Therapy", SPIP.-Procccding Vol.1981, USA, p.240-244. 1993.

6. Douplick A.Y. "The use of the conccpt of Specific Power Density" for paramctrisation of Low Level Laser Irradiation.", SPIE-Proc., Vol. 2086, USA, p. 308-311. 1994.

7. Douplick A.Y. Yaroslavsky I.V. Loschenov V. В., Alexandres' M. Т., Sirkin A. L. "Identification of spectroscopic parameters of whole blood depending on its physiological properties" SPIE-Proc., Vol. 2326, USA, p. 319-325. 1995.

8. N.L. Torshina, V.B. Loschenov, A. Starotovnikov, A.Yu. Douplik, A.M. Posypanova "Investigation of phtalcianine AI. photosensiti/.er and blood interaction", Sl'lL-Pioc.. Vol. 2325, USA, p. 389-390, 1995.

9. Douplik Alexandre J., Loschenov V.B. , "Identification of spectroscopic and optical parameters of whole blood depending on its concentration and lay er thickness". SPIH-Proc., Vol. 2624, USA, p. 165-176, 1995.

10. Douplik Alexandre J. .Loschenov Victor B. "Identification of optical parameters of the whole hlood depending on its oxygenation level", SPIE-Proc., Vol.2678. USA. p. 548-555, 1996.